一种微生物用于降低人体腔内三甲胺水平的应用，尤其是用于治疗三甲胺尿症或细菌性阴道炎以及预防心血管疾病
阅读：312发布：2024-02-01
专利汇可以提供一种微生物用于降低人体腔内三甲胺水平的应用，尤其是用于治疗三甲胺尿症或细菌性阴道炎以及预防心血管疾病专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种包含 微 生物 的组合物，这种微生物优选古菌，其表达TMA甲基转移酶和TMA甲基基团受体类咕啉蛋白，能在存在氢气的人体腔室内进行三甲胺(TMA)的代谢，比如肠道或者 阴道 ，可用作一种药物来处理、降低或者清除人体腔室中的TMA。另外，本发明还涉及一种包含TMA甲基转移酶和TMA甲基基团受体类咕啉蛋白的组合物。这些组合物可用来 治疗 三甲胺尿症，处理细菌性阴道炎发生时的阴道分泌液，以及减少或消除因TMA而产生的腥臭味。这些组合物还可用来降低 血浆 TMAO 水 平，防止动脉粥样化斑 块 的形成和/或 预防 心 血管 疾病 。，下面是一种微生物用于降低人体腔内三甲胺水平的应用，尤其是用于治疗三甲胺尿症或细菌性阴道炎以及预防心血管疾病专利的具体信息内容。
1.一种可作为药物用于处理、降低或抑制人体腔中三甲胺(TMA)的组合物，所述组合物包含表达TMA甲基转移酶的微生物，在至少一个包含可生成TMA的菌群的人体腔中，所述TMA甲基转移酶能够在存在氢气的条件下进行TMA的代谢。
2.根据权利要求1应用的所述的组合物，其特征在于，所述人体器官是肠道，所述组合物用于处理、降低或抑制肠道和/或肝脏中的TMA。
3.根据权利要求1或2应用的任一所述的组合物，用于治疗三甲胺尿症。
4.根据权利要求1或2应用的任一所述的组合物，用于降低血浆氧化三甲胺(TMAO)，防止形成动脉粥样化斑块和/或预防心血管疾病。
5.根据权利要求1应用的所述的组合物，其特征在于，所述人体器官是阴道，所述组合物用于处理、降低或抑制阴道或阴道分泌液中存在的TMA。
6.根据权利要求1或5应用的任一所述的组合物，用于处理细菌性阴道炎发生时的阴道分泌液，减少或清除所述阴道分泌液中因包含TMA而产生的腥臭味。
7.根据权利要求1到6应用的任一所述的组合物，其特征在于，所述微生物还表达或者说所述组合物还包含一种可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白。
8.根据权利要求1到7应用的任一所述的组合物，其特征在于，所述微生物包含由序列
1或序列2构成的编码TMA甲基转移酶的基因。
9.根据权利要求1到8应用的任一所述的组合物，其特征在于，所述微生物包含由序列
3或序列4构成的编码TMA甲基转移酶的基因。
10.根据权利要求1到9应用的任一所述的组合物，其特征在于，所述微生物还包含耐胆盐的基因，特别是编码胆盐水解酶的基因，优选胆酰甘氨酸水解酶的基因。
11.根据权利要求1到10应用的任一所述的组合物，其特征在于，所述微生物为产甲烷古菌，尤其是人源性或动物源性的产甲烷古菌，优选人源性的产甲烷古菌。
12.根据权利要求1到11应用的任一所述的组合物，其特征在于，所述微生物为产甲烷古菌，其16S RNA由DNA序列中序列11或12编码。
13.根据权利要求1到10应用的任一所述的组合物，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌或者重组乳酸杆菌。
14.根据权利要求1到8应用的任一所述的组合物，其特征在于，包含TMA甲基转移酶，所述TMA甲基转移酶包括序列1或序列2，或者包括与序列1或序列2的一致性高于90％的等同序列，尤其是一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的等同序列。
15.根据权利要求1到8应用的任一所述的组合物，其特征在于，包含可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白，所述类咕啉蛋白包括序列5或序列6，或者包括与序列5或序列6的一致性高于90％的等同序列，尤其是一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％的等同序列。
16.一种治疗三甲胺尿症或细菌性阴道炎的方法，其特征在于，所述方法包括服用有效剂量的根据权利要求1到15任一所述的组合物。
17.一种预防动脉粥样化斑块和/或心血管疾病形成的方法，其特征在于，所述方法包括服用有效剂量的根据权利要求1到15任一所述的组合物。
一种微生物用于降低人体腔内三甲胺水平的应用，尤其是
[0001] 本发明涉及一种微生物的应用，在至少一个包含可以生成三甲胺(TMA)的菌群的人体腔(以下简写为“人腔”)中，这些微生物可以进行TMA的代谢，从而降低人腔内的TMA水平。
[0002] 本发明涉及所述微生物在肠道内用于降低TMA水平的应用。本发明的目的尤其是用于治疗三甲胺尿症，和/或降低氧化三甲胺(TMAO)的水平，从而有可能防止动脉粥样化斑块的形成，以及为预防心血管疾病提供另外的方法。
[0003] 本发明还涉及用来进行TMA的代谢的酶的原位递送。
[0004] 三甲胺尿症(或称为TMAU、TMA引起的尿毒症、或臭鱼综合征)是一种遗传性疾病，由于患者体内一种酶的基因缺损(含黄素单氧化酶3，FMO3)，肝脏内的TMA不能被有效地转化为TMAO。而在某些病例中，这种转化能力的缺损是阵发性的，后天获得的。从而，三甲胺在体内大量蓄积，最终随着汗液、尿液和呼出的气体排出体外，并带有浓重的鱼腥臭味。虽然没有实际的研究对此病的总体发病率进行描述，但是推测美国人群中的发病率大概就是1％这个数字。在下文中，这样的人被确定为TMA-代谢缺陷型患者。
[0006] 此外，在具有活化的FMO3酶的人群中，TMA在肝脏内被转化为TMAO，这种代谢物会再出现在血流中。Wang等人.(《Nature》2011年第472卷7341期,第57-63页；另见《Nature》新闻与观点，2011年第472卷,第40-41页中K Rak和D J Rader的《心血管疾病》(Cardiovascular Disease))的研究发现，血液中循环的TMAOs可能造成动脉内动脉粥样化斑块的形成，从而导致心脏疾病。
[0007] 细菌性阴道炎是女性发生在的一种良性病变，其发病原因是阴道内微生物菌群失衡。这种失衡是因为乳酸杆菌菌群的减少，造成主要包含阴道加德纳氏菌的厌氧菌群大量繁殖。细菌性阴道炎的主要特征是阴道脱落物或分泌液呈灰白色且带有腥臭味。这些阴道脱落物或分泌液发出腥臭味道是由于其中包含TMA(Wolrath等人，《APMIS》2002年,第110期,第819-824页；另见Wolrath等人，《APMIS》2005年,第113期,第513-516页)。
[0008] 本发明还涉及所述微生物在阴道内的应用，用来降低阴道分泌液的TMA水平。本发明的目的尤其在于处理细菌性阴道炎发生时的阴道分泌液，或治疗由于局部TMA生成引起的任何紊乱或疾病，从而有可能减少阴道脱落物或分泌液散发的强烈腥臭的气味。
[0009] 本发明的目的还在于一种新型的微生物，其可以用于上述应用。
[0010] 产甲烷古菌是一种能在厌氧环境下产生甲烷的微生物。某些特定的古菌存在于动物的消化系统中，比如反刍类动物；也存在于特定的人群中，特别是老年人。
[0011] 因此，B.Dridi(《国际微生物分类进化学杂志》(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology)，2012年第62期，第1902-1907页)的研究团队报告称，他们分离出一种名为鲁米叶甲烷马赛里球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)的微生物，这种古菌可在H2气体环境中将甲醇还原为甲烷。文中还描述了这种微生物不能在CO2气体环境中利用三甲胺和一些其它底物生成甲烷。在A.Gorlas,《细菌学杂志》(Journal of Bacteriology),2012年9月,第194卷17期，第4745页上公开并提到了这种古菌的全部基因组序列，并且该基因组序列已经被收录进GenBank数据库，登陆号码从CAJE01000001到CAJE01000026。
[0012] 目前，尤其是在人群中，能在体内利用和进行TMA的代谢的微生物，特别是古菌，还未见报道。
[0013] 发明人从取自人类个体的未脱盐标本中，成功鉴定出一种产甲烷古菌的新菌种，该菌种包含编码TMA甲基转移酶的基因(mttB基因)和编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白的基因(mttC基因)。某些器官或者这些器官围成的腔室，比如肠道、人类的结肠或阴道，会出现存在氢气的厌氧环境，在这种条件下，该菌种能进行TMA的代谢，因此本发明建议利用这些微生物来进行TMA的代谢，从而降低其水平，尤其是降低其在肠道内和阴道内的水平。进一步的研究发现，该古菌菌株还包含耐胆盐的基因，特别是编码胆盐水解酶的基因，从而促进菌株存活，维持这种微生物在肠道内的数量。这种微生物在下文中被确定为菌株1，或者被称为(Methanomethylophilus alvus)。发明人还确定了另外一种鲁米叶甲烷马赛里球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)古菌菌株，该菌株曾经也被D.Didri等人.(如上所述)描述过，在下文中往往被称为菌株2，它也包含编码TMA甲基转移酶的基因和编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白的基因，菌株2能在肠道内存在氢气的环境下进行TMA的代谢。人们相信，TMA的代谢生成了甲基化蛋白(甲基化类咕啉蛋白)，即该甲基化蛋白捕获了TMA的甲基基团。之后，这种甲基化蛋白很可能进入了甲烷生成的代谢通路，从而产生甲烷。
[0014] 显然地，我们这里指的是能围成腔室的某种器官，同样也指的腔室本身，只要它包含厌氧微生物菌群，进而能产生或者生成TMA。也可以将这种器官或腔室称为包含能利用微生物菌群产生TMA的器官或腔室。通常情况下，在氢气源存在的条件下，由微生物的代谢生成这种TMA。
[0015] 因此，本发明的目的是一种组合物，其包含表达TMA甲基转移酶的微生物。根据上述定义，这种微生物能在存在氢气的上述人体器官或腔室环境内，进行三甲胺(TMA)的代谢。所述组合物可用作一种药物，用来处理、降低或者抑制人体器官和腔室中的TMA，和/或用来治疗以存在TMA为特征的或由于其存在而引起的任何病变、烦恼或紊乱。
[0016] 根据本发明所述的一种组合物，其包含表达TMA甲基转移酶的微生物，在至少一个包含可生成TMA的菌群的人体腔中，所述TMA甲基转移酶能够在存在氢气的条件下进行TMA的代谢，因此可用作处理、降低或抑制人体腔内的TMA水平的药物。
[0017] 根据第一方面，本发明涉及一种组合物，其包含表达TMA甲基转移酶的微生物，能在存在氢气的肠道环境内进行TMA(TMA)的代谢，因此可用作降低或抑制肠道和/或肝脏内的TMA水平的药物。
[0018] 更具体地，在第一个实施例中，所述应用旨在治疗三甲胺尿症。接受治疗的患者存在TMA代谢缺陷，特别是指那些缺少活化FMO3酶的人群。
[0019] 在第二个实施例中，所述应用旨在降低肝脏内TMA代谢物的水平，即TMAO，尤其是血浆中的TMAO。这种应用的目的还在于可能防止动脉粥样化斑块的形成和/或预防心血管疾病。目标患者或者是有能力进行TMA的代谢的患者，或者是存在TMA代谢缺陷但是通过药物可以重建TMA转化为TMAO代谢通路的患者。例如，如果在TMA代谢通路的上游应用本发明的所述组合物，就可以限制肝脏生成TMAO。
[0020] 根据本发明所述组合物的应用，TMA代谢缺陷型患者有可能将下面这两种效果结合起来，一是进行TMA的代谢或治疗三甲胺尿症，二是降低血浆TMAO含量，防止形成动脉粥样化斑块和/或预防心血管疾病。
[0021] 本发明的目的还在于一种组合物，其包含表达TMA甲基转移酶的微生物，能在存在氢气的肠道环境内代谢三甲胺(TMA)，用于治疗三甲胺尿症。
[0022] 因此，本发明的目的还在于一种组合物，其包含表达TMA甲基转移酶的微生物，能在存在氢气的肠道环境内进行三甲胺(TMA)的代谢，用作降低血浆TMAO水平，防止形成动脉粥样化斑块和/或预防心血管疾病的药物。
[0023] 根据第二方面，本发明涉及一种组合物，其包含表达TMA甲基转移酶的微生物，能在存在氢气的阴道环境内代谢三甲胺(TMA)，目的是处理、降低或抑制存在于阴道内或阴道分泌液中的TMA。
[0024] 特别地，尽管不希望受理论的限制，人们相信存在于阴道内或阴道分泌液中的TMA来源于阴道菌群对化合物的转化，该化合物包含一个含氮基团，而该含氮基团会被三个甲基取代。
[0025] 在一个实施例中，所述应用旨在处理细菌性阴道炎发生时的阴道分泌液，以及减少或抑制该阴道分泌液中因包含TMA而产生的腥臭味。
[0026] 本发明的目的是保证所述的微生物能进行TMA的代谢，更优选地，将TMA的甲基转移给其它分子。
[0027] 在一个实施例中，所述微生物还能表达类咕啉蛋白，该类咕啉蛋白可作为甲基受体。特别地，所述类咕啉蛋白是可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白。
[0028] 在一个实施例中，所述组合物包括含有编码TMA甲基转移酶基因的微生物，该基因包括序列1(SEQ ID NO:1)或序列2(SEQ ID NO:2)，或者是与其序列一致性高于90％的等同序列(编码能够作用于TMA的具有甲基转移酶活性的基因序列)，尤其是与序列1或序列2的一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的基因序列。
[0029] 在一个实施例中，所述组合物包括含有编码TMA甲基转移酶基因的微生物，该基因包括序列3(SEQ ID NO:3)或序列4(SEQ ID NO:4)，或者是与其序列一致性高于90％的等同序列(编码能够作用于TMA的具有甲基转移酶活性的基因序列)，尤其是与序列3或序列4的一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的基因序列。
[0030] 在一个实施例中，所述组合物包括含有编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因的微生物，该基因包括序列5(SEQ ID NO:5)或序列6(SEQ ID NO:6)，或者是与其序列一致性高于90％的等同序列(在甲基转移酶作用下，编码能捕获TMA的甲基并接受甲基基团的类咕啉蛋白的基因序列)，尤其是与序列5或序列6的一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的基因序列。
[0031] 在一个实施例中，所述组合物包括含有编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因的微生物，该基因包括序列7(SEQ ID NO:7)或序列8(SEQ ID NO:8)，或者是与其序列一致性高于90％的等同序列(在甲基转移酶作用下，编码能捕获TMA的甲基并接受甲基基团的类咕啉蛋白的基因序列)，尤其是与序列7或序列8的一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0032] 在一个实施例中，所述组合物包括含有编码TMA甲基转移酶基因的微生物，该基因包括序列1(SEQ ID NO:1)或如上所述的序列1的等同序列，还包含编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因序列，其包括序列5(SEQ ID NO:5)或如上所述的序列5的等同序列。
[0033] 在一个实施例中，所述组合物包括含有编码TMA甲基转移酶基因的微生物，该基因包括序列2(SEQ ID NO:2)或如上所述的序列2的等同序列，还包含编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因序列，其包括序列6(SEQ ID NO:6)或如上所述的序列6的等同序列。
[0034] 在一个实施例中，所述组合物包括含有编码TMA甲基转移酶基因的微生物，该基因包括序列3(SEQ ID NO:3)或如上所述的序列3的等同序列，还包含编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因序列，其包括序列7(SEQ ID NO:7)或如上所述的序列7的等同序列。
[0035] 在一个实施例中，所述组合物包括含有编码TMA甲基转移酶基因的微生物，该基因包括序列4(SEQ ID NO:4)或如上所述的序列4的等同序列，还包含编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因序列，其包括序列8(SEQ ID NO:8)或如上所述的序列8的等同序列。
[0036] 在一个实施例中，所述微生物还包含耐胆盐的基因，优选的是编码胆盐水解酶的基因，例如编码胆酰甘氨酸水解酶的基因。
[0037] 在一个实施例中，所述胆酰甘氨酸水解酶的编码基因包括序列9(SEQ ID NO:9)或对胆盐具有水解酶活性的等同序列，其与序列9的序列一致性高于90％，尤其是一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施例中，所述胆酰甘氨酸水解酶的编码基因包括序列10(SEQ ID NO:10)或对胆盐具有水解酶活性的等同序列，其与序列10的序列一致性高于90％，尤其是一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0038] 在一个实施例中，所述组合物包括含有编码TMA甲基转移酶基因的微生物，该基因包括序列1(SEQ ID NO:1)或如上所述的序列1的等同序列，还包括编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因序列，该基因包括序列5(SEQ ID NO:5)或如上所述的序列5的等同序列，以及编码胆酰甘氨酸水解酶的基因，该基因包含序列9或如上所述的序列9的等同序列。
[0039] 在一个实施例中，所述组合物包括含有编码TMA甲基转移酶基因的微生物，该基因包括序列3(SEQ ID NO:3)或如上所述的序列3的等同序列，还包括编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因序列，该基因包括序列7(SEQ ID NO:7)或如上所述的序列7的等同序列，以及编码胆酰甘氨酸水解酶的基因，该基因包含序列10或如上所述的序列10的等同序列。
[0040] 根据优选的实施例所述，这些组合物中所述的微生物是产甲烷古菌，尤其是人源性或动物源性的产甲烷古菌，优选人源性产甲烷古菌。
[0041] 在一个实施例中，所述微生物是产甲烷古菌，其16S RNA由DNA序列中序列11编码(经发明人鉴定为菌株1)或与序列11的一致性高于85％的序列编码，主要是一致性高于90％的序列，尤其是达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列。这种微生物包含编码TMA甲基转移酶的基因，该基因包括序列1(SEQ ID NO:1)或如上所述的序列1的等同序列，还包括编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因，该基因包括序列5(SEQ ID NO:5)或如上所述的序列5的等同序列，以及编码胆酰甘氨酸水解酶的基因，该基因包含序列9或如上所述的序列9的等同序列。这种微生物包含编码TMA甲基转移酶的基因，该基因包括序列3(SEQ ID NO:3)或如上所述的序列3的等同序列，还包括编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因，该基因包括序列7(SEQ ID NO:7)或如上所述的序列7的等同序列，以及编码胆酰甘氨酸水解酶的基因，该基因包含序列10或如上所述的序列10的等同序列。这个菌株的基因组，本文中称为Methanomethylophilus alvus，参见序列13。
[0042] 在一个实施例中，所述微生物是产甲烷古菌，其16S RNA由DNA序列中序列12编码(即上述由Dridi提及的菌株2，以保藏号25720保藏于德国微生物菌种保藏中心；或以保藏号P135保藏于法国菌种保藏中心CSUR)或与序列12的一致性高于85％的序列，优选一致性高于90％的序列，尤其是达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列。这种微生物包含编码TMA甲基转移酶的基因，该基因包括序列2(SEQ ID NO:2)或如上所述的序列2的等同序列，还包括编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白的基因，该基因包括序列6(SEQ ID NO:6)或如上所述的序列6的等同序列。这种微生物包含编码TMA甲基转移酶的基因，该基因包括序列4(SEQ ID NO:4)或如上所述的序列
4的等同序列，还包括编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因，该基因包括序列8(SEQ ID NO:8)或如上所述的序列8的等同序列。在一个实施例中，所述组合物包含鲁米叶甲烷马赛里球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)菌株，以保藏号25720保藏于DSMZ(地址是德国布伦瑞克市，银河池大街7B(Inhoffenstraβe 7B)，邮编38124)。
4的等同序列，还包括编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因，该基因包括序列8(SEQ ID NO:8)或如上所述的序列8的等同序列。在一个实施例中，所述组合物包含鲁米叶甲烷马赛里球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)菌株，以保藏号25720保藏于DSMZ(地址是德国布伦瑞克市，银河池大街7B(Inhoffenstraβe 7B)，邮编38124)。
[0043] 另一种可选的原位降低TMA含量的方法是应用基因改造生物，特别是重组菌。为了做到行之有效，这些细菌应该同时包含编码MttB蛋白(用于TMA的脱甲基化)的基因和编码MttC蛋白(类咕啉蛋白，在MttB蛋白作用下，接受从TMA转移来的甲基基团)的基因。活化MttB蛋白的表达需要其内部包含吡咯赖氨酸。为此，所述重组生物还应该具备以下功能，(i)能合成吡咯赖氨酸；以及(ii)在重组MttB蛋白翻译过程中，能插入该氨基酸，这个过程可通过插入扩展遗传密码的专用盒来实现。因此，该基因改造的生物包含：
[0044] ------编码类咕啉蛋白(比如序列5或6)的全部或部分的mttC基因(比如序列7或8)；
[0045] ------编码MttB蛋白(比如序列1或2)的全部或部分的mttB基因(比如序列3或4)。此基因或其编码区基因的阅读框被终止密码子从中阻断(理想情况下，终止密码子为UGA(琥珀密码子))正如本文中所述的菌株1和菌株2(鲁米叶甲烷马赛里球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)和Ca.methanomethylophilus alvus)中所展示的天然状态。
[0046] ------用于合成吡咯赖氨酸的基因：这些基因包含在pyl操纵子内，具体来说涉及pylB、pylC和pylD基因(也被称为pylBCD)，它们分别编码赖氨酸变位酶/脯氨酸-2甲基化酶，吡咯赖氨酸合成酶，和脯氨酸还原酶/吡咯赖氨酸合成酶。这些编码酶蛋白能将两个赖氨酸合成吡咯赖氨酸。
[0047] ------编码终止密码子对应的转运RNA抑制子(tRNA抑制子)(理想情况下，应该是UGA密码子对应的tRNA抑制子，即带有反密码子TCA的tRNA)的基因。理想情况下，所述两种微生物(鲁米叶甲烷马赛里球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)和Ca.methanomethylophilus alvus)中任一种也包含该基因，被称为pylT。
[0048] ------编码氨酰tRNA合成酶的基因，用于将合适的氨基酸结合到相应的tRNA分子上，在这种情况下，由pylS基因编码的吡咯赖氨酸tRNA合成酶是必需的。
[0049] 提到微生物，就有可能应用大肠杆菌进行研究。重组大肠杆菌(E.col i)菌株包含mttB、mttC、pylBCD、pylT和pylS基因。因此，此菌株能表达合成吡咯赖氨酸所需的蛋白。这种吡咯赖氨酸在吡咯赖氨酸tRNA合成酶的作用下结合到特定的tRNA分子上(Pyl琥珀型tRNA(Pyl amber tRNA)，其由pylT基因编码)。此外，这种类型的基因改造生物也曾被一些论文提及(Longstaff等人，2007年《美国国家科学院院刊》第104卷第3期，第1021-1026页："一种天然的遗传密码扩展盒启动可传递性生物合成与吡咯赖氨酸的遗传编码，(a natural genetic code expansion cassette enables transmissible biosynthesis and genetic encoding of pyrrolysine)"；Namy等人，2007年《欧洲生物学化学会联盟通讯》第581卷第27期，第5285-5288页:"将吡咯赖氨酸加入到大肠杆菌的遗传密码，(Adding pyrrolysine to the Escherichia coli genetic code)")，这种菌株是可以存活的，只要此mRNA在其阅读框中包含琥珀终止密码子，就能在这些蛋白中插入吡咯赖氨酸。
[0050] 这种重组大肠杆菌(E.coli)还表达mttB基因，其内部阅读框被琥珀终止密码子阻断(以古菌的mttB基因为例)。然后，此密码子被该重组菌株识别为琥珀型-Pyl密码子(amber-Pylcodon)，从而可以获得一种内部插入吡咯赖氨酸的蛋白，该蛋白具有酶活性。此方法模仿了甲醇营养型产甲烷微生物(methylotrophic methanogenic microorganisms)在天然状态下蛋白合成过程，比如甲烷八叠球菌(Methanosarcinales)。而且，此方法被证明对于醋酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)的mtmB1基因是可行的，该基因内部包含琥珀密码子，用于编码吡咯赖氨酸。mtmB1基因编码的蛋白(一甲铵甲基转移酶)可在表达pylBCD、pylS和pylT的大肠杆菌菌株中表达，其包含吡咯赖氨酸(Longstaff等人的上述引文；Namy等人的上述引文)。这种方法也能以同样的方式适用于MttB。合成的MttB包含吡咯赖氨酸，进而通过将甲基转移至受体蛋白(mttC基因编码的类咕啉蛋白)，催化TMA脱甲基变为二甲胺(DMA)，从而降低TMA浓度。
[0051] 再提到微生物，还可以用乳酸杆菌进行研究。利用对革兰氏阳性细菌特异性的细菌转化载体和技术，按照大肠杆菌研究中所述的相同原理对乳酸杆菌进行改造(比如参见Berthier等人发表于1996年《微生物学》第142期，第1273-1279页或Alegre等人发表于2006年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》第241卷第1期，第73-77页)。在此框架下，基因改造的微生物可直接来自天然共生宿主，即，人的肠道和阴道，对于其中的一部分来说，它们也能呈现出菌的初始活性。
[0052] 在一个实施例中，本发明所述天然或重组微生物是活的微生物。
[0053] 在其它实施例中，这些微生物可能被杀灭或者灭活。
[0054] 根据本发明所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体或辅料。
[0055] 在一个实施例中，所述组合物是一种培养液提取物，优选为浓缩提取物。尤其是使用活微生物的浓缩提取物。
[0056] 在一个实施例中，根据本发明的组合物或该组合物中作为活性组分的提取物包括大量微生物，主要由或者完全由根据本发明的产甲烷微生物组成。所述组合物可包含一个菌种或单一菌株的产甲烷微生物，或者至少包含两个不同菌种或菌株的产甲烷微生物。
[0057] 在另一个实施例中，根据本发明的组合物或该组合物中作为活性组分的提取物包括大量微生物，这些微生物包含至少单一菌种或单一菌株的产甲烷微生物，以及一种或多种其它微生物，其主要是来源于微生物培养。根据本发明的组合物可包含单一菌种或单一菌株的产甲烷微生物，或者至少包含两个不同菌种或菌株的产甲烷微生物。
[0058] 在第一个实施例中，所述微生物是经过冷冻干燥的，该冷冻干燥是通过标准技术实现的。从而所述组合物可包含辅料和/或冷冻干燥标准稳定剂，或其它任意有益添加剂。
[0060] －一方面，从天然生成MttB和MttC的微生物中纯化这些蛋白，例如甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)中的产甲烷古菌或与热原体目(Thermoplasmatales)相关的产甲烷菌，例如可在体外培养的鲁米叶甲烷马赛里球菌(M.luminyensis)和Ca.M.alvus。这些微生物也可以是其它类型的细菌，可在天然状态下编码吡咯赖氨酸、含吡咯赖氨酸的MttB、MttC，并可在体外培养，例如，阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)、脱卤脱亚硫酸菌(D.dehalogenans)或沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)。迄今为止，已知的这类微生物的列表可参见Prat等人发表在2012年，《美国国家科学院院刊》，第109卷51期，第1070-1075页，以及这篇论文的附加文件。
[0061] －另一方面，从重组微生物中纯化这些蛋白。通过使用外源蛋白合成和分泌系统，还可使这种生产/纯化更加便利。这个过程可在微生物中进行，比如上述的那些微生物(大肠杆菌或乳酸杆菌)，以便构建联合生成吡咯赖氨酸的表达系统，用于把吡咯赖氨酸引入到琥珀密码子和表达含吡咯赖氨酸的MttB蛋白。而且，MttC蛋白的生成可在另一种生物中并行进行。
[0062] －将这两种方法结合到一起，一方面是为了获得含吡咯赖氨酸的活化MttB蛋白，另一方面是为了获得类咕啉蛋白MttC。
[0063] 因此，本发明涉及一种包含TMA甲基转移酶的组合物，尤其是MttB蛋白，优选包含序列1、序列2或其等同序列(编码能够作用于TMA的具有甲基转移酶活性的基因序列)的MttB蛋白，其中，该等同序列与序列1或序列2的一致性高于90％，尤其是一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0064] 本发明还涉及可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白，其包含序列5、序列6或其等同序列(在甲基转移酶作用下，编码能捕获TMA的甲基并接受甲基基团的类咕啉蛋白的基因序列)，其中的等同序列与序列5或序列6的一致性高于90％，尤其是一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0065] 或者，相同的所述组合物包含这两种蛋白。
[0066] 再或者，这种组合物可做成包含这两种组合物的套装的形式，分开、同时或者连续使用。
[0067] 因此，根据所选靶点、肠道递送(考虑到耐胃性的载体)、直肠或阴道递送，所得到的蛋白涉及适当的盖仑制剂体系。原位递送后，活化的MttB蛋白通过脱甲基化作用将TMA转变为DMA，脱掉的甲基基团随后可被转移给MttC蛋白。这个过程再次激活了MttB蛋白，催化TMA继续脱掉第二个甲基，导致TMA的含量降低。
[0068] 本发明所述组合物还可适应接受治疗的腔室或器官而调整为不同的形式。这些组合物包含合适的载体或辅料，和/或与盖仑制剂相关或作为其中的一部分，以便适应不同的给药途径。
[0069] 在第一个实施例中，所述组合物优选为经口给药的剂型。
[0070] 尤其是对于肠道而言，这种口服剂型优选为包含肠内吸收剂型，尤其是肠溶胶囊、肠溶明胶胶囊或肠溶片，其包括具有保护作用的肠溶包衣以及包囊，例如微胶囊，或者是将这些方法其中的至少两种结合起来，只要其中的一种发挥肠溶保护作用即可。术语“肠溶”是指给药剂型对这种组合物提供保护作用，直到到达肠道才能溶解。例如，所述组合物，尤其是微生物的冷冻干燥物，可以使用保护剂包裹上一层涂层，特别地，保护剂通常选取蛋白、多糖、树胶和其它一些肠溶包衣材料。在一实施例中，根据专利EP1514553的技术教导制备了一种双涂层。
[0071] 给药剂型还可以为适应体内腔室(例如阴道)直接给药而调整，比如阴道栓剂剂型。
[0072] 给药剂型还可以为适应经直肠给药的途径而调整，例如栓剂或类似剂型。
[0073] 在这个实施例中，根据本发明所述的组合物包含10-1013个微生物。
[0074] 本发明的目的还在于一种治疗方法，旨在降低需帮助患者体内的TMA水平。
[0075] 因此，本发明的目的是一种降低或抑制腔室或人体器官内TMA水平的方法，尤其是肠道、阴道和/或肝脏，它包含给予需帮助患者足量的本发明的组合物，该组合物包含表达TMA甲基转移酶或此类酶的微生物。这种微生物通过表达这类酶或者直接加入这类酶，能在存在氢气的腔室内，尤其是在肠道或者阴道内，代谢三甲胺(TMA)。优选地，该微生物还表达一种能接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白，或者还直接包括这种蛋白。同样优选地，这种微生物还表达胆盐水解酶，尤其是胆酰甘氨酸水解酶。在一个实施例中，所述组合物包含产甲烷古菌，尤其是Methanomethylophilus alvus或鲁米叶甲烷马赛里球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)。
[0076] 在第一个实施例中，本发明涉及一种治疗三甲胺尿症的方法。接受治疗的患者存在TMA代谢能力缺陷，特别是指缺少活化FMO3酶。
[0077] 在第二个实施例中，本发明涉及一种用来降低肝脏内TMA代谢物(TMAO)水平的方法，尤其是血浆中的TMAO。该方法的目的还在于可能防止动脉粥样化斑块的形成和/或预防心血管疾病。目标患者或者是有能力进行TMA的代谢的患者，或者是存在TMA代谢缺陷但是通过药物可以重建TMA转化为TMAO代谢通路的患者。例如，如果在TMA代谢通路的上游应用本发明的所述组合物，就可以限制肝脏生成TMAO。
[0078] TMA代谢缺陷型患者中所用的这种方法，是将下面这两种效果结合起来，一是进行TMA的代谢或治疗三甲胺尿症，二是降低血浆TMAO含量，防止动脉粥样化斑块的形成和/或预防心血管疾病。
[0079] 在第三个实施例中，本发明涉及一种处理细菌性阴道炎发生时的阴道分泌液的方法，此方法的目标尤其在于降低或抑制TMA含量和/或由于存在TMA而产生的腥臭味。
[0080] 在优选的实施例中，所述微生物是活的微生物。
[0081] 在一个实施例中，为了达到预期的治疗效果，即降低TMA水平或者降低TMAO水平，或者是同时降低二者的水平，至少需要给患者服用一次包含足量的微生物或酶的组合物。为了维持预期的治疗效果，适时再给药一次，尤其是在固定的时间间隔，例如每次进餐时服用。
[0082] 在另一实施例中，所述微生物必须是活的。并且可选择至少充足剂量的给药方式，使其能直接达到预期的治疗效果，即降低TMA水平或者降低TMAO水平，或者是同时降低二者的水平，或者选择给予患者接种剂量，使所述微生物在阴道内或肠道内繁殖，进而可能达到预期的治疗效果。
[0083] 在一个实施例中，将所述微生物长期植入肠道内。因此有必要考虑以初始剂量给药一次或多次(比如一到五次)，例如每次进餐时服用，然后，按固定的时间间隔进行补充，或者是在每次肠道疾病之后(腹泻或其它肠道疾病)服用。
[0084] 在另一个实施例中，将所述微生物长期植入阴道内。因此有必要考虑以初始剂量给药一次或多次(比如一到五次)，例如在起床后和/或入睡时服用，然后，按固定的时间间隔进行补充，或者是在每次阴道脱落物出现之后服用。
[0085] 在一个实施例中，根据本发明的微生物、酶和/或受体蛋白的给药，是有关联的。
[0086] 这些治疗方法中使用的所述组合物，可能具有同上所述的不同成熟特征。
[0087] 本发明的目的还在于一种包含产甲烷古菌的培养物，其中的16S RNA由DNA序列中序列11编码(发明人鉴定为菌株1)或与序列11的一致性高于90％的序列编码，尤其是达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列。这种微生物包含编码TMA甲基转移酶的基因，这种基因包括序列1(SEQ ID NO:1)或如上所述的序列1的等同序列，还包括编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因序列，该基因包括序列5(SEQ ID NO:5)或如上所述的序列5的等同序列，以及编码胆酰甘氨酸水解酶的基因，此基因包含序列9或如上所述的序列9的等同序列。这种微生物包含编码TMA甲基转移酶的基因，该基因包括序列3(SEQ ID NO:3)或如上所述的序列3的等同序列，还包括一种编码可以接受从TMA转移来的甲基基团的类咕啉蛋白基因序列，该基因包括序列7(SEQ ID NO:7)或如上所述的序列7的等同序列，以及编码胆酰甘氨酸水解酶的基因，此基因包含序列10或如上所述的序列10的等同序列。这个菌株的基因组，本文中称为Methanomethylophilus alvus，参见序列13。
[0088] 所述培养物可对应一组微生物，例如来自于人或动物粪便的培养，尤其包括Methanomethylophilus alvus，优选地，该微生物在这组微生物中所占比例超过10％，更优选地，超过20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。尤其是在人类中最常见的产甲烷菌株(史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)和斯氏甲烷球形菌(Methanosphaera stadtmanae)中的产甲烷杆菌)中，这种微生物所占比例超过10％，优选所占比例超过20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
[0089] 所述培养物还可以是Methanomethylophilus alvus的单一培养物。
[0090] 所述培养物包括合适的载体，并且在厌氧条件下进行培养。
[0092]
[0093] 下面将用实施例的方式对本发明进行更详细的描述，但本发明包括而不仅仅限于这些实施例。
[0094] 实验例1：分离和培养消耗TMA的产甲烷古菌的方法：
[0095] 1.1.分子检测方法：
[0096] 分子生物学方法为消耗TMA的产甲烷古菌(本文中称为甲烷嗜甲基菌(Methanomethylophilales))检测和区分提供了可能性。第一步，利用上述的菌株1和菌株
2中的16S RNA进行产甲烷古菌的检测，或者是用适当的引物对编码16S RNA的DNA序列进行检测。第二步(如果已经完成分类，也可称为第一步)，检测是否存在mttb(或mttB)基因，可选地，还可以选择进一步检测mttc(或mttC)基因或。用于检测mttb基因的引物如下所示：
2中的16S RNA进行产甲烷古菌的检测，或者是用适当的引物对编码16S RNA的DNA序列进行检测。第二步(如果已经完成分类，也可称为第一步)，检测是否存在mttb(或mttB)基因，可选地，还可以选择进一步检测mttc(或mttC)基因或。用于检测mttb基因的引物如下所示：
[0097] 正向引物：序列14：GCACTTCCACCACATCG
[0098] 反向引物：序列15：AGCTGRGACAGRACGAT
[0099] 其中的R对应的是嘌呤碱基，即鸟嘌呤G或腺嘌呤A
[0100] 扩增子：270-300bp
[0101] 1.2.培养、富集和分离方法
[0102] 最初是从人的新鲜粪便中进行培养/分离，利用上述分子检测技术(按照粪便DNA基因组提取试剂盒(QIAGen DNA Stool Kit)提供的标准方法，从这些粪便中提取DNA)已证实这类人群体内通常存在产甲烷微生物，特别是甲烷嗜甲基菌(Methanomethylophilales)。或者，按照相同方法检测是否存在甲烷嗜甲基菌(Methanomethylophilales)可与细菌培养同时进行。
[0103] 所有的操作都在无菌条件下进行，并严格按照厌氧(通入氮气流)操作技术。这些粪便一旦回收后要立即进行处理，也可放在密闭的容器内，4℃保存几个小时再进行处理，这样，开始就是厌氧环境，这对实验结果以及样品中产甲烷微生物的存活没有明显影响。
[0104] 使用1ml胰岛素注射器可以回收大约500-600mg粪便，终产物体积降到约0.4ml。在60ml的抗生素玻璃瓶中，其为H2/CO2气体环境(80/20,压强为2atm)或N2气体环境(初始浓度为100％，压强为2atm)，把它们放入适用于产甲烷微生物的10ml DSMZ 141培养基(产甲烷微生物培养基)中。
[0105] 为了加快甲烷嗜甲基菌(Methanomethylophilales)的繁殖，从而富集培养基中的一组微生物，在试管内还要加入下列试剂：
[0106] ●这组微生物的特异性底物，即甲醇(终浓度80mM)；
[0107] ●或者天然来源的物质，即果胶，果胶可在人类结肠中被该组中的其它微生物水解(可能是甲烷嗜甲基菌(Methanomethylophilales))，尤其是为了获得甲醇；
[0108] ● 多 种 抗 生 素，比 如 100mg/l的 杆 菌 肽 (bacitracin) 或 甲 硝 唑(metronidazole))；如上所述，Dridi等人已经揭示了鲁米叶甲烷马赛里球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)对几种抗生素(杆菌肽(bacitracin)、甲硝唑(metronidazole)、奥硝唑(ordinazole)、鲨烯胺(squalamine))产生了抗性。
[0109] 接着，培养在37℃开始进行，并轻轻搅动，在此过程中用定量PCR进行持续监测，优选为按日监测。根据甲烷嗜甲基菌(Methanomethylophilales)中的不同类型菌株，可观察到不同的倍增时间，可相差1到3倍，或更大。比如，曾经遇到这样的情况，一名患者携带Methanomethylophilus alvus，是从粪便标本接种就开始描述，这名患者的粪便标本培养开始时(零时)，每毫升史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)(Mbs)培养物中包6
含10个拷贝数的16SrRNA基因，高出M.alvus(Mx)10倍，甚至也比细菌高10倍。在培养开始的前几天里，使用的是标准培养基，未添加果胶或者甲醇，Mbs和某些细菌繁殖很快，在Mx生长繁殖进入稳定期和趋于停滞之前，取代了Mx，使其水平处于标本初始状态。通过加入甲醇或能产生甲醇的底物果胶，可以提高Mx的水平，就像培养第20天出现的状况：随着培养时间的延长，与细菌和Mbs比较，Mx所占比例迅速提高。这种方法是可以重复的，监测期间(优选每日监测)，有可能利用甲醇/果胶来确定移植这组微生物或者只是补加培养基的最佳时间，比如从第20天开始出现的平台期。富集培养若干周期之后，通过取出这组液体培养基中的克隆进行单独培养，就有可能实现从混合物中分离Mx菌株。这个过程所用的方法称为“滚管技术”，即在厌氧环境下从DSMZ 141和琼脂培养基中分离菌落，该培养基中包含甲醇(无氧气体，至少包含氢气)。在这种固体培养物中，第一批出现(第1周)的菌落不是目标菌株Mx。随后，第二批小菌落出现了(主要是培养2到3周后)，经过回收后挑选单个菌落单独接种在包含DSMZ-141培养基的培养管内。同时，通过定量PCR来确定移植克隆是否是Mx。如果结果是阳性的，即成功完成分离，根据Mx在141液体培养基(添加甲醇并处于H2/CO2气体环境)中的生长速率，进行培养物的移植。分离菌株的纯度随后可进行鉴定，可通过再次重复上述方法(根据滚管技术分离固体培养基中的菌落)或者是通过分析扩增子定量PCR中建立的溶解曲线，或者是进一步对16S扩增子进行测序。
含10个拷贝数的16SrRNA基因，高出M.alvus(Mx)10倍，甚至也比细菌高10倍。在培养开始的前几天里，使用的是标准培养基，未添加果胶或者甲醇，Mbs和某些细菌繁殖很快，在Mx生长繁殖进入稳定期和趋于停滞之前，取代了Mx，使其水平处于标本初始状态。通过加入甲醇或能产生甲醇的底物果胶，可以提高Mx的水平，就像培养第20天出现的状况：随着培养时间的延长，与细菌和Mbs比较，Mx所占比例迅速提高。这种方法是可以重复的，监测期间(优选每日监测)，有可能利用甲醇/果胶来确定移植这组微生物或者只是补加培养基的最佳时间，比如从第20天开始出现的平台期。富集培养若干周期之后，通过取出这组液体培养基中的克隆进行单独培养，就有可能实现从混合物中分离Mx菌株。这个过程所用的方法称为“滚管技术”，即在厌氧环境下从DSMZ 141和琼脂培养基中分离菌落，该培养基中包含甲醇(无氧气体，至少包含氢气)。在这种固体培养物中，第一批出现(第1周)的菌落不是目标菌株Mx。随后，第二批小菌落出现了(主要是培养2到3周后)，经过回收后挑选单个菌落单独接种在包含DSMZ-141培养基的培养管内。同时，通过定量PCR来确定移植克隆是否是Mx。如果结果是阳性的，即成功完成分离，根据Mx在141液体培养基(添加甲醇并处于H2/CO2气体环境)中的生长速率，进行培养物的移植。分离菌株的纯度随后可进行鉴定，可通过再次重复上述方法(根据滚管技术分离固体培养基中的菌落)或者是通过分析扩增子定量PCR中建立的溶解曲线，或者是进一步对16S扩增子进行测序。
[0110] 1.3.快速定量培养的原核细胞系的程序
[0111] 这个程序可同时用于以下菌种，甲烷嗜甲基菌目或Mmp(Mx＝M.alvus、M.luminyensis、其它菌种)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)(Mbac,比如史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)或斯氏甲烷球形菌(Methanosphaera stadtmanae))、以及富集培养物中的总细菌(Bac)，目的是为了确定M.alvus的最佳生长环境。
[0112] -方法：
[0113] 高温和渗透压冲击下裂解小份培养物(0.1-0.2ml)；
[0114] 通过离心和稀释上清液来降低PCR抑制物的浓度；
[0115] 对定量PCR中所关注的组分进行定量；
[0116] 定量校正范围于实验前建立，主要在于PCR的扩增子，这些扩增子用上述的引物制备，并按照标准方法进行纯化和定量。
[0117] -仪器和设备：
[0118] 离心机(温度设置为4℃)；
[0119] 热混合器(温度设置为99℃)；
[0120] 温度循环控制仪。
[0121] -Mmp、Mbac和Bac引物：
[0122] MxF(AS-05_Fw；77):ggg gTA ggg gTA AAA TCC TG(SEQ ID NO:16)
[0123] MxR(AS-06_Rv；78):Cgg ggT ATC TAA TCC CgT TT(SEQ ID NO:17)
[0124] MbacF(MbS-01_Fw；75):gCg AAC Cgg ATT AgA TAC CC(SEQ ID NO:18)[0125] MbacR(MbS-02_Rv；76):AgT CTT gCg ACC gTA CTT CC(SEQ ID NO:19)[0126] BacF(ES-06_Fw；71):ACT CCT ACg ggA ggC Ag(SEQ ID NO:20)
[0127] BacR(ES-07_Rv；72):gTA TTA CCg Cgg CTg CTg(SEQ ID NO:21)
[0128] 注释：MxF和MxR引物的目的基因都存在于与M.alvus相近的甲烷嗜甲基菌目细菌内，也存在于与鲁米叶甲烷马赛里球菌(M.luminyensis)相近的甲烷嗜甲基菌(Methanomethylophilales)内。通过观察溶解曲线，有可能确定这些细胞系中哪种能以定量的方式控制另外一种(或者是否存在共显性)：M.alvus的扩增子溶解温度大约是84℃，而鲁米叶甲烷马赛里球菌(M.luminyensis)中的溶解温度处于85.5℃附近。目前还没有对产甲烷杆菌这种溶解温度的差异做出明确的解释。
[0129] -混合溶液的组成：
[0130] 使用Eurogentec公司的荧光定量PCR试剂盒(MESA GREEN qPCR Master Mix)。
[0131]混合溶液 体积(μl)
终体积 18
预混液 9
正向引物 0.8
反向引物 0.8
H2O 5.4
gDNA 2
终体积 18
预混液 9
正向引物 0.8
反向引物 0.8
H2O 5.4
gDNA 2
[0132] ------用上述引物进行定量PCR的反应条件：
[0133] 第一步：
[0134] 95℃加热10min；
[0135] 第二步：
[0136] 95℃持续30s；
[0137] 59℃持续20s；
[0138] 72℃持续30s；
[0139] 80℃持续20s→荧光读数；
[0140] 第三步(溶解曲线，参考所用仪器)：
[0141] 95℃加热1min；
[0142] 59℃孵育30s；
[0143] 95℃加热30s；
[0144] 注释：80℃时进行读数，以便非特异性结合的双链DNA在读数前完成变性(76℃)。
[0145] ------加热法提取DNA以及定量PCR实验前准备工作
[0146] ------吸取体积稍微大于100μl的培养物加入到一个Eppendorf微量离心管中(使用1ml注射器，针头型号23G，穿过厌氧培养管的隔膜)；
[0147] ------将100μl的此标本(用移液器P100)转移到另外一个管中；
[0148] ------16,000g、4℃离心10min，这一步用来沉淀细胞，去除培养基中的抑制物；
[0149] ------离心时，在1.5ml Eppendorf微量离心管中加入90μl超纯水；
[0150] ------倾去上清液，再加入100μl蒸馏水；这可能除去死细胞中的游离DNA、PCR抑制物，产生渗透压冲击作用从而裂解细胞；
[0151] ------加入一刮铲规格为0.2μm玻璃珠，涡旋5秒；
[0152] ------将混合液加入热混合器中，99℃静置加热3min，然后1,400rpm离心7min，接着静置10min，从而加热裂解细胞；
[0153] ------将水与引物混合，准备PCR混合液；
[0154] ------16,000g、4℃离心10min，细胞碎片沉淀下来，而溶解后细胞内容物，包括DNA，保留在上清液中；
[0155] ------在PCR混合液中加入预混液，使之铺在反应盘上；
[0156] ------再吸取10μl上清液加入到干净的离心管内，加入90μl超纯水；
[0157] ------定量之前将这些管置于冰内；
[0159] ------加入gDNA样品，置于反应板上；
[0160] ------确认所有反应孔的盖子都已经关闭；
[0161] ------将反应盘在最高转速500g下离心5s，使混合液落入反应孔的底部；
[0163] 实施例2：组合物的制备
[0164] 实施例1.1中获得的最终培养物包含本发明所述的产甲烷微生物，用来制备一种可服用的组合物。然而，含有促进微生物繁殖的底物甲醇的培养基在存在氢气的厌氧环境下进行培养，可以成批次的制备本发明所述的组合物，因此，这种方法优选用于大量制备所述组合物。所述培养基和培养条件同上所述(DSM 141培养基添加甲醇，置于含有氢气的厌氧气体中)。可选地，所获得的培养物在被添加到肠溶明胶胶囊之前可以进行浓缩和冷冻干燥。
[0165] 实施例3：组合物的制备
[0166] 培养菌株DSM 25720，其培养物可用于成批制备根据本发明所述的组合物。菌株培养条件如下：包含氢气的厌氧环境，培养基内存在包含甲醇的底物(例如DSM 141培养基，其被添加了甲醇并被置于包含氢气的厌氧气体中)。可选地，所获得的培养物在被添加到肠溶明胶胶囊之前可以进行浓缩和冷冻干燥。
[0167] 实施例4：组合物的制备
[0168] 培养菌株DSM 25720，其培养物可用于成批制备根据本发明所述的组合物。菌株培养条件如下：包含氢气的厌氧环境，培养基内存在包含甲醇的底物(例如DSM 141培养基，其被添加了甲醇，置于包含氢气的厌氧气体中)。可选地，所获得的培养物在被添加到阴道栓剂之前可以进行浓缩和冷冻干燥。这些阴道栓剂是一种适于置于阴道内的给药剂型。
[0169] 实施例 5：TMA 存在或不存在条件下，鲁米叶甲烷马赛里球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)菌株的纯培养
[0170] ------培养基组成
[0172] 微量元素水溶液的组成：
[0173]蒸馏水 1000ml
氮三乙酸 1.5g
水合硫酸镁(MnSO4.H2O) 0.5g
七水硫酸亚铁(FeSO4.7H2O) 100mg
七水硫酸钴(CoSO4.7H2O) 180mg
七水硫酸锌(ZnSO4.7H2O) 180mg
五水硫酸铜(CuSO4.5H2O) 10mg
十二水硫酸铝钾(KAl(SO4)2.12H2O) 20mg
硼酸(H3BO3) 10mg
二水钼酸钠(Na2MoO4.2H2O) 10mg
六水氯化镍(NiCl2.6H2O) 30mg
亚硒酸钠(Na2SeO3.5H2O) 30mg
氮三乙酸 1.5g
水合硫酸镁(MnSO4.H2O) 0.5g
七水硫酸亚铁(FeSO4.7H2O) 100mg
七水硫酸钴(CoSO4.7H2O) 180mg
七水硫酸锌(ZnSO4.7H2O) 180mg
五水硫酸铜(CuSO4.5H2O) 10mg
十二水硫酸铝钾(KAl(SO4)2.12H2O) 20mg
硼酸(H3BO3) 10mg
二水钼酸钠(Na2MoO4.2H2O) 10mg
六水氯化镍(NiCl2.6H2O) 30mg
亚硒酸钠(Na2SeO3.5H2O) 30mg
[0174] 表1：微量元素水溶液的组成
[0175] 常温常压下，按照表1所示的比例将这些化合物混合，加蒸馏水至1000ml，从而配制成这种微量元素水溶液。
[0176] 维生素水溶液的组成：
[0177]蒸馏水 1000ml
生物素 2mg
叶酸 2mg
盐酸吡哆醇 10mg
二水合盐酸硫胺 5mg
核黄素 5mg
烟酸 5mg
泛酸 5mg
维生素B12 0.1mg
氨基苯甲酸(维生素L) 5mg
硫辛酸 5mg
生物素 2mg
叶酸 2mg
盐酸吡哆醇 10mg
二水合盐酸硫胺 5mg
核黄素 5mg
烟酸 5mg
泛酸 5mg
维生素B12 0.1mg
氨基苯甲酸(维生素L) 5mg
硫辛酸 5mg
[0178] 表2：维生素水溶液的组成
[0179] 常温常压下，按照表2所示的比例将这些化合物混合，加蒸馏水至1000ml，从而配制成这种维生素水溶液。
[0180] 脂肪酸水溶液的组成：
[0181]蒸馏水 20ml
正戊酸 0.53ml
异戊酸 0.53ml
2-甲基丁酸 0.53ml
异丁酸 0.53ml
正戊酸 0.53ml
异戊酸 0.53ml
2-甲基丁酸 0.53ml
异丁酸 0.53ml
[0182] 表3：脂肪酸水溶液的组成
[0183] 常温常压下，按照表3所示的比例将这些化合物混合，加蒸馏水至1000ml，从而配制成这种脂肪酸水溶液。
[0184] 培养基的组成：
[0185]
[0186]
[0187] 表4：培养基的组成
[0188] ------制备包含培养基组合物的管
[0189] 将培养基组合物煮沸5min，之后在含氮(N2)的气体中冷却。当温度降至低于50℃时，每升培养基组合物中加入4g碳酸氢钠(NaHCO3)。然后，在氮气环境下将配制成的培养基组合物分别加入到一个个“亨盖特”或“Balch”型的厌氧培养管中，再将这些管置于120℃的高压灭菌器内20min。
[0190] 这些管中的培养基组合物的pH值是7.4。
[0191] ------制备鲁米叶甲烷马赛里球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)菌株的纯培养物
[0192] 三个系列的培养管存在如下差别，培养基气相部分包含或者不含氢气，培养基包含或者不含盐酸三甲胺(TMA.HCl)，据此分别命名为A、B和C，其根据上述初始培养基组分，按照以下方式用培养管制备而成的。
[0193] A、B和C系列的培养管中包含培养基组合物，然后加入0.1ml的无菌硫化钠(Na2S)溶液，浓度为15g/l(0.2M)。从而使每个管中Na2S的终浓度为3.5mM。
[0194] 每个A和B系列的培养管中加入盐酸三甲胺(TMA.HCl)的无氧无菌溶液(0.2ml，浓度为1M)，从而使A和B系列的每个培养管中TMA.HCl的终浓度为35到40mM。
[0195] 将预培养的鲁米叶甲烷马赛里球菌(M.luminyensis)B10菌株(DSM 25270)接种到每个培养管中，使其在所述培养基组合物中的体积比为10％。
[0196] 培养管中的气体开始只包含氮气，后来加入了CO2和H2，因此，所有A、B和C系列的培养管中的气体组成发生了改变，如表5所示。
[0197]
[0198] 表5.无氧气体的组成
[0199] 将A、B和C系列的培养管在37℃孵育，并在此过程中定时监测鲁米叶甲烷马赛里球菌(M.luminyensis)的培养，取样和加药穿插进行，具体操作程序参见下面表6所示的交叉表。
[0200]时间(hours) 0 24 48 72 104149 173197247295388
600nm处的O.D.值 X X X X X X X X X X X
TMA剂量 X X X X
检测CH4 X X X X
检测H2 X X X X
600nm处的O.D.值 X X X X X X X X X X X
TMA剂量 X X X X
检测CH4 X X X X
检测H2 X X X X
[0201] 表6.定时取样和加药程序，从而对A、B和C系列培养管中培养的鲁米叶甲烷马赛里球菌(M.luminyensis)进行监测。
[0202] 对A、B和C系列培养管中培养的鲁米叶甲烷马赛里球菌(M.luminyensis)进行监测，需要测定波长600nm处的光密度值(O.D.)，测定每支管中剩余的三甲胺浓度，测定气相中的氢气(H2)含量以及气相中的甲烷(CH4)含量。
[0203] 氢气(H2)含量的测定结果代表了在(从三甲胺)产甲烷(CH4)过程中消耗的氢气量，也是测定气相中甲烷(CH4)含量的一个指标。
[0204] O.D.值的测定，使我们可以通过比浊法对鲁米叶甲烷马赛里球菌(M.luminyensis)的细胞生长进行定量。
[0205] 对鲁米叶甲烷马赛里球菌(M.luminyensis)培养过程中产生的三甲胺含量进行测定，参考了这篇文献所述的方法，Kratzer等人.(2009年,《细菌学杂志》(Journal of Bacteriology),第191卷 第16期,第 5108-5115页,《在 马氏 甲 烷八叠球菌生长过程中，作用于三甲胺的甲基转移酶转录表达谱》“Transcriptional Profiling of Methyltransferase Genes during Growth of Methanosarcina mazei on Trimethylamine”)，并做了如下调整：
[0206] ------从含有培养物的培养管中，取出200μl培养物，放入第一无菌管内；
[0207] ------将含有200μl培养物的第一无菌管于13,000g离心10min；
[0208] ------在上述管中吸取50μl上清液再放入第二无菌管内；
[0209] ------在含50μl上清液的第二无菌管中，再加入浓度均为20％(m/v)的783μl蒸馏水和125μl碳酸氢钠(NaHCO3)；
[0210] ------在第二无菌管内再加入42μl的福林-西奥卡特(Folin-Ciocalteu)试剂；
[0211] ------将得到的第二无菌管搅拌60min，然后，测定管中溶液在波长745nm处的吸光度，参考相同条件下涵盖浓度范围0-50mM的TMA标准曲线，计算管内溶液所含TMA的含量。
[0212] A、B和C系列培养管中无氧气体的气体组成可通过穿刺隔膜取样2mL气体，用气相色谱进行测定。
[0213] 对每个系列培养管中的鲁米叶甲烷马赛里球菌(M.luminyensis)培养物定时取样，测定代表三甲胺含量的O.D.值和氢气的含量，并计算平均值，详见下表7。
[0214]
[0215]
[0216]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 使用酸、碱和蛋白酶处理从畜牧养殖副产品制造的氨基酸肥料组合物 | 2020-08-10 | 1 |
| 一种三层球壳结构生物复合材料的制备方法及其产品 | 2021-06-07 | 2 |
| 一种利用畜禽粪便发酵生产有机肥的方法 | 2021-06-30 | 1 |
| 餐厨垃圾现场厌氧消化处理方法 | 2022-05-25 | 1 |
| 衍生自B型肝炎病毒核蛋白精氨酸密集区的抗菌胜肽 | 2021-11-06 | 0 |
| 经取代的双环二氢嘧啶酮及其作为嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的抑制剂的用途 | 2022-06-10 | 1 |
| 暗渠和沟渠生物清淤去黑除臭工艺 | 2020-06-15 | 2 |
| 污泥深度氧化处理工艺 | 2022-05-26 | 2 |
| 一种动物尸体无害化处理系统 | 2022-05-31 | 2 |
| 세리포리아 락세라타 배양액의 유효성분이 함유된 당뇨, 당뇨합병증 또는 당뇨로 인한 질환을 예방, 개선하기 위한 조성물 및 이의 제조방법 | 2022-01-11 | 0 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈