根瘤菌及其用途
阅读：1037发布：2020-07-10
专利汇可以提供根瘤菌及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了根瘤菌及其用途，其中该根瘤菌(Rhizobium sp.)于2016年3月11日保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12205。本发明的根瘤菌能够有效抑制病原菌生物被膜形成，并抑制病原菌毒 力 因子，且该根瘤菌的 发酵 产物或 代谢物 能够有效用作病原菌生物被膜 抑制剂 的活性成分，从而，利用根瘤菌，或其发酵产物、代谢物能够有效抑制病原菌生物被膜形成，控制病原菌的毒性，进而能够有效用于细菌感染 治疗 ，以增加病原菌对普通药物的易感性，增强治疗效果。，下面是根瘤菌及其用途专利的具体信息内容。
1.根瘤菌在制备药物中的用途，所述药物用于抑制病原菌生物被膜形成、降低病原菌毒力，所述病原菌为铜绿假单胞菌，
其中，所述根瘤菌于2016年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12205。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述根瘤菌通过其代谢物实现抑制病原菌生物被膜形成和降低病原菌毒力的用途。
3.根瘤菌在制备产品中的用途，所述产品用于：
抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成；和/或
抑制铜绿假单胞菌毒力因子，
其中，所述根瘤菌于2016年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12205。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述产品用于：
降低铜绿假单胞菌生物被膜形成总量；和/或
抑制铜绿假单胞菌弹性蛋白酶产生量；和/或
抑制铜绿假单胞菌铁载体的产生量；和/或
与抗生素共同作用提高对铜绿假单胞菌的杀伤效率。
根瘤菌及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 细菌感染一直是威胁和困扰人类健康的重大问题，20世纪以青霉素为代表的抗生素的发现，为细菌性疾病治疗开启了新篇章。过去的半个世纪里，大部分感染性疾病得到了有效治疗。但与此同时也引发了抗生素的滥用和不合理应用，导致细菌耐药性增加。越来越多的病原菌对抗生素敏感性降低甚至消失，耐药谱的扩大和耐药性的增强给细菌治疗带来了极大挑战，同时也对公共健康构成巨大威胁。最近，一些超级细菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、抗万古霉素肠球菌(VRE)、耐多药肺炎链球菌(MDRSP)、多重抗药性结核杆菌(MDR-TB)，以及碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(KPC)，具有多重耐药性，对多种抗生素完全免疫。这无疑向健康医学与卫生生物学提出了挑战。因此，寻找治疗细菌感染的替代药品或新方法已成为急需。
[0003] 研究表明，细菌产生耐药性的原因主要来自两个方面：一方面是因为抗生素对病原菌产生胁迫压力，而病原菌在压力下产生适应性变异；另一方面是因为在正常情况下，致病菌会形成微生物被膜(Biofilm，BF)，为其提供一层保护屏障。生物被膜是指细菌吸附于惰性物体如医学材料或机体黏膜表面，以此为生态位进行定殖，并分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物，使细菌相互粘连并将自身菌落聚集缠绕其中形成一种膜类结构。现已证实约有90％的微生物生活在微生物被膜系统中，超过65％的细菌性疾病与BF有关。受BF的保护，大多数药物只能杀灭微表面的微生物，而对内部的微生物无能为力，而此时内部的微生物也在不断的产生变异以耐受抗生素的攻击。由于BF在病原菌耐药性方面的独特原理和巨大潜力，通过干扰或抑制病原菌微生物被膜来减弱其致病性已成为当下防控细菌性疾病的新态势。
[0004] BF的发生、发展与成熟受细菌群体感应信号(quorum sensing，QS)的调节，微生物被膜抑制剂(Biofilm inhibitor)主要通过抑制微生物之间的QS达到抑制BF生长和结构形成的目的。BF抑制剂的作用原理体现在两个方面：首先，它不直接对微生物进行杀灭，而是针对微生物耐以生存的膜类结构，破坏其生存环境而达到控制其数量的目的。其次，它不仅可以控制病原菌的毒性，而且可以通过抑制BF使病原微生物丧失保护，增加对普通药物的易感性，增强治疗效果。与抗生素相比，BF抑制剂不会诱导微生物的抗性压力，不会导致耐药性的产生，无二次风险。因此，微生物被膜抑制剂是极具潜力的抗生素替代品，有望成为对抗致病菌甚至是超级细菌的有效手段。
[0005] 然而，目前的微生物被膜抑制剂研究仍有待加强。
发明内容
[0006] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种针对病原菌生物被膜抑制和减毒的有效手段。
[0007] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
[0008] 为提出一种针对病原菌生物被膜抑制和减毒的有效手段，发明人旨在寻找分离出一种生物被膜抑制和减毒相关的细菌菌株。进而，发明人进行了一系列艰苦实验，从各种环境样品中分离细菌，并对其进行病原菌生物被膜抑制和减毒相关性研究，并最终惊喜地获得了一株能够制备抑制病原菌生物被膜形成并抑制病原菌毒力因子的细菌菌株——根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01。
[0009] 因而，在本发明的第一方面，本发明提供了一种根瘤菌(Rhizobium sp.)。根据本发明的实施例，该根瘤菌于2016年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12205。
[0010] 根据本发明的实施例，该根瘤菌(Rhizobium sp.)为革兰氏阴性菌，菌落成淡黄色，表面光滑、边缘浸润，适宜的生长条件为25-35℃，pH 6.5-7.5，普通LB培养基；其16s rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
[0011] 发明人惊奇地发现，本发明的根瘤菌能够有效抑制病原菌生物被膜形成，并抑制病原菌毒力因子，且该根瘤菌的发酵产物或代谢物能够有效用作病原菌生物被膜抑制剂的活性成分，从而，利用根瘤菌，或其发酵产物、代谢物能够有效抑制病原菌生物被膜形成，控制病原菌的毒性，进而能够有效用于细菌感染治疗，以增加病原菌对普通药物的易感性，增强治疗效果。
[0012] 其中，需要说明的是，本文所采用的术语“发酵产物”是指对根瘤菌进行发酵培养后得到的产物。术语“代谢物”是通过以下步骤获得的物质：对上述发酵产物进行离心，取上清过滤，获得滤液，所述滤液即为所述代谢物。
[0013] 在本发明中，“微生物被膜”有时也被简称为“生物被膜”。本发明的根瘤菌有时被称为“根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01”或“根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205”。
[0014] 进而，在本发明的第二方面，本发明提供了前面所述的根瘤菌在抑制病原菌生物被膜形成、降低病原菌毒力中的用途。换言之，根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205具有抑制病原菌生物被膜形成和减毒的作用，从而能够被有效用于抑制病原菌生物被膜形成、降低病原菌毒力。
[0015] 根据本发明的实施例，所述根瘤菌通过其代谢物实现抑制病原菌生物被膜形成和降低病原菌毒力的用途。但本领域里术人员可以理解，本发明的根瘤菌的发酵产物也可以直接用于抑制病原菌生物被膜形成和降低病原菌毒力。
[0016] 在本发明的第三方面，本发明提供了一种生物制剂。根据本发明的实施例，本发明的生物制剂的活性成分为前面所述的根瘤菌的代谢物。但本领域里术人员可以理解，也可以以本 发明的根瘤菌的发酵产物的形式提供所述代谢物。
[0017] 该生物制剂即为“微生物被膜抑制剂”。根据本发明的实施例，利用本发明的生物制剂能够有效抑制病原菌生物被膜形成，控制病原菌的毒性。当将其用于细菌感染治疗时，能够有效增加病原菌对普通药物的易感性，增强治疗效果，也即本发明的生物制剂能够有效用于防控细菌性疾病。并且，与抗生素相比，本发明的生物制剂作为微生物被膜抑制剂不会诱导微生物的抗性压力，从而不会导致耐药性的产生，无二次风险，因此，是极具潜力的抗生素替代品，有望成为对抗致病菌甚至是超级细菌的有效手段。
[0018] 在本发明的第四方面，本发明提供了前面所述的根瘤菌或生物制剂在制备产品中的用途。根据本发明的实施例，所述产品用于：抑制病原菌生物被膜形成；和/或抑制病原菌毒力因子。
[0019] 需要说明的是，本文中所使用的术语“毒力因子”是构成毒力的物质，主要包括病原菌弹性蛋白酶和病原菌载体。
[0020] 根据本发明的一些具体示例，所述产品用于：
[0021] 降低病原菌生物被膜形成总量；和/或
[0022] 抑制病原菌弹性蛋白酶产生量；和/或
[0023] 抑制病原菌载体的产生量；和/或
[0024] 与抗生素共同作用提高对病原菌的杀伤效率。
[0026] 在本发明的第五方面，本发明提供了一种制备前面所述的生物制剂的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
[0027] 将前面所述的根瘤菌进行发酵培养，并收集发酵产物；以及
[0028] 以所述发酵产物作为活性成分，制备所述生物制剂。
[0029] 根据本发明的实施例，所述发酵培养的温度为28～37℃。
[0030] 根据本发明的一些实施例，所述发酵培养的时间为24-36小时。
[0031] 根据本发明的一些具体示例实施例，所述发酵培养的方式为旋转震荡培养，优选所述旋转震荡培养的转速为200转/分钟～220转/分钟，旋转半径为13.5cm。
[0032] 根据本发明的实施例，利用LB液体培养基进行所述发酵培养。根据本发明的一些具体示例，在LB液体培养基中，具体溶质为蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，溶剂为水，所述蛋白胨在所述培养基中的终浓度为10g/L，所述酵母提取物在所述培养基中的终浓度为5g/L，所述氯化钠在所述培养基中的终浓度为10g/L；所述培养基的pH为7.0。
[0033] 根据本发明的实施例，以所述发酵产物中包含的根瘤菌代谢物作为所述活性成分，进而，在收集所述发酵产物之后以及制备所述生物制剂之前还包括以下步骤：将所述发酵产物进行离心，取上清过滤，获得滤液，所述滤液即为所述根瘤菌的代谢物。根据本发明的一些具体示例，所述离心的转速为12000r/min，所述离心的时间为20min，所述离心半径为13.5cm，所述离心温度为4℃；所述过滤采用的滤膜孔径为0.22μm。
[0034] 根据本发明的实施例，本发明的根瘤菌及生物制剂具有以下优点的至少之一：
[0035] (1)根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205具有抑制病原菌生物被膜形成和减毒的作用；
[0036] (2)本发明的生物制剂的活性成分(根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205的代谢物)不影响病原菌的生长，不产生抗性压力，不易产生耐药性；
[0037] (3)本发明的生物制剂的活性成分不仅仅抑制了病原菌生物被膜的形成，还降低了病原菌的毒力或毒力相关的表达元件。
[0038] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
[0039] 保藏说明
[0040] 菌种名称：根瘤菌
[0041] 拉丁名：Rhizobium sp.
[0042] 菌株编号：NA01
[0043] 保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)[0044] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
[0045] 保藏日期：2016年3月11日
[0047] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0048] 图1为根据本发明的实施例，根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205QSI能力的检测与筛选实验结果；
[0049] 图2为根据本发明的实施例，根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205代谢物和抽提物(水相、有机相)对病原菌生物被膜形成的抑制效果结果图，其中，横坐标的为570nm下的吸光值，纵坐标表示根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205代谢物及其抽提物的用量。双星号表示差异显著性(P<0.01)；
[0050] 图3为根据本发明的实施例，根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205一直病原菌毒力因子实验的结果，其中，
[0051] 上图为根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205代谢物及其抽提物对病原菌铁载体产量(％)的抑制结果，其中横坐标表示根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205代谢物及其抽提物的用量，纵坐标表示铁载体产生量(％)，双星号表示差异显著性(P<0.01)，
[0052] 下图为根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205代谢物对病原菌对弹性蛋白酶的抑制结果，其中横坐标表示根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205代谢物及其抽提物的用量，纵坐标表示铁载体产生量(％)，双星号表示差异显著性(P<0.01)，单星号表示差异显著性(P<0.05)；
[0053] 图4为根据本发明的实施例，根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205代谢物对病原菌生物被膜结构以及抗生素敏感性的影响实验结果，其中，a为铜绿假单胞菌M63稀释液，b为铜绿假单胞菌M63稀释液加入5％根瘤菌上清液，c为铜绿假单胞菌M63稀释液加入100μg/ml卡那霉素，d为铜绿假单胞菌M63稀释液加入100μg/ml卡那霉素和5％根瘤菌上清液；以及
[0054] 图5为根据本发明的实施例，根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205代谢物对病原菌生长影响情况实验结果，其中，三角实线为铜绿假单胞菌野生型的生长曲线，方框实线为铜绿假单胞菌生长初期添加5％根瘤菌上清液共培养的生长曲线。
具体实施方式
[0055] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0056] 紫色色杆菌报告菌株(Chromobacterium violaceum ATCC 12472)由中国科学院南海海洋研究所王晓雪研究员惠赠。
[0057] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来自上海抚生实业有限公司(产品编号：CL5201)。该菌为致病菌，经常引起术后伤口感染，可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等；本菌引起的感染病灶可导致菌血症和败血症。
[0058] LB固体培养基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，去离子水100ml，琼脂1.5g，pH7.0。
[0059] LB液体培养基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，去离子水100ml，pH7.0。
[0060] M63液体培养基：硫酸铵0.2g，磷酸二氢钾1.36g，七水硫酸亚铁0.5mg，甘油0.2g，酪蛋白水解物0.5g，七水硫酸镁0.02g，葡萄糖0.2g，去离子水100ml，用氢氧化钾调pH至7.0。
[0062] 弹性蛋白缓冲液：弹性蛋白酶2g，100mM氯化钙1ml，pH7.2Tris-HCl100μl，去离子水100ml，pH7.0。
[0063] CASCAS检测液配制：取10mmol/L十六烷基三甲溴化铵(HDTMA)溶液6.0ml加入到100ml洁净容量瓶内，用双蒸水稀释；再将1.5ml(l mmol/L)FeCl3溶液与7.5ml(2mmol/L)刃天青(CASCAS)溶液混合后，沿玻璃棒缓慢加入至上述容量瓶后。称取4.307g无水双二甲胺(哌嗪)溶于30ml双蒸水中，再小心加入6.25ml(12mmol/L)HCl，即得pH＝5.6的缓冲液。将此溶液转入前述容量瓶中，用双蒸水定容至100ml。
[0064] 实施例1、菌株NA01的分离与鉴定
[0065] 一、菌株NA01的分离
[0066] 在北大西洋表层海水中采集水样，无菌保存带回实验室后(清华大学深圳研究生院海洋生态实验室)无菌操作涂布于12cm中号含2216E固体培养基平板上，30℃过夜静置培养，直至长出清晰可见的单克隆。
[0067] 随后从培养平板上挑取100株单克隆于2ml EP管中，EP管中含1ml LB液体培养基，将这100个单克隆放入恒温摇床中30℃，220r/min培养过夜。经报告菌株Chromobacterium violaceum ATCC 12472检测，能抑制紫色圈形成的为阳性菌株，将其中的一个菌株命名为NA01菌。
[0068] 二、菌株NA01菌的鉴定
[0069] 从形态和16s rDNA序列同源性两个方面对步骤一获得的菌株NA01进行鉴定。
[0070] 1、形态学鉴定
[0071] 将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离得到的菌株NA01进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。
[0072] 结果表明：上述步骤一分离得到的菌株为革兰氏阴性菌，菌落成淡黄色，表面湿润、边缘平坦。
[0073] 2、16s rDNA序列同源性分析
[0074] 常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株NA01，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，采用通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO：1)，1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO：2)扩增细菌16S rRNA基因保守区。25μL扩增体系包括：1×PCR反应缓冲液，200μmol/L dNTPs，上游及下游引物各0.2μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％凝胶电泳检测，阳性结果用27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO：1)，1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO：2)进行双向测序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成，结果如下。
[0075] 菌株NA01的16s rDNA的序列为：
[0076]
[0077]
[0078] 鉴于上述形态特征和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离筛选得到的菌株NA01鉴定为根瘤菌(Rhizobium sp.)。该根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01已于2016年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏登记号为CGMCC No.12205。
[0079] 实施例2、根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205抑制病原菌生物被膜形成实验
[0080] 1、根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205的发酵培养以及发酵产物(代谢物)的提取
[0081] 从-80℃的冰箱中取出保种的实施例一分离鉴定得到的根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205，室温解冻后，在LB固体培养基平板上多次划线分离，30℃静置培养12h以上，直至长出清晰可见的单克隆。从中挑出3株单克隆于1ml的LB液体培养基中，30℃，
220r/min摇床培养过夜。取1ml菌液加入250ml含有100mlLB液体培养基的锥形瓶中，放入摇床上，30℃，220r/min(离心转头半径为13.5cm)培养24h～36h，直至培养基营养成分基本耗尽，细胞密度不再增加为止。
220r/min摇床培养过夜。取1ml菌液加入250ml含有100mlLB液体培养基的锥形瓶中，放入摇床上，30℃，220r/min(离心转头半径为13.5cm)培养24h～36h，直至培养基营养成分基本耗尽，细胞密度不再增加为止。
[0082] 收集发酵液，4℃，12000r/min，离心20min(离心半径为13.5cm)，取上清液。将获得的上清液进一步用0.22μm滤膜过滤(除去剩余菌液和杂质)，取滤液(根瘤菌Rhizobium sp.NA01 CGMCC No.12205)，保存在灭菌容器中，4℃保存备用(保存一半)。
[0083] 将剩余的一半上清液按1:1比例加入乙酸酯，搅拌萃取；取30-50ml水相液体，用0.22nm滤膜过除菌后备用。剩余有机相用旋转蒸馏法完全去乙酸乙酯，并用5ml甲醇洗脱，获得有机相备用。
[0084] 2、病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的活化培养
[0085] 从-80℃的冰箱中取出保种的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，室温解冻后，在LB固体培养基平板上划线，37℃静置培养12h以上，直至长出清晰可见的单克隆。从中挑 出3株单克隆于1ml的LB液体培养基中，37℃，220r/min摇床培养过夜。再转接入20mlLB液体培养基中，37℃，220r/min摇床培养8h，备用。
[0086] 3、检测根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205的代谢物和抽提物对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜的抑制效果
[0087] (1)将步骤2得到的活化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌液用M63液体培养基稀释至OD600为0.02。
[0088] (2)将稀释后的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液加入到96孔板中，100μl/孔，再向各孔中加入不同体积分数的步骤1得到的滤液上清(0，1％，3％，5％)，抽提物水相(5％)和有机相(0.5％)，每个浓度设12个复孔。盖上板盖，37℃下静置培养48小时，注意保持空气湿度。
[0089] (3)倒去培养基，用无菌水轻柔清洗平板，加入100μl，1％(1g/100ml)结晶紫染液，室温染色20分钟，倒去染料，彻底而轻柔的清洗。
[0090] (4)用DMSO溶解附着于壁上的结晶紫，并适度稀释，测OD570。实验重复三次，结果取平均值。检测原理如下：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)经过一段时间培养，会在96孔板的侧壁和底部形成生物被膜，弃去培养基，洗去悬浮细菌后，侧壁和底部的生物被膜中的细菌不会洗去，用结晶紫对这部分细菌进行染色，再用DMSO溶解结晶紫，溶解产物在
570nm波长下有最大吸收峰。此时，吸光度越大，说明溶解产物的浓度越大，生物被膜的生物量也就越大。反之，则表明微生物被膜的生物量变小，生物被膜形成受到抑制。
570nm波长下有最大吸收峰。此时，吸光度越大，说明溶解产物的浓度越大，生物被膜的生物量也就越大。反之，则表明微生物被膜的生物量变小，生物被膜形成受到抑制。
[0091] 检测结果如图2所示，从图中可以看出，与对照(0浓度组)相比，加入了步骤1得到的滤液和抽提物(根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205的代谢物)的各组，对病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜的形成均具有明显的抑制作用(p<0.01，差异极显著)，且这种抑制作用随着加入的所述滤液的浓度的增大而增强。
[0092] 实施例3、根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205抑制病原菌毒力因子实验
[0093] 1、检测根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205的代谢物对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)铁载体产量的抑制效果
[0094] (1)将实施例2步骤2得到的活化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌液用LB液体培养基液体培养基稀释至OD600为0.05。
[0095] (2)向稀释后的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液中加入不同体积分数的实施例2步骤1得到的滤液上清(0，1％，3％，5％)，抽提物水相(5％)和有机相(0.5％)，每个浓度3次重复，放入摇床中，220r/min，30℃条件下培养16h后，4℃，12000r/min离心15min。
[0096] (3)取三份10ml上清液，分别加入20μl浓度为5mM的三种不同的水解底物(铁载体)，黑暗中共培养9h。空白对照为煮沸的所述上清液(未加实施例2步骤1得到的滤液)与底物共培养的产物。
[0097] (4)将共培养9h后的产物，取出100μl于96孔板中(注意用锡箔纸包好，避光)，放 入酶标仪中，设定激发光为365nm，发射光为455nm，检测荧光值。实验重复三次，结果取平均值。检测原理如下：铁载体能将带有荧光标记(MUF)的底物水解，荧光标记转移至水解产物上，在365nm的激发光激发后，产生455nm的荧光，根据荧光强弱，可知铁载体的浓度大小，荧光值越小，受到抑制越大。
[0098] 检测结果如图3的上图所示，从图中可以看出，与对照(0浓度组)相比，加入了实施例2步骤1得到的滤液和抽提物(根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205的代谢物)的各组，对病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的3种不同水解酶的产量均具有明显的抑制作用(p<0.05，差异显著)，且这种抑制作用随着加入的所述滤液的浓度的增大而增强。
[0099] 2、根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205的代谢物对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)弹性蛋白酶的抑制效果
[0100] (1)将实施例2步骤2得到的活化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌液用LB液体培养基稀释至OD600为0.05。
[0101] (2)向稀释后的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液中加入不同体积分数的实施例2步骤1得到的滤液上清(0，1％，3％，5％)，抽提物水相(5％)和有机相(0.5％)，每个浓度3次重复，放入摇床中，220r/min，37℃培养21小时后，4℃，12000g/min，离心5分钟。
[0102] (3)取500μl离心后的上清液加入1mL弹性蛋白缓冲液，振荡共培养6小时，加入600μl浓度为0.1M的EDTA终止反应，离心去沉淀(10000r/min，2分钟)，测OD495。实验重复三次，结果取平均值。检测原理如下：弹性蛋白微溶于水，弹性蛋白酶可将弹性蛋白水解，形成红色水解产物，此红色水解产物在495nm的波长下有最大吸收峰。此时，水解产物的浓度越大，光能量越强，得到的数值就越大。
[0103] 检测结果如图3的下图所示，从图中可以看出，与对照(0浓度组)相比，加入了实施例2步骤1得到的滤液和抽提物(根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205的代谢物)的各组，对病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的弹性蛋白酶的产量均具有明显的抑制作用(p<0.01，差异极显著)，且这种抑制作用随着加入的所述滤液的浓度的增大而增强。
[0104] 实施例4、根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜结构以及抗生素敏感性影响实验
[0105] (1)将实施例2步骤2得到的活化铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液用M63液体培养基稀释至OD600为0.05。实验设置四组，分别记为a、b、c、d。其中，a为铜绿假单胞菌M63稀释液；b为铜绿假单胞菌M63稀释液加入5％根瘤菌上清液；c为铜绿假单胞菌M63稀释液加入100μg/ml卡那霉素；d为铜绿假单胞菌M63稀释液加入100μg/ml卡那霉素和5％根瘤菌上清液。
[0106] 实验结果的表征用COMSTAT荧光显微镜分析生物被膜生物量，平均厚度及最大厚度值 (PA：铜绿假单胞菌；PA+QSI：铜绿假单胞菌+5％QSI提取物混合；PA+K：铜绿假单胞菌+100μg/ml卡那霉素混合；PA+K+QSI：铜绿假单胞菌+100μg/ml卡那霉素+5％QSI提取物混合)。上方四图是Z轴扫描后得到的生物被膜图，下方四图为其3D图像。
[0107] (2)配制荧光染色剂(现配现用)，所用荧光染色剂为-7012LIVE/DEAD BacLightTM Bacterial Viability Kit(Molecular Probes Inc)，将其中的SYTO9和PI染液按如下比例稀释，SYTO9：PI：蒸馏水＝1.5μl：1.5μl：1ml，振荡混匀(注意避光)。
[0108] (3)取出4个样品中的盖玻片，用0.9％(0.9g/100ml)的氯化钠溶液清洗，自然晾干，在每个盖玻片上滴加200μl步骤(2)配制好的荧光染料(注意避光)，黑暗中染色30min，自然晾干后，放置共聚焦显微镜上观察。红色为死菌，绿色为活菌。检测原理：SYTO9染料可以透过细胞膜，能将死菌或者活菌的DNA结合，在488nm波长的激发光下，产生绿色荧光。而PI不能透过细胞膜，只能与死菌的DNA结合，且能取代SYTO9，在488nm波长的激发光下，产生红色荧光。在用激光共聚焦显微镜观测时，利用Z轴逐层扫描，根据上下表面的距离即得厚度。
[0109] 检测结果如图4所示，从图中可以看出，野生型铜绿假单胞菌PAO1可以形成厚度约为10000nm的均匀的具有高度结构化的生物被膜，并且在生物膜中的细菌生长状态良好，经染料色后整体颜为绿色，表示几乎没有细菌死亡(a)；加入5％QSI上清液后，可以明显发现生物被膜结构性受到破坏，已经较为离散，整体的厚度降低，但是几乎没有细菌死亡(b)；加入100μg/ml卡那霉素处理后生物被膜，整体颜色开始泛黄，这是绿色和红混合的中间态颜，表明表面细菌已经开始有部分死亡，生物被膜厚度降低，但其结构性与野生型相比几乎无变化(c)；100μg/ml的卡那霉素与5％QSI上清液联合处理的生物被膜，可明显观察到其结构性受很大程度的破坏，较为离散，厚度显著降低，整体颜色呈现红色呈，表明90％以上的细菌已经死亡(d)。
[0110] 实施例5、根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生长的影响实验
[0111] (1)取出200μl实施例2步骤2得到的活化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液，分成2份，每份100μl。在一份中加入5μl实施例2步骤1得到的滤液，另一份中不添加，进行野生型铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的培养。
[0112] (2)实验组合对照组放入30℃培养箱中培养36小时，没4小时检测一次OD600吸光值，观察菌浓的变化情况。
[0113] 检测结果如图5所示，从图上可以看出两条生长曲线几乎重合，QSI上清液的添加对铜绿假单胞菌生长几乎无影响。这表明，实施例2步骤1得到的滤液(根瘤菌(Rhizobium sp.)NA01 CGMCC No.12205的代谢物)并不影响病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的生长。
[0114] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
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