一株同时具有硝化和反硝化功能的卓贝尔氏菌及其应用
阅读：1发布：2020-07-08
专利汇可以提供一株同时具有硝化和反硝化功能的卓贝尔氏菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株同时具有硝化和反硝化功能的卓贝尔氏菌及其应用。卓贝尔氏菌(Zobellella sp.)2G-5，保藏于广东省 微 生物 菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏日期为2019年03月06日，保藏号GDMCCNo.60606。本发明的卓贝尔氏菌2G-5均能快速高效地脱除 水 体 中的 氨 氮、亚硝态氮和硝态氮及其总氮，对上述三种无机氮源及总氮的脱除效果均在98％以上，且过程中无其他无机氮源的明显积累，无二次污染，该菌在养殖水质改良中具有很大的应用价值，如降低在 水产养殖 过程中氨氮、亚硝态氮及硝态氮等对养殖对象的危害。，下面是一株同时具有硝化和反硝化功能的卓贝尔氏菌及其应用专利的具体信息内容。
1.卓贝尔氏菌(Zobellella sp.)2G-5，其保藏号GDMCC No.60606。
2.权利要求1所述的卓贝尔氏菌2G-5在脱除氨氮、亚硝态氮和/或硝态氮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，卓贝尔氏菌2G-5在制备脱除氨氮、亚硝态氮和/或硝态氮的制剂中应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，卓贝尔氏菌2G-5对含氨氮、亚硝态氮和/或硝态氮的水体进行脱氮，改良水质中的应用。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是将卓贝尔氏菌2G-5接种至以亚硝态氮、硝态氮或氨氮为唯一氮源的培养基中生长进而脱氮的应用。
6.一种具有硝化和反硝化功能的脱氮活菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的卓贝尔氏菌2G-5作为活性成分。
7.根据权利要求6所述的脱氮活菌剂，其特征在于，所述的脱氮活菌剂为水质改良剂。
一株同时具有硝化和反硝化功能的卓贝尔氏菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 随着水产集约化养殖方式的普遍应用，养殖过程中部分饲料在养殖动物消化、吸收等代谢过程中转化为氨氮排泄到养殖环境中，亦进一步转化成亚硝酸盐和硝酸盐，从而造成养殖水中氮素含量过高。水体中氮素过高能导致水体富营养化，藻类大量繁殖，消耗水体中的溶氧，使得水变腥臭，致使鱼类等各种水生动物大量死亡。如过量的氨氨和亚硝酸盐是造成鱼虾等水产养殖动物致病的主要根源。研究表明，养殖水体中过量的亚硝酸盐对鱼虾主要通过影响其呼吸作用，降低鱼类血液中的血红蛋白和虾类血液中的血蓝蛋白对氧的亲和力，从而对水产养殖动物产生毒害。养殖水体过量的氨氮(主要有NH4+和非离子化NH3两种形式)会使鱼虾的免疫活性受迫，亦能破坏养殖动物的皮、胃及肠道面膜，造成体表和内部器官出血，从而导致急性中毒死亡。因此，如何经济有效地去除养殖水体中过量的氮素污染物，寻找一种高效的养殖水质改良剂越来越受到人们的关注。
[0003] 目前，对水体中过量氮素的处理技术主要有化学、物理和生物方法，其中生物脱氮处理技术克服了物理化学脱氮法的一些缺陷，具有操作简单、适应范围广、处理效果好、基本上无二次污染等优点，近年来该技术已被广泛应用。微生物脱氮是生物脱氮中研究较多的方法，传统上认为，反硝化过程是在厌氧条件下实现的，而近年来，随着对脱氮菌的深入研究，发现有些菌能在好氧条件下同时具有异养硝化和反硝化的功能，此类菌在去除水体中氨氮、亚硝态氮和硝态氮方面具有独特的优势，能将氨氮或硝态氮最终还原为气体或者自身同化而脱离养殖水体，无残留，不造成二次污染，改善和维持养殖生态平衡，减少疾病发生，在养殖水质改良中具有重要作用。
[0004] 好氧反硝化菌在生理生化和系统发育上存在多样性。已有研究表明，好氧反硝化细菌主要分布于假单胞菌(Pseudomonas)、产碱杆菌(Alcaligenes)、副球菌(Paracoccus)及芽胞杆菌(Bacillus)等属中，且相关文献及专利也较多。有关卓贝尔氏菌属(Zobellella)中具有脱氮作用的菌株，目前授权的国家发明仅有2件，专利201510316321.7(申请日2015.06.10)公布了一株海洋卓贝尔氏菌(Zobellella sp.)CYT1-8，其与模式菌Zobellella denitrificansZD1的相似最高，16S rRNA相似性为99.04％，该专利所涉及菌株在好氧条件下能快速去除水体中硝酸盐和亚硝酸盐，但其在去除硝酸盐过程中会有大量亚硝酸盐积累。专利201310100699.4(申请日2013.08.07)公布了一株好氧反硝化细菌卓贝尔氏菌(Zobellella sp.)NKDN-01，其与模式菌Zobellella taiwanensisZT1相似性最高，该菌对高氨氮废水有很高的去除率，也具有一定的硝态氮去除效果，但其对亚硝态氮的去除效果未提及，且该专利中，在对该菌处理人工高氨氮废水时，最后有微量亚硝态氮的增加。
发明内容
[0005] 本发明的第一个目的是提供一株同时具有异养硝化和好氧反硝化功能的卓贝尔氏菌(Zobellella sp.)2G-5，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏日期为2019年03月06日，保藏号GDMCCNo.60606。
[0006] 本发明分离获得一株具有异养硝化和好氧反硝化功能的卓贝尔氏菌2G-5，将菌株分别接种至以NH4+-N，NO2--N和NO3--N为唯一氮源的培养基中，28℃，180rpm振荡培养，分别在培养0、12、18、24、36、48h时，取出培养液测定培养液OD 600，同时取2.0mL培养液，离心，测定上清液中氨氮、亚硝态氮和硝态氮，并测定上清和与菌体中总氮，结果显示卓贝尔氏菌2G-5分别对水体中的(NH4)2SO4、NaNO2和KNO3均具有快速高效的去除效果。在以亚硝态氮为唯一氮源培养基中，该菌株培养48h后对NO2--N及总氮的脱除率为99.00％和99.60％，其中
27.08％的无机氮被同化为菌体有机氮；在硝态氮为唯一氮源培养基中，该菌株培养48h后对NO3--N及总氮的脱除率为99.58％和99.84％，其中29.72％的无机氮被同化为菌体有机氮；在氨氮为唯一氮源培养基中，该菌株培养48h后对NH4+-N及总氮的脱除率为98.72％和
99.80％，其中26.35％的无机氮被同化为菌体有机氮。在研究菌株2G-5脱除水体中氨氮、亚硝态氮和硝态氮时，过程中均未检测到明显的其他形式无机氮的积累。
27.08％的无机氮被同化为菌体有机氮；在硝态氮为唯一氮源培养基中，该菌株培养48h后对NO3--N及总氮的脱除率为99.58％和99.84％，其中29.72％的无机氮被同化为菌体有机氮；在氨氮为唯一氮源培养基中，该菌株培养48h后对NH4+-N及总氮的脱除率为98.72％和
99.80％，其中26.35％的无机氮被同化为菌体有机氮。在研究菌株2G-5脱除水体中氨氮、亚硝态氮和硝态氮时，过程中均未检测到明显的其他形式无机氮的积累。
[0007] 因此，本发明的第二个目的是提供卓贝尔氏菌2G-5在脱除氨氮、亚硝态氮和/或硝态氮中的应用。如在制备脱除氨氮、亚硝态氮和/或硝态氮的制剂中应用。
[0008] 优选，是对含氨氮、亚硝态氮和/或硝态氮的水体进行脱氮，改良水质中的应用。
[0010] 优选，所述的应用是将卓贝尔氏菌2G-5接种至以亚硝态氮、硝态氮或氨氮为唯一氮源的培养基中生长进而脱氮的应用。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种具有硝化和反硝化功能的脱氮活菌剂(如水质改良剂)，其含有卓贝尔氏菌2G-5作为活性成分。
[0012] 专利201510316321.7(申请日2015.06.10)公布了一株海洋卓贝尔氏菌(Zobellella sp.)CYT1-8，其与模式菌Zobellella denitrificansZD1的相似最高，16S rRNA相似性为99.04％，该专利所涉及菌株在好氧条件下能快速去除水体中硝酸盐和亚硝酸盐，但其在去除硝酸盐过程中会有大量亚硝酸盐积累，而本发明所涉及的菌株在对硝酸盐去除过程中，无明显亚硝酸盐的积累，由此推测本发明菌株在反硝化过程中，亚硝酸盐还原酶活性较高，能很快地将由硝酸盐还原成的亚硝酸盐进一步还原为含氮气体，其在实际养殖水体水质改良上具有较大的应用潜力。
[0013] 本发明的卓贝尔氏菌2G-5均能快速高效地脱除水体中的氨氮、亚硝态氮和硝态氮及其总氮，对上述三种无机氮源及总氮的脱除效果均在98％以上，且过程中无其他无机氮源的明显积累，无二次污染，该菌在养殖水质改良中具有很大的应用价值，如降低在水产养殖过程中氨氮、亚硝态氮及硝态氮等对养殖对象的危害。
[0014] Zobellella sp.2G-5于2019年03月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为GDMCCNo：60606。
附图说明
附图说明
[0015] 图1为卓贝尔氏菌2G-5在固体平板上的菌落形态；
[0016] 图2为卓贝尔氏菌2G-5在光学显微镜下(100×)的照片；
[0017] 图3为卓贝尔氏菌2G-5生长趋势与脱除NO2--N的能力示意图；
[0018] 图4为卓贝尔氏菌2G-5生长趋势与脱除NO3--N的能力示意图；
[0019] 图5为卓贝尔氏菌2G-5生长趋势与脱除NH4+-N的能力示意图。
具体实施方式
[0020] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0021] 实施例1：
[0022] 1、卓贝尔氏菌(Zobellella sp.)2G-5的富集、分离纯化与保藏
[0023] 富集培养：
[0024] 配制富集培养基，配方如下：丁二酸钠2.5g，二水合柠檬酸钠2.5g，(NH4)2SO40.66g,KNO31.01g,NaNO20.69g，K2HPO41g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.2g，pH 7.4，定容至
1000mL，分装至250mL三角瓶中，每瓶100mL。121℃，20min，高温高压灭菌。然后添加无菌过滤后的复合碳源1％(质量分数)，复合微量元素0.2％(质量分数)。复合碳源：D-葡萄糖
6.9g，D-果糖6.9g，D-乳糖6.9g，醋酸钠9.5g，质量分数90％乳酸6.4mL，甘露醇7g，无水乙醇
7mL，甘油6.3mL，苯甲酸钠4.8g，水杨酸4.6g，溶于500mL水中，pH 7.4，0.22μm滤膜过滤除菌。微量元素混合液：ZnSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.4g，H3BO3 1.24g，CoCl2·2H2O
0.5g，CuCl2·2H2O 0.5g，NiSO4·6H2O 0.02g，NaMoO4·2H2O 0.4g，KI 0.2g，CaCl25g，FeSO4·7H2O 1.1g，EDTA-Na 10g，溶于1000mLH2O，pH 7.4，0.22μm滤膜过滤。
1000mL，分装至250mL三角瓶中，每瓶100mL。121℃，20min，高温高压灭菌。然后添加无菌过滤后的复合碳源1％(质量分数)，复合微量元素0.2％(质量分数)。复合碳源：D-葡萄糖
6.9g，D-果糖6.9g，D-乳糖6.9g，醋酸钠9.5g，质量分数90％乳酸6.4mL，甘露醇7g，无水乙醇
7mL，甘油6.3mL，苯甲酸钠4.8g，水杨酸4.6g，溶于500mL水中，pH 7.4，0.22μm滤膜过滤除菌。微量元素混合液：ZnSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.4g，H3BO3 1.24g，CoCl2·2H2O
0.5g，CuCl2·2H2O 0.5g，NiSO4·6H2O 0.02g，NaMoO4·2H2O 0.4g，KI 0.2g，CaCl25g，FeSO4·7H2O 1.1g，EDTA-Na 10g，溶于1000mLH2O，pH 7.4，0.22μm滤膜过滤。
[0025] 取汕头南澳岛鱼虾混养池塘水样品10mL，接入装有上述富集培养基的锥形瓶中，28℃，180rpm，培养5d，进行脱氮细菌的富集。对以上孵育后的培养物，转接1mL至新的装有富集培养基的锥形瓶中，28℃，180rpm，培养5d，进行二次富集，同上再进行第三次富集培养。
[0026] 分离纯化与保藏
[0027] 对于上述三次富集培养物，采用稀释涂布法涂布固体平板(所用固体培养基是在富集培养基配方的基础上添加1.7％(质量分数)的琼脂)；肉眼观察菌落形态，并划线纯化，挑取已纯化的菌落至5mL含杜氏管的液体培养基(富集培养基，但将三种无机氮源分开)，28℃孵育观察产气情况，发现菌株2G-5能将亚硝酸盐转化为气体产物。对纯化后的菌株，扩大培养并保种甘油管和冻干管。
[0028] 形态特征
[0029] 所述的菌株2G-5的形态特征为：革兰氏阴性菌；菌落颜色为乳白色，半透明(见图1)；菌落为圆形，边缘规则，表面湿润光滑；细胞形状为短杆状(见图2)。所述菌株2G-5能分别在以(NH4)2SO4、NaNO2和KNO3为唯一氮源的培养基中生长。
[0030] 2卓贝尔氏菌(Zobellella sp.)2G-5的16S rDNA鉴定
[0031] 提取菌株2G-5的基因组DNA，用细菌16S rRNA基因扩增通用引物27F/1492R扩增得到PCR产物，并送至上海美吉生物医药科技有限公司(广州分公司)进行序列测序，测序结果(16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)与EzBioCloud网站数据库中的16S rDNA序列进行同源性比对分析，结果分析表明其与模式菌Zobellella denitrificansZD1的16S rRNA基因序列相似性最高，为98.43％，与两株模式菌Z.taiwanensisZT1和Z.aerophile JC2671的相似性均为97.36％，与模式菌Z.endophytica 59N8的相似性为97.21％。基于以上结果分析，初步鉴定本发明菌株为Zobellellasp.，命名为卓贝尔氏菌(Zobellellasp.)2G-5，于2019年03月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏号GDMCCNo.60606。
[0032] 3卓贝尔氏菌(Zobellellasp.)2G-5的脱氮性能
[0033] 接种卓贝尔氏菌2G-5至液体培养基中[富集培养基配方，但分别以NO2--N、NO3--N和NH4+-N为唯一氮源，具体为：
[0034] 以NO2--N为唯一氮源的液体培养基配方：丁二酸钠2.5g，二水合柠檬酸钠2.5g，NaNO20.69g，K2HPO41g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.2g，pH 7.4，定容至1000mL，121℃，20min，高温高压灭菌，然后添加无菌过滤后的复合碳源1％(质量分数，配方同上)，复合微量元素0.2％(质量分数，配方同上)。
[0035] 以NO3--N为唯一氮源的液体培养基配方：丁二酸钠2.5g，二水合柠檬酸钠2.5g，KNO3 1.01g，K2HPO41g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.2g，pH 7.4，定容至1000mL，121℃，20min，高温高压灭菌，然后添加无菌过滤后的复合碳源1％(质量分数，配方同上)，复合微量元素0.2％(质量分数，配方同上)。
[0036] 以NH4+-N为唯一氮源的液体培养基配方：丁二酸钠2.5g，二水合柠檬酸钠2.5g，(NH4)2SO40.66g，K2HPO41g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.2g，pH 7.4，定容至1000mL，121℃，20min，高温高压灭菌，然后添加无菌过滤后的复合碳源1％(质量分数，配方同上)，复合微量元素0.2％(质量分数，配方同上)]，
[0037] 28℃，180rpm摇床培养，分别在培养0、12、18、24、36、48h后，取样，一部分样品用于检测OD 600值，另一部分培养液离心取上清，定量检测NO2-、NO3-、NH4+和总氮浓度(TN-N)，此外还测定菌体中总氮浓度(CN-N)。结果如图3,4,5所示，卓贝尔氏菌2G-5对水体中NO2--N、NO3--N、NH4+-N及其中的总氮均有很好的脱除效果。该菌株在以亚硝态氮为唯一氮源的培养基中，培养48h后对NO2--N及总氮的脱除率为99.00％和99.60％，其中27.08％的无机氮被同化为菌体有机氮；在硝态氮为唯一氮源的培养基中，该菌株培养48h后对NO3--N及总氮的脱除率为99.58％和99.84％，其中29.72％的无机氮被同化为菌体有机氮；在氨氮为唯一氮源培养基中，该菌株培养48h后对NH4+-N及总氮的脱除率为98.72％和99.80％，其中26.35％的无机氮被同化为菌体有机氮。且该菌株在脱除水体中氨氮、亚硝态氮和硝态氮时，过程中均未检测到明显的其他形式无机氮的积累。卓贝尔氏菌2G-5是一株同时具有硝化和反硝化功能的菌，对水体中氨氮、亚硝态氮和硝态氮都有很高的脱除效果，且过程中均不积累其他的有害含氮产物。鉴于此，卓贝尔氏菌2G-5在养殖水质改良，去除养殖水体主要氮素污染物，保障水产动物的健康生长的实际应用中具有巨大的潜力。
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