本発明は、被験体における免疫応答を発生、調節又は制御するための医薬組成物、及びその使用方法に関する。

本発明は、より具体的には、腫瘍抗原、微生物抗原又は他の抗原等の選択された異種抗原に対する免疫応答を経口ワクチン接又は粘膜ワクチン接種により高めるための、ジアルジア属（Giardia）の寄生虫の可変表面タンパク質（ＶＳＰ）又はその断片（例えば、ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメイン又はその断片）等の少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフを含むポリペプチドを使用する医薬組成物に関する。

発明の背景：
抗原の直接投与、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球又は樹状細胞等）のエクスビボ刺激及び増殖、遺伝的に又は化学的に改変されている癌細胞の注射、不活化ウイルスの投与、ならびに特定の抗原又はサイトカインをコードする核酸を用いる遺伝子治療等、被験体における免疫応答を高める様々なストラテジが当技術分野において提案されている。

これら様々なアプローチは、特定の種類の抗原又は病原体に対する免疫応答を生じさせることができるが、免疫応答を誘発、制御、又は刺激するより優れた方法が依然として必要とされている。 具体的には、特に経口投与により、腫瘍抗原、ウイルス抗原、又は病原体に由来する他の抗原等の様々な抗原に対して、効率的な細胞性及び／又は体液性免疫応答等の効率的な免疫応答を生じさせる簡単な方法が必要とされている。

実際には、安全性、患者の受容性、及び罹患率の問題により、今日市販されているワクチンの大部分は注射により送達されているが、これは、特に資源の乏しい開発途上国において、集団予防接種のコストを増大させ且つ安全性を低下させている。 したがって、他の投与経路、特に非経口ワクチンに比べて、経口送達は多数の著しい利点を提供する（投与が簡単であり、安全性が改善される）。 更に、全身性免疫とは異なり、経口送達は、粘膜免疫応答を誘導することができる。

したがって、経口送達されたワクチンは、腸関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）と呼ばれることの多い消化管の免疫系によってプロセシングされ、提示される。 ＧＡＬＴは、ホーミング系により関連付けられている（抗原が遭遇し、応答を開始する）誘導部位と、（局所免疫応答が生じる）エフェクター部位からなる複雑な系であって、ＧＡＬＴにおいて抗原により活性化された細胞は、循環に、次いで粘膜に遊走する（Lavelle et al.;2006）。 結果として、経口ワクチン接種は、腸及び遠位の粘膜部位において局所的に免疫応答を誘導できることに加えて、全身性の体液性及び細胞性免疫応答も誘導することができる。 経口ワクチン接種は、典型的に、粘膜の防御において重要な役割を果たす分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）を大量に産生させる。

更に、たとえ経口経路のワクチン送達が予防的及び治療的なワクチンを送達する理想的な手段を表し、全身性送達よりも著しい利点を提供するとしても、経口経路は、胃腸管によってもたらされる多数の障壁のせいで最も困難な経路である。 ペプチド及びタンパク質のワクチンで有効な免疫を促進するためには、抗原を保護し、取り込みを強化し、そして、先天性免疫応答を活性化しなければならない。 したがって、生ベクター、不活性粒子及び細菌毒素を含む多数の送達系及びアジュバントが、経口ワクチン送達について評価されている。 しかし、タンパク質又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）のみを用いることによる効率的な経口免疫は未だ得られていないので、現在のところ経口ワクチンの開発は成功していない。

結果として、経口投与又は粘膜投与により、腫瘍抗原、ウイルス抗原、又は病原体に由来する他の抗原等の様々な抗原に対して、効率的な細胞性及び／又は体液性免疫応答等の免疫応答を誘発、制御、又は刺激するより優れた方法が依然として必要とされている。

発明の概要：
本発明は、経口投与又は粘膜投与により、被験体における免疫応答を誘発、制御、又は刺激する新規の、代替となる、そして改善された方法を提供する。

本発明は、より具体的には、被験体における選択された抗原により引き起こされる疾患を治療又は予防するために、ジアルジア属の寄生虫の可変表面タンパク質（ＶＳＰ）又はその断片（例えば、ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメイン又はその断片）等の少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフ（式中、Ｃはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）を含むポリペプチドを用いて、経口投与又は粘膜投与により、このような選択された抗原に対する免疫応答、特に細胞性及び／又は体液性免疫応答を高める新規概念に基づく。

また、本発明は、経口投与又は粘膜投与により、抗原に対する改善された免疫応答を生じさせることができるベクター粒子及び／又は融合タンパク質を含む関連する医薬組成物、その調製及び使用について開示する。

したがって、第１の態様では、本発明は、
− 少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフ（式中、Ｃはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）を含むポリペプチドと、
− 異種抗原とを少なくとも含む医薬組成物に関する。

第２の態様では、本発明は、上に定義される少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフ（式中、Ｃはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）を含み、そして、腸の上皮細胞に付着する能力を保持しているポリペプチドと、異種抗原とを含む融合タンパク質に関する。

第３の態様では、本発明は、上に定義される少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフを含み、そして、ベクター粒子に結合している腸の上皮細胞に付着する能力を保持しているポリペプチドに関する。

第４の態様では、本発明は、被験体における疾患、障害、又は生理学的状態の治療又は予防において使用するための医薬組成物に関する。

第５の態様では、本発明は、提示用及びワクチン接種、特に経口ワクチン接種又は粘膜ワクチン接種用の異種抗原のキャリアとしての、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の上に定義される少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフを含むポリペプチドの使用に関する。

発明の詳細な説明：
本発明者らは、ジアルジア属の可変表面タンパク質（ＶＳＰ）（例えば、ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメイン又はその断片）等の少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフ（式中、Ｃはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）を含むタンパク質又はポリペプチドを、候補ワクチン抗原のキャリアとして又は防御免疫を誘導するために、経口経路により用い得ることを初めて実証する。 更に、本発明者らは、ＶＳＰの細胞外ドメイン等のこのようなポリペプチドが、プロテアーゼ、様々なｐＨに対して耐性であり、そして、腸の上皮細胞に付着することができ、経口投与に適したウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成するのに有用であることを実証する。

定義：
明細書の全体を通して、以下の段落で幾つかの用語を使用し、そして、定義する。

本明細書で使用するとき、用語「免疫原性」は、免疫応答又は免疫反応を誘発するか、引き起こすか、刺激するか、又は制御する生成物、組成物、又は方法を意味する。 したがって、免疫原性組成物は、被験体又はインビトロにおいて免疫系の活性を変化させる任意の組成物である。 これは、防御免疫応答、細胞性免疫応答、抗体応答、免疫応答の中和、抗体レベルの変化、免疫細胞レベルの改変等を含む。

本明細書で使用するとき、用語「抗原」は、ＭＨＣ分子によってプロセシング及び提示される場合、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合することができる分子を指す。 また、用語「抗原」は、本明細書で使用するとき、Ｔ細胞のエピトープを含む。 更に、抗原は、免疫系によって認識され得る、ならびに／又はＢリンパ球及び／もしくはＴリンパ球の活性化を導く体液性免疫応答及び／もしくは細胞性免疫応答を誘導することができる。 しかし、これは、少なくとも特定の場合において、抗原がＴｈ細胞のエピトープを含有するか又はＴｈ細胞のエピトープに結合し、そして、アジュバントにおいて与えられることを必要とする場合があるか、あるいは、抗原が本発明に従って提示されることを必要とする場合がある。 抗原は、１以上のエピトープ又は抗原性部位（Ｂ−及びＴ−エピトープ）を有し得る。 用語「特異的に結合する」は、本明細書で使用するとき、抗原が、好ましくは、典型的には高度に選択的に、対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘起され得る多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことを示すことを意味する。

本明細書で使用するとき、用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性又は免疫原性活性を有するポリペプチド性又は非ペプチド性の分子の連続する部分又は不連続な部分を指す。 ＭＨＣ分子に関しては、エピトープは、抗体に又はそのＴ細胞受容体を通してＴ細胞に認識される。 本明細書で使用するとき「免疫原性エピトープ」は、当技術分野において公知の任意の方法により求めたとき、動物における抗体応答を誘発するか又はＴ細胞応答を誘導するポリペプチド性又は非ペプチド性の分子の部分として定義される。 本明細書で使用するとき、用語「抗原性エピトープ」は、当技術分野において周知の任意の方法により求めたとき、抗体がその抗原に免疫特異的に結合することができるタンパク質又は非ペプチド性の分子の部分として定義される。 免疫特異的結合は、非特異的な結合を除くが、他の抗原との交差反応性を必ずしも除くものではない。 抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。 また、抗原性エピトープは、Ｔ細胞エピトープであってもよく、この場合、抗原性エピトープは、ＭＨＣ分子に関する文脈において、Ｔ細胞受容体と免疫特異的に結合し得る。

本明細書で使用するとき、用語「異種抗原」は、寄生虫ジアルジア属（特にランブル鞭毛虫（Giardia lamblia））又は本発明に定義される他の微生物に対して異種である抗原を指し、したがって、このような異種抗原は、寄生虫ジアルジア属又は前記他の微生物に由来するものではない。 したがって、本発明の文脈では、用語「異種抗原」は、植物、動物、寄生虫（例えば、ジアルジア属に由来するもの以外）、細菌、ウイルス、腫瘍抗原、自己抗原、又は化学分子を含む。 しかし、本発明のポリペプチドが、例えばテトラヒメナ属（Tetrahymena）、ゾウリムシ属（Paramecium）、エントアメーバ属（Entamoeba）等の別の微生物に由来する場合、前記異種抗原がジアルジア属に由来する場合もあることに留意すべきである。

本明細書で使用するとき、用語「ジアルジア属」又は「ジアルジア属の寄生虫」は、幾つかの脊椎動物の小腸においてコロニー形成し、そして繁殖して、ジアルジア症を引き起こすメタモナーダ（Metamonada）門の嫌気性有鞭毛寄生原虫の属を指す。 世界中で、糞便−口腔衛生状態の悪い人々の間でジアルジア症は一般的であり、主な伝播様式は、汚染水の供給又は性行為を含む。 有鞭毛ジアルジア属の栄養体は、小腸の上皮細胞（すなわち、腸管粘膜の表面）に付着し、そこで、顕著な炎症反応を誘発することなく疾患を引き起こすことができる（Rivero et al., 2010）。 毒性因子又は毒素は知られておらず、表面タンパク質の発現を変化させることにより、ホストの免疫応答を回避し、そして、様々なホスト環境に適応することができる（Rivero et al. 2010）。 その生活環は、活発に泳ぐ栄養体と感染性の保護嚢子とを交互に繰り返す。 ジアルジア属の寄生虫はヒトに感染するが、ネコ、イヌ及びトリに感染する最も一般的な寄生虫のうちの１つでもある。 また、哺乳類ホストは、ウシ、ビーバー、シカ、及びヒツジを含む。 したがって、用語「ジアルジア属」は、ランブル鞭毛虫及びジアルジア・ムリス（Giardia muris）を含む様々な種を含む。

本明細書で使用するとき、用語「ランブル鞭毛虫」（腸鞭毛虫（Giardia intestinails）又はジアルジア・デュオデナリス（Giardia duodenalis）とも呼ばれる）は、ヒトの最も一般的な腸内寄生虫のうちの１つを指す。 ランブル鞭毛虫は、米国で最も流行している寄生性原生生物であり、米国における発生率は０．７％もの高さである場合もある（Hlavsa et al. 2005）。

本明細書で使用するとき、「可変表面タンパク質」又は「ＶＳＰ」という用語は、ジアルジア属の寄生虫の全表面を被覆するポリペプチドを指し、そして、ホストの免疫系によって認識される主な抗原である。 ＶＳＰは、一部のＶＳＰにおけるＣＸＣモチーフ、ジアルジア属に特異的なジンクフィンガーモチーフ、及びＧＧＣＹモチーフの存在を含む、幾つかの特定の特徴を有するＣＸＸＣモチーフ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）が頻繁に存在するシステインリッチタンパク質である（Nash, 2002; Adam wt al, 2010）。 より正確には、ＶＳＰは、サイズが２０〜２００ｋＤａで変動する１型内在性膜タンパク質であり；可変アミノ末端システインリッチ領域（ホスト／寄生虫の接触面を表し、そして、タンパク分解及び低ｐＨに対する耐性をタンパク質に付与する細胞外ドメイン）と、免疫系には「見つからない」疎水性膜貫通領域及びわずか５アミノ酸（ＣＲＧＫＡ）を含む短いサイトゾル側末端を含む保存されたカルボキシ末端領域とを有する。 Nash (1997)に記載されている通り、各寄生虫の表面上では常に１つのＶＳＰしか発現していない。 本発明の文脈において、用語「可変表面タンパク質」は、ジアルジア属のＶＳＰの完全なレパートリ、特にランブル鞭毛虫の任意の可変表面タンパク質を含むことを意図する。 実際、集合体Ａについては、Morrison et al. (2007)及びAdam et al. (2010)に記載の通り、ジアルジア属の寄生虫は、ＶＳＰをコードする約２００の遺伝子のレパートリをコードし、Svardのグループによる２つの報告は、集合体Ｂ及びＥに由来する分離菌のＶＳＰレパートリについて記載している（Jerlstrom-Hultqvist et al. (2010)及びFranzen et al. (2009)。ＶＳＰの細胞外ドメインは、上部小腸の苛酷な環境で寄生虫が生存することを可能にする。ＶＳＰは、可変ｐＨに対する耐性（特定のＶＳＰに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の立体構造エピトープに対する反応性は、ｐＨ２〜１２で不変である）、ならびにトリプシン及び他の幾つかのプロテアーゼによる消化に対する耐性が非常に高い。更に、栄養体がそれに付着した後、ＶＳＰは腸粘膜に付着したままである（Rivero et al., 2010）。

更に、ジアルジア属のＶＳＰ又は他の微生物のＶＳＰ様タンパク質等の少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフ（式中、Ｃはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）を含むポリペプチドは、遺伝子操作によりインビトロで作製されてもよく、異種系で産生されてもよいことに更に留意しなければならない。 したがって、野性型の寄生虫ではみられないアミノ酸変異を有するもの（例えば、ジアルジア属のＶＳＰの変異体）を含む、化学的に作製されるか又は細胞で産生されるポリペプチドも含まれる。 したがって、固相合成、液相合成又は遺伝子工学等の当技術分野において周知の任意の手順によってＶＳＰを調製することができる。

本発明のＶＳＰは、場合により化学的修飾を含んでもよい。 化学的修飾は、インビボにおいて酵素的分解に対するタンパク質の保護が増大し及び／又は膜障壁を通過する能力が上昇し、それによって、半減期が増加し且つ生物活性が維持されているか又は改善しているタンパク質を得ることを目的とする。 当技術分野において公知の任意の化学的修飾を、本発明に従って使用してよい。 このような化学的修飾は、以下を含むが、これらに限定されない：
− 例えば、Ｎ末端のアシル化（好ましくは、アセチル化）もしくは脱アミノ化、又はＣ末端カルボキシル基のアミド基もしくはアルコール基への修飾等、タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に対する修飾；
− ２つのアミノ酸間のアミド結合における修飾：２つのアミノ酸を結合させるアミド結合の窒素原子又はアルファ炭素におけるアシル化（好ましくはアセチル化）又はアルキル化（好ましくはメチル化）；
− 例えば、２つのアミノ酸を結合させるアミド結合のアルファ炭素におけるアシル化（好ましくはアセチル化）又はアルキル化（好ましくはメチル化）等、２つのアミノ酸を結合させるアミド結合のアルファ炭素における修飾；
− 例えば、１以上の天然に存在するアミノ酸（Ｌ鏡像異性体）を対応するＤ鏡像異性体に置換する等、キラリティの変更；
− （Ｃ末端からＮ末端に）アミノ酸鎖を反転させると共に、１以上の天然に存在するアミノ酸（Ｌ−鏡像異性体）を対応するＤ鏡像異性体に置換するレトロインバージョン；及び／又は − １以上のアルファ炭素を窒素原子に置換するアザペプチド。

用語「タンパク質」又はそれと互換的に用いられる用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用するとき、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直鎖状に結合されるモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。 ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等も含まれる。 また、用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、そのポリペプチドの配列と７０％を超える、好ましくは８０％を超える、更により好ましくは９０％を超える、更により好ましくは９５％を超える、そして、最も好ましくは９７％を超えるアミノ酸配列同一性を有する任意の天然の又は遺伝的に改変されているポリペプチドを含む、又は好ましくは前記ポリペプチドからなる任意のポリペプチドを含むはずである変異体も含む。 ポリペプチドの変異体を作製する好ましい方法は、遺伝子工学による方法、好ましくは挿入、置換、欠失又はこれらの組合せによる方法である。 用語「タンパク質の変異体」を本発明に従って抗原に適用する場合、このような変異体は、インビボにおいて抗体の産生又はＴ細胞の刺激を誘導することができなくてはならない。 用語「タンパク質の変異体」を本発明に従ってジアルジア属のＶＳＰ又は他の微生物のＶＳＰ様タンパク質に適用する場合、このような変異体は、細胞、具体的には粘膜細胞、より具体的には腸の上皮細胞に付着する能力を保持し、最終的にはそれ自体が免疫応答を誘導することができなくてはならない。

本明細書で使用するとき、用語「タンパク質の断片」又はそれと互換的に用いられる用語「ポリペプチドの断片」を本発明に従ってＶＳＰに適用する場合、このような断片は、本明細書に定義するとき、タンパク質、ポリペプチド、又は抗原のうちの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００の連続するアミノ酸もしくは不連続なアミノ酸を含むか、又は好ましくは前記アミノ酸からなる任意のポリペプチド、並びにそれに対して６５％を超える、好ましくは８０％を超える、より好ましくは９０％を超える、そして、更により好ましくは９５％を超えるアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを含むべきである。 用語「タンパク質の断片」を本発明に従って抗原に適用する場合、このような断片は、インビボにおいて抗体の産生又はＴ細胞の刺激を誘導することができなくてはならない。 したがって、タンパク質の断片は、少なくとも１つの免疫原性エピトープを含まなくてはならない。 用語「タンパク質の断片」を本発明に従ってジアルジア属のＶＳＰ又は他の微生物のＶＳＰ様タンパク質に適用する場合、このような断片は、細胞、具体的には粘膜細胞、より具体的には腸の上皮細胞に付着する能力を保持し、最終的にはそれ自体が免疫応答を誘導することができなくてはならない。

本明細書で使用するとき、用語は「結合」は、例えば、化学的カップリング等の共有結合であってもよく、又は例えばイオン相互作用、疎水的相互作用、水素結合等の非共有結合であってもよい結合を指す。 共有結合は、例えばエステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄結合、炭素−リン結合等であり得る。 また、この用語は、物質（例えば異種抗原）の封入、又は部分的封入も含む。 用語「結合」は、「カップリング」、「融合」、「封入」、「パッケージ化」、「偽型化」、「脂質二重膜における発現」、及び「付着」等の用語よりも広く、そして、これらを含む。

本明細書で使用するとき、用語「融合」は、様々な起源のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をインフレームで組合せることにより、１本のポリペプチド鎖中に様々な起源のアミノ酸配列を組合せることを指す。 遺伝子コードの縮重により、１を超えるヌクレオチド配列が１つの所与のアミノ酸配列をコードし得ることに留意しなければならない。 用語「融合」は、明示的に内部融合（すなわち、その末端のうちの１つに融合させることに加えて、ポリペプチド鎖内に異なる起源の配列を挿入すること）を含む。

本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲート」は、（ａ）ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片と（ｂ）有機分子（例えば、非タンパク質抗原からなる異種抗原）とのコンジュゲート産物であって、要素（ａ）及び（ｂ）が互いに結合しているコンジュゲート産物を指す。 このような要素（ａ）及び（ｂ）は、例えばリンカーにより結合する場合もある。

本明細書で使用するとき、用語「連結配列」又はそれと互換的に用いられる用語「リンカー」は、タンパク質又はニコチン分子等の非タンパク質抗原をポリペプチドに共有結合させることに加えて、ベクター粒子をポリペプチドに共有結合させる分子実体を指す。 例えば、リンカーは、チオール基、アルキル基、グリコール基又はペプチド基を含み得る。 リンカーは、架橋分子を含み、そして、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2004/009116号として公開されている国際特許出願に幾つかの例が記載されている。

本明細書で使用するとき、「ベクター粒子」は、その表面にジアルジア属のＶＳＰもしくはその断片及び／又は異種抗原を提示する傾向のある任意の粒子を意味する。 本発明の文脈においては、用語「ベクター粒子」は、ウイルスベクター粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びナノ粒子を含むことを意図する。

本明細書で使用するとき、用語「ウイルスベクター粒子」は、ウイルスの形態学的形態を指す。 一部のウイルス型では、ウイルスベクター粒子は、タンパク質カプシドに囲まれたゲノムを含み；他のウイルス型は、付加構造（例えばエンベロープ、尾部等）を有する。

本明細書で使用するとき、用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、ウイルス粒子に類似する構造を指す。 本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの全て又は一部が欠損しており、典型的にそして好ましくは、ウイルスゲノムの複製及び感染に関する成分の全て又は一部が欠損しているので、非複製的である。 本明細書で使用するとき、用語「非複製的」とは、ＶＬＰに含まれるか又は含まれないゲノムを複製することができないことを指す。

本発明の医薬組成物 第１の態様では、本発明は、少なくとも− 少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフ（式中、Ｃはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）を含むポリペプチドと− 異種抗原とを含む医薬組成物、好ましくは免疫原性医薬組成物に関する。

本発明の医薬組成物を個体に投与する場合、本発明の医薬組成物は、塩、バッファ、アジュバント、キャリア、又は組成物の有効性を改善するために望ましい他の物質を含有する形態であってよい。 医薬組成物の調製において使用するのに適した薬学的材料の例は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990)）を含む多数の情報源に提供されている。 「薬学的に」又は、「薬学的に許容しうる」は、適切な場合、哺乳類、特にヒトに投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の有害な反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。 薬学的に許容しうるキャリア又は賦形剤は、任意の種類の無毒な固体、半固形又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤助剤を指す。

更に、医薬組成物は、更なるアジュバント又は免疫原性剤もしくは生物学的活性剤を含み得る。 しかし、本発明の有利な特徴は、アジュバントが存在しない場合でさえも組成物の免疫原性が高いことであるので、１つの好ましい態様では、医薬組成物はアジュバントを含まない。 更に、アジュバントが存在しないことにより、ワクチン接種における安全性の問題を提示する望ましくない炎症性Ｔ細胞応答の発生が最小限に抑えられる。

本発明の医薬組成物は、好ましくは、経口投与又は粘膜投与用に製剤化される。 経口投与又は粘膜投与用に使用される用量は、様々なパラメータに応じて、特に、関連する病状又は望ましい治療期間に応じて適応させることができる。

任意の適切な粘膜に医薬組成物を投与してよく、投与は、（消化器系の粘膜を介する）経口投与、鼻内投与、膣内投与、舌下投与、眼球投与、直腸内投与、泌尿器（urinal）内投与、乳房内投与（intramammal）、肺内投与、経耳（すなわち、耳を介する）投与及び頬側投与、好ましくは頬側投与又は舌下投与（口腔粘膜投与）を含む。

製剤化する際、医薬組成物は、投薬製剤に適合する方法で、そして治療上有効な量で投与される。 製剤は、例えば、経口投与又は粘膜投与用の錠剤又は他の固体；徐放性カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態の種類等の様々な剤形で容易に投与される。 したがって、医薬組成物は、噴霧剤、煙霧剤、合剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、ゲル、ペースト剤、シロップ剤、クリーム、軟膏剤、インプラント（耳、目、皮膚、鼻、直腸、及び膣）、乳房内調製物、膣剤（vagitories）、坐剤、又は子宮剤（uteritories）の形態であってよい。 特定の実施形態では、リポソームの使用を意図する。 リポソームの形成及び使用は、当技術分野において公知である。

上述の通り、好ましい実施形態では、医薬組成物は経口投与に適している。

より具体的には、必要な場合、異種抗原及びポリペプチドが上部消化管の酵素的分解及び化学的分解に対して耐性であるように医薬組成物を製剤化する。 更に、ポリペプチドは、細胞、より具体的には腸の上皮の細胞に付着できなければならないことに留意すべきである。 したがって、１つの実施形態では、ポリペプチドは腸の上皮細胞に付着することができ、そして、必要な場合、異種抗原及びポリペプチドが上部消化管の酵素的分解及び化学的分解に対して耐性であるように組成物を製剤化する。

１つの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸によって分離された少なくとも２つのＣＸＸＣモチーフを含むポリペプチドからなる。

したがって、２つのＣＸＸＣモチーフは、３〜２０アミノ酸、好ましくは５〜８アミノ酸を含むアミノ配列によって分離される。

少なくとも２つのＣＸＸＣモチーフを分離するアミノ酸は、任意のアミノ酸残基であってよいことに留意すべきである。

別の１つの実施形態では、ポリペプチドは１〜１０のＣＸＸＣモチーフ、１〜２０のＣＸＸＣモチーフ、１〜３０のＣＸＸＣモチーフ、１〜４０のＣＸＸＣモチーフ、１〜５０のＣＸＸＣモチーフ、１〜６０のＣＸＸＣモチーフ、１〜７０のＣＸＸＣモチーフ、１〜８０のＣＸＸＣモチーフ、１〜９０のＣＸＸＣモチーフ又は１〜１００のＣＸＸＣモチーフを含む。

したがって、ポリペプチドは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０のＣＸＸＣモチーフを含み得る。

１つの特定の実施形態では、上に定義されるポリペプチドは、微生物の可変表面タンパク質（ＶＳＰ）、ＶＳＰ様タンパク質、又はこれらの断片である。

したがって、微生物は、好ましくはジアルジア属、テトラヒメナ属、ゾウリムシ属及びエントアメーバ属の種からなる群より選択される。

１つの好ましい態様では、ポリペプチドは、ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメイン又はその断片である（前記細胞外ドメインは、ジアルジア属のＶＳＰタンパク質の複数のＣＸＸＣモチーフを含むアミノ末端システインリッチ領域であるため）。

実際、ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメインは、ｐＨ、温度及びタンパク分解に対して耐性であるドメインである。

したがって、別の好ましい実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメイン又はその断片のみを含む。 したがって、ジアルジア属のＶＳＰの膜貫通領域及び細胞質側末端は除去されている。

また、ペプチドシグナルも除去できることに留意すべきである。

可変表面タンパク質（ＶＳＰ）
したがって、可変表面のタンパク質（ＶＳＰ）又はその断片は、寄生虫のゲノムにおいてＤＮＡレベルでコードされているＶＳＰの完全なレパートリの中から選択することができる。 このレパートリは、ジアルジア属の分離菌によって異なる約２００の同種のＶＳＰをコードする遺伝子（ｖｓｐ）で構成される。 本発明に係る組成物においてＶＳＰの変異体も使用できることに更に留意すべきである。

上述の通り、ジアルジア属のＶＳＰ、より具体的にはジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメインは、複数のＣＸＸＣモチーフ、好ましくは、（複数の配列のアラインメントによって観察されるように）３〜２０アミノ酸、より具体的には５〜８アミノ酸等の幾つかのアミノ酸により分離される複数のＣＸＸＣモチーフを含む。

特定の実施形態では、ジアルジア属の寄生虫はランブル鞭毛虫である。

好ましい実施形態では、ジアルジア属のＶＳＰは、ランブル鞭毛虫のＶＳＰ９Ｂ１０、ＶＳＰ１２６７、ＶＳＰＡ６、ＶＳＰＳ１、ＶＳＰＳ２、ＶＳＰＳ３、ＶＳＰＳ４、ＶＳＰＳ５、ＶＳＰＳ６、ＶＳＰＳ７、ＶＳＰＳ８、ＶＳＰＡＳ１、ＶＳＰＡＳ２、ＶＳＰＡＳ３、ＶＳＰＡＳ４、ＶＳＰＡＳ５、ＶＳＰＡＳ６、ＶＳＰＡＳ７、ＶＳＰＡＳ８、ＶＳＰＡＳ９、ＶＳＰＡＳ１０、ＶＳＰＡＳ１１、ＶＳＰＡＳ１２及びＶＳＰＨ７からなる群より選択される。

ＶＳＰ様ドメイン したがって、ジアルジア属と配列相同性及び生化学的特性を共有するジアルジア属以外の微生物に由来するポリペプチド、特に、複数のＣＸＸＣモチーフ、好ましくは５〜８アミノ酸により分離される複数のＣＸＸＣモチーフを含有するポリペプチドの中から、ＶＳＰ様タンパク質又はその断片を選択することができる。 実際、ＶＳＰ１２６７配列の細胞外ドメイン（クエリー）と他のＶＳＰ様分子の配列（分析からジアルジア属を除いてＢＬＡＳＴＰを行った後のドメイン構造から得られた）とのアライメントから、ゾウリムシ属、テトラヒメナ属及びエントアメーバ属の種に属するタンパク質に複数のＣＸＸＣモチーフ、特に５〜８アミノ酸により分離される複数のＣＸＸＣモチーフが存在することが観察された。 したがって、ゾウリムシ属の表面キナーゼ、ならびにエントアメーバ属の種及びテトラヒメナ属の種の表面タンパク質の一次配列の代表的な断片は、ｐＨ、温度及びタンパク分解に対する耐性に関与する（ＶＳＰ１２６７、９Ｂ１０、及びＨ７と比較した）、ＶＳＰ様構造におけるＣＸＸＣモチーフを含有する保存ドメインと予測される。

１つの実施形態では、テトラヒメナ属の微生物はテトラヒメナ・サーモフィラ（Tetrahymena thermophila）である。

別の実施形態では、エントアメーバ属の微生物は赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）である。

別の実施形態では、ゾウリムシ属の微生物はヨツヒメゾウリムシ（Paramecium tetraurelia）である。

異種抗原 異種抗原は、１つの天然に存在する抗原又はその一部からなり得、前記天然に存在する抗原の一部は、少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むか、又は少なくとも１つの免疫原性エピトープからなる。 天然に存在する抗原とは、自然界に存在する抗原、好ましくは植物、動物、寄生虫、細菌又はウイルス等の生物中に存在する抗原を指す。

したがって、好ましい実施形態では、異種抗原は、植物、動物、寄生虫、細菌、ウイルス、自己、腫瘍抗原、又は化学分子からなる群より選択される。

したがって、本発明の１つの好ましい実施形態では、異種抗原は、非自己（又は外来）タンパク質抗原、その断片又は変異体である。

意図される例示的な非自己タンパク抗原は、細菌タンパク質抗原、ウイルスタンパク質抗原、寄生虫タンパク質抗原、腫瘍タンパク質抗原、マイコプラズマタンパク質抗原及びアレルゲンタンパク質抗原を含む。

前記粒子（例えば、下記のウイルス様粒子（ＶＬＰ））がウイルスに由来するか、又はそれに対する免疫が求められるウイルスの一部を含む場合、異種抗原がベクター粒子自体で構成される場合もあることに更に留意しなければならない。 例えば、粒子がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する場合、前記粒子は異種抗原を構成し得る。

本発明の別の好ましい実施形態では、異種抗原は、自己タンパク質抗原、その断片又は変異体である。

実際、疾患、特に自己免疫疾患及び慢性炎症性疾患は、自己タンパク質抗原の過剰産生又は機能不全により引き起こされ得る。

意図される例示的な自己タンパク質抗原は、サイトカイン、インターロイキン、ホルモン、成長因子及び受容体を含む。

更に別の好ましい実施形態では、異種抗原は非タンパク質抗原である。

意図される例示的な非タンパク質抗原は、多糖抗原、脂質抗原、核酸抗原、リポ多糖抗原、及び薬物等の化学分子を含む。

依存性薬物及び治療薬の両方を含む典型的な薬物は、ニコチン等のアルカロイド類、ステロイド類、毒素炭水化物、多くの汚染物質を含む芳香族化合物、及びそれに対する免疫応答が高まり得る他の化合物である。

例示的な異種抗原（タンパク質抗原又は非タンパク質抗原）は、国際公開第2006/02674号に記載されているものを含むが、これらに限定されない。

１つの実施形態では、ポリペプチドは、異種抗原に結合する。

別の実施形態では、ポリペプチドは、異種抗原に融合する。

更に別の実施形態では、ポリペプチドは、異種抗原を含有するベクター粒子に結合する。 したがって、ベクター粒子は、ウィルス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）又はナノ粒子であり得る。

１つの特定の実施形態では、ベクター粒子は、その表面に本発明のポリペプチドを提示するＶＬＰである。

別の特定の実施形態では、異種抗原は、ＶＬＰの内部に含有されるか又はその表面上に存在する。

異種抗原に結合する本発明に係るポリペプチド 本発明の別の態様は、異種抗原に結合するジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係る少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフを含むポリペプチドに関する。

本発明に係るポリペプチド−異種抗原融合タンパク質 異種抗原が自己又は非自己のタンパク質抗原である場合、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の上に定義される本発明に係るポリペプチドは、異種抗原と融合し得る。

したがって、本発明の１つの態様は、少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフ（式中、Ｃはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）を含み、そして、腸の上皮細胞に付着する能力を保持しているポリペプチドと、異種抗原とを含む融合タンパク質に関する。

１つの実施形態では、ポリペプチドは、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片である。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメイン又はその断片である。

本発明の融合タンパク質は、（例えば、組換え型核酸技術の使用等）当技術分野において公知の技術に従って調製することができる。

また、本発明は、上に定義される異種タンパク質抗原に融合しているジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメイン又はその断片等の本発明に係るポリペプチドに加えて、前記ポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関することに留意しなければならない。

本発明に係るポリペプチド−異種抗原コンジュゲート 異種抗原が非タンパク質抗原である場合、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の上に定義される本発明に係るポリペプチドは、連結配列により非タンパク質抗原に共有結合し得る。

したがって、本発明の別の態様は、少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフ（式中、Ｃはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）を含有し、そして、腸の上皮細胞に付着する能力を保持しているポリペプチドと、異種抗原とを含むコンジュゲートに関する。

１つの実施形態では、ポリペプチドは、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片である。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメイン又はその断片である。

本発明のコンジュゲートは、当技術分野において公知の技術に従って（例えば、有機分子をアミノ酸にカップリングさせるための技術により）、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2004/009116号として公開されている国際特許出願に記載の通り調製することができる。

また、本発明は、上に定義される異種非タンパク質抗原にコンジュゲートする、ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメイン又はその断片等の本発明に係るポリペプチドに関することに留意しなければならない。

ベクター粒子に結合する本発明に係るポリペプチド 更に別の態様では、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の上に定義される本発明に係るポリペプチドは、ベクター粒子に結合する。

１つの実施形態では、ポリペプチドは、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片である。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメイン又はその断片である。

別の実施形態では、異種抗原はベクター粒子に結合する。

更に別の実施形態では、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の上に定義される本発明に係るポリペプチドと異種抗原とは、両方ともベクター粒子に結合する。

したがって、上記融合タンパク質又はコンジュゲートは、ベクター粒子に結合し得る。

本発明の文脈において、ベクター粒子は、ウィルスベクター粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）又はナノ粒子であり得る。

特定の実施形態では、ベクター粒子はウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。

ウイルス様粒子が使用される場合、それらは、当技術分野において公知の技術、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第02/34893号として公開されている国際特許出願に記載の通り調製することができる。

好ましい実施形態では、ＶＬＰは、ジアルジア属の寄生虫のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドをその表面に提示する。

したがって、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドは、ＶＬＰの表面に露出し得る。 この点に関して、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドは、エンベロープタンパク質又はその断片、合成リンカー等の様々な構造に対する結合を通して、あるいは抗体を含む化学反応又は酵素反応を通して露出し得る。

１つの特定の実施形態では、ＶＬＰは、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドに融合しているレトロウイルスのエンベロープの膜貫通ドメインの少なくとも一部を含む合成（キメラ）エンベロープであり得る改変エンベロープを含む。

したがって、好ましい実施形態では、例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープタンパク質又はその断片との遺伝的又は化学的融合によりＶＬＰの表面に露出しているジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドと融合しているＶＳＶに由来するエンベロープタンパク質又はその断片（例えば、ＶＳＶ Ｇ糖タンパク質の膜貫通（ＴＭ）領域）等のウイルスのエンベロープタンパク質をＶＬＰは提示する。

別の好ましい実施形態では、（ｉ）ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドと融合している水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来するエンベロープタンパク質又はその断片（例えば、ＶＳＶ Ｇ糖タンパク質の膜貫通（ＴＭ）領域）等のウイルスのエンベロープタンパク質と、（ｉｉ）異種抗原とをＶＬＰは提示する。

別の特定の実施形態では、合成エンベロープを官能化することにより、共有相互作用又は非共有相互作用を通して、対象となる任意の選択された分子に前記合成エンベロープが結合できるようにしてもよい。 官能化されたエンベロープは、対象となる任意の選択された分子の（特異的）結合を可能にするリンカーを含んでもよい。 一例として、エンベロープは、分子の特異的結合を可能にするためにアビジン部分又はビオチン部分を含んでもよい。 結合する分子は、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドに加えて、異種抗原（すなわち、非タンパク質抗原及びタンパク抗原）であってよい。

１つの特定の実施形態では、異種抗原はＶＬＰの内部に含有される。

好ましい実施形態では、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、レトロウイルス又はレンチウイルスのＧａｇタンパク質（マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）もしくはＨＩＶのＧａｇタンパク質、又はこれらの断片等）を含み、更により好ましくは、レトロウイルスの改変Ｇａｇタンパク質を含む。 具体例では、Ｇａｇタンパク質は、異種抗原を含む融合タンパク質（すなわち、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）又はその断片（例えば、ペプチドＨＡ １１１−１１９からなるＳＦＥペプチド）であり、このことから、異種抗原がＶＬＰの内部に含有されているという事実が導かれる。

したがって、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドは、消化管において分解を受けることなく粘膜（例えば、腸管粘膜）に異種抗原を正確に送達することを可能にする保護表面を形成することができ（寄生虫栄養体において自然に生じるので）、同時に、異種抗原は、適切な防御免疫応答を生じさせるために、ＶＳＰ自体により免疫賦活される場合もある。

また、本発明は、本発明に係る上記ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関することに留意しなければならない。

別の実施形態では、ベクター粒子はナノ粒子である。

本発明の文脈において、ナノ粒子は、細胞表面上に抗原を提示させるために細胞によって取り込まれるのに十分な程度小さなサイズである。 好ましい実施形態では、ナノ粒子は、０．５〜１０ｎｍ、より好ましくは１〜２．５ｎｍの平均直径を有するコアを有する。

ナノ粒子のコアは、金属コアであり得る。 好ましくは、金属コアは、Ａｕ、Ａｇ又はＣｕ、例えば、Ａｕ／Ａｇ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ａｇ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｐｔ、Ａｕ／Ｐｄ、Ａｕ／Ａｇ／Ｃｕ／Ｐｄ、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｇｄ又はＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄから選択される合金を含む。

好ましくは、本発明のナノ粒子は、ほとんどの有機溶媒、特に水に可溶性である。

ナノ粒子が使用される場合、それらは、当技術分野において公知の技術、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2007/122388号として公開されている国際特許出願に記載の通り調製することができる。

好ましい実施形態では、ナノ粒子は、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドをその表面上に提示する。

別の好ましい実施形態では、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドと異種抗原とは、両方ともナノ粒子の表面に結合する。

したがって、上記融合タンパク質又はコンジュゲートは、ナノ粒子に結合し得る。

本発明の医薬組成物の治療的及び予防的使用 別の態様では、本発明は、被験体における疾患、障害、又は生理学的状態の治療又は予防において使用するための本発明の医薬組成物に関する。

本明細書で使用するとき、用語「被験体」は、げっ歯類、ネコ科、イヌ科、及び霊長類等の哺乳類を意味する。 好ましくは、本発明に係る被験体はヒトである。

本発明の文脈において、用語「治療する」又は「治療」は、本明細書で使用するとき、このような用語が適用される障害又は状態、あるいはこのような障害又は状態の１以上の症状の進行を逆行、緩和、阻害するか、又は予防することを意味する。

本発明の意味において、ある事象に関する用語「予防する」又は「予防」は、前記事象の発生リスクを減少させることを意味することを意図する。

したがって、本発明において意図される疾患、障害、又は生理学的状態は、癌、免疫疾患、自己免疫疾患、同種異系移植片拒絶、インフルエンザ又はＡＩＤＳ等のウイルス疾患、マラリア又はトリパノソーマ等の寄生虫病、結核等の細菌感染、アレルギーからなる群より選択され得る。

また、本発明は、ワクチンとして使用するための本発明の医薬組成物に関する。

本発明は、更に、本発明の医薬組成物、本発明の異種抗原に結合するジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチド（融合タンパク質及びコンジュゲートを含む）、免疫応答を誘発する及び／又は免疫応答を強化するために本発明のベクター粒子に結合するジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドに関する。

また、本発明は、被験体における疾患、障害又は生理学的状態を治療又は予防する方法であって、治療上有効な量の本発明の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法に関する。

１つの好ましい実施形態では、医薬組成物は経口経路によって投与される。

別の好ましい態様では、医薬組成物は粘膜経路によって投与される。

「治療上有効な量」は、被験体に治療効果を付与するのに必要な活性剤の最小量を意図する。 例えば、哺乳類に対する「治療上有効な量」は、病理学的症状、疾患の進行、又は障害に関連する生理学的状態もしくは障害に屈することに対する抵抗における向上を誘導するか、改良するか、又はその他を引き起こす量である。

また、本発明は、被験体を免疫する方法であって、本発明の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法に関する。

本発明は、更に、異種抗原の提示及びワクチン接種、特に経口ワクチン接種又は粘膜ワクチン接種のためのキャリアとしての、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドの使用に関する。

上述の通り、ジアルジア属のＶＳＰ又はその断片等の本発明に係るポリペプチドは、消化管において広範囲にわたる分解を受けることなく、異種抗原を粘膜に正確に送達するのに役立つ。

１つの実施形態では、ポリペプチドは、腸の上皮細胞に付着することができる、ならびに／又は上部消化管の酵素的分解及び／もしくは化学的分解に対して耐性である。

１つの特定の実施形態では、ポリペプチドは、微生物の可変表面タンパク質（ＶＳＰ）、ＶＳＰ様タンパク質、又はこれらの断片である。

本発明は、以下の図面及び実施例により更に例証される。 しかし、これら実施例及び図面は、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

ＳＦＥ−ＴＣＲマウス（１０

^６ ／ウェル）に由来するＣＦＳＥ標識脾細胞を、培地のみ、指定の濃度のＶＬＰ−ＶＳＰ−ＨＡ、又は組換え型ＳＦＥペプチド（ポジティブコントロール）中で７２時間ＣＤ１１ｃで精製されたＤＣ（５Ｔ：１ＤＣ比）と共に培養した。 ヒストグラムは、ＳＦＥに特異的なＴ細胞のＣＦＳＥ希釈によるＴ細胞の増殖を示す（抗ＣＤ４＋抗体、及びトランスジェニックＴ細胞を特異的に認識する６．５抗クローン型抗体を使用してゲート制御した）。 数は、分裂した細胞の割合を示す。

ELISPOTアッセイ（ＨＡ−ＶＳＰ融合タンパク質による経口免疫）。 標準的なELISPOTアッセイ（Mabtech, Sophia Antipolis, France）により、ＨＡ特異的なＩＦＮ−γの産生を求めた。 脾細胞（５×１０

^５細胞／ウェル）を、５％ＣＯ２中で３７℃にて一晩、１μg/mLのＨＡタンパク質で刺激した。 ＰＢＳ又はコンカナバリンＡ（５μL/mL；ＣｏｎＡ；Sigma-Aldrich）をそれぞれネガティブ及びポジティブコントロールとして使用した。 顕色後、AID ELISPOTリーダー（ELR03、AID AutoimmunDiagnostika、Strassberg、Germany）を使用してスポットを計数し、ネガティブコントロールで検出された非特異的なスポットを減じた。 記号は個々のマウスを表し、横線は、各群の幾何平均を表す。

^* p<0.05、

^** p<0.01。

ＶＳＰ−ＨＡ融合タンパク質を経口ワクチン接種したマウスにおける体液性免疫応答。 酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）。 ９６ウェルのマイクロタイタープレートを組換え型ＨＡ Ｈ５Ｎ１でコーティングした。 血清の段階希釈物を添加し、室温で２時間インキュベートし、ビオチンで標識したヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）（Biot. Human adsorbed. Southern Biotech カタログ番号1010-08）を用いて室温で１時間、そして、超感受性ストレプトアビジンペルオキシダーゼポリマー（Sigma-Aldrich）を用いて室温にて１時間顕色させた。 ＴＭＢ基質（Sigma-Aldrich）を使用してペルオキシダーゼ活性を測定し、ＨＣｌを添加することにより反応をブロックした後に４５０nmにおける光学密度（OD450）を読み取った。 標準モノクローナル抗体抗Ｈ５Ｎ１ ＨＡ（マウス抗インフルエンザＡ型及びトリＨ５Ｎ１ヘマグルチニン（ＨＡ）カタログ番号17649-55B。USBiological）に基いて、抗ＨＡの量を計算した。

ELISPOTアッセイ（ＨＡ及びＶＳＰで偽型化（pseudotyped）されたＶＬＰによる経口免疫）。 標準ELISPOTアッセイ（Mabtech、Sophia Antipolis, France）により、ＨＡ特異的なＩＦＮ−γ（Ａ）及びＩＬ−４−（Ｂ）の産生を求めた。 ＨＡ及びＮＡ†で偽型化されたＨＩＶ−Ｇａｇに基づく粒子２０ngを用いて、脾細胞（５×１０

^５細胞／ウェル）を５％ＣＯ２中で３７℃にて一晩刺激した。 培地のみ又はコンカナバリンＡ（２μL/mL；ＣｏｎＡ；Sigma-Aldrich）をそれぞれネガティブ及びポジティブコントロールとして使用した。 顕色後、AID ELISPOTリーダー（ELR03、AID AutoimmunDiagnostika、Strassberg、Germany）を使用してスポットを計数し、ネガティブコントロールで検出された非特異的スポットを減じた。 記号は個々のマウスを表し、横線は、各群の幾何平均を表す。

^* p<0.05、

^** p<0.01、

^*** p<0.001。 †：ウイルス成分（pCMV9(Gap)+HA(pXD14)+NA(pXD15)）をコードする発現ベクターで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることにより、ＨＩＶ−Ｇａｇに基づくレンチウイルス粒子を作製した。 ＨＩＶｐ２４特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（Kit RETRO-TEK# HIV-1 p24 Antigen ELISA;ZeptoMetrixCorp., New-York, USA）を使用して、製造業者の指示に従ってレンチウイルスのベクターサンプル中のｐ２４の濃度を求めた。

ＶＬＰ−ＶＳＰ−ＨＡ／ＮＡを経口ワクチン接種したマウスにおける体液性免疫反応。 赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体応答。 血清サンプルを段階希釈し、２５μＬのＰＢＳ中でＨ５Ｎ１−偽型化ＭＬＶ−Ｇａｇに基づく粒子４ＨＡユニットと共に３７℃で１時間インキュベートした。 次いで、各ウェルに０．５％のニワトリ赤血球懸濁液５０μＬを添加した。 凝集を阻害するサンプルの中で最も高い希釈度の逆数としてＨＩ抗体価を表す。 記号は個々のマウスを表し、横線は、各群の幾何平均を表す。

実施例 潜在的なワクチン候補の原理証明を得ると同時に開発するために、モデルワクチン抗原としてインフルエンザの赤血球凝集素（ＨＡ）を使用した。

したがって、ＶＳＰによって運ばれるＨＡ抗原の経口送達により防御及び完全（Ｔ及びＢ）免疫応答が誘発され得るかどうかを判定するために、ＶＳＰ及びＨＡ抗原を同時に発現させることができる幾つかのベクターを構築した。 Ｂ細胞特異的免疫応答及びＴ細胞特異的免疫応答を誘導するための抗原としてインフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１／香港ウイルスに由来するＨＡタンパク質を使用した。

実施例１
材料及び方法経口ワクチンとして使用するための３つの異なるＶＳＰ／ＨＡコンストラクトの作製：
ジアルジア属のＶＳＰによって運ばれるインフルエンザの赤血球凝集素（ＨＡ）抗原の経口送達により防御及び完全（Ｔ及びＢ）免疫応答が誘発され得るかどうかを判定するために、ＶＳＰ及びＨＡ抗原を同時に発現させることための幾つかのベクターを作製した。 それぞれＢ細胞特異的免疫応答及びＴ細胞特異的免疫応答を誘導するための異種抗原として、ＨＡタンパク質及びその免疫優勢のＳＦＥペプチドを使用する。

これらＶＳＰ／ＨＡコンストラクションは、融合タンパク質とＶＳＰ及びＨＡ抗原が結合しているウイルス様粒子（ＶＬＰ）とを含む。

より正確には、３つの異なるＶＳＰ／ＨＡコンストラクションを作製する、すなわち：
１−Ｔ細胞特異的免疫応答をモニタするための、ＳＦＥペプチドに融合しているＶＳＰ。
２−Ｂ細胞特異的免疫応答及びＴ細胞特異的免疫応答をモニタするための、ＨＡの細胞外部分（ΔＨＡ）に融合しているＶＳＰ。
３−その表面にＶＳＰ及びＨＡのタンパク質（完全長形態）を提示するウイルス様粒子（ＶＬＰ）及び／又はｇａｇ融合タンパク質としての前記粒子内部のＳＦＥペプチド。 ＶＬＰは、ＳＦＥペプチドと融合したＭＬＶ Ｇａｇタンパク質によって形成される。 ＶＬＰの表面でＶＳＰタンパク質を提示するために、ＶＳＰはＶＳＶ−Ｇ膜貫通（ＴＭ）領域に融合する。

ＶＳＰ融合タンパク質の作製及び生化学的特徴：
対照：ΔＨＡのみ及び本発明のポリペプチド：ＨＡの細胞外部分（ΔＨＡ）に融合しているＶＳＰ Ｅｘ。
より具体的には、ΔＨＡをコードするｃＤＮＡ配列は、インフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１（香港）に由来していた。 タンパク質の産生はGenscript Companyに依頼した。 組換え型タンパク質のＤＮＡ配列のコドンを最適化し、Genscript Companyの発現ベクターを使用して細菌を形質転換した。 大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用して、細菌発現系で組換え型ＨＡを得た。 ＨＡタンパク質の精製については、変性条件下でＱカラムを使用し、そして、５０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５％のグリセロール、ｐＨ８．０に対する透析により得られたタンパク質を再び折り畳んだ。

ＨＡタンパク質の細胞外部分に融合しているＶＳＰの作製については、ＴＭ領域が欠失している可溶性形態のＨＡ（ΔＨＡ）を用いた。 オンラインのトポロジー予測プラットフォームPhobius(http://phobius.sbc.su.se/)を使用して、タンパク質配列を解析した。

完全長ＶＳＰは、多数のＣＸＸＣモチーフを含有するシステインリッチ細胞外領域を含有する。 シグナルペプチド、膜貫通領域、及び細胞質側の５つの残基を除去した（ＶＳＰ Ｅｘ）。 これら実験においてはＶＳＰ １２６７を使用した。

バキュロウイルス系にクローニングするために、融合タンパク質の配列のコドンを最適化した。 タンパク質を発現させ、そして、タンパク質のカルボキシル末端部分に存在するＨｉｓタグを使用して１工程の親和性精製により精製した。

表面におけるＶＳＰ及びＨＡで偽型化されたレトロウイルス粒子（ＶＬＰ）の作製：
Ｇａｇから作製され、ＨＡ及びＮＡで偽型化されたＶＬＰ（ノイラミニダーゼ）：
ＨＡベクターについては、それ自身のＴＭドメインを含むＨＡ Ｈ５Ｎ１（香港）配列をクローニングした（ｐＸＤ１４ベクター）。 ウイルス又は偽ウイルス粒子上において野性型ＨＡを自然に且つ非常に効率的に偽型化する。 ＮＡ発現については、ｐＸＤ１５ベクターを使用した。

Ｇａｇから作製され、ＶＳＰ及びＨＡ及びＮＡで偽型化されたＶＬＰ：
ＶＬＰ上においてＶＳＰ配列を偽型化するために、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）の膜貫通領域（ＴＭ）に、ＶＳＰの細胞外ドメインを融合させた。 これは、哺乳類細胞において原形質膜で効率的にエクスポートされ、Ｇａｇタンパク質と共局在し、そして、新たに形成されるウイルス偽ウイルスの粒子上で偽型化されることが知られている（ｐＣＰ１２６７ベクター）。

注記：幾つかの実験については、ＣＤ８応答を測定するために、ＧＡＧの代りにＧａｇ−Ｇｐ３３−４１融合タンパク質を使用した。 粒子の内部でＧｐ３３−４１ペプチドを提示するために、ＭＬＶ Ｇａｇのカルボキシル末端にＧｐ３３−４１を融合させた（ｐＥＢ１ベクター）。

ＤＮＡ産生：全てのコンストラクトを検証したら、プラスミドを増幅し、そして、精製した。 内毒素を含まない調製キット（Nucleobond（登録商標）PC 2000 EF; Macherey-Nagel, Hoerd, France）を使用して、プラスミドの産生を行った。

ＶＬＰ産生：組み換え型レトロウイルス粒子を作製するために、作製した発現ベクター（ｐＥＢ１、ｐＣＰ１２６７、ｐＸＤ１５及びｐＸＤ１４）で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。 粒子を含有する上清を濃縮し、そして、超遠心分離により精製し、ＦＰＬＣによる更なる精製を行った又は行わなかった。
− 様々な技術によりＭＬＶ−Ｇａｇ、ＨＡ又はＶＳＰの存在を検証するために、ＶＬＰの各バッチを品質管理分析に供した：
− ｐＣＰ１２６７ベクターによってトランスフェクトされた細胞の表面における適切な発現により、ＶＳＰ−ＴＭコンストラクトの機能性を実証する。

超遠心分離した上清に対してウェスタンブロットを行うことにより、ＶＬＰ産生及びＶＬＰ中又はＶＬＰ上へのＶＳＰの取込みの効率を評価した。

結果：
赤血球凝集素アッセイにより、ＶＬＰ上におけるＨＡの正確な偽型化を評価した。 優れた立体構造のＨＡタンパク質の存在下における凝集を評価するために、様々なＶＬＰの段階希釈物の存在下でニワトリ赤血球（ＲＢＣ）をインキュベートした。 ポジティブコントロールとしてＶＬＰ−ＨＡＨ５Ｎ１／ＮＡを使用し、ネガティブコントロールとしてＶＬＰ−Ｇａｇ−ＧＦＰを使用した。 ＲＢＣをＰＢＳと共にインキュベートすることは、沈降時間を評価する機能を有する。 この試験によって、この研究中に開発されたＶＬＰ−ＶＳＰ−ＨＡ／ＮＡは、ニワトリＲＢＣの凝集を促進できることが示された。

実施例２
材料及び方法：
３つのコンストラクトのインビトロにおける検証：
２．１−生化学的レベル：
ＶＳＰ−ΔＨＡ及びＶＬＰコンストラクトを検証するために、ＶＳＰ特異的な免疫沈降を行った。 ウェスタンブロットにより免疫沈殿を分析する。 それぞれコンストラクトを検証するためにＨＡの検出及びＨＡ／Ｇａｇタンパク質の検出を行う。

２．２−免疫学的レベル：
ＨＡ特異的Ｔ細胞によりＨＡ抗原が認識され得るかどうかを判定するために、３つのコントラクトのそれぞれで感作されるか、又は精製組換え型タンパク質でロードされたＤＣの存在下で、ＳＦＥ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（Kirberg et al. 1994に記載のＳＦＥトランスジェニックマウスから得られた）を用いてインビトロ増殖試験を行った。

結果：
（ＳＦＥトランスジェニックマウスから得られた（Kirberg J.,1994））ＳＦＥ１１０−１１９ペプチド型ＨＡを特異的に認識するＴＣＲについてトランジェニックのＣＦＳＥ標識ＳＦＥ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いるインビトロ増殖試験を用いて、ＶＬＰ中に存在するＨＡ抗原が正確にプロセシングされ、ＨＡ特異的Ｔ細胞を活性化したことが確認された。 図１から分かる通り、トランスジェニック細胞は、ＶＬＰ−ＶＳＰ−ＨＡでパルス処理された樹状細胞（ＤＣ）の存在下で活発に分裂しており、これは、ＶＬＰ中に存在するＨＡタンパク質が正確にプロセシングされ、ＭＨＣｃＩＩ制限様式において提示されることを示す。

実施例３
ＶＳＰ／ＨＡコンストラクトで経口免疫されたマウスにおける免疫応答抗ＨＡ及び抗ＶＳＰの特性評価：
マウスにおける局所免疫応答及び全身免疫応答を、経口ワクチン接種後の様々な時点で分析する。

モデル：
マウス（Ｈ−２ ^ｄ ）をＶＳＰ−ΔＨＡ又はＨＡ−ＶＬＰ（ＶＳＰ−）で経口免疫する。 対照として、ΔＨＡ又はＨＡ−ＶＬＰ（ＶＳＰ−）でマウスを経口免疫し、Ａｌ（ＯＨ） _３中のＨＡ−ＶＬＰで皮下免疫する［ポジティブコントロール］。

分析：
−全身性Ｔ細胞応答：脾臓細胞のＨＡ特異的再刺激後に、ＨＡ特異的Ｔ細胞の頻度をＩＦＮ−γELISPOTによって分析する。
−全身性Ｂ細胞応答：ＥＬＩＳＡ又は阻害赤血球凝集アッセイによって、血清におけるＨＡ特異抗体応答を研究する。

ＶＳＰ−ＨＡ融合タンパク質による経口免疫：
免疫プロトコール：
雌のBalb/c（Ｈ−２ｄ）マウス（７週齢）に、滅菌ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％に懸濁させた組換えΔＨＡタンパク質又は組換えΔＨＡ−ＶＳＰタンパク質３５μgを３日間おきに３回連続して経口投与した。 対照として、マウスにビヒクルのみを投与した（ネガティブコントロール）、又はアルム中３５μgのΔＨＡを一度皮下免疫した（ポジティブコントロール）。

１７日目（最後の経口投与の１０日後）に屠殺したマウスの群において抗ＨＡ Ｔ細胞応答を分析した。 ２１日目（最後の免疫の１４日後）に屠殺したマウスの別の群において抗ＨＡ Ｂ細胞応答を調べた。

結果：
Ｔ細胞応答の分析：
図２から分かる通り、３匹のワクチン接種されたマウスの内３匹で著しい応答が誘導されなかったＨＡタンパク質のみの経口免疫とは対照的に、ＶＳＰ−ＨＡ融合タンパク質で免疫することにより、２匹の免疫されたマウスのうちの２匹でＨＡ特異的ＩＦＮ−γＴ細胞応答が成功裏に誘導された。

これら結果は、ＶＳＰタンパク質にＨＡ抗原を融合させることにより、前記融合タンパク質に、経口経路により投与されたときにＨＡ抗原特異的全身Ｔ細胞応答を生じさせる独自の能力が付与されることを確認する。

Ｂ細胞応答の分析：
ＥＬＩＳＡにより抗ＨＡ特異的Ａｂの生成を分析した。 ＨＡタンパク質の経口投与は、抗ＨＡ Ａｂを誘導することができなかったが、ＶＳＰ−ＨＡ融合タンパク質は、経口免疫されたマウスのうちの１匹において高力価の抗ＨＡ Ａｂを誘導した。 これは、ＶＳＰの存在下において、ＨＡに対して全身性Ｂ細胞応答が生じ得ることを示す（図３）。

表面においてＶＳＰ及びＨＡで偽型化されたＶＬＰによる経口免疫：
免疫プロトコール：
雌のBalb/c（Ｈ−２ｄ）マウス（７週齢）に、滅菌ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％に懸濁させたＶＬＰ−ＨＡ／ＮＡ、ＶＬＰ−ＶＳＰ−ＨＡ／ＮＡ３５μgを３日間おきに３回連続して経口投与した。 対照として、マウスにビヒクルのみを投与した（ネガティブコントロール）、又はアルム中３５μgのＶＬＰ−ＶＳＰ−ＨＡ／ＮＡを一度皮下免疫した（ポジティブコントロール）。
１７日目（最後の経口投与の１０日後）にマウスを屠殺し、ＨＡに対するＴ細胞応答及びＢ細胞応答を分析した。

結果：
Ｔ細胞応答の分析：
図４から分かる通り、３匹のワクチン接種されたマウスの内３匹で著しい応答が誘導されなかったＶＬＰ−ＨＡ／ＮＡの経口免疫とは対照的に、ＶＬＰ−ＶＳＰ−ＨＡ／ＮＡ融合タンパク質で免疫することにより、３匹の免疫されたマウスのうちの３匹でＨＡ特異的ＩＦＮ−γＴ細胞応答が成功裏に誘導された。 著しいＨＡ特異的ＩＬ−４産生は検出されなかった。 これは、融合タンパク質によって生じた免疫応答がＴｈ１型であることを示唆する。 これら結果は、ＶＳＰタンパク質でＶＳＰ−ＨＡを遮蔽することにより、粒子に、経口経路により投与されたときにＨＡ抗原特異的全身Ｔ細胞応答を生じさせる独自の能力が付与されることを確認する。

Ｂ細胞応答の分析：
全身性Ｂ細胞応答の分析については、図５に示す通り、阻害赤血球凝集反応アッセイを使用して、血清におけるＨＡ特異抗体応答を定量した。 ＨＡ及びＶＳＰで偽型化されたＶＬＰのみが、特異的抗ＨＡ抗体を生じさせ得ることが分かる。 これは、ＶＬＰ上におけるＶＳＰの存在が、全身性の抗ＨＡ Ｂ細胞応答を生じさせるのに必須であったことを示す。

結論：
ＶＳＰ−ＨＡキメラタンパク質又はＶＳＰで被覆されているＨＡ発現ＶＬＰで構成される経口ワクチン、及び対応する対照を作製した。 ＶＳＰ及びＨＡタンパク質が対応するコントラクトにおいて正確な立体構造を維持することを生化学的に検証した。 動物を経口免疫するために、作製をスケールアップした。 これら実験において、特異的Ｔ又はＢ細胞応答を誘導しないＨＡタンパク質のみの経口投与とは対照的に、融合タンパク質としてＶＳＰにより又はＶＬＰ製剤において運ばれるＨＡの経口投与は、ＨＡ特異的な体液性及び細胞性応答を生じさせることが分かった。

この研究により、本発明者らのストラテジの妥当性が証明される。

ワクチンの経口送達の普遍的なプラットフォームの開発は、様々な感染性疾患に対して広く利用されるはずである。 特に、集団予防接種用の予防的ワクチンのために、経口投与経路が大きな注目を集めている。

ジアルジア属のＶＳＰ、より一般的には本発明に係る少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフを含むポリペプチドは、消化管を通って腸まで候補抗原を運び、免疫応答を生じさせる時間腸で留まらせることができる優れたキャリアを表すと考えられることがこの実験の結果である。 そして、特に、単独で免疫応答（抗体応答）を誘導する能力により示唆される通り、ＶＳＰは粘膜アジュバントとしても作用し得る。

実際は、原理証明として、経口ワクチン用の候補抗原を運ぶキャリアとしての腸内寄生虫ジアルジア属のＶＳＰの細胞外ドメインは、経口ワクチン接種によってインフルエンザＨＡに対する有効な免疫応答を誘導する能力を有することが示された。

本出願を通じて、様々な参照は本発明が関係する技術状況を記載する。 これによって、これらの参照の開示は、参照によって本発明に組み込まれる。