肿瘤细胞多药耐药逆转剂
阅读：491发布：2021-04-11
专利汇可以提供肿瘤细胞多药耐药逆转剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 肿瘤 细胞多药耐药逆转剂，该逆转剂为孕甾烷衍 生物 ，具体地，是通光散 苷元 乙(又名通光散苷元B，或通光散甙元B，英文名Tenacigenin B)的衍生物，以及二氢肉珊瑚苷元(又名二氢肉珊瑚甙元，英文名Dihydrosarcostin)的衍生物和通光散苷元丙(又名通光散苷元C，或通光散甙元C，英文名Tenacigenin C)的衍生物。本发明这种孕甾烷化合物具有逆转肿瘤细胞多药耐药性质的优异特性，可制成肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物。孕甾烷类MDR逆转剂药物与抗肿瘤药物或其他肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物共同使用，可以提高肿瘤化疗的效果。，下面是肿瘤细胞多药耐药逆转剂专利的具体信息内容。
1.一种甾体化合物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物中的应用，其特征在于这种甾体 化合物是通光散苷元乙的衍生物，或二氢肉珊瑚苷元的衍生物或通光散苷元丙的衍生物，具 有如下结构通式所示的化学结构：
式中，粗实线表示为β取代基；虚线表示为α取代基；波纹线表示既可为α取代基，又 可为β取代基；
取代基A可为羟基(OH)，或酮基(＝O)，或酯基(WCOO-)，或为如下糖链之一：
3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖，3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡 喃糖基(1-4)]-β-D-磁麻吡喃糖，β-D-葡萄吡喃糖基(1-4)-3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基 (1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖，β-D-葡萄吡喃糖基(1-4)-3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基 (1-4)]-β-D-磁麻吡喃糖；
取代基B或D可为氢(H)，或羟基(OH)；或者，取代基B+D可为环氧基氧原子(O)；
取代基Q或R可为氢(H)，或羟基(OH)，或酯基(WCOO-)；取代基U或V可为氢 (H)，或羟基(OH)，或者，取代基U+V可为酮基氧原子(O)；取代基Y可为氢(H)，或 羟基(OH)；
其中，当取代基A或Q或R为酯基(A＝WCOO-，或Q＝WCOO-，或R＝WCOO-)时， 其中的基团W又可为如下基团之一：
甲基，乙基，丙基，丙酸基[-(CH2)3CO2H]，丁基，1-甲基丙基，1-甲基丙烯基，苯基，对 甲苯基，对羟基苯基，对甲氧基苯基，对氨基苯基，对甲基氨基苯基，对二甲基氨基苯基， 苯乙烯基，对羟基苯乙烯基，对甲氧基苯乙烯基，对氨基苯乙烯基，对甲基氨基苯乙烯基， 对二甲基氨基苯乙烯基；
例如，化合物通光散苷元乙(通光散苷元B，英文名tenacigenin B)：取代基A＝OH，取 代基Q＝R＝H，取代基B+D＝环氧基氧原子(O)，取代基U+V＝酮基氧原子(O)，取代基Y＝H；
化合物11α-O-苯甲酰基-12β-O-乙酰通光散苷元乙：取代基A＝OH，取代基Q＝苯基，R＝ 甲基，取代基B+D＝环氧基氧原子(O)，U+V＝酮基氧原子(O)，取代基Y＝H；
化合物二氢肉珊瑚苷元：取代基A＝OH，取代基Q＝H，R＝OH，取代基B＝OH，取代基 D＝OH，取代基U＝H，取代基V＝OH，取代基Y＝OH；
化合物11α-O-(2-甲基丁烯酰基)-12β-O-乙酰基通光散苷元乙3-O-[3-O-甲基-6-脱氧-β-D- 阿洛吡喃糖基(1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖苷[通光藤新苷A(英文名tenacissimoside A)，又名通 光散甙G(英文名tenacissoside G)]：取代基A＝3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)]-β-D- 夹竹桃吡喃糖，Q＝2-甲基丁烯酰氧基，R＝乙酰氧基，取代基B+D＝环氧基氧原子(O)，U+V＝ 酮基氧原子(O)，取代基Y＝H。
2.根据权利要求1所述的甾体化合物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物中的应用，其 特征在于是从植物提取得到的天然化合物，以及该天然化合物经过化学反应得到的衍生物， 以及二者的组合。
3.根据权利要求1-2所述的甾体化合物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物中的应用， 其特征在于是指从萝藦科(Asclepiadaceae)的植物通光散(Marsdenia tenacissima)提取的化合 物，该化合物结构符合权利要求1所声明的化学结构通式；以及该化合物经过化学反应得到 的结构符合权利要求1所声明的化学结构通式的衍生物，以及二者的组合。
4.根据权利要求1所述的甾体化合物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物中的应用，其 特征是用于制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物。
5.根据权利要求1所述的甾体化合物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物中的应用，其 特征是用于制备通过逆转肿瘤细胞多药耐药性发挥疗效的抗肿瘤药物，及作为药物赋形剂或 载体。
6.根据权利要求1-5所述的甾体化合物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物中的应用， 其特征在于所述的药物可以是一种组合物，该组合物至少含有1种以上结构符合权利要求1 所声明的化学结构通式的化合物，也可以含有抗肿瘤药物。
7.根据权利要求6所述的甾体化合物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物中的应用，其 特征在于所述的组合物中，结构符合权利要求1所声明的化学结构通式的化合物，能够影响 多药耐药肿瘤细胞P糖蛋白(P-gp)的功能，显著提高多药耐药肿瘤细胞中抗肿瘤药物的浓度。
8.根据权利要求6所述的甾体化合物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物中的应用，其 特征在于所述的抗肿瘤药物是肿瘤细胞P-gp的底物，包括紫杉烷类、蒽环类、鬼臼毒素类、 长春碱类药物。
9.根据权利要求6所述的甾体化合物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物中的应用，其 特征在于所述的药物可以被制成药学上可接受的剂型，包括片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、 缓释制剂、控释制剂、纳米制剂，或者注射剂。
技术领域
本发明涉及可以制造药物的新的肿瘤细胞多药耐药逆转剂。具体地说，是涉及一种具有 通光散苷元乙(又名通光散苷元B，或通光散甙元B，英文名Tenacigenin B)的衍生物，以 及二氢肉珊瑚苷元(又名二氢肉珊瑚甙元，英文名Dihydrosarcostin)的衍生物和通光散苷元丙 (又名通光散苷元C，或通光散甙元C，英文名Tenacigenin C)的衍生物的甾体结构的天然 的或半合成的衍生物，在用于制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物中的应用。
背景技术
肿瘤细胞的多药耐药(MDR)，是指肿瘤细胞在对一种抗癌药产生耐药性以后，可同时对 未接触过的、化学结构和作用机制不同的其他抗癌药物产生交叉耐药的现象。癌症(恶性肿 瘤)病人在接受化疗的过程中往往由于肿瘤细胞出现多药耐药导致化疗失败，危及病人生存。 因此肿瘤细胞的多药耐药性已经成为肿瘤临床治疗的巨大障碍。引起肿瘤多药耐药的机制较 为复杂，主要涉及一些转运蛋白如：P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药耐药相关蛋白 (Multi-drug Resistances-associated protein，MRP)、肺耐药相关蛋白(Lung Resistance Asociated protein，LRP)、乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistance protein，BCRP)等。其中，对由P-糖蛋 白(P-gp)介导的MDR机理研究得较为透彻。
针对已知的MDR形成机制，科学家已经发现了一些作用确切的MDR逆转剂，如异搏定 即维拉帕米(verapamil，VER)、环孢霉素A(cyclosporine A，CsA)等。但由于毒副作用等问题，至 今无法应用于临床。寻找疗效明确、毒副作用低微的肿瘤MDR逆转剂成为医药界十分迫切 的任务。
天然来源的孕甾烷类化合物主要存在于萝藦科(Asclepiadaceae)植物中，由于其结构骨架 是由21个碳原子构成，又称为C21甾体。该类天然甾体化合物往往含有多个羟基和/或酯基， 以及往往在3位羟基位置上与2-去氧糖或2，6-双去氧糖缩合形成甾体苷(苷即甙，亦即配糖 体，英文名Glycoside)，有时被称为多氧孕甾酯苷。
多氧孕甾酯苷通过弱酸水解，断开糖链，可以得到3位或其它连糖位置转变为游离羟基 的多氧孕甾酯化合物[参见文献：胡英杰等.华萝藦的化学成分.化学学报1998，56：507；Qiu SX et al.Steroidal glycosides from the root of Cynanchum versicolor.Phytochem 1989，28：3175]； 用碱水解除去原有酯基的话，可以得到含有多个羟基的多氧孕甾化合物[参见文献：沈小玲等. 苦绳的一个新甾体成分.云南植物研究1989，11：51；陈纪军等.云南匙羹藤的化学成分.云南 植物研究1989，11：203]；如果与酸酐或酰卤反应，将游离羟基酯化，则可以形成酯类衍生物。
萝藦科植物通光散是萝藦科牛奶菜属植物Marsdenia tenacissima，含有多种多氧孕甾酯苷 类化合物。其中以通光散苷元乙(Tenacigenin B)的衍生物数量居多，如Tenacigenin B、 17β-Tenacigenin B、11α-Tigloyl，12β-Acetyl Tenacigenin B、11α，12β-Ditigloyl Tenacigenin B、 11α-Benzoyl，12β-Acetyl Tenacigenin B、Tenacissoside A-I(其中Tenacissoside F、G、H依次 就是TenacissimosideA、B、C)，MarsdenosideA-H等；也有二氢肉珊瑚苷元(Dihydrosarcostin) 及通光散苷元丙(Tenacigenin C)的衍生物，如Marstenacisside A-D、Tenacissoside J-M、 Tenacigenin C、3-O-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-allopyranosyl-(1-4)-β-D-oleandro-pyranosyl tenacigenin C等[参见文献：杨仁洲等.通光散甙元甲乙丙的结构.云南植物研究，1981，3：271； Deng J，et al.Two new C21 Steroids from Marsdenia tenacissima.Chin Chem Lett，2005，16：487； Miyakawa S，et al.Five glycosides from the Chinese drug″TONG-GUANG-SAN″：the stems of Marsdenia tenacissima.Phytochem，1986，25：2861；Luo SQ，et al.Polyoxypregnanes from Marsdeniatenacissima.Phytochem，1993，34：1615；蒋毅等。通光散中的三个新C21-甾体甙.中 国医药工业杂志，1996，27：391；Chen.JJ，et al.New C21 steroidal glycosides from Marsdenia Tenacissima.Acta Botanica Yunnanica，1999，21：369；Deng J et al.Marsdenosides A-H，polyoxy- pregnane glycosides from Marsdenia tenacissima.Phytochemistry，2005，66：1040；Xia ZH，et al. Pregnane glycosides from the stems of Marsdenia tenacissima.J Asian Nat Prod Res，2004，6：79；邢 旺兴等.通光散中的两个新C21-甾体甙.药学学报，2004，39：272；Wang S et al.Two new C-21 steroidal glycosides from Marsdenia tenacissima.Chem Pharm Bull，2006，54：696]。测试了部分 C21甾体化合物体外对KB、KB-IV和P388肿瘤细胞的作用，发现有三种通光散苷元乙的酯 类衍生物11α-O-2-甲基丁酰-12β-O-2-甲基丁烯酰通光散苷元乙、11α-O-2-甲基丁酰-12β-O-苯 甲酰通光散苷元乙和11α-O，-12-β-O-双丁烯酰基-17β-通光散苷元乙对KB-VI细胞有一定细胞 毒活性，半数抑制浓度ED50分别是4.1、2.5和3.4μg/ml，其它成分则未见抗肿瘤活性[参见 文献：Luo S Q，et al.Polyoxypregnanes from Marsdenia tenacissima.Phytochem，1993，34：1615]。 通光散较为翔实的化学成分研究成为现代药物开发研究的基础和本发明的背景。
国内外未见孕甾烷类化合物逆转肿瘤多药耐药性的研究报道和专利公开。
针对已知的MDR形成机制，科学家已经发现了一些作用确切的MDR逆转剂，如异搏定 即维拉帕米(verapamil，VER)、环孢霉素A(cyclosporine A，CsA)等。但由于毒副作用等问题，至 今无法应用于临床。寻找疗效明确、毒副作用低微的肿瘤MDR逆转剂成为医药界十分迫切 的任务。
天然来源的孕甾烷类化合物主要存在于萝藦科(Asclepiadaceae)植物中，由于其结构骨架 是由21个碳原子构成，又称为C21甾体。该类天然甾体化合物往往含有多个羟基和/或酯基， 以及往往在3位羟基位置上与2-去氧糖或2，6-双去氧糖缩合形成甾体苷(苷即甙，亦即配糖 体，英文名Glycoside)，有时被称为多氧孕甾酯苷。
多氧孕甾酯苷通过弱酸水解，断开糖链，可以得到3位或其它连糖位置转变为游离羟基 的多氧孕甾酯化合物[参见文献：胡英杰等.华萝藦的化学成分.化学学报1998，56：507；Qiu SX et al.Steroidal glycosides from the root of Cynanchum versicolor.Phytochem 1989，28：3175]； 用碱水解除去原有酯基的话，可以得到含有多个羟基的多氧孕甾化合物[参见文献：沈小玲等. 苦绳的一个新甾体成分.云南植物研究1989，11：51；陈纪军等.云南匙羹藤的化学成分.云南 植物研究1989，11：203]；如果与酸酐或酰卤反应，将游离羟基酯化，则可以形成酯类衍生物。
萝藦科植物通光散是萝藦科牛奶菜属植物Marsdenia tenacissima，含有多种多氧孕甾酯苷 类化合物。其中以通光散苷元乙(Tenacigenin B)的衍生物数量居多，如Tenacigenin B、 17β-Tenacigenin B、11α-Tigloyl，12β-Acetyl Tenacigenin B、11α，12β-Ditigloyl Tenacigenin B、 11α-Benzoyl，12β-Acetyl Tenacigenin B、Tenacissoside A-I(其中Tenacissoside F、G、H依次 就是TenacissimosideA、B、C)，MarsdenosideA-H等；也有二氢肉珊瑚苷元(Dihydrosarcostin) 及通光散苷元丙(Tenacigenin C)的衍生物，如Marstenacisside A-D、Tenacissoside J-M、 Tenacigenin C、3-O-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-allopyranosyl-(1-4)-β-D-oleandro-pyranosyl tenacigenin C等[参见文献：杨仁洲等.通光散甙元甲乙丙的结构.云南植物研究，1981，3：271； Deng J，et al.Two new C21 Steroids from Marsdenia tenacissima.Chin Chem Lett，2005，16：487； Miyakawa S，et al.Five glycosides from the Chinese drug″TONG-GUANG-SAN″：the stems of Marsdenia tenacissima.Phytochem，1986，25：2861；Luo SQ，et al.Polyoxypregnanes from Marsdeniatenacissima.Phytochem，1993，34：1615；蒋毅等。通光散中的三个新C21-甾体甙.中 国医药工业杂志，1996，27：391；Chen.JJ，et al.New C21 steroidal glycosides from Marsdenia Tenacissima.Acta Botanica Yunnanica，1999，21：369；Deng J et al.Marsdenosides A-H，polyoxy- pregnane glycosides from Marsdenia tenacissima.Phytochemistry，2005，66：1040；Xia ZH，et al. Pregnane glycosides from the stems of Marsdenia tenacissima.J Asian Nat Prod Res，2004，6：79；邢 旺兴等.通光散中的两个新C21-甾体甙.药学学报，2004，39：272；Wang S et al.Two new C-21 steroidal glycosides from Marsdenia tenacissima.Chem Pharm Bull，2006，54：696]。测试了部分 C21甾体化合物体外对KB、KB-IV和P388肿瘤细胞的作用，发现有三种通光散苷元乙的酯 类衍生物11α-O-2-甲基丁酰-12β-O-2-甲基丁烯酰通光散苷元乙、11α-O-2-甲基丁酰-12β-O-苯 甲酰通光散苷元乙和11α-O，-12-β-O-双丁烯酰基-17β-通光散苷元乙对KB-VI细胞有一定细胞 毒活性，半数抑制浓度ED50分别是4.1、2.5和3.4μg/ml，其它成分则未见抗肿瘤活性[参见 文献：Luo S Q，et al.Polyoxypregnanes from Marsdenia tenacissima.Phytochem，1993，34：1615]。 通光散较为翔实的化学成分研究成为现代药物开发研究的基础和本发明的背景。
国内外未见孕甾烷类化合物逆转肿瘤多药耐药性的研究报道和专利公开。
发明内容
本发明的目的是提供一种与已知肿瘤细胞多药耐药逆转剂的化学结构均不相同的新型 肿瘤细胞多药耐药逆转剂。这种MDR逆转剂可与抗肿瘤药物或其他肿瘤细胞多药耐药逆转 剂药物共同使用，提高肿瘤治疗的效果。
这种MDR逆转剂为孕甾烷衍生物，具体地，是通光散苷元乙的衍生物，或二氢肉珊瑚 苷元的衍生物或通光散苷元丙的衍生物，具有如下结构通式特征：
其中，取代基A可为羟基(OH)或酯基(W-COO-)，或为如下基团之一：
3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖，3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛 吡喃糖基(1-4)]-β-D-磁麻吡喃糖，β-D-葡萄吡喃糖基(1-4)-3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基 (1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖，β-D-葡萄吡喃糖基(1-4)-3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基 (1-4)]-β-D-磁麻吡喃糖；
取代基B或D可为氢(H)，或羟基(OH)；或者，取代基B+D可为环氧基氧原子(O)；
取代基Q或R可为氢(H)，或羟基(OH)，或酯基(WCOO-)；取代基U或V可为氢 (H)，或羟基(OH)，或者，取代基U+V可为酮基氧原子(O)；取代基Y可为氢(H)，或 羟基(OH)；
其中，当取代基A或Q或R为酯基(A＝WCOO-，或Q＝WCOO-，或R＝WCOO-)时， 其中的基团W又可为如下基团之一：
甲基，乙基，丙基，丙酸基[-(CH2)3CO2H]，丁基，1-甲基丙基，1-甲基丙烯基，苯基， 对甲苯基，对羟基苯基，对甲氧基苯基，对氨基苯基，对甲基氨基苯基，对二甲基氨基苯基， 苯乙烯基，对羟基苯乙烯基，对甲氧基苯乙烯基，对氨基苯乙烯基，对甲基氨基苯乙烯基， 对二甲基氨基苯乙烯基。
例如，化合物通光散苷元乙(通光散苷元B，英文名tenacigenin B)：取代基A＝OH，取 代基Q＝R＝H，取代基B+D＝环氧基氧原子(O)，取代基U+V＝酮基氧原子(O)，取代基Y＝H；
再例如，化合物11α-O-苯甲酰基-12β-O-乙酰通光散苷元乙：取代基A＝OH，取代基Q＝ 苯基，R＝甲基，取代基B+D＝环氧基氧原子(O)，U+V＝酮基氧原子(O)，取代基Y＝H；
再例如，化合物二氢肉珊瑚苷元：取代基A＝OH，取代基Q＝H，R＝OH，取代基B＝OH， 取代基D＝OH，取代基U＝H，取代基V＝OH，取代基Y＝OH；
又例如：化合物11α-O-(2-甲基丁烯酰基)-12β-O-乙酰基通光散苷元乙3-O-[3-O-甲基-6- 脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖苷[通光藤新苷A(英文名tenacissimoside A)，又名通光散甙G(英文名tenacissoside G)]：取代基A＝3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖 基(1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖，Q＝2-甲基丁烯酰氧基，R＝乙酰氧基，取代基B+D＝环氧基氧原 子(O)，U+V＝酮基氧原子(O)，取代基Y＝H。
具有结构通式所示的天然化合物及其修饰得到的衍生物，以及二者的组合，即可用作药 物制剂的活性成分，或活性成分之一，或药物赋形剂，用于制备针对肿瘤细胞多药耐药性的 多药耐药逆转剂药物，可制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液或者注射剂。
本发明所说的天然化合物，是指从植物中提取的，特别是指从萝藦科植物通光散 (Marsdenia tenacissima)提取的，符合上述化学结构通式的化合物。
本发明所说的从植物中提取，是本领域工作人员都能够掌握和采用的方法：用含水 1％-90％(体积百分数，下同)的低级醇(甲醇、乙醇、丙醇)，或含水1％-90％的丙酮，或 水饱和的丁酮、水饱和的乙酸乙酯、水饱和的氯仿、水饱和的二氯甲烷或者水饱和的正丁醇， 在室温条件下(如0℃到30℃之间)或者在加热条件下(30℃以上，最高到溶剂沸点温度) 下，从植物，特别是从萝藦科植物通光散的根茎中溶出并制成含有符合上述化学结构通式的 化合物的提取物。
本发明所说的符合上述化学结构通式的天然化合物，是指从上述提取物中，用本领域工 作人员都能够掌握和采用的柱层析方法(柱子的填料为硅胶，或辛烷基烷化硅胶，或十八烷 基烷化硅胶，或葡聚糖凝胶)分离纯化，并经过波谱解析识别和确定了结构的天然来源的孕 甾烷类化合物。
本发明所说的对天然来源的孕甾烷类化合物开展的化学反应和结构修饰，是指本领域工 作人员都能够掌握和采用的常规化学方法，包括对天然来源的孕甾烷类化合物纯品或其混合 物实施弱酸水解，断开糖链，得到3位或其它连糖位置为游离羟基的多氧孕甾酯化合物的方 法；也包括用碱水解，除去原有酯基，得到含有多个羟基的衍生物的方法；还包括将多羟基 衍生物与酸酐或酰卤反应，将游离羟基酯化，得到半合成多氧孕甾酯衍生物的方法，在本发 明的背景技术部分已经有所陈述。例如，当A＝OH，Q＝CH3CO，R＝C6H5CO时的氧孕甾酯衍生 物，即是11α-O-苯甲酰基-12β-O-乙酰基通光散苷元乙；A＝OH，Q＝R＝C6H5CO时的衍生物， 即是11α-O-，12β-O-双苯甲酰基通光散苷元乙。
本发明的特点和突出进步在于：首次公开了甾体类型肿瘤MDR逆转剂的结构通式及在 治疗具有多药耐药作用的恶性肿瘤中可能产生的协同作用。在本发明公开的符合结构通式的 化合物中还有如下规律性：芳酯化衍生物活性较强；去氧糖链外端接上葡萄糖类非去氧糖后 活性降低或丧失；结构和构型发生显著改变的人工产物通光散苷元A(tenacigenin A)不具有活 性。
本发明首次公开了孕甾烷类化合物逆转肿瘤MDR的作用。例如，当联合20μg/mL的化 合物MT-1(名称和结构后述)后，抗癌药长春碱、阿霉素、嘌呤霉素和紫杉醇在耐药的 HepG2/Dox细胞中的药物浓度分别能提高10，18，11和6倍。20μg/mL的化合物MT-9(名 称和结构后述)和化合物MT-10(名称和结构后述)则分别能够使抗癌药长春碱、阿霉素、嘌呤 霉素和紫杉醇在耐药HepG2/Dox细胞中的药物浓度提高18、54、5、15.8倍和3.3、15.9、14.2、 315.1倍。机理研究证实，孕甾烷类MDR逆转剂不是通过调节P-gp蛋白表达，而是通过干 扰P-gp的转运功能，抑制对肿瘤药底物的外排，从而提高了MDR肿瘤细胞内的抗肿瘤药物 积累。
本发明公开的C21甾体类型肿瘤MDR逆转剂，可以制成药物制剂，与抗肿瘤药物联合用 药，也可以与抗肿瘤药物制成复方制剂应用于临床，使抗肿瘤药物在多药耐药肿瘤细胞中的 浓度获得成倍至数百倍的提高，从而对肿瘤化疗产生协同作用。有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明几个通光散苷元乙衍生物的结构示意图；
图2是本发明MT-1逆转MDR、增加细胞内药物浓度的倍数的效果图；
图3是本发明MT-1增强Hepg2/Dox细胞内阿霉素积蓄的效果图；
图4是本发明MT-1抑制HepG2/Dox细胞内Rh-123外排的效果图；
图5是本发明MT-1不能抑制HepG2/Dox细胞内Pgp的表达图；
图6是本发明MT-1增强P-gp与UIC2反应性的效果图；
图7a是本发明MT-9逆转MDR、增加细胞内药物浓度的倍数的效果图；
图7b是本发明MT-10逆转MDR、增加细胞内药物浓度的倍数的效果图；
图8是本发明20μg/ml浓度MT-1、MT-9、MT-10逆转MDR、增加细胞内药物浓度的倍数 的效果比较图。
这种MDR逆转剂为孕甾烷衍生物，具体地，是通光散苷元乙的衍生物，或二氢肉珊瑚 苷元的衍生物或通光散苷元丙的衍生物，具有如下结构通式特征：
其中，取代基A可为羟基(OH)或酯基(W-COO-)，或为如下基团之一：
3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖，3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛 吡喃糖基(1-4)]-β-D-磁麻吡喃糖，β-D-葡萄吡喃糖基(1-4)-3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基 (1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖，β-D-葡萄吡喃糖基(1-4)-3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基 (1-4)]-β-D-磁麻吡喃糖；
取代基B或D可为氢(H)，或羟基(OH)；或者，取代基B+D可为环氧基氧原子(O)；
取代基Q或R可为氢(H)，或羟基(OH)，或酯基(WCOO-)；取代基U或V可为氢 (H)，或羟基(OH)，或者，取代基U+V可为酮基氧原子(O)；取代基Y可为氢(H)，或 羟基(OH)；
其中，当取代基A或Q或R为酯基(A＝WCOO-，或Q＝WCOO-，或R＝WCOO-)时， 其中的基团W又可为如下基团之一：
甲基，乙基，丙基，丙酸基[-(CH2)3CO2H]，丁基，1-甲基丙基，1-甲基丙烯基，苯基， 对甲苯基，对羟基苯基，对甲氧基苯基，对氨基苯基，对甲基氨基苯基，对二甲基氨基苯基， 苯乙烯基，对羟基苯乙烯基，对甲氧基苯乙烯基，对氨基苯乙烯基，对甲基氨基苯乙烯基， 对二甲基氨基苯乙烯基。
例如，化合物通光散苷元乙(通光散苷元B，英文名tenacigenin B)：取代基A＝OH，取 代基Q＝R＝H，取代基B+D＝环氧基氧原子(O)，取代基U+V＝酮基氧原子(O)，取代基Y＝H；
再例如，化合物11α-O-苯甲酰基-12β-O-乙酰通光散苷元乙：取代基A＝OH，取代基Q＝ 苯基，R＝甲基，取代基B+D＝环氧基氧原子(O)，U+V＝酮基氧原子(O)，取代基Y＝H；
再例如，化合物二氢肉珊瑚苷元：取代基A＝OH，取代基Q＝H，R＝OH，取代基B＝OH， 取代基D＝OH，取代基U＝H，取代基V＝OH，取代基Y＝OH；
又例如：化合物11α-O-(2-甲基丁烯酰基)-12β-O-乙酰基通光散苷元乙3-O-[3-O-甲基-6- 脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖苷[通光藤新苷A(英文名tenacissimoside A)，又名通光散甙G(英文名tenacissoside G)]：取代基A＝3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖 基(1-4)]-β-D-夹竹桃吡喃糖，Q＝2-甲基丁烯酰氧基，R＝乙酰氧基，取代基B+D＝环氧基氧原 子(O)，U+V＝酮基氧原子(O)，取代基Y＝H。
具有结构通式所示的天然化合物及其修饰得到的衍生物，以及二者的组合，即可用作药 物制剂的活性成分，或活性成分之一，或药物赋形剂，用于制备针对肿瘤细胞多药耐药性的 多药耐药逆转剂药物，可制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液或者注射剂。
本发明所说的天然化合物，是指从植物中提取的，特别是指从萝藦科植物通光散 (Marsdenia tenacissima)提取的，符合上述化学结构通式的化合物。
本发明所说的从植物中提取，是本领域工作人员都能够掌握和采用的方法：用含水 1％-90％(体积百分数，下同)的低级醇(甲醇、乙醇、丙醇)，或含水1％-90％的丙酮，或 水饱和的丁酮、水饱和的乙酸乙酯、水饱和的氯仿、水饱和的二氯甲烷或者水饱和的正丁醇， 在室温条件下(如0℃到30℃之间)或者在加热条件下(30℃以上，最高到溶剂沸点温度) 下，从植物，特别是从萝藦科植物通光散的根茎中溶出并制成含有符合上述化学结构通式的 化合物的提取物。
本发明所说的符合上述化学结构通式的天然化合物，是指从上述提取物中，用本领域工 作人员都能够掌握和采用的柱层析方法(柱子的填料为硅胶，或辛烷基烷化硅胶，或十八烷 基烷化硅胶，或葡聚糖凝胶)分离纯化，并经过波谱解析识别和确定了结构的天然来源的孕 甾烷类化合物。
本发明所说的对天然来源的孕甾烷类化合物开展的化学反应和结构修饰，是指本领域工 作人员都能够掌握和采用的常规化学方法，包括对天然来源的孕甾烷类化合物纯品或其混合 物实施弱酸水解，断开糖链，得到3位或其它连糖位置为游离羟基的多氧孕甾酯化合物的方 法；也包括用碱水解，除去原有酯基，得到含有多个羟基的衍生物的方法；还包括将多羟基 衍生物与酸酐或酰卤反应，将游离羟基酯化，得到半合成多氧孕甾酯衍生物的方法，在本发 明的背景技术部分已经有所陈述。例如，当A＝OH，Q＝CH3CO，R＝C6H5CO时的氧孕甾酯衍生 物，即是11α-O-苯甲酰基-12β-O-乙酰基通光散苷元乙；A＝OH，Q＝R＝C6H5CO时的衍生物， 即是11α-O-，12β-O-双苯甲酰基通光散苷元乙。
本发明的特点和突出进步在于：首次公开了甾体类型肿瘤MDR逆转剂的结构通式及在 治疗具有多药耐药作用的恶性肿瘤中可能产生的协同作用。在本发明公开的符合结构通式的 化合物中还有如下规律性：芳酯化衍生物活性较强；去氧糖链外端接上葡萄糖类非去氧糖后 活性降低或丧失；结构和构型发生显著改变的人工产物通光散苷元A(tenacigenin A)不具有活 性。
本发明首次公开了孕甾烷类化合物逆转肿瘤MDR的作用。例如，当联合20μg/mL的化 合物MT-1(名称和结构后述)后，抗癌药长春碱、阿霉素、嘌呤霉素和紫杉醇在耐药的 HepG2/Dox细胞中的药物浓度分别能提高10，18，11和6倍。20μg/mL的化合物MT-9(名 称和结构后述)和化合物MT-10(名称和结构后述)则分别能够使抗癌药长春碱、阿霉素、嘌呤 霉素和紫杉醇在耐药HepG2/Dox细胞中的药物浓度提高18、54、5、15.8倍和3.3、15.9、14.2、 315.1倍。机理研究证实，孕甾烷类MDR逆转剂不是通过调节P-gp蛋白表达，而是通过干 扰P-gp的转运功能，抑制对肿瘤药底物的外排，从而提高了MDR肿瘤细胞内的抗肿瘤药物 积累。
本发明公开的C21甾体类型肿瘤MDR逆转剂，可以制成药物制剂，与抗肿瘤药物联合用 药，也可以与抗肿瘤药物制成复方制剂应用于临床，使抗肿瘤药物在多药耐药肿瘤细胞中的 浓度获得成倍至数百倍的提高，从而对肿瘤化疗产生协同作用。有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明几个通光散苷元乙衍生物的结构示意图；
图2是本发明MT-1逆转MDR、增加细胞内药物浓度的倍数的效果图；
图3是本发明MT-1增强Hepg2/Dox细胞内阿霉素积蓄的效果图；
图4是本发明MT-1抑制HepG2/Dox细胞内Rh-123外排的效果图；
图5是本发明MT-1不能抑制HepG2/Dox细胞内Pgp的表达图；
图6是本发明MT-1增强P-gp与UIC2反应性的效果图；
图7a是本发明MT-9逆转MDR、增加细胞内药物浓度的倍数的效果图；
图7b是本发明MT-10逆转MDR、增加细胞内药物浓度的倍数的效果图；
图8是本发明20μg/ml浓度MT-1、MT-9、MT-10逆转MDR、增加细胞内药物浓度的倍数 的效果比较图。
具体实施方式
以下用一些实施例进一步说明本发明的内容。但是这些实施例不得理解为对本发明 权利要求的限制。
实施例1提取分离
通光散粗粉5.0kg，加体积百分数为80％的乙醇，加热回流提取3次，每次2小时。收集 提取液，减压蒸除乙醇，加水形成悬浮液，加石油醚脱脂，分液，水相加乙酸乙酯萃取，分 取有机相，减压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏146.5g。取乙酸乙酯部位(80g)，加氯仿-甲醇混合 液溶解，行硅胶柱(粒度200-300目)层析，用氯仿∶甲醇(100∶0-0∶100，体积比)梯度洗脱， 收集洗脱液，用TLC检测分离结果，合并相近的流份，进行多次重复硅胶柱层析、C-18烷化 硅胶反相柱层析和制备HPLC分离，得到13个纯化合物MT-1至MT-13(得率0.001％至 0.05％)。通过对主要基于NMR(1D-、2D-NMR)、MS(EIMS、ESIMS)技术的波谱解析，鉴定 了下述化合物的结构。
为方便结构分析，定义通光散苷元乙(tenacigenin B)所指结构是：3β，11α，12β-三羟基 -8β，14β-环氧-5αH，9αH，17βH-孕甾-20-酮；17β-通光散苷元乙(17β-tenacigenin B)所指结构是： 3β，11α，12β-三羟基-8β，14β-环氧-5αH，9αH，17αH-孕甾-20-酮。
实施例2化合物MT-1的结构鉴定(结构式参见附图，下同)
MT-1：17βH，R＝Pachbiosyl，R1＝Tig，R2＝Ac
化合物MT-1，C42H64O14。白色无定型粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶 于水。[α]D 25-26.3(c0.076，CH3OH)，分子式为C42H64O14，ESI-MS：m/z 815.2([M+Na]+)，1H NMR(400MHz，CDCl3，δin ppm)和13C NMR数据见表1、表3。MT-1的Liebermann反应和 Keller-Kiliani反应均呈阳性，表明可能为含有2-脱氧糖的甾体苷。13C NMR(DEPT)谱显示含 有42个碳原子，包括10个甲基，8个亚甲基，16个次甲基和8个季碳。结合该植物含有21 碳甾体酯苷的生源特点分析，MT-1的化学位移值及信号多重度支持其由C21+C5+C2+C7+C7 片断构成，即为含有乙酸酯、五碳酸酯、2个甲氧基取代己醛糖的21碳甾体酯苷，NMR谱 δC101.1[δH4.655，dd(1.6，9.6)]与δC97.9[δH4.732，d(8.0)]ppm处的两组信号证实1个2，6-二脱氧 己醛糖和1个6-脱氧己醛糖存在。ESI-MS给出m/z 815.2的[M+Na]+准分子离子(基峰)，表 明分子量应为792。因此可得出分子式为C42H64O14。MT-1的ESI-MS低质量数区域出现两个 离子碎片m/z 145.1和m/z 161.1，亦表明两个糖基是2，6-脱氧糖(C7H12O3，残基质量145)、 6-脱氧-3-O-甲基己醛糖(C7H13O4，残基质量161)。MT-1分子中δC210.8的信号符合甾体20 位酮基特征；δ170.7和20.5归属为乙酰基；δ167.2表明有共轭不饱和酯存在，连同138.0、 128.6的双键和高场区14.4、12.6的甲基，应为2-甲基-2-丁烯酸酯(Tiglic acid)；HMBC谱 中，11β-H(δ5.326，t，10.0Hz)和12α-H(δ5.019，d，10.0Hz)分别与δC167.2和δC170.7的酰基碳相 关，说明2-甲基-2-丁烯酸酯和乙酸酯分别连接在苷元的11α-和12β-位。此外，2个含氧季碳 (δ66.7和δ71.8)为苷元8β，14β环氧特征。苷元部分与11α-O-2-甲基-2-丁烯酰-12β-O-乙 酰-通光散苷元乙(11α-O-tigloyl-12β-O-acetyl-tenacigenin B)一致。与文献报道的通光散新甙A (tenacissimoside A)的13C NMR数据相对照(表1)，二者完全一致[蒋毅等.通光散中的三个 新C21甾体甙.中国医药工业杂志，1996，27：391]。因此，MT-1的结构确定为11α-O-2-甲基-2- 丁烯酰-12β-O-乙酰-通光散苷元乙-3-O-β-D-3-O-甲基-6-去氧阿洛吡喃糖(1-4)-β-D-夹竹桃吡喃 糖苷。
弱酸水解反应与糖的鉴定取MT-1样品10mg溶解于甲醇2.5ml，加0.1mol/L H2SO4 水溶液2.5ml，60℃水浴搅拌60min，加水2.5ml，减压蒸出甲醇，加水饱和Ba(OH)2中和， 离心，滤液蒸干，加甲醇0.5ml溶解，TLC检查，与标准品对照，检出D-Oleandrose和 D-3-O-methyl-6-deoxyallose。
实施例3化合物MT-9、MT-10的结构鉴定
MT-9：17βH，R＝H，R1＝Bu，R2＝Ac
MT-10：17βH，R＝H，R1＝Bz，R2＝Ac
MT-9，C28H42O7。白色粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。[α]D 25-9.6 (c 0.052，CH3OH)，ESI-MS：m/z 513.1([M+Na]+)，1H NMR(400MHz，CDCl3，δin ppm)和13C NMR数据见表1、表3。化合物MT-9的13C NMR(DEPT)谱显示含有28个碳原子，其中包 括MT-8苷元部分的全部特征：C21孕甾+乙酸酯+2-甲基-2-丁烯酸酯。包括C-20酮基(δC210.8)； 乙酰基(δC170.7/20.5)，2-甲基-2-丁烯酸酯(Tiglic acid)(δC167.2，138.0，128.6，14.4，12.6)；8β，14β 环氧(δ66.7和δ71.8)等。MT-9的1H NMR谱中，δ5.330(1H，t，J＝10.0Hz)和5.013(1H，d， J＝10.0Hz)为11α-，12β-酯基取代C21甾体的11β-H、12α-H特征；2.988(1H，d，J＝7.6Hz)为 17β-H信号，0.888(3H，t，J＝7.6Hz)和1.042(3H，d，J＝7.6Hz)为2-甲基-2-丁烯酸酯4-和5-甲基 特征，其它包括1.026(3H，s，H-19)，1.035(3H，s，H-18)角甲基信号等。所以，MT-9的NMR 数据与文献报道的11α-O-2-甲基-2-丁烯酰-12β-O-乙酰-通光散苷元乙完全相同[参见文献Luo SQ，et al.Polyoxypregnanes from Marsdenia tenacissima.Phytochem，1993，34：1615]。
MT-10，C30H44O7。白色粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。[α]D 25+16.2 (c 0.037，CHCl3)，ESI-MS：m/z 533.2([M+Na]+)，1H NMR(400MHz，CDCl3，δin ppm)和13C NMR数据见表1、表3。MT-10亦为游离的C21甾体双酯苷元。1HNMR谱低场区5个芳氢 信号[δ7.920(2H，d，J＝7.6，3’，7’-H)，δ7.530(1H，t，J＝7.6，5’-H)，δ7.397(2H，t，J＝7.6，4’，6’-H)证 实苯甲酰基存在；5.581(1H，t，J＝10.0Hz)和5.095(1H，d，J＝10.0Hz)为11α-，12β-酯基取代C21 甾体的11β-H、12α-H特征，13C NMR(DEPT)谱显示，另一个酰基亦为Ac，结构类型包括 11-和12-C化学位移值与MT-9的相近似(表1和表3)；因此其结构鉴定为 11α-O-Benzoyl-12β-O-acetyltenacigenin B。前人曾将通光散根茎乙醇提取物的氯仿部位用 0.05N硫酸-50％甲醇加热回流处理，再从水解产物中分离鉴定出MT-9和MT-10[参见文献： Luo SQ，et al.Polyoxypregnanes from Marsdenia tenacissima.Phytochem，1993，34：1615]。我们的 研究结果则表明，通光散植物中存在这2个成分的原形结构。
表1化合物MT-1、MT-9和MT-10的13C NMR数据
(100MHz，以TMS作为内标) 化合物I# C5D5N* MT-8 (CD3)2CO* MT-1 C5D5N* MT-9 (CD3)2CO* MT-10 CHCl3 * 1CH2 37.7 37.6 37.7 38.6 37.3 2CH2 29.7 30.1 29.7 32.0 31.3 3CH 76.1 76.6 76.1 70.2 70.4 4CH2 35.2 35.7 35.10 39.5 38.3 5CH 43.9 44.5 43.8 44.8 44.0 6CH2 27.2 27.6 27.2 27.6 26.6 7CH2 25.2 25.4 25.2 32.6 31.8 8C 66.7 67.0 66.8 67.0 66.9 9CH 51.8 52.0 51.8 52.3 51.2 10C 39.3 39.7 39.4 39.8 38.9 11CH 69.0 69.2 69.1 69.1 69.6 12CH 75.1 75.1 75.1 75.3 75.1 13C 46.1 46.6 46.1 46.5 45.8 14C 71.7 72.1 71.7 71.9 71.4 15CH2 32.1 32.5 32.1 27.3 26.5 16CH2 27.2 27.4 27.2 25.4 25.0 17CH 59.7 60.3 59.6 60.4 59.8 18CH3 16.9 17.1 16.9 17.0 16.6 19CH3 13.0 13.1 13.1 13.2 12.7 20C 210.2 210.4 210.3 210.2 210.8 21CH3 30.2 30.1 30.2 29.4 30.1 Acyl1 Tig Tig Tig Bu Bz 1’ 167.2 167.6 167.2 175.6 165.9 2’ 129.0 128.9 129.1 41.9 130.0 3’ 138.2 138.5 138.2 26.9 129.6 4’ 12.1 12.0 12.1 12.0 128.5 5’ 14.3 14.4 14.3 15.7 133.2 6’ 128.5 7’ 129.6 Acyl2 Ac Ac Ac Ac Ac 1” 170.7 170.6 170.7 171.0 170.7 2” 20.4 21.5 20.5 20.9 20.4 Sug1 Ole Ole Ole 1CH 97.5 97.9 97.5 2CH2 37.7 38.2 37.7 3CH 79.5 79.9 79.6 4CH 83.1 82.3 83.2 5CH 71.9 71.9 72.0 6CH3 18.6 18.3 18.6 OCH3 57.0 56.8 57.1 Sug1 Allo Allo Allo 1’ 101.9 101.1 102.0 2’ 73.2 73.0 73.3 3’ 84.0 83.2 84.1 4’ 74.5 74.3 74.6 5’ 70.9 71.2 71.0 6’ 19.1 19.0 19.1 OCH3 62.0 62.0 62.0
注：化合物I#是文献报道的通光散新甙A(tenacissimoside A)，即通光散甙G(tenacisside G)。数据引自 文献[蒋毅等.通光散中的三个新C21-甾体甙.中国医药工业杂志，1996，27：391；Chen.JJ，et al.New C21 steroidal glycosides from Marsdenia Tenacissima.Acta Botanica Yunnanica，1999，21：369]：*为溶剂。
实施例4化合物MT-4的结构鉴定
MT-4：17αH，R＝Pachbiosyl，R1＝R2＝H；
C35H56O12。白色无定型粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。[α]D 25+5.3 (c 0.077，CH3OH)，ESI-MS：m/z 691.2([M+Na]+)，1H NMR(400MHz，CDCl3，δin ppm)和13C NMR数据见表1、表3。化合物MT-4的Liebermann反应和Keller-Kiliani反应均呈阳性，表 明可能为含有2-脱氧糖的甾体苷。13C NMR(DEPT)谱显示含有35个碳原子，包括7个甲基， 8个亚甲基，15个次甲基和5个季碳。与MT-1参照，MT-4的化学位移值及信号多重度支持 其由C21+C7+C7片断构成，即C21甾体双去氧糖苷。糖部分δC97.5[δH4.568，dd(1.2，9.6)]与 δC102.1[δH4.776，d(8.0)]ppm处的两组端基信号，糖部分其它位置的NMR信号与MT-1的完 全一致(表2、表3)。MT-4的ESI-MS给出m/z691.2的[M+Na]+准分子离子(基峰)，表明分 子量应为668，联合NMR分析可得出分子式C35H64O14。苷元部分的13C NMR与文献[2]报道 的tenacissoside F[tenacigenin B 3-O-β-D-3-O-methyl-6-deoxyall-opyranosyl (1-4)-β-D-oleandropyranoside]对照，MT-4的C-12化学位移值(δ79.6)和C-17化学位移值(δ62.9) 分别比tenacissoside F偏低场5.0和3.1ppm，同时18-CH3化学位移值(δ11.3)比tenacissoside F偏高场7.1ppm。与17β-tenacigenin B以及17β-tenacigenin C 3-O-β-D-3-O-methyl-6-deoxyallopyranosyl(1-4)-β-D-oleandropyranoside的相应碳原子化学位移 值相吻合[Deng J，et al.Marsdenosides A-H，polyoxypregnane glycosides from Marsdenia tenacissima.Phytochem，2005，66：1040]，因此，化合物MT-4的结构确定为17β-tenacigenin B 3-O-β-D-3-O-methyl-6-deoxyallopyranosyl(1-4)-β-D-oleandropyranoside，是个新化合物。
实施例5化合物MT-12的结构鉴定
MT-12：17βH，R＝Pachbiosyl，R1＝R2＝H
C35H56O12。白色无定型粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。[α]D 25- 25.3(c 0.075，CHCl3)，ESI-MS：m/z 691.3([M+Na]+)，1H NMR(400MHz，CDCl3，δin ppm)和 13C NMR数据见表1、表3。
实施例6化合物MT-13的结构鉴定
MT-13：17βH，R＝Pachbiosyl，R1＝R2＝Ac
化合物MT-13，C39H60O14。白色无定型粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不 溶于水。[α]D 25-13.2(c 0.136，CHCl3)，ESI-MS：m/z 775.3([M+Na]+)，1H NMR(400MHz， CDCl3，δin ppm)和13C NMR数据见表1、表3。化合物MT-13的13C NMR(DEPT)谱显示含 有39个碳原子。结合1H NMR可见其包括tenacigenin B类型苷元的特征；端基为δC97.5[δH 4.568，dd(1.2，9.6)]与δC102.1[δH4.776，d(8.0)]的双去氧糖Pachbiose的特征(表2、表3)。与 MT-8对照，唯一不同的地方是有两个乙酸酯。所以，MT-13的结构确定为11α-，12β-O，O-乙 酰通光散苷元乙3-O-β-D-3-O-甲基-6-去氧阿洛吡喃糖(1-4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷[参见文献 Deng J，et al.Marsdenosides A-H，polyoxypregnane glycosides from Marsdenia tenacissima. Phytochem，2005，66：1040]。
表2化合物MT-4、MT-12、MT-13和MT-2的13CNMR化学位移
(以TMS作为内标) MT-4 125MHz， C5D5N* MT-12 125MHz， C5D5N* MT-13 125MHz， C5D5N* MT-2 100MHz， CHCl3 * 1CH2 39.2 39.1 37.8 37.6 2CH2 29.9 30.0 29.8 29.0 3CH 76.5 76.7 76.0 76.1 4CH2 35.2 35.2 35.2 36.2 5CH 44.9 44.9 43.8 43.9 6CH2 28.1 29.9 27.1 26.2 7CH2 33.0 28.3 32.0 24.9 8C 66.1 66.2 66.6 66.8 9CH 54.4 54.5 51.5 51.2 10C 39.7 39.6 39.0 39.1 11CH 68.1 68.0 68.8 69.2 12CH 79.6 74.5 75.0 75.6 13C 48.5 48.5 46.0 45.8 14C 71.7 71.9 71.6 15CH2 27.6 27.7 27.0 32.5 16CH2 25.5 25.6 25.1 26.7 17CH 62.9 60.7 59.8 60.2 18CH3 11.3 18.4 19.1 16.8 19CH3 13.2 13.3 13.0 12.7 20C 210.2 211.4 210.1 210.6 21CH3 32.4 32.9 30.0 29.7 Ac Bz 1’ 170.2 166.0 2’ 20.4 130.0 3’ 129.6 4’ 128.5 5’ 133.2 6’ 128.5 7’ 129.6 Ac Bu 1” 170.6 175.7 2” 21.2 41.3 3” 26.4 4” 11.8 5” 15.3 Ole Ole Ole Ole 1 97.5 97.6 97.6 96.9 2CH2 37.8 37.9 37.5 37.4 3 81.2 79.6a 79.6 79.1 4 83.3 83.3 84.0 82.2 5 72.0 71.9 72.0 71.9 6 18.6 18.6 18.6 18.0 OCH3 57.1 57.1 57.1 56.8 Allo Allo Allo Allo 1’ 102.1 102.1 102.0 100.0 2’ 73.3 73.3 74.6 73.0 3’ 84.0 84.0 83.2 83.2 4’ 74.6 74.6 73.3 74.3 5’ 71.0 70.9 70.9 71.2 6’ 19.1 19.1 16.8 18.5 OCH3 62.1 62.1 62.0 62.0 Glc 1” 104.3 2” 75.5 3” 78.4 4” 72.0 5” 78.4 6” 61.6
*为溶剂
表3化合物MT-1、MT-4、MT-9、MT-10、MT-12和MT-13的1H NMR化学位移
[400MHz，以CDCl3为溶剂，以TMS作为内标，δin ppm(J in Hz)] H at MT-9 MT-10 MT-4 MT-12 MT-13 MT-1 C-3 3.519m 3.535hept 3.774m 3.775m 3.774m 3.53m C-11 5.330t(10.0) 5.581t(10.0) 3.583t(9.6) 3.583t(9.6) 5.297t(10.0) 5.386t(10.0) C-12 5.013d(10.0) 5.095d(10.0) 3.560d(9.6) 3.560d(9.6) 4.928d(10.0) 4.978d(10.0) C-17 2.988d(7.6) 2.925d(7.6) 2.575dd(11.6，8.0) 2.575dd(11.6，8.0) 2.915d(7.6) 2.907d(7.2) C-18 1.026s 0.994s 0.898s 1.021s 1.020s 1.025s C-19 1.035s 1.017s 1.011s 1.132s 1.067s 1.037s C-21 2.829s 2.180s 2.234s 2.254s 2.178s 2.171s Acyl1 Bu Bz Ac Tig C-3’ 7.920d(7.6) 1.961s 6.736q(7.6) (C-2’) C-4’ 0.888t(7.6) 7.397t(7.6) 1.743brs C-5’ 1.042d(7.6) 7.530t(7.6) 1.749s C-6’ 7.397t(7.6) C-7’ 7.920d(7.6) Acyl2 Ac Ac Ac Ac C-2” 2.115s 1.576s 1.923s 1.893s Sug1 Ole Ole Ole Ole C-1 4.568dd(1.2，9.6) 4.570dd(1.2，9.6) 4.560dd(1.2，9.6) 4.552dd(1.2， 9.6) C-6 1.235d(6.4) 1.237d(6.4) 1.236d(6.4) OCH3 3.353s 3.356s 3.355s 3.350s Sug2 Allo Allo Allo Allo C-1’ 4.776d(8.0) 4.777d(8.0) 4.780d(8.0) 4.776d(8.0) C-6’ 1.341d(6.0) 1.357d(6.0) 1.344d(5.2) OCH3 3.640s 3.641s 3.643s 3.640s
实施例7肿瘤细胞MDR逆转剂活性的检测方法
1、药物与试剂
阿霉素(Doxorubicin)、长春碱(vinblastine)、嘌呤霉素(puromycin)、紫杉醇(paclitaxel)、维 拉帕米(verapamil)、罗丹明(rhodamine 123)和硫氰酸盐B(Sulforhodamine B)及其它化学试剂 购自Sigma/Aldrich公司(St.Louis，MO，USA)；碘化丙啶(PI)购自Molecular Probes；RPMI 1640 培养基，胎牛血清(FBS)和双抗为GibcoBRL产品(Invitrogen Coporation，USA)。
2、细胞系与细胞培养
人肝癌细胞系HepG2及其多药耐药株HepG2/Dox培养于含10％FBS和100U抗生素的 RPMI1640培养液中，并置于饱和湿度，含5％二氧化碳的37℃培养箱中。HepG2/Dox细胞 培养在含1.2μM阿霉素的培养液中以维持其耐药性，测试前7天撤去阿霉素。
3、增殖抑制试验
3.1药物应用：将待检测细胞分散成单个细胞悬液，按5×103细胞/孔分种于96孔板， 24小时后换用含药培养液，每3孔为一个检测浓度。药物与细胞作用72小时后用 sulforhodamine B(SRB)法测定药物细胞毒性，实验另设培养液空白对照组-I及未加药处理的 细胞对照组-II。
3.2SRB法测定药物对细胞生长的半数抑制浓度(IC50)：药物处理后的细胞用预冷的 50％三氯乙酸于4℃固定一小时，弃去固定液，蒸馏水洗漂5次，晾干。用0.4％的SRB染色 10分钟，再1％的乙酸洗去多余的染色液并风干。最后，将与细胞结合的SRB溶解于10mM 的Tris缓冲溶液(pH10.5)中，与515nm波长出测定吸光度A值，此时SRB的颜色强度与 细胞数目呈正相关，可以此作为细胞数量进行估算比较。细胞存活率(％)＝(实验孔A值/ 对照孔-IIA值)×100％，IC50为细胞存活率为50％时的药物浓度。
4、MDR逆转效果评价
待测样品的MDR逆转能力通过比较肿瘤药物与代测样品联合使用前后肿瘤药物IC50的 降低倍数作为评价。P-gp调节剂维拉帕米作为阳性对照药，含有代测样品的培养液作为阴性 对照。所有试验至少重复三次。
5、细胞周期分布
2×105/ml浓度的细胞悬液培养在35mm培养皿中，培养过夜。加入不含有药物或含有各 种浓度药物的培养液1ml，继续培养48小时。收集细胞，离心，PBS漂洗一次，用70％的乙 醇于-20℃固定过夜。固定后的细胞再次离心并重悬于1ml含有100μg/mL Rnase的PBS中， 37℃孵化30分钟。加入终浓度为40μg/mL的PI染色剂，室温放置5-10分钟。细胞样品最 后置于12×75的Faclon管中用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。
6、细胞内阿霉素积蓄
1×106个细胞悬浮于1mL含10μM阿霉素的培养液中，加入不同浓度待测样品，37℃ 培养1h，孵育后细胞用冰浴PBS漂洗两次，然后重悬于1ml冰浴PBS中。于FACSCAN流 式细胞仪(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)测定细胞内阿霉素荧光强 度，分析待测样品对阿霉素在细胞内继续的影响。数据分析运用Macintosh CellQuest software 软件。P-gp抑制剂维拉帕米作为阳性对照。
7、细胞内药物外排
细胞内罗丹明-123外排：1×106个细胞悬浮于1ml含5μg/mL罗丹明-123的培养液中， 于37℃培养1小时。吸收罗丹明之后的细胞用冰浴PBS漂洗两次，重悬于不含罗丹明的新 鲜培养液中，加入或不加入不同浓度的待测样品，于37℃培育1小时。细胞用冰浴PBS漂 洗两次，重悬于1ml冰浴PBS中，于流式细胞仪测定细胞内罗丹明-123的荧光强度，分析待 测样品对药物外排的影响。维拉帕米作为P-gp抑制剂阳性对照。
细胞内H33342外排：HepG2/Dox细胞以每孔5×104个接种于96孔板中，培养过夜。 贴壁后的细胞改用含20μg/mL H33342的新鲜培养液，37℃继续培养1小时。细胞以冰浴 PBS轻柔洗涤两次，加入含有不同浓度待测样品的新鲜培养液，37℃培养1小时，再以冰浴 PBS冲洗两次后用，于λex＝365nm，λem＝460nm处测定每孔的荧光强度，分析待测样品对药 物外排的影响。
8、蛋白印记分析法检测P-gp表达
HepG2/Dox细胞分别于不含或者含有5μg/mL，10μg/mL或20μg/mL待测药物MT-1的 培养液中培养72小时。收集细胞置入冰浴裂解缓冲液(50mM Tris pH7.4，100mM NaCl，1 mM EDTA，5％Glycerol，0.5mM MgCl2，0.5％NP 40，0.05％SDS，1mM PMS F，1μg/ml leupeptin， 1％aprotinin，1％pepstatin A，2mM Na3VO4 and 50mM NaF)中20分钟后，离心，收集上清液， 用Bradford法测定蛋白质浓度。
在上清中加入1/4体积的5×buffer(50mM Tris-HCl pH6.8，40％Glycerol，5％SDS，0.05％ Pyronin Y and 1％2-Mercaptoethanol)，在37℃温浴10min以变性蛋白(可保存于-80℃备用)。 将变性后的样品(含50μg蛋白)经10％的SDS-PAGE分离，随后电转移至硝化纤维膜上。 用4％脱脂牛奶/0.1％Tween-20/TBS(10mM Tris pH7.5，100mM NaCl)封闭封闭该膜，随后 在室温下加入抗-P-gp抗体反应1小时，再在室温下加入辣根过氧化酶标记的二级抗体反应1 小时，最后被抗体标记的蛋白通过ECL方法检测蛋白条带。
实施例8MT-1对多药耐药肿瘤细胞的MDR逆转活性及其机理
1、MT-1可显著增加HepG2/Dox细胞对P-gp底物药物的敏感性
以四种P-gp底物抗肿瘤药物长春碱、阿霉素、嘌呤霉素和紫杉醇单独或联合20μg/mL， 10μg/mL或5μg/mL的MT-1给药HepG2/Dox耐药细胞株及其敏感株。72小时后测定IC50 值，分析MT-1对细胞耐药性的影响。结果表明，相对于敏感株，耐药细胞株显示出极高的 抗肿瘤药物耐药性，HepG2/Dox细胞对四种药物的耐药率(＝IC50(MDR)/IC50(sensitive))分别达 到1000倍(长春碱)，121倍(阿霉素)，119倍(嘌呤霉素)和226倍(紫杉醇)(表4)。
MT-1(分子量792)单独使用时对耐药株和敏感株均无显著细胞增值抑制作用 (IC50＞80μg/mL)。然而当MT-1与抗肿瘤药物联合作用于细胞时，能明显增强耐药细胞的化学 敏感性。如表5所示，5μg/mL(6.3μM)的MT-1即可中等程度的增强耐药细胞的药物敏感性。 而在20μg/mL(25.3μM)的MT-1存在下，长春碱、阿霉素、嘌呤霉素和紫杉醇对HepG2/Dox 细胞的IC50值分别下降了10、18、11和6倍，逆转MDR活性高于4μM阳性对照维拉帕米。 4μM维拉帕米存在下，四种药物的IC50值下降倍数分别为4.6，5.7，7.6和4.9倍。MT-1的 MDR逆转活性具有剂量依赖性。
同样条件下，MT-1不能增强敏感细胞株HepG2的化学敏感性(表5)。表明MT-1的 MDR逆转作用与对P-gp的调节有关。
表4肿瘤药物抑制敏感肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞的活性 Table 4 Cytotoxic study of Vinblastine anticancer drugs against Doxorubicin human cancer Puromycin cells(IC50，μM) Paclitaxel HepG2 2.64±0.67 (×10-4) 0.07±0.06 0.17±0.07 6.07±2.61 (×10-3) HepG2/Dox 0.26±0.08 8.46±4.02 20.17±6.95 1.37±0.47 Resistant ratio 1000 121 119 226
Resistant ratio＝IC50(MDR)/IC50(Sensitive)
表5MT-1对肿瘤药物抑制耐药性肿瘤细胞效果的增强作用
Table5.Effect of MT-1 on increasing drug sensitivity in HepG2/Dox cells(IC50，μM) HepG2/Dox HepG2 IC50(μM) Sensitivity increaseda IC50(μM) Sensitivity increaseda Vinblastine With MT-1 20μg/ml (25.3μM) With MT-1 10μg/ml (12.7μM) With MT-1 5μg/ml (6.3μM) With Verapamil (4μM) Doxorubicin With MT-1 20μg/ml (25.3μM) With MT-1 10μg/ml (12.7μM) With MT-1 5μg/ml (6.3μM) With Verapamil (4μM) Puromycin With MT-1 20μg/ml (25.3μM) With MT-1 10μg/ml (12.7μM) With MT-1 5μg/ml (6.3μM) With Verapamil (4μM) Paclitaxel With MT-1 20μg/ml (25.3μM) With MT-1 10μg/ml (12.7μM) With MT-1 5μg/ml (6.3μM) With Verapamil (4μM) 0.264±0.079 0.026±0.016 0.113±0.037 0.186±0.045 0.059±0.020 8.64±4.02 0.48±0.21 1.12±0.74 3.22±2.72 1.52±0.51 20.17±6.95 1.76±1.41 2.90±1.10 7.66±3.92 2.65±0.66 1.37±0.47 0.24±0.31 0.30±0.17 0.81±0.20 0.28±0.07 10.1 2.3 1.4 4.5 18.0 7.7 2.7 5.6 11.5 7.0 2.6 7.6 5.7 4.6 1.7 4.9 2.64±0.67(×10-4) 2.41±0.88(×10-4) - - 3.38±1.07(×10-4) 0.17±0.09 0.15±0.03 - - - 0.21±0.03 0.20±0.03 - - - 5.94±2.68(×103) 5.42±1.91(×103) - - - 1.1 - - 0.8 1.1 - - - 1.1 - - - 1.1 - - -
2、MT-1可增强阿霉素诱导的HepG2/Dox细胞G2/M期停滞
P-gp抑制剂本身对细胞周期无影响，但通过对P-gp的调节能增强细胞内底物药的积蓄， 增强药物原有的药理作用，由此逆转细胞的耐药性。为了证明MT-1及类似化合物是否通过 调节P-gp逆转MDR，我们测定了MT-1对阿霉素诱导的HepG2/Dox细胞周期停滞的作用。 阿霉素是拓扑异构酶II抑制剂，可以诱导细胞周期停滞于G2/M期。如表6所示，0.2μM阿 霉素即可获得HepG2细胞G2/M期的完全静止，而在HepG2/Dox细胞中，由于P-gp对阿霉 素的外排作用，要达到相应效果所需要阿霉素的浓度为50μM。若MT-1可以调节P-gp，则 可以抑制阿霉素的转运从而增加耐药细胞内药物浓度，也就相应增强了阿霉素对细胞周期的 静止作用。
试验结果显示MT-1不能影响细胞周期，却可明显增强阿霉素诱导的HepG2/Dox细胞 G2/M期静止：1μM阿霉素单独应用对细胞周期的作用较弱，而联合5μg/mL，10μg/mL and 20μg/mL的MT-1一同给药后，细胞处于G2/M期的时间呈剂量依赖性。20μg/mL的MT-1 可以辅助阿霉素获得完全G2/M期静止。结果进一步证明了MT-1逆转MDR机制与P-gp调 节有关。
表6MT-1辅助阿霉素对耐药性HepG2/Dox细胞的细胞周期产生静止的效果
Table 6 Effect of MT-1 on doxorubicin-induced cell cycle arrest in HepG2/Dox cells Cell line Drug treatment Cell cycle distribution(％) SubG1 G0/G1 S G2/M HepG2 Control 0.2μM Dox 1.88±1.03 0.92±0.45 60.34±3.59 4.92±0.91 10.06±0.78 8.89±0.83 22.59±0.96 76.57±1.32 Control 1μMDox 10μM Dox 50μM Dox 20μ/mL MT-1 1.71±0.14 2.37±0.34 3.36±0.17 4.88±0.75 3.00±0.86 54.91±3.76 51.33±0.92 24.81±0.23 12.05±5.08 49.29±1.54 9.90±4.12 7.74±3.57 6.86±1.80 5.58±1.34 7.24±2.31 32.79±2.11 33.47±0.17 60.80±0.79 73.43±9.00 32.03±3.42 1μM Dox+MT-1 5μg/mL 10μg/mL 20μg/mL 3.51±0.69 3.54±1.55 7.61±1.78 39.82±2.81 24.48±1.72 8.93±3.10 6.78±1.47 6.26±4.84 5.09±2.64 44.18±3.49 63.63±3.13 72.96±4.56
3、MT-1具有增强MDR细胞内药物积蓄、降低药物外排的作用
P-gp调节剂能抑制P-gp的转运功能，增加耐药细胞内药物的浓度。试验结果表明，MT-1 能增强HepG2/Dox细胞对阿霉素的摄入，减少细胞内罗丹明-123和Hoechst 33342的外排， 并呈剂量依赖性。
药物摄入：HepG2/Dox细胞经10μM阿霉素分别联用不同浓度的MT-1或维拉帕米处理， 细胞对阿霉素的摄入如图3所示，MT-1在提高阿霉素的HepG2/Dox细胞摄入中显示出弱于 维拉帕米但仍然呈剂量依赖性的活性。
药物的外排：P-gp具有多个药物结合位点，不同结构类型的底物可结合于不同的位点。 罗丹明-123和Hoechst 33342是分别结合于P-gp的R-位点和H-位点的两个荧光底物，在本试 验测试MT-1对P-gp转运外排的影响。试验结果表明，MT-1能明显减弱细胞内罗丹明-123 或Hoechst 33342的外排，增加其在耐药细胞内的残留。MT-1的这一活性弱于维拉帕米，但 具有剂量依赖性。在80μg/ml的MT-1存在下，细胞内罗丹明-123的残留量增加为90％，而 在10μM的维拉帕米存在下，罗丹明-123的残留量增加达210％(图4)。
4、MT-1不影响耐药细胞中P-gp表达水平
另外一种逆转P-gp介导的MDR的路径是抑制细胞内P-gp的表达。在实验中我们通过蛋 白印记(Western blot)法分析了MT-1对于P-gp表达的活性。结果表明，HepG2/Dox细胞分别 用5μg/mL、10μg/mL或者20μg/mL的MT-1作用72小时后，细胞内P-gp表达水平没有 变化(图5)。说明MT-1不能抑制MDR1基因的表达，对P-gp介导的MDR的逆转是通过抑 制P-gp的转运功能实现的。
5、MT-1显示具有底物样活性
上述实验提示MT-1与P-gp有相互作用，但不能提示与P-gp的作用机制。MDR1反应 性位移分析法(MDR1 reactivity shift assay)是通过对P-gp与单克隆抗体UIC2的反应性的检 测，间接反映MDR逆转剂与P-gp相互作用。UIC2是一个对P-gp构象敏感的单克隆抗体， 作用于P-gp位于细胞膜外的糖支链，并优先识别结合了底物或者竞争性抑制剂的P-gp构象。 与底物或者竞争性抑制剂结合的P-gp构象改变能增加UIC2与P-gp的结合，而由于非底物作 用于P-gp变构位点导致的P-gp构象改变，则减弱UIC2与P-gp的结合。P-gp与UIC2的反 应可通过荧光标记的第二抗体进行观察。试验结果表明，P-gp底物环孢霉素A能增加 HepG2/Dox细胞的荧光强度；非底物物质钒酸钠(Na3VO4)与P-gp的结合能减少细胞的荧 光强度。而MT-1在试验中显示出底物样活性，在10μg/mL，20μg/mL或者40μg/mL时都能 增强细胞的荧光强度(图6)，提示MT-1可能作用于P-gp底物结合位点。
实施例8MT-9和MT-10对多药耐药肿瘤细胞的MDR逆转活性
在确定多药耐药细胞株HepG2/Dox对四种抗肿瘤药物长春碱、阿霉素、嘌呤霉素和紫杉 醇显示出极高的耐药性[耐药率＝IC50(MDR)/IC50(sensitive)]分别达到1000倍(长春碱)，121倍 (阿霉素)，119倍(嘌呤霉素)和226倍(紫杉醇)]并系统研究了C21甾体类MDR逆转剂MT-1之 后，我们用同样的方法测定了类似结构的MT-9和MT-10在逆转HepG2/Dox细胞对该四种抗 肿瘤药物耐药性的作用。
结果如下：
MT-9(分子量为490)和MT-10(分子量为510)单独使用对耐药株和敏感株均无任何 细胞增值抑制作用(IC50＞100μg/mL)。然而当二者分别联合抗肿瘤药物共同作用于HepG2/Dox 细胞时，细胞的化学敏感性被明显提高，并呈剂量依赖关系：
在HepG2/Dox细胞中，5、20μg/mL(10.2、40.8μM)的MT-9联合长春碱，能使后者在细 胞中的浓度分别提高3.9和18.0倍；当联合阿霉素时，能使后者在HepG2/Dox细胞中的浓度 分别提高3.0和5.0倍；当联合嘌呤霉素时，能使后者在HepG2/Dox细胞中的浓度分别提高 1.9和3.3倍；当联合紫杉醇时，能使后者的药物浓度分别提高3.3和14.2倍；
在HepG2/Dox细胞中，5、10、20μg/mL(9.8、19.6、39.2μM)的MT-10联合长春碱，能 使后者在细胞中的浓度分别提高6.8、13.5和54.0倍；当联合阿霉素时，能使后者在HepG2/Dox 细胞中的浓度分别提高4.6、10.1和15.8倍；当联合嘌呤霉素时，能使后者在HepG2/Dox细 胞中的浓度分别提高9.0、7.9和15.9倍；当联合紫杉醇时，能使后者的药物浓度分别提高19.9、 41.7和315.1倍(表7和图7a、7b、8)。
表7MT-9和MT-10增加药物在HepG2/Dox细胞中药物敏感性的效果(IC50，μM)
Table 7 Effect of MT-9 and MT-10 on increasing drug sensitivity
in HepG2/Dox cells(IC50，μM) Treatment Vinblastine(μM) Doxorubicin(μM) Puromycin(μM) Paclitaxel(μM) Mean STDEV Mean STDEV Mean STDEV Mean STDEV control MT-9＝5ug/ml (10.2μM) MT-9＝20ug/ml (40.8μM) MT-10＝5ug/ml (9.8μM) MT-10＝10ug/ml (19.6μM) MT-10＝20ug/ml (39.2μM) 0.54 0.14 0.03 0.08 0.04 0.01 0.24 0.06 0.01 0.05 0.04 0.01 39.11 13.03 7.87 8.44 3.86 2.47 10.07 6.66 2.83 9.56 2.65 1.55 80.83 41.58 24.64 8.98 10.18 5.08 11.97 7.54 6.18 2.10 5.04 3.14 6.303 1.917 0.443 0.317 0.151 0.020 1.815 0.735 0.065 0.195 0.126 0.025
实施例1提取分离
通光散粗粉5.0kg，加体积百分数为80％的乙醇，加热回流提取3次，每次2小时。收集 提取液，减压蒸除乙醇，加水形成悬浮液，加石油醚脱脂，分液，水相加乙酸乙酯萃取，分 取有机相，减压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏146.5g。取乙酸乙酯部位(80g)，加氯仿-甲醇混合 液溶解，行硅胶柱(粒度200-300目)层析，用氯仿∶甲醇(100∶0-0∶100，体积比)梯度洗脱， 收集洗脱液，用TLC检测分离结果，合并相近的流份，进行多次重复硅胶柱层析、C-18烷化 硅胶反相柱层析和制备HPLC分离，得到13个纯化合物MT-1至MT-13(得率0.001％至 0.05％)。通过对主要基于NMR(1D-、2D-NMR)、MS(EIMS、ESIMS)技术的波谱解析，鉴定 了下述化合物的结构。
为方便结构分析，定义通光散苷元乙(tenacigenin B)所指结构是：3β，11α，12β-三羟基 -8β，14β-环氧-5αH，9αH，17βH-孕甾-20-酮；17β-通光散苷元乙(17β-tenacigenin B)所指结构是： 3β，11α，12β-三羟基-8β，14β-环氧-5αH，9αH，17αH-孕甾-20-酮。
实施例2化合物MT-1的结构鉴定(结构式参见附图，下同)
MT-1：17βH，R＝Pachbiosyl，R1＝Tig，R2＝Ac
化合物MT-1，C42H64O14。白色无定型粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶 于水。[α]D 25-26.3(c0.076，CH3OH)，分子式为C42H64O14，ESI-MS：m/z 815.2([M+Na]+)，1H NMR(400MHz，CDCl3，δin ppm)和13C NMR数据见表1、表3。MT-1的Liebermann反应和 Keller-Kiliani反应均呈阳性，表明可能为含有2-脱氧糖的甾体苷。13C NMR(DEPT)谱显示含 有42个碳原子，包括10个甲基，8个亚甲基，16个次甲基和8个季碳。结合该植物含有21 碳甾体酯苷的生源特点分析，MT-1的化学位移值及信号多重度支持其由C21+C5+C2+C7+C7 片断构成，即为含有乙酸酯、五碳酸酯、2个甲氧基取代己醛糖的21碳甾体酯苷，NMR谱 δC101.1[δH4.655，dd(1.6，9.6)]与δC97.9[δH4.732，d(8.0)]ppm处的两组信号证实1个2，6-二脱氧 己醛糖和1个6-脱氧己醛糖存在。ESI-MS给出m/z 815.2的[M+Na]+准分子离子(基峰)，表 明分子量应为792。因此可得出分子式为C42H64O14。MT-1的ESI-MS低质量数区域出现两个 离子碎片m/z 145.1和m/z 161.1，亦表明两个糖基是2，6-脱氧糖(C7H12O3，残基质量145)、 6-脱氧-3-O-甲基己醛糖(C7H13O4，残基质量161)。MT-1分子中δC210.8的信号符合甾体20 位酮基特征；δ170.7和20.5归属为乙酰基；δ167.2表明有共轭不饱和酯存在，连同138.0、 128.6的双键和高场区14.4、12.6的甲基，应为2-甲基-2-丁烯酸酯(Tiglic acid)；HMBC谱 中，11β-H(δ5.326，t，10.0Hz)和12α-H(δ5.019，d，10.0Hz)分别与δC167.2和δC170.7的酰基碳相 关，说明2-甲基-2-丁烯酸酯和乙酸酯分别连接在苷元的11α-和12β-位。此外，2个含氧季碳 (δ66.7和δ71.8)为苷元8β，14β环氧特征。苷元部分与11α-O-2-甲基-2-丁烯酰-12β-O-乙 酰-通光散苷元乙(11α-O-tigloyl-12β-O-acetyl-tenacigenin B)一致。与文献报道的通光散新甙A (tenacissimoside A)的13C NMR数据相对照(表1)，二者完全一致[蒋毅等.通光散中的三个 新C21甾体甙.中国医药工业杂志，1996，27：391]。因此，MT-1的结构确定为11α-O-2-甲基-2- 丁烯酰-12β-O-乙酰-通光散苷元乙-3-O-β-D-3-O-甲基-6-去氧阿洛吡喃糖(1-4)-β-D-夹竹桃吡喃 糖苷。
弱酸水解反应与糖的鉴定取MT-1样品10mg溶解于甲醇2.5ml，加0.1mol/L H2SO4 水溶液2.5ml，60℃水浴搅拌60min，加水2.5ml，减压蒸出甲醇，加水饱和Ba(OH)2中和， 离心，滤液蒸干，加甲醇0.5ml溶解，TLC检查，与标准品对照，检出D-Oleandrose和 D-3-O-methyl-6-deoxyallose。
实施例3化合物MT-9、MT-10的结构鉴定
MT-9：17βH，R＝H，R1＝Bu，R2＝Ac
MT-10：17βH，R＝H，R1＝Bz，R2＝Ac
MT-9，C28H42O7。白色粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。[α]D 25-9.6 (c 0.052，CH3OH)，ESI-MS：m/z 513.1([M+Na]+)，1H NMR(400MHz，CDCl3，δin ppm)和13C NMR数据见表1、表3。化合物MT-9的13C NMR(DEPT)谱显示含有28个碳原子，其中包 括MT-8苷元部分的全部特征：C21孕甾+乙酸酯+2-甲基-2-丁烯酸酯。包括C-20酮基(δC210.8)； 乙酰基(δC170.7/20.5)，2-甲基-2-丁烯酸酯(Tiglic acid)(δC167.2，138.0，128.6，14.4，12.6)；8β，14β 环氧(δ66.7和δ71.8)等。MT-9的1H NMR谱中，δ5.330(1H，t，J＝10.0Hz)和5.013(1H，d， J＝10.0Hz)为11α-，12β-酯基取代C21甾体的11β-H、12α-H特征；2.988(1H，d，J＝7.6Hz)为 17β-H信号，0.888(3H，t，J＝7.6Hz)和1.042(3H，d，J＝7.6Hz)为2-甲基-2-丁烯酸酯4-和5-甲基 特征，其它包括1.026(3H，s，H-19)，1.035(3H，s，H-18)角甲基信号等。所以，MT-9的NMR 数据与文献报道的11α-O-2-甲基-2-丁烯酰-12β-O-乙酰-通光散苷元乙完全相同[参见文献Luo SQ，et al.Polyoxypregnanes from Marsdenia tenacissima.Phytochem，1993，34：1615]。
MT-10，C30H44O7。白色粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。[α]D 25+16.2 (c 0.037，CHCl3)，ESI-MS：m/z 533.2([M+Na]+)，1H NMR(400MHz，CDCl3，δin ppm)和13C NMR数据见表1、表3。MT-10亦为游离的C21甾体双酯苷元。1HNMR谱低场区5个芳氢 信号[δ7.920(2H，d，J＝7.6，3’，7’-H)，δ7.530(1H，t，J＝7.6，5’-H)，δ7.397(2H，t，J＝7.6，4’，6’-H)证 实苯甲酰基存在；5.581(1H，t，J＝10.0Hz)和5.095(1H，d，J＝10.0Hz)为11α-，12β-酯基取代C21 甾体的11β-H、12α-H特征，13C NMR(DEPT)谱显示，另一个酰基亦为Ac，结构类型包括 11-和12-C化学位移值与MT-9的相近似(表1和表3)；因此其结构鉴定为 11α-O-Benzoyl-12β-O-acetyltenacigenin B。前人曾将通光散根茎乙醇提取物的氯仿部位用 0.05N硫酸-50％甲醇加热回流处理，再从水解产物中分离鉴定出MT-9和MT-10[参见文献： Luo SQ，et al.Polyoxypregnanes from Marsdenia tenacissima.Phytochem，1993，34：1615]。我们的 研究结果则表明，通光散植物中存在这2个成分的原形结构。
表1化合物MT-1、MT-9和MT-10的13C NMR数据
(100MHz，以TMS作为内标) 化合物I# C5D5N* MT-8 (CD3)2CO* MT-1 C5D5N* MT-9 (CD3)2CO* MT-10 CHCl3 * 1CH2 37.7 37.6 37.7 38.6 37.3 2CH2 29.7 30.1 29.7 32.0 31.3 3CH 76.1 76.6 76.1 70.2 70.4 4CH2 35.2 35.7 35.10 39.5 38.3 5CH 43.9 44.5 43.8 44.8 44.0 6CH2 27.2 27.6 27.2 27.6 26.6 7CH2 25.2 25.4 25.2 32.6 31.8 8C 66.7 67.0 66.8 67.0 66.9 9CH 51.8 52.0 51.8 52.3 51.2 10C 39.3 39.7 39.4 39.8 38.9 11CH 69.0 69.2 69.1 69.1 69.6 12CH 75.1 75.1 75.1 75.3 75.1 13C 46.1 46.6 46.1 46.5 45.8 14C 71.7 72.1 71.7 71.9 71.4 15CH2 32.1 32.5 32.1 27.3 26.5 16CH2 27.2 27.4 27.2 25.4 25.0 17CH 59.7 60.3 59.6 60.4 59.8 18CH3 16.9 17.1 16.9 17.0 16.6 19CH3 13.0 13.1 13.1 13.2 12.7 20C 210.2 210.4 210.3 210.2 210.8 21CH3 30.2 30.1 30.2 29.4 30.1 Acyl1 Tig Tig Tig Bu Bz 1’ 167.2 167.6 167.2 175.6 165.9 2’ 129.0 128.9 129.1 41.9 130.0 3’ 138.2 138.5 138.2 26.9 129.6 4’ 12.1 12.0 12.1 12.0 128.5 5’ 14.3 14.4 14.3 15.7 133.2 6’ 128.5 7’ 129.6 Acyl2 Ac Ac Ac Ac Ac 1” 170.7 170.6 170.7 171.0 170.7 2” 20.4 21.5 20.5 20.9 20.4 Sug1 Ole Ole Ole 1CH 97.5 97.9 97.5 2CH2 37.7 38.2 37.7 3CH 79.5 79.9 79.6 4CH 83.1 82.3 83.2 5CH 71.9 71.9 72.0 6CH3 18.6 18.3 18.6 OCH3 57.0 56.8 57.1 Sug1 Allo Allo Allo 1’ 101.9 101.1 102.0 2’ 73.2 73.0 73.3 3’ 84.0 83.2 84.1 4’ 74.5 74.3 74.6 5’ 70.9 71.2 71.0 6’ 19.1 19.0 19.1 OCH3 62.0 62.0 62.0
注：化合物I#是文献报道的通光散新甙A(tenacissimoside A)，即通光散甙G(tenacisside G)。数据引自 文献[蒋毅等.通光散中的三个新C21-甾体甙.中国医药工业杂志，1996，27：391；Chen.JJ，et al.New C21 steroidal glycosides from Marsdenia Tenacissima.Acta Botanica Yunnanica，1999，21：369]：*为溶剂。
实施例4化合物MT-4的结构鉴定
MT-4：17αH，R＝Pachbiosyl，R1＝R2＝H；
C35H56O12。白色无定型粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。[α]D 25+5.3 (c 0.077，CH3OH)，ESI-MS：m/z 691.2([M+Na]+)，1H NMR(400MHz，CDCl3，δin ppm)和13C NMR数据见表1、表3。化合物MT-4的Liebermann反应和Keller-Kiliani反应均呈阳性，表 明可能为含有2-脱氧糖的甾体苷。13C NMR(DEPT)谱显示含有35个碳原子，包括7个甲基， 8个亚甲基，15个次甲基和5个季碳。与MT-1参照，MT-4的化学位移值及信号多重度支持 其由C21+C7+C7片断构成，即C21甾体双去氧糖苷。糖部分δC97.5[δH4.568，dd(1.2，9.6)]与 δC102.1[δH4.776，d(8.0)]ppm处的两组端基信号，糖部分其它位置的NMR信号与MT-1的完 全一致(表2、表3)。MT-4的ESI-MS给出m/z691.2的[M+Na]+准分子离子(基峰)，表明分 子量应为668，联合NMR分析可得出分子式C35H64O14。苷元部分的13C NMR与文献[2]报道 的tenacissoside F[tenacigenin B 3-O-β-D-3-O-methyl-6-deoxyall-opyranosyl (1-4)-β-D-oleandropyranoside]对照，MT-4的C-12化学位移值(δ79.6)和C-17化学位移值(δ62.9) 分别比tenacissoside F偏低场5.0和3.1ppm，同时18-CH3化学位移值(δ11.3)比tenacissoside F偏高场7.1ppm。与17β-tenacigenin B以及17β-tenacigenin C 3-O-β-D-3-O-methyl-6-deoxyallopyranosyl(1-4)-β-D-oleandropyranoside的相应碳原子化学位移 值相吻合[Deng J，et al.Marsdenosides A-H，polyoxypregnane glycosides from Marsdenia tenacissima.Phytochem，2005，66：1040]，因此，化合物MT-4的结构确定为17β-tenacigenin B 3-O-β-D-3-O-methyl-6-deoxyallopyranosyl(1-4)-β-D-oleandropyranoside，是个新化合物。
实施例5化合物MT-12的结构鉴定
MT-12：17βH，R＝Pachbiosyl，R1＝R2＝H
C35H56O12。白色无定型粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。[α]D 25- 25.3(c 0.075，CHCl3)，ESI-MS：m/z 691.3([M+Na]+)，1H NMR(400MHz，CDCl3，δin ppm)和 13C NMR数据见表1、表3。
实施例6化合物MT-13的结构鉴定
MT-13：17βH，R＝Pachbiosyl，R1＝R2＝Ac
化合物MT-13，C39H60O14。白色无定型粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不 溶于水。[α]D 25-13.2(c 0.136，CHCl3)，ESI-MS：m/z 775.3([M+Na]+)，1H NMR(400MHz， CDCl3，δin ppm)和13C NMR数据见表1、表3。化合物MT-13的13C NMR(DEPT)谱显示含 有39个碳原子。结合1H NMR可见其包括tenacigenin B类型苷元的特征；端基为δC97.5[δH 4.568，dd(1.2，9.6)]与δC102.1[δH4.776，d(8.0)]的双去氧糖Pachbiose的特征(表2、表3)。与 MT-8对照，唯一不同的地方是有两个乙酸酯。所以，MT-13的结构确定为11α-，12β-O，O-乙 酰通光散苷元乙3-O-β-D-3-O-甲基-6-去氧阿洛吡喃糖(1-4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷[参见文献 Deng J，et al.Marsdenosides A-H，polyoxypregnane glycosides from Marsdenia tenacissima. Phytochem，2005，66：1040]。
表2化合物MT-4、MT-12、MT-13和MT-2的13CNMR化学位移
(以TMS作为内标) MT-4 125MHz， C5D5N* MT-12 125MHz， C5D5N* MT-13 125MHz， C5D5N* MT-2 100MHz， CHCl3 * 1CH2 39.2 39.1 37.8 37.6 2CH2 29.9 30.0 29.8 29.0 3CH 76.5 76.7 76.0 76.1 4CH2 35.2 35.2 35.2 36.2 5CH 44.9 44.9 43.8 43.9 6CH2 28.1 29.9 27.1 26.2 7CH2 33.0 28.3 32.0 24.9 8C 66.1 66.2 66.6 66.8 9CH 54.4 54.5 51.5 51.2 10C 39.7 39.6 39.0 39.1 11CH 68.1 68.0 68.8 69.2 12CH 79.6 74.5 75.0 75.6 13C 48.5 48.5 46.0 45.8 14C 71.7 71.9 71.6 15CH2 27.6 27.7 27.0 32.5 16CH2 25.5 25.6 25.1 26.7 17CH 62.9 60.7 59.8 60.2 18CH3 11.3 18.4 19.1 16.8 19CH3 13.2 13.3 13.0 12.7 20C 210.2 211.4 210.1 210.6 21CH3 32.4 32.9 30.0 29.7 Ac Bz 1’ 170.2 166.0 2’ 20.4 130.0 3’ 129.6 4’ 128.5 5’ 133.2 6’ 128.5 7’ 129.6 Ac Bu 1” 170.6 175.7 2” 21.2 41.3 3” 26.4 4” 11.8 5” 15.3 Ole Ole Ole Ole 1 97.5 97.6 97.6 96.9 2CH2 37.8 37.9 37.5 37.4 3 81.2 79.6a 79.6 79.1 4 83.3 83.3 84.0 82.2 5 72.0 71.9 72.0 71.9 6 18.6 18.6 18.6 18.0 OCH3 57.1 57.1 57.1 56.8 Allo Allo Allo Allo 1’ 102.1 102.1 102.0 100.0 2’ 73.3 73.3 74.6 73.0 3’ 84.0 84.0 83.2 83.2 4’ 74.6 74.6 73.3 74.3 5’ 71.0 70.9 70.9 71.2 6’ 19.1 19.1 16.8 18.5 OCH3 62.1 62.1 62.0 62.0 Glc 1” 104.3 2” 75.5 3” 78.4 4” 72.0 5” 78.4 6” 61.6
*为溶剂
表3化合物MT-1、MT-4、MT-9、MT-10、MT-12和MT-13的1H NMR化学位移
[400MHz，以CDCl3为溶剂，以TMS作为内标，δin ppm(J in Hz)] H at MT-9 MT-10 MT-4 MT-12 MT-13 MT-1 C-3 3.519m 3.535hept 3.774m 3.775m 3.774m 3.53m C-11 5.330t(10.0) 5.581t(10.0) 3.583t(9.6) 3.583t(9.6) 5.297t(10.0) 5.386t(10.0) C-12 5.013d(10.0) 5.095d(10.0) 3.560d(9.6) 3.560d(9.6) 4.928d(10.0) 4.978d(10.0) C-17 2.988d(7.6) 2.925d(7.6) 2.575dd(11.6，8.0) 2.575dd(11.6，8.0) 2.915d(7.6) 2.907d(7.2) C-18 1.026s 0.994s 0.898s 1.021s 1.020s 1.025s C-19 1.035s 1.017s 1.011s 1.132s 1.067s 1.037s C-21 2.829s 2.180s 2.234s 2.254s 2.178s 2.171s Acyl1 Bu Bz Ac Tig C-3’ 7.920d(7.6) 1.961s 6.736q(7.6) (C-2’) C-4’ 0.888t(7.6) 7.397t(7.6) 1.743brs C-5’ 1.042d(7.6) 7.530t(7.6) 1.749s C-6’ 7.397t(7.6) C-7’ 7.920d(7.6) Acyl2 Ac Ac Ac Ac C-2” 2.115s 1.576s 1.923s 1.893s Sug1 Ole Ole Ole Ole C-1 4.568dd(1.2，9.6) 4.570dd(1.2，9.6) 4.560dd(1.2，9.6) 4.552dd(1.2， 9.6) C-6 1.235d(6.4) 1.237d(6.4) 1.236d(6.4) OCH3 3.353s 3.356s 3.355s 3.350s Sug2 Allo Allo Allo Allo C-1’ 4.776d(8.0) 4.777d(8.0) 4.780d(8.0) 4.776d(8.0) C-6’ 1.341d(6.0) 1.357d(6.0) 1.344d(5.2) OCH3 3.640s 3.641s 3.643s 3.640s
实施例7肿瘤细胞MDR逆转剂活性的检测方法
1、药物与试剂
阿霉素(Doxorubicin)、长春碱(vinblastine)、嘌呤霉素(puromycin)、紫杉醇(paclitaxel)、维 拉帕米(verapamil)、罗丹明(rhodamine 123)和硫氰酸盐B(Sulforhodamine B)及其它化学试剂 购自Sigma/Aldrich公司(St.Louis，MO，USA)；碘化丙啶(PI)购自Molecular Probes；RPMI 1640 培养基，胎牛血清(FBS)和双抗为GibcoBRL产品(Invitrogen Coporation，USA)。
2、细胞系与细胞培养
人肝癌细胞系HepG2及其多药耐药株HepG2/Dox培养于含10％FBS和100U抗生素的 RPMI1640培养液中，并置于饱和湿度，含5％二氧化碳的37℃培养箱中。HepG2/Dox细胞 培养在含1.2μM阿霉素的培养液中以维持其耐药性，测试前7天撤去阿霉素。
3、增殖抑制试验
3.1药物应用：将待检测细胞分散成单个细胞悬液，按5×103细胞/孔分种于96孔板， 24小时后换用含药培养液，每3孔为一个检测浓度。药物与细胞作用72小时后用 sulforhodamine B(SRB)法测定药物细胞毒性，实验另设培养液空白对照组-I及未加药处理的 细胞对照组-II。
3.2SRB法测定药物对细胞生长的半数抑制浓度(IC50)：药物处理后的细胞用预冷的 50％三氯乙酸于4℃固定一小时，弃去固定液，蒸馏水洗漂5次，晾干。用0.4％的SRB染色 10分钟，再1％的乙酸洗去多余的染色液并风干。最后，将与细胞结合的SRB溶解于10mM 的Tris缓冲溶液(pH10.5)中，与515nm波长出测定吸光度A值，此时SRB的颜色强度与 细胞数目呈正相关，可以此作为细胞数量进行估算比较。细胞存活率(％)＝(实验孔A值/ 对照孔-IIA值)×100％，IC50为细胞存活率为50％时的药物浓度。
4、MDR逆转效果评价
待测样品的MDR逆转能力通过比较肿瘤药物与代测样品联合使用前后肿瘤药物IC50的 降低倍数作为评价。P-gp调节剂维拉帕米作为阳性对照药，含有代测样品的培养液作为阴性 对照。所有试验至少重复三次。
5、细胞周期分布
2×105/ml浓度的细胞悬液培养在35mm培养皿中，培养过夜。加入不含有药物或含有各 种浓度药物的培养液1ml，继续培养48小时。收集细胞，离心，PBS漂洗一次，用70％的乙 醇于-20℃固定过夜。固定后的细胞再次离心并重悬于1ml含有100μg/mL Rnase的PBS中， 37℃孵化30分钟。加入终浓度为40μg/mL的PI染色剂，室温放置5-10分钟。细胞样品最 后置于12×75的Faclon管中用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。
6、细胞内阿霉素积蓄
1×106个细胞悬浮于1mL含10μM阿霉素的培养液中，加入不同浓度待测样品，37℃ 培养1h，孵育后细胞用冰浴PBS漂洗两次，然后重悬于1ml冰浴PBS中。于FACSCAN流 式细胞仪(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)测定细胞内阿霉素荧光强 度，分析待测样品对阿霉素在细胞内继续的影响。数据分析运用Macintosh CellQuest software 软件。P-gp抑制剂维拉帕米作为阳性对照。
7、细胞内药物外排
细胞内罗丹明-123外排：1×106个细胞悬浮于1ml含5μg/mL罗丹明-123的培养液中， 于37℃培养1小时。吸收罗丹明之后的细胞用冰浴PBS漂洗两次，重悬于不含罗丹明的新 鲜培养液中，加入或不加入不同浓度的待测样品，于37℃培育1小时。细胞用冰浴PBS漂 洗两次，重悬于1ml冰浴PBS中，于流式细胞仪测定细胞内罗丹明-123的荧光强度，分析待 测样品对药物外排的影响。维拉帕米作为P-gp抑制剂阳性对照。
细胞内H33342外排：HepG2/Dox细胞以每孔5×104个接种于96孔板中，培养过夜。 贴壁后的细胞改用含20μg/mL H33342的新鲜培养液，37℃继续培养1小时。细胞以冰浴 PBS轻柔洗涤两次，加入含有不同浓度待测样品的新鲜培养液，37℃培养1小时，再以冰浴 PBS冲洗两次后用，于λex＝365nm，λem＝460nm处测定每孔的荧光强度，分析待测样品对药 物外排的影响。
8、蛋白印记分析法检测P-gp表达
HepG2/Dox细胞分别于不含或者含有5μg/mL，10μg/mL或20μg/mL待测药物MT-1的 培养液中培养72小时。收集细胞置入冰浴裂解缓冲液(50mM Tris pH7.4，100mM NaCl，1 mM EDTA，5％Glycerol，0.5mM MgCl2，0.5％NP 40，0.05％SDS，1mM PMS F，1μg/ml leupeptin， 1％aprotinin，1％pepstatin A，2mM Na3VO4 and 50mM NaF)中20分钟后，离心，收集上清液， 用Bradford法测定蛋白质浓度。
在上清中加入1/4体积的5×buffer(50mM Tris-HCl pH6.8，40％Glycerol，5％SDS，0.05％ Pyronin Y and 1％2-Mercaptoethanol)，在37℃温浴10min以变性蛋白(可保存于-80℃备用)。 将变性后的样品(含50μg蛋白)经10％的SDS-PAGE分离，随后电转移至硝化纤维膜上。 用4％脱脂牛奶/0.1％Tween-20/TBS(10mM Tris pH7.5，100mM NaCl)封闭封闭该膜，随后 在室温下加入抗-P-gp抗体反应1小时，再在室温下加入辣根过氧化酶标记的二级抗体反应1 小时，最后被抗体标记的蛋白通过ECL方法检测蛋白条带。
实施例8MT-1对多药耐药肿瘤细胞的MDR逆转活性及其机理
1、MT-1可显著增加HepG2/Dox细胞对P-gp底物药物的敏感性
以四种P-gp底物抗肿瘤药物长春碱、阿霉素、嘌呤霉素和紫杉醇单独或联合20μg/mL， 10μg/mL或5μg/mL的MT-1给药HepG2/Dox耐药细胞株及其敏感株。72小时后测定IC50 值，分析MT-1对细胞耐药性的影响。结果表明，相对于敏感株，耐药细胞株显示出极高的 抗肿瘤药物耐药性，HepG2/Dox细胞对四种药物的耐药率(＝IC50(MDR)/IC50(sensitive))分别达 到1000倍(长春碱)，121倍(阿霉素)，119倍(嘌呤霉素)和226倍(紫杉醇)(表4)。
MT-1(分子量792)单独使用时对耐药株和敏感株均无显著细胞增值抑制作用 (IC50＞80μg/mL)。然而当MT-1与抗肿瘤药物联合作用于细胞时，能明显增强耐药细胞的化学 敏感性。如表5所示，5μg/mL(6.3μM)的MT-1即可中等程度的增强耐药细胞的药物敏感性。 而在20μg/mL(25.3μM)的MT-1存在下，长春碱、阿霉素、嘌呤霉素和紫杉醇对HepG2/Dox 细胞的IC50值分别下降了10、18、11和6倍，逆转MDR活性高于4μM阳性对照维拉帕米。 4μM维拉帕米存在下，四种药物的IC50值下降倍数分别为4.6，5.7，7.6和4.9倍。MT-1的 MDR逆转活性具有剂量依赖性。
同样条件下，MT-1不能增强敏感细胞株HepG2的化学敏感性(表5)。表明MT-1的 MDR逆转作用与对P-gp的调节有关。
表4肿瘤药物抑制敏感肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞的活性 Table 4 Cytotoxic study of Vinblastine anticancer drugs against Doxorubicin human cancer Puromycin cells(IC50，μM) Paclitaxel HepG2 2.64±0.67 (×10-4) 0.07±0.06 0.17±0.07 6.07±2.61 (×10-3) HepG2/Dox 0.26±0.08 8.46±4.02 20.17±6.95 1.37±0.47 Resistant ratio 1000 121 119 226
Resistant ratio＝IC50(MDR)/IC50(Sensitive)
表5MT-1对肿瘤药物抑制耐药性肿瘤细胞效果的增强作用
Table5.Effect of MT-1 on increasing drug sensitivity in HepG2/Dox cells(IC50，μM) HepG2/Dox HepG2 IC50(μM) Sensitivity increaseda IC50(μM) Sensitivity increaseda Vinblastine With MT-1 20μg/ml (25.3μM) With MT-1 10μg/ml (12.7μM) With MT-1 5μg/ml (6.3μM) With Verapamil (4μM) Doxorubicin With MT-1 20μg/ml (25.3μM) With MT-1 10μg/ml (12.7μM) With MT-1 5μg/ml (6.3μM) With Verapamil (4μM) Puromycin With MT-1 20μg/ml (25.3μM) With MT-1 10μg/ml (12.7μM) With MT-1 5μg/ml (6.3μM) With Verapamil (4μM) Paclitaxel With MT-1 20μg/ml (25.3μM) With MT-1 10μg/ml (12.7μM) With MT-1 5μg/ml (6.3μM) With Verapamil (4μM) 0.264±0.079 0.026±0.016 0.113±0.037 0.186±0.045 0.059±0.020 8.64±4.02 0.48±0.21 1.12±0.74 3.22±2.72 1.52±0.51 20.17±6.95 1.76±1.41 2.90±1.10 7.66±3.92 2.65±0.66 1.37±0.47 0.24±0.31 0.30±0.17 0.81±0.20 0.28±0.07 10.1 2.3 1.4 4.5 18.0 7.7 2.7 5.6 11.5 7.0 2.6 7.6 5.7 4.6 1.7 4.9 2.64±0.67(×10-4) 2.41±0.88(×10-4) - - 3.38±1.07(×10-4) 0.17±0.09 0.15±0.03 - - - 0.21±0.03 0.20±0.03 - - - 5.94±2.68(×103) 5.42±1.91(×103) - - - 1.1 - - 0.8 1.1 - - - 1.1 - - - 1.1 - - -
2、MT-1可增强阿霉素诱导的HepG2/Dox细胞G2/M期停滞
P-gp抑制剂本身对细胞周期无影响，但通过对P-gp的调节能增强细胞内底物药的积蓄， 增强药物原有的药理作用，由此逆转细胞的耐药性。为了证明MT-1及类似化合物是否通过 调节P-gp逆转MDR，我们测定了MT-1对阿霉素诱导的HepG2/Dox细胞周期停滞的作用。 阿霉素是拓扑异构酶II抑制剂，可以诱导细胞周期停滞于G2/M期。如表6所示，0.2μM阿 霉素即可获得HepG2细胞G2/M期的完全静止，而在HepG2/Dox细胞中，由于P-gp对阿霉 素的外排作用，要达到相应效果所需要阿霉素的浓度为50μM。若MT-1可以调节P-gp，则 可以抑制阿霉素的转运从而增加耐药细胞内药物浓度，也就相应增强了阿霉素对细胞周期的 静止作用。
试验结果显示MT-1不能影响细胞周期，却可明显增强阿霉素诱导的HepG2/Dox细胞 G2/M期静止：1μM阿霉素单独应用对细胞周期的作用较弱，而联合5μg/mL，10μg/mL and 20μg/mL的MT-1一同给药后，细胞处于G2/M期的时间呈剂量依赖性。20μg/mL的MT-1 可以辅助阿霉素获得完全G2/M期静止。结果进一步证明了MT-1逆转MDR机制与P-gp调 节有关。
表6MT-1辅助阿霉素对耐药性HepG2/Dox细胞的细胞周期产生静止的效果
Table 6 Effect of MT-1 on doxorubicin-induced cell cycle arrest in HepG2/Dox cells Cell line Drug treatment Cell cycle distribution(％) SubG1 G0/G1 S G2/M HepG2 Control 0.2μM Dox 1.88±1.03 0.92±0.45 60.34±3.59 4.92±0.91 10.06±0.78 8.89±0.83 22.59±0.96 76.57±1.32 Control 1μMDox 10μM Dox 50μM Dox 20μ/mL MT-1 1.71±0.14 2.37±0.34 3.36±0.17 4.88±0.75 3.00±0.86 54.91±3.76 51.33±0.92 24.81±0.23 12.05±5.08 49.29±1.54 9.90±4.12 7.74±3.57 6.86±1.80 5.58±1.34 7.24±2.31 32.79±2.11 33.47±0.17 60.80±0.79 73.43±9.00 32.03±3.42 1μM Dox+MT-1 5μg/mL 10μg/mL 20μg/mL 3.51±0.69 3.54±1.55 7.61±1.78 39.82±2.81 24.48±1.72 8.93±3.10 6.78±1.47 6.26±4.84 5.09±2.64 44.18±3.49 63.63±3.13 72.96±4.56
3、MT-1具有增强MDR细胞内药物积蓄、降低药物外排的作用
P-gp调节剂能抑制P-gp的转运功能，增加耐药细胞内药物的浓度。试验结果表明，MT-1 能增强HepG2/Dox细胞对阿霉素的摄入，减少细胞内罗丹明-123和Hoechst 33342的外排， 并呈剂量依赖性。
药物摄入：HepG2/Dox细胞经10μM阿霉素分别联用不同浓度的MT-1或维拉帕米处理， 细胞对阿霉素的摄入如图3所示，MT-1在提高阿霉素的HepG2/Dox细胞摄入中显示出弱于 维拉帕米但仍然呈剂量依赖性的活性。
药物的外排：P-gp具有多个药物结合位点，不同结构类型的底物可结合于不同的位点。 罗丹明-123和Hoechst 33342是分别结合于P-gp的R-位点和H-位点的两个荧光底物，在本试 验测试MT-1对P-gp转运外排的影响。试验结果表明，MT-1能明显减弱细胞内罗丹明-123 或Hoechst 33342的外排，增加其在耐药细胞内的残留。MT-1的这一活性弱于维拉帕米，但 具有剂量依赖性。在80μg/ml的MT-1存在下，细胞内罗丹明-123的残留量增加为90％，而 在10μM的维拉帕米存在下，罗丹明-123的残留量增加达210％(图4)。
4、MT-1不影响耐药细胞中P-gp表达水平
另外一种逆转P-gp介导的MDR的路径是抑制细胞内P-gp的表达。在实验中我们通过蛋 白印记(Western blot)法分析了MT-1对于P-gp表达的活性。结果表明，HepG2/Dox细胞分别 用5μg/mL、10μg/mL或者20μg/mL的MT-1作用72小时后，细胞内P-gp表达水平没有 变化(图5)。说明MT-1不能抑制MDR1基因的表达，对P-gp介导的MDR的逆转是通过抑 制P-gp的转运功能实现的。
5、MT-1显示具有底物样活性
上述实验提示MT-1与P-gp有相互作用，但不能提示与P-gp的作用机制。MDR1反应 性位移分析法(MDR1 reactivity shift assay)是通过对P-gp与单克隆抗体UIC2的反应性的检 测，间接反映MDR逆转剂与P-gp相互作用。UIC2是一个对P-gp构象敏感的单克隆抗体， 作用于P-gp位于细胞膜外的糖支链，并优先识别结合了底物或者竞争性抑制剂的P-gp构象。 与底物或者竞争性抑制剂结合的P-gp构象改变能增加UIC2与P-gp的结合，而由于非底物作 用于P-gp变构位点导致的P-gp构象改变，则减弱UIC2与P-gp的结合。P-gp与UIC2的反 应可通过荧光标记的第二抗体进行观察。试验结果表明，P-gp底物环孢霉素A能增加 HepG2/Dox细胞的荧光强度；非底物物质钒酸钠(Na3VO4)与P-gp的结合能减少细胞的荧 光强度。而MT-1在试验中显示出底物样活性，在10μg/mL，20μg/mL或者40μg/mL时都能 增强细胞的荧光强度(图6)，提示MT-1可能作用于P-gp底物结合位点。
实施例8MT-9和MT-10对多药耐药肿瘤细胞的MDR逆转活性
在确定多药耐药细胞株HepG2/Dox对四种抗肿瘤药物长春碱、阿霉素、嘌呤霉素和紫杉 醇显示出极高的耐药性[耐药率＝IC50(MDR)/IC50(sensitive)]分别达到1000倍(长春碱)，121倍 (阿霉素)，119倍(嘌呤霉素)和226倍(紫杉醇)]并系统研究了C21甾体类MDR逆转剂MT-1之 后，我们用同样的方法测定了类似结构的MT-9和MT-10在逆转HepG2/Dox细胞对该四种抗 肿瘤药物耐药性的作用。
结果如下：
MT-9(分子量为490)和MT-10(分子量为510)单独使用对耐药株和敏感株均无任何 细胞增值抑制作用(IC50＞100μg/mL)。然而当二者分别联合抗肿瘤药物共同作用于HepG2/Dox 细胞时，细胞的化学敏感性被明显提高，并呈剂量依赖关系：
在HepG2/Dox细胞中，5、20μg/mL(10.2、40.8μM)的MT-9联合长春碱，能使后者在细 胞中的浓度分别提高3.9和18.0倍；当联合阿霉素时，能使后者在HepG2/Dox细胞中的浓度 分别提高3.0和5.0倍；当联合嘌呤霉素时，能使后者在HepG2/Dox细胞中的浓度分别提高 1.9和3.3倍；当联合紫杉醇时，能使后者的药物浓度分别提高3.3和14.2倍；
在HepG2/Dox细胞中，5、10、20μg/mL(9.8、19.6、39.2μM)的MT-10联合长春碱，能 使后者在细胞中的浓度分别提高6.8、13.5和54.0倍；当联合阿霉素时，能使后者在HepG2/Dox 细胞中的浓度分别提高4.6、10.1和15.8倍；当联合嘌呤霉素时，能使后者在HepG2/Dox细 胞中的浓度分别提高9.0、7.9和15.9倍；当联合紫杉醇时，能使后者的药物浓度分别提高19.9、 41.7和315.1倍(表7和图7a、7b、8)。
表7MT-9和MT-10增加药物在HepG2/Dox细胞中药物敏感性的效果(IC50，μM)
Table 7 Effect of MT-9 and MT-10 on increasing drug sensitivity
in HepG2/Dox cells(IC50，μM) Treatment Vinblastine(μM) Doxorubicin(μM) Puromycin(μM) Paclitaxel(μM) Mean STDEV Mean STDEV Mean STDEV Mean STDEV control MT-9＝5ug/ml (10.2μM) MT-9＝20ug/ml (40.8μM) MT-10＝5ug/ml (9.8μM) MT-10＝10ug/ml (19.6μM) MT-10＝20ug/ml (39.2μM) 0.54 0.14 0.03 0.08 0.04 0.01 0.24 0.06 0.01 0.05 0.04 0.01 39.11 13.03 7.87 8.44 3.86 2.47 10.07 6.66 2.83 9.56 2.65 1.55 80.83 41.58 24.64 8.98 10.18 5.08 11.97 7.54 6.18 2.10 5.04 3.14 6.303 1.917 0.443 0.317 0.151 0.020 1.815 0.735 0.065 0.195 0.126 0.025
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