리그닌 분해효소의 제조방법{Process for preparing ligninolytic enzyme}

본 발명은 리그닌 분해효소의 제조방법에 관한 것으로, 특히 고정화된 백색부후균을 통하여 LiP를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

나무는 주로 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 리그닌(lignin)으로 구성되어 있고, 그밖에 펙틴(pectin), 전분(starch), 당단백질(glycoprotein) 등의 성분을 포함하고 있다.

리그닌은 셀룰로오스 다음으로 가장 풍부한 유기화합물로서, 생태계의 탄소 순환에 매우 중요한 역할을 하고 있다. 나무는 20 내지 30%의 리그닌을 함유하고 있고, 리그닌은 셀룰로오스 섬유 사이의 공간을 차지하고 있으며, 또한 세포벽에도 존재한다.

리그닌은 다른 생물학적 고분자와는 달리 페닐프로파노이드 유닛(phenylpropanoid unit)을 지니는 구조적으로 불균일하고 3차원적으로 가교결합된 방향족 고분자이다. 대부분의 생물학적 고분자는 선형이며 규칙적이고 반복적인 결합으로 연결된 서브유닛(subunit)으로 구성되어진 반면에, 리그닌의 서브유닛은 비선형적이고 랜덤(random) 형태로 결합되어 있다.

리그닌의 전구체는 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol), 시나필 알코올(sinapyl alcohol), 쿠마릴 알코올(coumaryl alcohol)이며, 이 p-하이드록시시나밀 알코올(p-hydroxycinnamyl alcohol)들의 상대적인 양에 따라 리그닌의 형태가 결정된다. 리그닌은 이 전구체들의 자유 라디칼(free radical) 공중합 반응에 의해 형성되고, 10가지 이상의 안정한 인터유닛(interunit) 결합을 포함하며, 이 중 50% 이상이 β-o-4 결합이다.

셀룰로오스나 단백질과 달리 리그닌은 쉽게 가수분해되는 결합을 포함하지 않기 때문에 자연상태에서 분리하기가 어렵다. 복잡하고 불균일한 구조적 특성으로 인하여, 리그닌은 식물세포에 구조적인 단단함을 제공하고, 미생물의 공격으로부터 식물을 보호하는 역할을 한다.

리그닌의 분해는 호기성 산화과정이며, 자연계에서 곰팡이와 박테리아의 공동적인 작용에 의하여 분해되는 것으로 여겨지고 있다. 리그닌의 분해과정은 매우 복잡하며, 리그닌의 구조와 합성 기작에 대해서는 잘 정립되어 있는 반면에, 그 분해 기작은 30년 이상 연구되어오고 있지만 상대적으로 정립되어 있지 않은 상태이고, 이러한 이유는 리그닌 분해에 대한 보편적인 분석방법이 부족하기 때문이다.

백색부후균은 어떠한 미생물보다 리그닌을 빠르고 광범위하게 분해한다. 백색부후균의 리그닌 분해효소에 의한 리그닌 구조 내에 프로필(propyl)기의 Cα-Cβ의 붕괴, 벤질 알코올(benzylic alcohol)의 산화, β-아릴 에테르(aryl ether)의 붕괴가 제안되어져 있는 상황이다.

패니로키트 크라이소스포리엄 ( Phanerochaete chrysosporium ) 은 1974년 죽은 나무로부터 처음으로 분리되었고, 리그닌 분해에 관하여 가장 많은 연구가 이루어진 백색부후균 중의 하나이다. 피. 크라이소스포리엄 은 단단한 세포벽을 가진 종속영양 진핵생물이며, 세포벽을 통하여 영양물을 흡착하고, 흡착할 수 없는 고분자를 분해하기 위하여 세포외 효소를 분비하며, 또한 유성 및 무성생식의 수단으로 포자를 생산한다.

백색부후균은 정체 배양을 하는 경우 배지의 상단에서 균사체 형태로 성장하며, 액체 교반 배양을 하는 경우 펠릿(pellet) 형태로 성장한다. 백색부후균은 탄소, 질소, 황 같은 영양물 제한조건에서 2차 대사기간(idiophase) 중에 리그닌 분해효소를 생산하며, 백색부후균에 의해 리그닌 분해효소(ligninolytic enzyme)가 발현되기 위해서는 고농도의 산소조건이 요구되며, 또한 배지 조성 및 배양조건에 대한 의존성이 높다.

백색부후균에 의한 리그닌 분해시스템에는 리그닌 퍼록시데이즈(lignin peroxidase, 이하 LiP), 망가니즈 퍼록시데이즈(manganese peroxidase, MnP), 락케이즈(laccase), H ₂ O ₂ 발생효소(generating enzyme), 베라트릴 알코올(veratryl alcohol, 이하 VA), Mn ^{2 +} 등이 있으며, 백색부후균은 리그닌 분해시스템의 최적 pH인 3.0을 맞추기 위하여 옥살산(oxalic acid) 및 다른 유기산들을 분비한다.

백색부후균과 그들의 리그닌 분해시스템은 광범위한 기질특이성을 나타내어 리그닌뿐만 아니라 TNT(trinitro toluene) 등 다양한 난분해성 유기화합물들을 분해할 수 있으며, 특히 염료의 색도 제거에 대한 연구가 많이 진행되어 왔다.

백색부후균의 리그닌 분해시스템은 생물 펄핑(biopulping), 생물 표백(biobleaching)과 같은 제지 및 펄프산업에 적용될 수 있고, 리그노셀룰로오스성(lignocellulosic) 물질을 사료, 연료 및 유용한 화합물로 전환시킬 수 있으며, 또한 폐수의 색도 제거나 독성 화합물의 처리에도 응용될 수 있다.

백색부후균에 의해 세포외적으로 분비되는 LiP는 1983년 세포외 산소첨가효소(extracellular oxygenase)로서 처음으로 보고되었고, 이후에 퍼록시데이즈로 규명되었다. LiP는 38 내지 48 kDa 범위의 분자량을 가지는 6개의 동위효소(isoenzyme)의 총칭이고, 효소 한 분자당 한 개의 Fe 프로토포르피린(protoporphyrin) 분자를 지닌 헴(heme) 단백질이다.

LiP는 리그닌 분해의 주요 효소(key enzyme)로서, 활성을 나타내기 위해서는 H ₂ O ₂ 를 필요로 하며, pH 3 이하에서 최적의 활성을 나타낸다. LiP는 비특정 기질특이성으로 인하여 다양한 산화반응에서 촉매작용을 한다. LiP의 광범위한 기질특이성은 불균일하고 복잡한 리그닌의 구조에 기인하는 것으로 추정된다.

LiP의 촉매기작을 살펴보면 다음과 같다. LiP는 H ₂ O ₂ 에 의해 2개의 전자를 잃으며 산화되어 중간체인 컴파운드Ⅰ(compoundⅠ, LiPⅠ)이 생성된다. LiPⅠ은 한 개의 전자를 수용하며 기질을 산화시키고 자신은 환원되어서 또 다른 중간체인 컴파운드Ⅱ(compoundⅡ, LiPⅡ)를 형성한다. LiPⅡ는 다시 한 개의 전자를 수용하며 기질을 산화시키고 원래의 상태인 제2철의(ferric) LiP로 환원되는 것이 정상적인 촉매주기이다.

그러나, LiPⅡ는 H ₂ O ₂ 와의 반응성이 높기 때문에 기질이 부족하고 H ₂ O ₂ 가 과잉으로 존재하게 되면 불활성된 중간체인 컴파운드Ⅲ(compoundⅢ, LiPⅢ)를 경유하여 완전히 불활성된다. LiPⅢ는 제1철의(ferrous) LiP, 제2철의 LiP, LiPⅡ로부터 형성될 수 있는 FeⅡ-O ₂ 또는 FeⅢ-O ₂ ^- ·결합체이며, 퍼록시데이즈의 정상적인 촉매주기에는 포함되지 않는다. LiPⅢ는 H ₂ O ₂ 의 부재시 O ₂ ^- ·을 방출하며 천천히 제2철의 LiP로 전환된다. H ₂ O ₂ 가 과잉으로 존재하게 되면 LiPⅢ는 LiPⅢ-H ₂ O ₂ 의 형태인 LiPⅢ*로 전환되며, H ₂ O ₂ 를 제거하면 다시 LiPⅢ로 복귀한다. LiPⅢ*는 H ₂ O ₂ 에 의해서 완전히 불활성된 형태로 전환된다.

백색부후균은 난분해성인 리그닌 뿐만 아니라 광범위한 환경오염 물질들을 분해하는 것으로 보고되었고, 백색부후균 중에서도 P. chrysosporium 이 가장 많은 연구가 이루어졌다. P. chrysosporium 이 생산하는 리그닌 분해효소 중 하나인 LiP는 광범위한 기질특이성으로 다양한 난분해성 유기화합물들을 분해할 수 있는 것으로 보고되었다.

그러나, 리그닌 분해효소의 생산수율이 낮아서 그 응용에 제한을 받고 있는 실정이고, 염료를 비롯한 난분해성 화합물 및 실제폐수의 처리 등 LiP의 다양한 응용을 위해서는 고농도의 LiP가 필요하다.

이에 본 발명자는 LiP 생산성을 향상시킬 수 있는 배지 조성, 배양조건 및 배양방법 등을 조사하면서 부단히 연구하고 노력한 결과, 최적의 LiP 생산조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 LiP를 고수율로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 백색부후균을 담체에 고정화하여 배양함으로써 리그닌 분해효소 중 LiP를 제조함에 있어서, 상기 백색부후균으로 P. chrysosporium PSBL-1을 사용하고, 상기 담체로서 다공성 연질 폴리우레탄 폼을 사용하되 배지 100 mL당 0.5 내지 2 g을 사용하여 용기 안에서 담체끼리 서로 밀착되 게 탄성적으로 지지되도록 단단히 고정시키며, 접종후 6시간 내지 2일까지는 정치배양 또는 1 내지 99 rpm의 교반속도로 배양한 후 100 내지 250 rpm의 교반속도로 배양하는 것을 특징으로 하는 리그닌 퍼록시데이즈의 제조방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 제조방법은 망간이 제외된(Mn-free) 배지를 사용하고, 질소원으로 암모늄 타트레이트(ammonium tartrate)를 사용하되 2 내지 30 mM의 농도로 사용하며, 탄소원으로 글루코오스(glucose)를 사용하되 배양 전에 3 내지 20 g/L의 농도로 첨가한 후 배양 2 내지 10일 사이에 1 내지 20 g/L를 추가로 첨가하고, VA를 배양 전에 0.1 내지 5 mM의 농도로 첨가한 후 배양 2 내지 10일 사이에 0.1 내지 5 mM을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 한다.

이외의 생산조건으로서, 온도는 30 내지 45℃, pH는 3 내지 7, 접종량 0.1 내지 10% (v/v), 배지 부피는 용기 대비 10 내지 80%, 완충용액은 DMS(2,2-dimethylsuccinate) 또는 소디움 타트레이트(sodium tartrate), 계면활성제는 트윈(Tween)계가 바람직하다.

더욱 바람직하게는, 백색부후균으로 P. chrysosporium PSBL-1을 사용하고, 담체로서 다공성 연질 폴리우레탄 폼을 사용하되 배지 100 mL당 0.8 내지 1.2 g을 사용하여 용기 안에서 담체끼리 서로 밀착되게 탄성적으로 지지되도록 단단히 고정시키며, 접종 후 12시간 내지 1일까지는 정치배양한 후 150 내지 220 rpm의 교반속도로 배양하고, 망간이 제외된 배지를 사용하며, 질소원으로 암모늄 타트레이트를 사용하되 11 내지 25 mM의 농도로 사용하고, 탄소원으로 글루코오스를 사용하되 배양 전에 8 내지 15 g/L의 농도로 첨가한 후 배양 4 내지 9일 사이에 1 내지 10 g/L 를 추가로 첨가하며, VA를 배양 전에 0.2 내지 2.5 mM의 농도로 첨가한 후 배양 3 내지 9일 사이에 0.2 내지 2.5 mM을 추가로 첨가하고, 온도는 35 내지 40℃, pH는 4 내지 5, 접종량 0.5 내지 2% (v/v), 배지 부피는 용기 대비 20 내지 60%, 완충용액은 DMS 또는 소디움 타트레이트, 계면활성제는 트윈 80을 사용한다.

본 발명은 고정화된 백색부후균을 통한 최적의 LiP 생산조건을 확립함으로써 LiP를 고수율로 제조할 수 있는 방법을 제공한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명한다.

[실험예]

1. 재료

LiP의 안정화제로서 VA(3,4-dimethoxybenzyl alcohol, Aldrich), 인돌(indole, 2,3-benzopyrrole, Acros), L-트립토판(L-tryptophan, L-α-aminoindole-3-propionic acid, Junsei)을 사용하였고, 계면활성제로서 트윈 20(polyoxyethylene(20) sorbitan monooleate, Sigma), 트윈 80(polyoxyethylene(20) sorbitan monolaurate, Shinyo), 스판(Span) 20(sorbitan monolaurate, Yakuri), 스판 80(sorbitan monooleate, Yakuri)을 사용하였으며, 배지성분을 포함한 모든 시약은 1급 시약으로 부가적인 정제 없이 사용하였다.

세포고정화 담체로는 시중에서 쉽게 구할 수 있는 폴리우레탄 폼(polyurethane foam)으로 연질(이하 스펀지)과 경질 폼을 사용하였으며, 대략 2 ×2×2 ㎤의 크기로 제작한 담체를 70% (v/v) 에탄올 수용액으로 세척하고 건조하여 121℃에서 15분간 멸균한 후 사용하였다.

또 다른 세포고정화 담체로는 칼슘-알지네이트 비드(Ca-alginate bead)를 사용하였고, 그 제조방법은 다음과 같다. 멸균된 4% (w/v) 소디움 알지네이트 10 mL와 균사체 현탁액 10 mL를 혼합한 후, 마이크로 튜브 펌프(micro tube pump, Eyela)와 3 mL 주사기(syringe)를 이용하여 2% (w/v) CaCl ₂ 수용액 200 mL에 0.5 mL/min의 유속으로 적하시킴으로써 직경 2 내지 3 mm의 비드를 형성하였다. 제조된 비드를 CaCl ₂ 수용액에서 20분간 경화시키고, 10 mM 소디움 아세테이트(sodium acetate) 완충액(pH 4.5)으로 세척한 후 사용시까지 4℃에서 보관하였다. 이 모든 과정은 무균적으로 진행하였다.

균주로는 백색부후균 Phanerochaete chrysosporium PSBL-1(ATCC No. 없음)을 이 균주의 분리자인 펜실베이니아(Pennsylvania) 주립대학의 Ming Tien으로부터 직접 분양받아서 사용하였다. 이 균주는 라이신 영양요구 돌연변이(lysine auxotroph mutant)로서, 야생 균주와는 달리 질소 충분 조건하에서도 리그닌 분해효소를 생산할 수 있고, 효소의 생산성도 야생 균주보다 우수한 것으로 보고되었다.

2. 배지 조성 및 배양조건과 방법

P. chrysosporium PSBL-1은 표 1 조성의 YMPG 한천(agar) 슬랜트(slant) 또는 플레이트(plate)에서 보존 및 유지하였다. 백색의 포자가 전체적으로 형성될 때까지 37℃에서 4 내지 5일간 배양한 후 4℃에 보관하였고 2개월마다 계대 배양하였 다. 균주의 장기보존을 위하여 포자가 형성된 슬랜트 또는 플레이트에 증류수를 첨가하여 얻은 포자현탁액을 유리 솜(glass wool)으로 여과하고 글리세롤(glycerol)을 20% (v/v)으로 첨가한 후 -80℃에 냉동 보관하였다.

접종원으로서 일반적인 포자 현탁액(spore suspension) 대신에 균사체 현탁액(mycelium suspension)을 사용하였다. 농후한 균체량을 확보하기 위해 한천을 제외한 YMPG 배지를 사용하여 37℃, 150 rpm에서 4 내지 5일간 액체배양을 하였다. 형성된 펠릿을 10 mM DMS 또는 소디움 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 수차례 세척한 후, 균주의 적응성을 높이기 위하여 세척한 펠릿을 LiP 생산 배지에 첨가하였다. 1 내지 2 시간 배양한 후, 분쇄기(blender)를 이용하여 1 내지 2분간 급속으로 펠릿을 분쇄한 후, 형성된 현탁액(균사체 건조중량 농도로 약 4.5 mg/mL)을 접종원으로 사용하였다.

LiP의 생산을 위한 배지 조성은 표 2와 같다. 기초 배지(basal medium)와 미량 원소(trace element) 배지의 조성은 각각 표 3 및 표 4와 같으며, Mn이 제외된 미량 원소 배지를 사용하였다.

각각의 배지 성분은 저장 용액(stock solution)을 제조하여 121℃에서 15분간 고압증기 멸균하거나 0.2 ㎛ 막을 사용하여 여과 멸균한 후 혼합하였다. 배지의 pH는 완충용액인 DMS에 의해서만 조절하였다.

LiP의 생산을 위하여 표 2와 같은 질소초과 조건(nitrogen excess condition, NH ₄ ⁺ 로서 44 mM)을 기본적인 배지 조성으로 사용하였으며, LiP 생산의 최적조건을 확립하기 위하여 각 성분의 종류와 농도를 변화시켰다.

각각 따로 멸균한 LiP 생산 배지 100 mL를 1 g의 스펀지가 포함되어 있는 250 mL 삼각 플라스크(flask)에 첨가하고, 균주를 1% (v/v)으로 최종농도가 45 mg/L가 되게 접종하였다. 산소와 공기는 공급하지 않았으며, 솜 마개로 밀봉하였다. 담체를 적절히 배열 및 충진하고 균체가 담체에 부착될 수 있도록 37℃에서 12시간 정도 정치시킨 후 200 rpm의 교반속도로 배양하였다. 상기의 방법을 기본적인 배양방법으로 사용하였으며, LiP 생산의 최적조건을 확립하기 위하여 배지 부피, 담체의 종류 및 함량, 접종량, 온도, 교반속도 등을 변화시켰다.

3. 효소의 정제

고정화된 백색부후균을 5 내지 7일 동안 배양한 후, 종이여과지를 이용하여 배양액을 균체와 담체로부터 분리하고 0.2 ㎛ 막으로 여과하여 포자를 제거하였다. 여과한 배양액을 한외여과기(Amicon 8200)와 YM 10 막(Diaflo, 10 kDa cut-off)을 이용하여 10배 이상 농축하고, 투석막(Spectrum, 8 kDa cut-off)을 이용하여 10 mM 소디움 아세테이트 완충액(pH 6.0)에서 24시간 투석하였다. 부분적으로 정제된 LiP 효소용액은 사용시까지 -30℃에서 냉동 보관하였다.

4. 분석방법

1) LiP 활성 측정

LiP는 VA를 베라트릴 알데히드(veratryl aldehyde)로 산화시킬 수 있으며, 이 반응을 이용하여 LiP의 정량 측정을 실시하였다. 반응혼합물은 표 5와 같이 2 mM VA, 0.4 mM H ₂ O ₂ , 50 mM 소디움 타트레이트(pH 3.0)이며, 전체부피가 1 mL가 되도록 하였다.

반응은 H ₂ O ₂ 를 첨가하면서 시작되며, H ₂ O ₂ 는 매번 새로 제조하여 사용하였다. 베라트릴 알데히드가 생성되는 양은 자외선-가시광선 분광광도계(UV-Visible spectrophotometer, Milton roy, Genesis 5)를 이용하여 310 nm에서 선형구간의 흡광도 증가치로 측정하였다. 이 파장에서 베라트릴 알데히드는 빛을 강하게 흡수하지만, VA의 흡광도는 나타나지 않는다. 반응은 LiP의 양에 따라 초기 1 내지 2분 동안만 선형적이다. LiP 활성은 베라트릴 알데히드의 몰흡광계수(molar extinction coefficient, 9,300 M ^-1 cm ^-1 )를 이용하여 다음의 식으로 구하였다.

LiP 활성(Unit/L) = [(ΔOD/min)(전체부피)(10

⁶ μmol/mol)] ÷

[(시료부피)(9,300 M ^-1 cm ^-1 )(통과길이, 1 cm)]

이 식에서 전체부피가 매우 중요하며, 전체부피/시료부피는 희석률을 의미한다. LiP 1 unit는 분당 1 μmol의 VA를 베라트릴 알데히드로 산화시킬 수 있는 효소의 양으로 정의된다.

2) MnP 활성 측정

MnP 활성은 페놀 레드(phenol red)의 산화반응을 이용하여 610 nm에서 측정하였다. 반응혼합물은 50 mM 소디움 석시네이트(sodium succinate, pH 4.5), 50 mM 소디움 락테이트(sodium lactate, pH 4.5), 0.1 mM MnSO ₄ , 3 mg/mL 젤라틴, 0.1 mM 페놀 레드, 50 μM H ₂ O ₂ 이며, 전체부피가 1 mL가 되도록 하였다. 반응은 H ₂ O ₂ 를 첨가하면서 시작되며, 1분 후 NaOH를 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. NaOH를 첨가하면 반응물은 황색에서 분홍색으로 변하였다. 증류수로 바탕시험을 병행하여 610 nm에서의 흡광도 차이를 구하고, MnP 활성은 페놀 레드의 몰흡광계수(4,460 M ^-1 cm ^-1 )를 이용하여 아래의 식으로 구하였다. MnP 1 unit는 분당 1 μmol의 페놀 레드를 산화시킬 수 있는 효소의 양으로 정의된다. MnP는 Tienzyme Inc.으로부터 구입하여 사용하였다.

MnP 활성(Unit/L) = [(ΔOD/min)(전체부피)(10

⁶ μmol/mol)] ÷

[(시료부피)(4,460 M ^-1 cm ^-1 )(통과길이, 1 cm)]

3) 당 정량

포도당의 농도는 페놀 테스트(phenol test) 방법을 이용하여 490 nm에서 측정하였다. 1 mL의 시료를 5% (w/v) 페놀과 혼합하여 30초간 볼텍스(vortex)하고, 5 mL의 진한 황산을 첨가하여 다시 30초간 볼텍스하고, 실온에서 30분간 방치한 후 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 포도당의 표준시료로서 D-글루코오스를 사용하 여 검량선을 작성하였고, 시료의 포도당 농도가 검량선의 농도범위 안에 포함되도록 적당히 희석하였다.

4) 단백질 정량

단백질의 농도는 브래드포드(Bradford) 방법을 이용하여 595 nm에서 측정하였다. 0.1 mL의 시료에 3 mL의 브래드포드 시약(Sigma)을 첨가하고 혼합한 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질-염료 복합체는 1시간 동안 안정하였다. 단백질 표준시료로서 BSA(bovine serum albumin, Sigma)를 사용하여 검량선을 작성하였다.

5) 균사체 건조중량 측정

균사체 건조중량을 측정하기 위하여 수집한 균사체를 미리 무게를 측정한 종이 여과지로 여과하고 증류수로 수차례 세척한 후 80℃에서 건조시켰다. 항량에 도달한 균사체의 무게를 밸런스(balance, Precisa)를 이용하여 소수점 넷째 자리까지 측정하였다. 담체의 무게는 배양 전에 미리 측정하였다.

[실시예]

1. P. chrysosporium PSBL-1의 성장특성

LiP 효소의 생산을 위하여 백색부후균 P. chrysosporium PSBL-1을 사용하였고, 우선 이 균주의 고정화 배양시의 성장특성을 조사하였다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 성장 기질인 글루코오스는 2일과 3일 사이에 급격히 감소하였고 4일경에 거의 완전히 소모되었다. 균체는 글루코오스가 급격히 소모되는 2일과 3일 사이에 지수성장을 하였고, 균체량은 글루코오스가 고갈되는 4일경에 최대치(7.63 g/L)에 도달하였다. 지수성장기로부터 비성장속도를 구하였고 μ는 1.005 day ^-1 이었다. 배지 성분 중에 완충용액이 존재하기 때문에 pH는 배양 중에 크게 변화하지 않았다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, LiP는 탄소원의 고갈에 상응하여 3일째부터 생산되기 시작해서 5일경에 최대치(912 U/L)에 도달하였고, LiP가 생산되는 시점과 일치하여 균체와 담체의 갈색화 현상이 발생하였고, 질소제한 조건에서 갈색화 현상이 더 현저하게 발생하였다. 단백질 농도는 질소원의 고갈에 상응하여 급격히 증가하였으며, 효소가 단백질이므로 LiP 생산곡선과 단백질 농도곡선 사이에는 일치되는 경향의 상관관계가 존재하였다.

2. 세포고정화의 영향

LiP의 생산을 위하여 기존에는 균사체 형태로 성장하는 정체 배양과 펠릿 형태로 성장하는 현탁 배양의 자유 세포(free cell) 배양방법을 주로 사용해왔다. 백색부후균에 의해 리그닌 분해 시스템(ligninolytic system)이 발현되기 위해서는 배지조성과 배양조건에 의존성이 높으며, 특히 100% 산소조건이 요구되는 것으로 보고되었다. 백색부후균의 고체배양에서는 균체가 공기에 직접 노출되어 있어서 리그닌의 분해와 LiP의 합성에 대한 산소조건의 영향이 크지 않지만, 액체배양시에는 산소조건에 의존성이 높으며, 백색부후균의 액침 배양시 균사체 매트(mycelium mat) 내 2 mm 깊이 이상에서는 100% 산소 하에서도 매트 내에 용존산소가 발견되지 않는다고 보고되었다. 그리고 대기 중의 산소농도보다는 균체와 배양액으로 산소의 확산이 리그닌 분해에서 제한요소이고 CO ₂ 농도도 관련 있다고 보고되었다. 기존의 연구에서는 접종시와 배양 중에 100% 산소를 기본적으로 주입하였으나, 본 실시예에서는 장치의 복잡성과 위험성을 고려하여 산소공급을 채택하지 않았다. 그러나, 산소를 공급한 실험에서도 자유 세포 배양으로는 LiP가 생산되지 않거나 검출하기 어려울 정도로 극미량(2.79 U/L)만이 생산되었다. 따라서, LiP의 생산을 위한 대안으로 고정화 방법을 도입하게 되었다. 기존의 연구에서도 고정화 방법을 사용한 사례가 많았고 고정화를 통하여 LiP의 수율이 향상된 것으로 보고되었다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 실시예에서는 백색부후균의 고정화 배양에 의해서만 비로소 LiP가 생산되었고, LiP의 생산을 위해서는 세포고정화가 절대적으로 필요하였고, 세포고정화가 LiP의 생산을 위한 가장 중요한 요소임을 확인하였다. 본 실시예에서 적용한 비-담금(non-immersed) 액체배양은 균체에 안정성을 부여하여 마치 그들이 야생의 나무조직에서 서식하는 것처럼 유사한 환경을 제공하고, 또한 자유 펠릿 배양에서처럼 세포밀도가 높아지는 것을 방지하고 세포의 표면적을 증대시키어 균체로의 산소전달(oxygen availability)을 증가시키기 때문에 공기조건하에서도 LiP가 생산된 것으로 판단되었다.

3. 고정화 담체의 영향

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, LiP의 생산을 위해서는 고정화가 필수적이었고, 고정화 담체로는 스펀지가 가장 우수하였다. Ca-알지네이트의 경우 자유 펠릿과 유사한 양상의 성장 특성을 나타내기 때문에 LiP가 생산되지 않았고, 스펀지와 경질 폴리우레탄 폼과 같은 다공성인 소수성 고체이고 부착력과 흡수력이 우수한 담체를 사용할 경우에만 LiP가 생산되었다. 접종 후 포자는 배양액에서 입자 의 형태로 고립된 채 존재하다가 팽창(swelling)과 발아(germination) 과정 동안에 그 표면특성이 변형되면서 포자끼리 결합하여 포자의 결합체(aggregate)를 형성한다. 포자 결합체가 다른 포자들을 포집하고 균사의 가지를 확장시키면서 결과적으로 펠릿을 형성시키기에 이른다. 자유 펠릿 배양시에는 펠릿의 크기가 펠릿의 수에 따라 다양하고 궁극적으로 펠릿끼리 서로 결합하여 펠릿의 결합체(clump)를 형성한다. 그러나, 스펀지와 같은 다공성 담체가 존재하면 펠릿의 크기는 담체의 기공(pore) 크기에 의해 제한되고, 결국 담체의 물리적인 성질에 의해 제어된다. 펠릿 크기의 조절과 펠릿 결합체 형성을 억제하는 것은 LiP의 생산을 최적화하는데 중요한 인자이다. 스펀지와 경질 폴리우레탄 폼의 기공 직경인 0.4 내지 1 mm에서 펠릿은 제한된 크기로 다공성 담체에 부착성장을 하게 되며, 또한 펠릿의 표면적은 증대하여 기체확산 및 산소전달을 증가시키게 된다. 따라서 다공성 담체에 안정적으로 고정화된 균체는 충분한 산소를 공급받아서 LiP를 과량으로 생산할 수 있는 것으로 판단되었다.

기존에 백색부후균의 고정화에 사용된 담체는 플라스틱 디스크, 나일론 웹, 폴리우레탄 폼, 실리콘 튜브, 소결 유리, 다공성 세라믹 담체, 스테인리스 스틸 네트 등이었으며, 그 중 주로 폴리우레탄 폼을 광범위하게 사용하였다. 또한, 효율적인 부착을 위해서는 높은 이온 강도 또는 담체와 포자 사이의 정전기적인 반발력을 감소시킬 수 있는 담체의 표면처리 같은 특수한 조건이 필요한 것으로 보고되었다. 폴리우레탄의 폼(경질) 형태가 스펀지(연질) 형태보다 밀도는 높고 기공 직경은 큰 편이다. 본 실시예에서 사용한 경질 폴리우레탄 폼은 제품의 보호를 위해 충진하는 패킹제를 이용하였으나, 일정 규격의 담체로 제작하기가 난이한 관계로 LiP의 생산성이 문헌치보다 낮은 편(108.81 U/L)이었다. 본 실시예에서 사용한 스펀지는 시중에서 쉽게 구할 수 있는 저가형 다공성 담체로서, 일정 규격으로의 제작이 용이하고 경질 폼보다 밀도가 낮아서 배지 부피에 상당하는 담체의 무게를 저감시킬 수 있으며, 또한 경질 폼보다 친수성이어서 흡수력이 우수하고 탄성과 신축성도 우수하였다. 스펀지가 지니는 담체로서의 여러 가지 장점으로 인하여 본 실시예에서는 LiP의 생산성이 경질 폼보다 우수하였고, 이후 모든 실시예에서 스펀지를 백색부후균의 고정화 담체로서 사용하였다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 담체의 함량은 스펀지의 경우 배지 100 mL당 1.0 내지 1.2 g(10 내지 12 g/L) 정도가 적절하였고, 14 g/L 이상일 때는 LiP의 생산성이 10 g/L일 때에 비하여 70% 이상 현저히 감소하였다. 담체의 부피는 배지 부피의 90% 정도가 적당하였다. 담체가 부족할 시에는 충진이 제대로 이루어지지 않아서 교반으로 인해 담체가 부유하였고, 담체의 함량이 과다할 시에는 담체끼리 너무 밀접하여서 물질 및 산소전달이 원할하지 못하므로 LiP의 생산성이 감소하였다. 담체의 크기는 2×2×2 ㎤가 적절하였다. 담체의 크기가 작을수록 담체의 표면적은 증가하나, 반면에 충진하는 데에 애로사항이 많았다. 담체의 적절한 크기와 함량과 더불어 담체의 충진과 담체의 배열 그리고 초기에 얼마나 고정화가 잘 이루어졌느냐가 LiP 생산성을 좌우하는 매우 중요한 변수였다. 균체가 다공성 담체에 고정화되는 과정의 주된 기작은 포자의 부착이 아니라, 배양액에서 포자 결합체의 형성과 담체에 의한 포자 결합체의 기계적 체류이다. 시간이 경과할수록 배양액에 서의 포자 결합체는 감소하고 담체 내에 체류하는 포자 결합체는 증가하게 된다. 담체 내에 체류하는 포자 결합체는 다른 포자들을 부착하고 포집하면서 고정화된 펠릿의 형태로 발전하게 되어 담체의 내부공간을 차지하고 표면에 분산되는 것이다.

4. 교반속도의 영향

교반속도는 미생물의 발효에 있어서 매우 중요한 요소이며, 용존산소의 농도와도 밀접한 관련이 있다. 특히, 균사를 형성하는 곰팡이(filamentous fungi)의 액체배양의 경우에는 교반속도가 균체의 성장특성을 좌우하여 분산된 균사체와 압축된 펠릿까지 그 형태(morphology)를 변화시킨다. 일반적으로 교반속도가 증가할수록 펠릿의 수는 증가하고 크기는 감소하며, 밀도는 증가하여 작고 조밀한 펠릿이 형성된다. 기존의 연구에서는 백색부후균의 정체배양법을 주로 사용하였고, 현탁 배양시에는 교반으로 인한 생산된 효소의 기계적 불활성과 또는 펠릿 형성과 균사체의 분화와 같은 균체 형태에 미치는 전단 응력의 역효과가 LiP의 생산을 저해하는 것으로 보고되었다. 또한, 배지 내에 용존산소가 부족할 경우 탄소원의 고갈에 의한 것보다 단백질 분해효소(protease)의 생산이 급증하게 되어 생산된 LiP를 불활성시킨다. 교반속도가 느릴 경우 기계적 불활성과 전단 응력에 의한 역효과는 감소하는 반면에, 미약한 혼합효과로 용존산소의 양이 감소하고 물질 및 산소전달이 원활하지 못하다. 반대로 교반속도가 빠를 경우 기계적인 불활성과 전단응력에 의한 역효과는 증가하는 반면에, 강한 혼합효과로 용존산소의 양이 증가하며 물질 및 산소전달이 원활해진다. 세포를 다공성 고체 담체에 고정화한 경우에는 교반에 의 한 역효과를 감소시킬 수 있으며, 균체가 전단 응력에 대한 민감성을 극복할 수 있다. 따라서 세포를 고정화하고 교반속도를 증가시킬 경우 균체의 안전성과 교반효과를 동시에 얻을 수 있으므로 LiP 생산성이 급격히 향상된 것으로 판단되었다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 100 rpm 이하의 낮은 교반속도에서는 미약한 교반효과로 LiP의 생산성이 현저히 감소하였고(27.95 U/L), 200 rpm을 넘는 너무 강한 교반속도에서는 담체가 부유하기 때문에 고정화가 불가능하였다. 따라서 이후 모든 실시예에서는 200 rpm의 교반속도로 수행하였다.

5. 온도와 pH의 영향

상업적인 측면에서 세포의 최적성장과 2차 대사물의 활성을 위한 온도를 유지하고 제어하는데 필요한 비용을 감안하지 않을 수 없다. 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, P. chrysosporium 의 최적성장 온도는 35 내지 39℃이며, 그 온도범위인 37℃에서 LiP의 생산성이 가장 높았고, 온도가 감소함에 따라 LiP의 생산성도 감소하였다. 30℃에서는 LiP의 생산성이 37℃일 때에 비하여 50% 이상 급격히 감소하였고, 특히 25℃에서는 LiP의 생산성이 현저히 감소하였으며(19.78 U/L), 투명하였던 배지가 불투명하게 탁해지어서 저온으로 인한 다른 대사과정이 진행된 것으로 추측되었다. pH 보다는 LiP의 생산성에 미치는 온도의 영향이 더욱 컸으며, 20℃ 이하의 저온에서는 균체의 성장이 저해됨을 확인하였다.

백색부후균의 배양에서 pH는 완충용액에 의해서 초기 pH만을 조절하였고 완충작용으로 인하여 배양 중에 pH의 변화는 크지 않았다. 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, P. chrysosporium 의 생리적인 최적 pH는 4.5이며, pH 4.5에서 역시 LiP 의 생산성도 가장 높았다. LiP 생산성에 대한 pH의 영향은 그렇게 크지 않은 편이었지만, pH가 4.5보다 낮거나 높을 경우 LiP 생산성이 pH 4.5일 때에 비하여 20 내지 30% 정도 감소하였다. 따라서 이후 모든 실시예에서는 37℃, pH 4.5에서 배양하였다.

6. 접종량과 배지부피의 영향

본 실시예에서는 LiP의 생산을 위한 백색부후균의 접종원으로서 포자 현탁액(spore suspension) 대신 균사체 현탁액(mycelium suspension)을 사용하였다. 균사체 현탁액을 사용하는 것이 포자 현탁액을 사용하는 것보다 성장의 지연기를 감소시킬 수 있고, 또한 담체로의 부착이 보다 용이하므로, 접종원으로 균사체 현탁액을 사용하였다. 접종량에 따라서 펠릿의 수와 크기가 달라지며, 다른 곰팡이에서도 펠릿의 크기는 유용한 2차 대사물의 생산을 위해서 중요하다고 보고되었다. 일반적으로 접종량이 증가할수록 펠릿의 수는 증가하고 크기는 감소한다. 접종량이 적으면 지연기가 길어질 수 있고 접종량이 많으면 급속한 성장 또는 과잉성장으로 인하여 2차 대사과정이 저해될 수 있으며, 따라서 최적성장과 최적의 LiP 생산성을 위한 적정 접종량이 존재하게 된다. 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 접종부피 1% v/v, 접종농도는 최종농도로 45 mg/L 정도가 적정 접종량이었다. 접종량이 2% v/v일 경우 LiP 생산성이 1% 일 때에 비하여 20% 정도, 5% v/v일 경우 40% 가량 감소하였다.

또한, LiP의 생산을 위하여 배치 스케일(batch scale)로 250 mL 삼각 플라스크를 사용하였고, 250 mL 플라스크의 공간을 차지하는 배지 부피가 LiP의 생산성에 미치는 영향을 조사하였다. 기존의 연구에서는 배지 부피를 작게 하고 산소를 공급하는 정체 배양(shallow stationary culture)을 주로 사용하였다. 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 배지 부피가 50 mL일 경우 100 mL일 때에 비하여 LiP의 생산성이 약 45% 가량 감소하였다. 플라스크 내에 배지의 부피가 작을 경우 그만큼 플라스크 내에 공기의 부피가 증가하게 되지만, 세포를 다공성 고체 담체에 고정화함으로써 향상된 산소전달로 인하여 플라스크 내 공기부피의 영향은 줄어들었고, 공기부피보다는 균주가 필요로 하는 배지 성분이 상대적으로 불충분하기 때문에 LiP의 생산성이 감소된 것으로 사료되었다.

7. 탄소원의 종류와 농도의 영향

백색부후균의 탄소 및 에너지원으로 글루코오스, 글리세롤, 석시네이트, 셀룰로오스, 자일로오스(xylose) 등이 사용되었고, 주로 글루코오스를 사용해왔다. 본 실시예에서는 탄소 및 에너지원으로 글루코오스와 글리세롤에 대하여 조사하였다. 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 글리세롤을 탄소원으로 사용하였을 경우 글루코오스를 사용하였을 경우보다 약 60% 가량 LiP 생산성이 감소하였다. 글리세롤은 백색부후균에 의해 천천히 대사되는 물질로서 성장기간 중에도 불균형적인 영양조건, 특히 탄소제한 조건을 야기한다. 가장 일반적이고 대표적인 탄소 및 에너지원인 글루코오스는 빠르게 대사되는 성장 기질로서 백색부후균의 탄소 및 에너지원으로 가장 우수하였다.

탄소원인 글루코오스의 농도가 LiP 생산성에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 제한조건(2 g/L), 충분조건(10 g/L), 초과조건(20 g/L)에서 실험을 수행하였 다. 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 탄소 제한조건과 초과조건일 경우 탄소 충분 조건일 경우에 비하여 LiP 생산성이 각각 65%, 40% 가량 감소하였다. 야생 균주의 경우 질소 또는 탄소제한 조건이 필수적이었고, 탄소제한이 질소제한보다 LiP 생산에 유효하였던 사례도 있었다. 그러나, 탄소가 제한될 경우 성장 기질이 부족하게 되어 그만큼 백색부후균의 성장이 제한되었고, 탄소 초과조건일 경우 과잉성장으로 인하여 LiP의 생산성이 저해된 것으로 판단되었다. 따라서, 글루코오스의 농도는 충분 조건인 10 g/L(56 mM)가 적정하였고, 이후 모든 실험에서 탄소 및 에너지원으로 글루코오스를, 그 농도는 10 g/L를 사용하였다.

8. 질소원의 종류와 농도의 영향

백색부후균의 질소원으로 암모늄, 아스파라긴, 글루타메이트(glutamate), 질산 나트륨 등이 사용되었고, 대부분의 연구에서 암모늄을 질소원으로 사용해왔다. 본 실시예에서는 백색부후균의 질소원으로 몇 가지 암모늄 화합물에 대하여 조사하였다. 그 결과 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 백색부후균의 대표적인 질소원으로 사용되어 왔었던 암모늄 타트레이트가 가장 우수한 질소원이었고, 암모늄 포스페이트의 경우 암모늄 타트레이트를 사용하였을 경우보다 LiP 생산성이 75% 가량 감소하였으며, 질산 암모늄, 황산 암모늄, 염화 암모늄을 질소원으로 사용하였을 경우 LiP가 전혀 생산되지 않았다. 암모늄의 질산염, 황산염, 염화물은 백색부후균의 성장 및 2차 대사과정에 유효하지 않은 것으로 판단되었다.

질소원인 디암모늄 타트레이트의 농도가 LiP 생산성에 미치는 영향을 평가하 기 위하여 제한조건(1.1 mM, NH ₄ ⁺ 로서 2.2 mM), 충분조건(11 mM, NH ₄ ⁺ 로서 22 mM), 초과조건(22 mM, NH ₄ ⁺ 로서 44 mM)에서 실험을 수행하였다. 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, 질소원의 농도가 증가할수록 LiP의 생산성이 급격하게 증가하였다. 특히 질소초과 조건에서 LiP의 생산성이 월등히 향상되었다. 질소원의 농도를 22 mM 이상으로 증가하여도 LiP 생산성이 더 이상 증가하지는 않는다고 보고되었다. 백색부후균을 이용하여 리그닌 분해효소를 생산하기 위한 기존 연구에서는 대부분 탄소, 질소, 황 등의 영양소를 제한하는 제한조건을 사용하였다. 그 중에서도 특히 질소제한 조건을 일반적으로 사용하였고, 질소를 제한하지 않고서는 리그닌 분해효소가 생산되지 않는다고 보고되었다. 그러나, 불균형적인 배지 조성(unbalanced Carbon/Nitrogen ratio)인 제한조건을 사용하였을 경우 성장의 제한과 리그닌 분해효소의 생산성 저하라는 결과를 초래한다. 또한, 질소제한 조건일 경우 주된 2차 대사물질로서 세포외 다당류(extracellular polysaccharide)가 형성되어 균체에 부착된 다당류가 영양소 및 산소 확산에 저항으로 작용한다고 보고되었다. 질소 충분 또는 초과조건에서는 성장 기질인 글루코오스의 소모속도가 제한조건일 경우보다 훨씬 빠르며, NH ₄ ⁺ 이 글루코오스의 고갈과 동시에 고갈되었다가 배양액으로 재축적되는 현상이 발생하고, 이것은 대체 에너지원의 생성을 위한 세포 단백질의 가수분해(proteolysis)를 수반한 자가 융해(autolytic) 메커니즘에 의한 결과라고 판명되었다. 질소제한 조건이 필요한 야생 균주의 경우에서도 다공성 고체 담체를 사용하 였을 때 질소 충분 조건에서 오히려 높은 LiP 생산성을 기록한 바 있으며, 이것은 균형잡힌 영양조건, 비-담금 배양으로 향상된 산소전달, 글루코오스 소모속도의 가속, NH ₄ ⁺ 의 재축적 등으로 설명되었다. 아울러 본 실시예에서 사용한 균주는 LiP의 수율을 향상시키기 위하여 전략적으로 질소 충분 조건하에서 돌연변이(mutation) 기술을 도입하여 분리한 돌연변이 균주(mutant)이기 때문에 질소 충분 또는 초과 조건에서 LiP의 생산성이 괄목할만하게 향상된 것으로 사료되었다. 따라서, 이후 모든 실시예에서 질소원으로 암모늄 타트레이트를 사용하였고, 질소초과 조건에서 배양하였다.

9. 완충용액(buffer solution)의 영향

백색부후균의 배양에서 배지의 pH를 조절하기 위하여 완충용액을 사용하며, DMS, 아세테이트, 시트레이트, 석시네이트, 프탈레이트, 타트레이트, 옥실레이트 버퍼 등이 사용되었다. 본 실시예에서는 백색부후균의 배양에서 보편적으로 사용되었던 DMS 버퍼를 기본적으로 사용하였고, 그 외에 아세테이트와 타트레이트 버퍼에 대한 LiP 생산성 실험을 수행하였다. 도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, 소디움 타트레이트를 사용하였을 경우 DMS를 사용하였을 경우보다 LiP 생산성이 약 10% 가량 향상되었으나, 소디움 아세테이트를 사용하였을 경우 LiP 생산성이 약 70% 가량 감소하였다. 배양방법 및 조건과 배지 조성에 따라서 LiP의 생산성이 우수한 버퍼의 종류가 다르며, 특히 아세테이트 버퍼의 경우는 MnP의 생산에 효과적인 것으로 보고되었다. DMS 버퍼의 경우는 우수한 완충작용으로 배양 중 pH의 변화폭이 크지 않지만 고가이므로, 소디움 타트레이트 버퍼로 대체하는 것이 경제적일 것으로 판단되었다.

10. 계면활성제(surfactant)의 영향

계면활성제의 투입으로 인하여 백색부후균의 현탁 배양이 가능해졌다. 본 실시예에서는 LiP 생산성에 미치는 계면활성제의 영향을 평가하기 위하여 트윈 계열과 스판 계열의 비이온계 계면활성제를 첨가하였다. 도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이, 트윈 80의 경우 계면활성제를 첨가하지 않은 경우보다 LiP 생산성이 30% 가량 향상되었고, 트윈 80의 농도는 0.05 내지 0.1%가 적절하였다. 트윈 80의 농도가 0.2% 이상일 경우 LiP의 생산성을 저해한다고 보고되었다. 트윈 20의 경우 계면활성제를 첨가하지 않은 경우보다 LiP 생산성이 약 7% 가량 향상되었고, 스판 20의 경우 계면활성제를 첨가하지 않은 경우보다 LiP 생산성이 약 30% 가량, 스판 80의 경우 약 15% 가량 각각 감소하였다. 결과적으로 스판 계열은 LiP의 생산에 유효하지 못하고 오히려 LiP 생산성을 저해하였으며, 트윈 계열만이 유효하였다. 계면활성제와 단백질 사이의 상호작용은 복잡하며 계면활성제는 단백질과 결합하여 그 구조를 변화시킬 수 있다. 트윈 80은 교반으로 인한 LiP의 기계적인 불활성을 보호하고, 또한 세포막의 특성을 변형시켜서 세포막을 통한 화합물들의 출입을 촉진한다고 보고되었다. 트윈 80의 농도가 CMC(critical micelle concentration) 값 이하일 경우 LiP의 불활성에 대한 보호효과가 나타나지 않으며, 이것은 미셀(micelle)의 형성이 LiP 효소의 보호작용에 관여함을 암시한다. 또한, 트윈 80의 가수분해로 방출되는 포화 및 불포화 지방산이 백색부후균의 2차 대사기간 동안에 대체 에너지원 으로 사용될 수 있고, 또한 LiP의 합성과정에 관여될 수 있는 것으로 보고되었다.

11. Mn과 Fe의 영향

미량 원소는 미생물의 배양에서 매우 적은 양만이 필요하지만, 미세 영양원으로서 세포의 기능에, 특히 효소의 구성성분으로서 매우 중요한 역할을 수행한다. 본 실시예에서는 미량 원소 중 Mn과 Fe의 농도가 LiP의 생산성에 미치는 영향을 조사하였다. Mn은 LiP의 생산을 저해하고 반면에 MnP의 생산을 촉진하는 것으로 보고되었다. 따라서, 도 17에서 확인할 수 있는 바와 같이, Mn의 농도가 증가할수록 LiP의 생산성이 감소하였고 MnP의 생산성은 증가하였다. Mn의 농도가 10 ppm 이상에서는 LiP의 생산성이 급격히 감소하여 35 ppm일 경우 Mn을 첨가하지 않은 경우보다 70% 가량 감소하였고, 100 ppm일 경우 85% 가량 감소하였으며, 반면에 Mn의 농도가 10 ppm 이상에서는 MnP의 생산성이 급격히 증가하였다. Mn은 MnP 유전자의 발현을 직접적으로 유도하지만 LiP 유전자 전사를 직접적으로 억제하지는 않는다고 보고되었다. Mn은 리그닌 분해효소의 동위효소 구성을 조절하는 역할을 하여 Mn의 부재시 LiP가 생산되며, Mn의 존재시 주로 MnP가 생산된다. 따라서 LiP의 생산을 위해서는 Mn을 첨가하지 않은 것이 효과적이며, LiP 생산이 주목적인 본 발명에서는 Mn이 포함되지 않은 미량 원소를 사용하였다. 최근 연구에 의하면 Mn의 결핍이 LiP가 생성되는데 필요한 산소조건을 대체할 수 있다고 보고되었다. Mn은 항산화제(antioxidant)적인 특성을 지닌 것으로 알려졌고, 펜톤(Fenton) 반응의 역반응으로 자유 라디칼을 파괴시킨다. Mn의 존재하에 발현되는 MnSOD(Mn superoxide dismutase)는 초과산화물(superoxide) 라디칼을 그보다 낮은 반응성 산화종인 H ₂ O ₂ 로 전환시킴으로써 세포를 산화 스트레스로부터 보호하는 역할을 한다. LiP가 항산화제로서의 역할을 한다는 가능성이 제안되었고, 항산화 효소의 활성이 감소한 후에만 LiP의 생성이 시작된다고 증명되었다. MnP는 일반적으로 질소 충분 조건보다는 질소제한조건에서 Mn의 첨가시에 과량 생산되고, 질소제한 조건에서 동위효소 프로파일이 다양한 것으로 보고되었다. 나무의 종류에 따라 다르지만, 일반적으로 나무에서 Mn은 20 내지 200 ppm의 농도범위로 존재하며, 그러한 농도에서는 MnP가 유도되고 MnP는 Mn(Ⅱ)을 Mn(Ⅲ)으로 산화시키고, 반응성이 좋은 Mn(Ⅲ)은 나무에서 유동하며 확산한다. 일정 기간이 경과하면 균사체 부근에 Mn이 고갈되는 시점이 있고, LiP가 발현되어 리그닌의 하부 구조에 직접적으로 작용한다. MnP의 활성이 작용한 후, 리그닌은 LiP의 공격에 보다 민감해지게 된다. 실제 백색부후균에 의해 부패된 나무에는 검게 변색된 부분이 존재하며, 이 지역에서 과량의 Mn이 검출되었다. 실제 나무의 부패과정에서 LiP, MnP, Mn의 상호작용과 역할은 명확히 규명될 것으로 기대된다.

LiP는 Fe를 함유한 헴 단백질이기 때문에 Fe의 농도에 따른 LiP의 생산성을 조사하였다. 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, Fe의 농도가 고농도인 100 ppm일 경우와 저농도인 7 ppm일 경우 모두에서 동일한 LiP 생산성을 나타내었다. Fe는 매우 중요한 미량 원소이지만 Fe의 농도와 LiP의 생산성과는 무관한 것으로 판단되었다.

12. VA의 영향

일반적으로 LiP는 백색부후균의 배양 3일경에 생산되어 5 내지 6일경에 최대 활성도에 도달한 후 점차적으로 활성도가 감소하게 된다. 이렇게 생산된 LiP의 활성도가 최대치에 도달한 후 감소하게 되는 이유는 강한 교반으로 인한 기계적인 변성, 단백질 분해효소에 의한 LiP 단백질의 분해, 2차 대사물로 생성되는 H ₂ O ₂ 에 의한 불활성 등으로 요약될 수 있다. 본 실시예에서는 LiP의 생산성을 향상시킬 수 있는 물질로서 VA와 인돌 화합물을 선택하여 LiP 생산성에 미치는 VA와 인돌 화합물의 투입시기 및 농도의 영향을 조사하였다. 도 19에서 확인할 수 있는 바와 같이, 안정화제를 투입하지 않은 경우 LiP 활성도가 최대치에 도달한 후 급격히 감소하였고, 0.05 mM 트립토판과 인돌을 투입하였을 경우 LiP의 생산성이 안정화제를 투입하지 않았을 경우보다 각각 15%, 30% 증가하였다. 도 20에서 확인할 수 있는 바와 같이, VA와 인돌 화합물을 비교하여 보면, VA의 LiP 생산성 향상효과가 인돌 화합물보다 2배 이상 높았다. 이러한 결과는 H ₂ O ₂ 에 의한 불활성에 대한 LiP의 안정화 실험과 일치하는 결과였다. 따라서 LiP의 생산성을 향상시킬 수 있는 물질로 VA를 선택하였고, VA에 대하여 추가적으로 실험하였다. 도 21에서 확인할 수 있는 바와 같이, VA의 투입시기에 따라 LiP의 생산성에 다소 차이가 있었지만 투입시기의 영향은 크지 않은 것으로 판단되었다. 본 실시예에서는 VA를 초기에 투입하였을 경우에 LiP의 생산성이 높았지만, 초기에 VA를 투입하였을 경우 백색부후균의 대사과정을 방해할 수 있다고 보고되었다. VA의 투입시기보다는 투입횟수와 농도의 영향 이 더욱 중요하였다. 도 22에서 확인할 수 있는 바와 같이, VA의 농도가 증가할수록 LiP의 생산성은 향상되었으며, VA를 추가적으로 투입하였을 경우 LiP의 생산성은 더욱 효과적으로 향상되었다. VA를 접종시에 0.4 mM, LiP가 생산되는 시점인 3 내지 4일경에 2 mM을 추가로 투입하였을 경우에 LiP의 생산성이 가장 높았다. VA의 농도가 2 mM 이상으로 증가하여도 LiP의 생산성은 향상되지 않는 것으로 보고되었다. 도 23에서 확인할 수 있는 바와 같이, VA를 반복적으로 투입하였을 경우 LiP의 생산성은 점진적으로 향상되었고, 또한 높은 LiP 생산성을 장시간 유지할 수 있었다. VA의 투입에 의하여 LiP의 생산성이 최고 3배 이상 증가하였고, VA은 LiP 생산성 향상에 탁월한 효과를 발휘하였다. 백색부후균의 배양 중 2차 대사물로 H ₂ O ₂ 가 30 μM까지 생산되며, 글리세롤보다 글루코오스를 탄소원으로 사용하였을 경우에 H ₂ O ₂ 가 더 많이 생산된다고 보고되었다. HO·, O ^{2 -} ·과 같은 라디칼은 단백질을 분해하는 것으로 알려졌고, 이 라디칼들은 H ₂ O ₂ 로부터 생성된다. VA의 투입으로 LiP의 생산성이 향상되고 그 생산성이 유지될 수 있는 것은 VA가 LiP 유전자의 발현을 유도하기보다는, 배양 중 2차 대사물로 생산되는 H ₂ O ₂ 에 의한 불활성으로부터 LiP를 보호하여 생산된 LiP가 불활성되지 않고 축적되기 때문인 것으로 사료되었다.

13. 탄소원 투입의 영향

본 실시예에서는 탄소원의 투입과 유가식 배양(fed-batch)을 통하여 LiP의 생산성을 향상시키고자 하였다. 성장기질인 글루코오스가 고갈되는 시점인 5일경부 터 글루코오스를 2 g/L의 농도로 매일 투입하였다. 그 결과, 도 24에서 확인할 수 있는 바와 같이, LiP의 생산성은 점진적으로 향상되었으며, 또한 그 생산성이 지속적으로 유지되었다. 탄소원을 추가적으로 투입하였을 경우 지속적인 균체의 성장과 더불어 LiP의 합성도 지속적으로 활성화되었고, 또한 탄소원의 투입으로 단백질 ㅂ분해효소의 생산을 억제하는 효과도 얻을 수 있었기 때문에 LiP의 생산성이 향상된 것으로 판단되었다. 탄소원의 고갈에 상응하여 생산되는 단백질 분해효소에 의한 LiP의 분해가 최대 활성도에 도달한 후 LiP의 활성도가 감소하게 되는 주요 요인이며, 탄소원의 투입으로 단백질 분해효소에 의한 LiP의 분해를 억제할 수 있다고 보고되었다.

LiP의 불활성을 보호하고 LiP의 생산성을 향상시킬 수 있는 방법은 다음과 같다. 기계적인 교반으로 인한 LiP의 불활성은 계면활성제의 투입으로, H ₂ O ₂ 에 의한 LiP의 불활성은 VA의 투입으로, 단백질 분해효소에 의한 LiP의 분해는 탄소원의 투입으로 극복할 수 있으며, 그 결과로 LiP의 생산성이 향상되었다.

14. LiP 생산의 최적조건

상기의 결과들을 토대로 LiP 생산의 최적조건을 확립하였고, 그 결과를 표 6에 요약하였다. 도 25에서 확인할 수 있는 바와 같이, 고정화된 백색부후균의 배양을 통하여 질소초과 조건에서 향상제로서 VA를 접종시에 0.4 mM, LiP가 생산되는 시점인 3일에 2 mM의 농도로 투입하였을 경우 최고 1,472 U/L의 LiP를 생산하였다. 이러한 수치는 기존의 국내외에서 보고된 연구결과와 비교하여도 손색이 없을 정도 의 높은 수율이었다.

도 1은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1의 성장특성을 나타낸 그래프이다.

도 2는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 리그닌 분해효소인 LiP와 MnP의 시간에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 세포 고정화의 영향을 비교한 그래프이다.

도 4는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 고정화 담체의 영향을 비교한 그래프이다.

도 5는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 담체 함량의 영향을 비교한 그래프이다.

도 6은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 교반속도의 영향을 비교한 그래프이다.

도 7은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 온도의 영향을 비교한 그래프이다.

도 8은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 초기 pH의 영향을 비교한 그래프이다.

도 9는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 접종량의 영향을 비교한 그래프이다.

도 10은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 배지부피의 영향을 비교한 그래프이다.

도 11은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 탄소원 종류의 영향을 비교한 그래프이다.

도 12는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 탄소원 농도의 영향을 비교한 그래프이다.

도 13은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 질소원 종류의 영향을 비교한 그래프이다.

도 14는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 질소원 농도의 영향을 비교한 그래프이다.

도 15는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 완충용액의 영향을 비교한 그래프이다.

도 16은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 계면활성제의 영향을 비교한 그래프이다.

도 17은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 망간 농도의 영향을 비교한 그래프이다.

도 18은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 철 농도의 영향을 비교한 그래프이다.

도 19는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 인돌 화합물의 영향을 비교한 그래프이다.

도 20은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 안정화제의 영향을 비교한 그래프이다.

도 21은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 베라트릴 알코올(veratryl alcohol, VA) 첨가시기의 영향을 비교한 그래프이다.

도 22는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 VA 첨가 농도와 시기의 영향을 비교한 그래프이다.

도 23은 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 반복적인 VA 첨가의 영향을 비교한 그래프이다.

도 24는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 생산에 미치는 유가식 배양의 영향을 비교한 그래프이다.

도 25는 고정화된 P. chrysosporium PSBL-1에 의한 LiP의 최대 활성을 나타낸 그래프이다.