制备用于生物燃料、生物柴油和其它有用的化学品的脂肪酸的方法
阅读：0发布：2022-11-30
专利汇可以提供制备用于生物燃料、生物柴油和其它有用的化学品的脂肪酸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种制备 脂肪酸 的方法，通过(i)在一定条件下将 纤维 素、半 纤维素 和木质素的至少一种的混合物用至少一种产生一种或多种纤维素酶、半纤维素酶和漆酶的 微 生物 菌株接种，以制备 葡萄糖 、纤维 二糖 、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维素糖的至少一种，所述纤维素酶、半纤维素酶和漆酶 水 解 至少纤维素、半纤维素和木质素的至少一种；(ii)抑制所述至少一种微生物菌株的生长；(iii)在一定条件下将步骤(ii)的混合物用至少一种代谢所述葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维素糖的至少一种的藻类株系接种，使得所述至少一种藻类株系产生一种或多种脂肪酸；和任选地(iv)从所述至少一种藻类株系回收所述一种或多种脂肪酸。，下面是制备用于生物燃料、生物柴油和其它有用的化学品的脂肪酸的方法专利的具体信息内容。
1.一种制备脂肪酸的方法，该方法包括：
(i)在一定条件下将纤维素、半纤维素和木质素的至少一种的混合物用至少一种产生一种或多种纤维素酶、半纤维素酶和漆酶的微生物菌株接种，以制备葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维素糖的至少一种，所述纤维素酶、半纤维素酶和漆酶水解纤维素、半纤维素和木质素的至少一种；
(ii)抑制所述至少一种微生物菌株的生长；和
(iii)在一定条件下将步骤(ii)的混合物用代谢所述葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维素糖的至少一种的藻类株系接种，使得所述至少一种藻类株系产生一种或多种脂肪酸。
2.权利要求1的方法，其中步骤(i)中的混合物还包含糠醛、酚类化合物和乙酸的至少一种。
3.权利要求1的方法，其中步骤(i)中的混合物得自生物质。
4.权利要求3的方法，其中所述生物质包括植物生物质。
5.权利要求4的方法，其中所述生物质得自植物废物或动物废物。
6.权利要求4的方法，其中所述植物生物质经过通过酸水解和热处理的预处理，以制备在步骤(i)中接种的所述混合物。
7.权利要求4的方法，其中所述植物生物质包含：
10-35％木质素；
15-35％半纤维素；和
30-60％纤维素。
8.权利要求4的方法，其中所述植物生物质得自选自柳枝稷、玉米秸秆和植物混合废物的至少一种。
9.权利要求1的方法，其中所述至少一种微生物菌株是细胞外和/或细胞内纤维素酶、半纤维素酶和漆酶生产者微生物。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞外和/或细胞内纤维素酶生产者微生物选自原核生物、细菌、古菌和真核生物和真菌。
11.权利要求10的方法，其中所述细胞外和/或细胞内纤维素酶生产者微生物是真菌或细菌，其选自腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、杆菌属(Bacillus)、噬纤维菌属(Cytophaga)和生孢噬纤维菌属(Sporocytophaga)、灰腐质霉(Humicola grisea)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、木素木霉(Trichoderma lignorum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、疣孢青霉(Penicillium verruculosum)、白色瘤胃球菌(ruminococcus albus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、热葡糖昔酶芽胞杆菌(Bacillus thermoglucosidasius)、噬纤维菌(Cytophaga spp.)和生孢噬纤维菌(Sporocytophaga spp.)。
12.权利要求11的方法，其中所述至少一种微生物菌种是真菌。
13.权利要求12的方法，其中所述至少一种微生物菌株是里氏木霉(红褐肉座菌Hypocrea jecorina)。
14.权利要求1的方法，其中所述至少一种微生物菌株耐受生物质预处理产生的一种或多种化合物，其中所述一种或多种化合物选自糠醛、乙酸和其它杂质。
15.权利要求1的方法，其中所述至少一种微生物菌株已进化改良，从而与未改良的微生物野生型形式相比，更有效地代谢作为目标的经预处理的生物质，并且更好地耐受糠醛、酚类化合物和乙酸。
16.权利要求15的方法，其中所述至少一种进化改良的微生物菌株产生一种或多种纤维素酶、半纤维素酶和/或漆酶，从而与未改良的微生物野生型形式相比，所述进化改良的微生物菌株具有更大的代谢具有木质素的纤维素和半纤维素的能力。
17.权利要求1的方法，其中所述至少一种微生物菌株已经通过选自连续移植、连续稀释、遗传工程、连续培养和恒化培养的至少一种方法进化改良。
18.权利要求17的方法，其中所述方法是连续培养。
19.权利要求18的方法，其中所述至少一种进化改良的微生物菌株是需氧真菌。
20.权利要求16的方法，其中所述至少一种微生物菌株是里氏木霉(红褐肉座菌)，并且已经通过连续培养进化改良。
21.权利要求1的方法，其中已经将所述至少一种微生物菌株对特定生物质植物进化改良。
22.权利要求1的方法，其中所述至少一种或多种纤维素酶是选自内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶、和半纤维素酶和任选的漆酶的至少一种。
23.权利要求1的方法，还包括测量步骤(i)中的纤维素酶和/或半纤维素酶的活性，并且根据酶的活性来进行至步骤(ii)。
24.权利要求1的方法，其中所述抑制步骤(ii)通过选自热激、UV照射、射线照射、气体注射、均质和步骤(i)之前的所述至少一种微生物的遗传改良的一种或多种方法实施，使得当温度升高到45℃时，所述至少一种遗传改良的微生物的生长受到抑制。
25.权利要求1的方法，其中步骤(iii)中的所述至少一种藻类株系选自绿藻、红藻、蓝绿藻、蓝细菌和硅藻。
26.权利要求25的方法，其中步骤(iii)中的所述至少一种藻类株系选自单肠
藻(Monalanthus Salina)；丛粒藻(Botryococcus Braunii)；原始小球藻(Chlorella prototecoides)；Outirococcus sp.；斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)；微绿球藻(Nannochloris sp.)；巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)(盐生杜氏藻D.Salina)；舟形藻(Navicula pelliculosa)；Radiosphaera negevensis；长耳盒形藻(Biddulphia aurita)；普通小球藻(Chlorella vulgaris)；谷皮菱形藻(Nitzschia palea)；丹麦棕鞭藻(Ochromonas dannica)；蛋白核小球藻(Chrorella pyrenoidosa)；腰带多甲藻(Peridinium cinctum)；Neochloris oleabundans；多形卵囊藻(Oocystis polymorpha)；
金色藻(Chrysochromulina spp.)；弯曲栅藻(Scenedesmus acutus)；栅藻(Scenedesmus spp.)；微小小球藻(Chlorella minutissima)；小定鞭金藻(Prymnesium parvum)；舟形藻(Navicula pelliculosa)；二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)；螺翼藻(Scotiella sp.)；小球藻(Chorella spp.)；纤细裸藻(Euglena gracilis)；和紫球藻(Porphyridium cruentum)。
27.权利要求1的方法，其中步骤(iii)中的至少一种藻类株系的生长不因为木质素、糠醛、酚类化合物、盐和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或漆酶的存在而被抑制。
28.权利要求1的方法，其中步骤(iii)中的所述至少一种藻类株系可以在选自需要、缺氧、光养和异养的一种或多种条件中生长。
29.权利要求1的方法，其中步骤(iii)中的所述至少一种或多种藻类株系通过选自连续移植、连续稀释、遗传工程、连续培养和恒化培养的至少一种方法进化改良。
30.权利要求29的方法，其中所述方法是连续培养。
31.权利要求29的方法，其中所述至少一种藻类株系是已通过连续培养方法进化改良的原始小球藻。
32.权利要求1的方法，其中步骤(iii)中的所述至少一种藻类株系代谢所述葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维素糖和废甘油的至少一种。
33.权利要求1的方法，其中步骤(iii)中的所述至少一种藻类株系使用乙酸作为碳源。
34.权利要求1的方法，其中当步骤(iii)处于乙酸和异养条件下时，所述至少一种藻类株系使用呼吸作用。
35.权利要求1的方法，其中在步骤(iii)中，当藻类与产生发酵副产物生产者的生物体使用相同量的碳源时，该方法产生至多10％的二氧化碳。
36.权利要求1的方法，其中步骤(iii)中的所述至少一种藻类株系不产生抑制所述藻类生长的抑制性副产物。
37.权利要求1的方法，还包括(iv)回收来自所述至少一种藻类株系的一种或多种脂肪酸。
38.权利要求37的方法，其中所述回收步骤(iv)包括选自所述至少一种含有脂肪酸的藻类菌株的过滤-离心分离、絮凝、溶剂萃取、酸提取、碱提取、均质、超声处理、微波、压榨、蒸馏、热蒸发、氢化裂解(流体催化裂化)和干燥的至少一种。
39.权利要求37的方法，其中步骤(iv)中回收的上清液可以再使用。
40.权利要求1的方法，其中步骤(iii)还包括为了选自脂肪酸、碳氢化合物、蛋白质、色素、例如多糖和单糖的糖、和甘油的至少一种化合物的细胞外和/或细胞内生产，在一定条件下培养所述至少一种藻类并使其生长。
41.权利要求40的方法，其中所述至少一种化合物可以用于柴油、化妆品、食品、机械润滑脂、着色和医药用途的制备。
42.权利要求1的方法，其中所述至少一种藻类株系产生烃链，其可以用作油精炼厂中氢化裂化的原料，以制备选自辛烷、汽油、石油溶剂油、柴油和其它作为溶剂、塑料、油、润滑脂和纤维的石油产品的一种或多种化合物。
43.权利要37的方法，还包括在步骤(iv)之后，所述至少一种藻类株系细胞的直接酯基转移作用，以制备用于生物柴油燃料的脂肪酸。
44.权利要求43的方法，其中所述直接酯基转移作用包括破裂藻类细胞、释放脂肪酸和通过使用甲醇或乙醇的碱法或酸法的酯基转移作用，以制备生物柴油燃料。
45.权利要求1的方法，其中所述至少一种藻类株系适用于使用废甘油作为碳源，以制备用于生物柴油燃料的脂肪酸，所述废甘油是通过未经预处理或精炼的酯基转移反应而产生的。
制备用于生物燃料、生物柴油和其它有用的化学品的脂肪
酸的方法
[0001] 发明背景
[0002] 石油是一种非再生资源。因此，许多人担心未来石油储备的枯竭。有些人已指出世界石油资源将在21世纪用尽(Kerr RA，Science 1998，281，1128)。
[0003] 这促进了可替代的碳氢化合物产品的发展，例如来自植物衍生原料和废物的乙醇和其它微生物发酵产品。事实上，当前研究估计，美国每年可以轻易生产十亿吨干生物质(生物质原料)材料(其中超过一半是废物)。其中主要是纤维素生物资源的形式。
[0004] 纤维素包含于全世界几乎每一种在草甸、森林和田地中天然、自由生长的植物、树木和灌木，这不需要农业作用或成本去促使其生长。
[0005] 据估计，在2030年，这些纤维素材料可以用来产生足够的乙醇，以代替30％或更多的美国能源需求。该策略的重大优点在于纤维是地球上最丰富的并且可再生的碳源，其向可用燃料的有效转化可以解决世界能源问题。
[0006] 纤维素乙醇已被广泛研究。纤维素乙醇与例如来自玉米淀粉或糖的其它来源的乙醇是在化学上相同的，但是其具有纤维素原料非常丰富且来源广泛的优点。然而，其不同之处在于其需要大量处理来使得糖单体被常规用于发酵制备乙醇的微生物使用。
[0007] 虽然纤维素是一种丰富的植物原料资源，但是它的刚性结构使得纤维素成了一种难以加工的起始原料。因此，需要一种有效的预处理将纤维素从木质素包封和它的晶体结构中释放出来，从而使其可以经受随后的水解步骤。到目前为止，大多数预处理通过物理或化学方法完成。为了实现更高的效率，一些研究人员开始寻求两种效果的结合。
[0008] 到目前为止，可用的预处理技术包括酸水解，蒸汽膨胀，氨纤维膨胀、碱湿氧化和臭氧预处理。除了有效的纤维素释放外，理想的预处理需要最小化降解产物的形成，因为他们对随后的水解和发酵处理有抑制作用。
[0009] 抑制物的存在使得很难制得乙醇。纵使通过酸水解的预处理可能是最古老并且研究最多的预处理技术，其还是产生了一些有效抑制物，包括糠醛和羟甲基糠醛(HMF)，它们被认为是目前为止存在于木质纤维水解产物的最大毒性抑制物。
[0010] 纤维素分子由各种长链糖分子组成。在水解过程中，在发酵成为乙醇产物之前，这些长链破裂成为游离糖。
[0011] 有两种主要的纤维素水解方法：i)使用酸的化学反应，或者ii)酶反应。然而，目前的水解方法是昂贵并且低效的。例如，酶水解方法需要得自外部供应商的昂贵的纤维素酶。
[0012] 另一个将纤维素产品转化成乙醇的问题是高达50％的可利用碳到二氧化碳通过发酵处理内在地损失。此外，乙醇比汽油和柴油更具腐蚀性。所以，这需要独特的配送基础结构以及专门设计的引擎。最后，乙醇的效力比化石气体低20-30％，并且乙醇更易蒸发，在整个生产和配送过程中有更高比例的损耗。
[0013] 一种可以从纤维素制备生物柴油的方法将减轻乙醇和其它生物柴油制品相关的问题。
[0014] 得自微生物(例如藻类或细菌)的生物柴油还是无毒的、生物可降解的并且无硫的。由于大部分从燃烧的生物柴油中释放的二氧化碳是从微生物(例如藻类和细菌)生长期间吸收而再循环的，因此可以相信，生物柴油的燃烧相比石油燃烧释放较少的二氧化碳，石油是从已经贮藏了数个世纪的来源中释放二氧化碳。因此，使用微生物制备生物柴油可以产生较少的例如二氧化碳的温室气体。
[0015] 一些微生物物种理想地适用于生物柴油的制备，这是由于他们的高含油量。某些微生物含有作为膜成分、贮存产物、代谢产物和能量源的脂类和/或其它所需的碳氢化合物。微生物中显示出的脂类、碳氢化合物和脂肪酸的比例根据培养的微生物的种类而不同。然而，发现某些菌株中高达其总重的90％包含脂类、脂肪酸和其它所需碳水化合物含量(例如，葡萄藻属(Botryococcus))。
[0016] 例如小球藻属(Chlorela sp.)和杜氏藻属(Dunaliella)的藻类是用于生物柴油的脂肪酸源，这已经被认识很久了。的确，这些真核微生物产生较高的脂肪酸产量(干重的20-80％)，并且可以使用太阳能利用CO2。
[0017] 然而，光合过程并不能有效地使得该过程称为成本节约的生物柴油源。另选地是使用藻类的有机异养特性，并且使其生长在例如葡萄糖的碳源上。在这些情况下，脂肪酸的产量极端的高，并且该脂肪酸具有很高的品质。剩余的干重主要包括蛋白质。然而，可用碳源非常稀少并且昂贵，以致于不能实现任何商业生命力。
[0018] 微生物中积聚的脂类和其它所需的碳氢化合物可以在环境应激阶段期间产生，包括在营养不足状态下生长。相应地，微生物的脂类和脂肪酸含量可以根据培养条件而不同。
[0019] 这些微生物中自然产生的脂类和其它碳氢化合物可以分离并且酯基转移从而获得生物柴油。具有一元醇(大多数情况为甲醇)的脂类的酯基转移作用可以产生烷基酯，这是生物柴油的主要成分。
[0020] 脂类的酯基转移反应导致了具有与所用起始脂类(例如，油脂可以的自动物或植物源)类似脂肪酸曲线的生物柴油燃料。由于所得生物柴油脂肪酸曲线可以根据脂类来源而不同，由酯基转移反应产生的烷基酯也将产生变化。因此，生物柴油的特性也可以根据脂类源而不同(例如，参见Schuchardt等，TRANSESTERIFICATION OF VEGETABLE OILS：A REVIEW，J.Braz.Chem.Soc，vol.9，1，199-210，1998和G.Knothe，FUEL PROCESSING TECHNOLOGY，86，1059-1070(2005)，均引入本文以作参考)。
[0021] 概述
[0022] 本发明涉及一种从生物质制备脂肪酸的方法，特别地，一种从生物质制备脂肪酸并且用于从所述脂肪酸制备生物燃料的方法。特别地，本发明涉及一种制备脂肪酸的方法，通过：
[0023] (i)在一定条件下将纤维素、半纤维素和木质素的至少一种的混合物用至少一种产生一种或多种纤维素酶、半纤维素酶和漆酶的微生物菌株接种，从而产生葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维素糖的至少一种，这些酶水解纤维素、半纤维素和木质素的至少一种；
[0024] (ii)抑制所述至少一种微生物菌株的生长；
[0025] (iii)在一定条件下将步骤(ii)的混合物用至少一种藻类株系接种，该藻类株系代谢所述葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维素糖的至少一种，以使所述至少一种藻类株系产生一种或多种脂肪酸；和
[0026] 任选地，(iv)从所述至少一种藻类株系回收一种或多种脂肪酸。
[0028] 附图简要说明
[0029] 附图1是例示生物乙醇制备的常规方法的流程图。
[0030] 附图2是例示用于本发明脂肪酸制备和生物燃料制备的一般方法的流程图。
[0031] 附图3是例示用于本发明脂肪酸制备和生物燃料制备的特定方法的流程图。
[0032] 附图4是例示用于本发明脂肪酸制备和生物燃料制备的特定方法的一个优选具体实施方式的流程图。
[0033] 发明详细说明
[0034] 现在将对本发明实施方式进行详细参考。实施方式的实施例例示于随附的附图中。虽然将结合这些实施方式描述本发明，但是可以理解的是，这不意味着将发明限定于这些实施方式。相反，这是想要覆盖可能包含在所附权利要求定义发明的精神和范围之内的替代物、变型以及等同物。
[0035] 在下面的说明中，给出了许多具体的细节以提供本发明的深入理解。本发明可以在没有某些或全部这些具体的细节下完成。在其它的例子中，熟知的过程操作没有给予详细说明，这是为了不给本发明造成不必要的不清楚。
[0036] 本发明涉及一种从生物质材料制备脂肪酸的方法。该脂肪酸可以用于例如生物燃料的制备。
[0037] 本发明的一个具体实施方式涉及一种制备脂肪酸的方法，通过：
[0038] (i)在一定条件下将纤维素、半纤维素和木质素的至少一种的混合物用至少一种产生一种或多种纤维素酶、半纤维素酶和漆酶的微生物菌株接种，从而产生至少葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和其它半纤维素糖的至少一种，所述酶水解至少纤维素、半纤维素和木质素的至少一种；
[0039] (ii)抑制所述至少一种微生物菌株的生长，并且回收上清液中的细胞外和/或细胞内的纤维素酶(细胞内纤维素酶的回收可以通过使用常规技术破裂/破坏细胞从而释放细胞内的酶，包括超声波处理，弗氏细胞压碎器，温度，化学处理，酶处理，均质机，微波)。
[0040] (iii)在所述至少一种藻类株系产生一种或多种脂肪酸的条件下，将步骤(ii)的混合物用至少一种藻类株系接种，所述藻类株系代谢所述葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维素糖的至少一种；和
[0041] 任选地，(iv)从所述至少一种藻类株系回收所述一种或多种脂肪酸。
[0042] 步骤(i)中的混合物可以得自生物质。生物质是任何得自植物或动物的有机原料，包括活的或最近死亡的生物学原料，其可以用作燃料或用于工业生产。最普通地，生物质指的是为了用作生物燃料而种植的植物体(plant matter)，但是其还包括用于纤维、化学品或热能生产的植物体或动物体(animal matter)。生物质是可再生能源。
[0043] 有广泛的各种生物质源，包括树木和牧场作物以及森林地、农业作物以及城市垃圾，他们都可以用于本发明。生活用的生物质源的例子包括农业或森林残留物、城市固体废物、工业废物以及陆地和水生作物。
[0044] 世界上有很多种类的植物，有很多种将他们用于能量制备的方法。一般地，有两种途径：培育特定用于能源使用的植物，和使用用于其它事物的植物的残留物。本发明中使用的植物类型根据气候、土壤、地理、人口等等从地区到地区是不同的。
[0045] 能源作物(也被称为“能量作物”)可以以潜在的非常大的量在农田中种植。树和草，包括某地区天然生长的，是优选的能源作物，但是其它农业上的支持性(agriculturally sustainable)较低的作物，包括玉米也可以被使用。
[0046] 树木是用于本发明方法的良好的可再生生物质来源。除了生长快以外，某些树木在接近地面处被砍断之后还可以重新生长(称为“矮林作业”)。这使得树木在重载之前的20或30年可以每3-8年收获一次。这种树木(也被称为“短期轮作木材”)在收获之间的年月中可以长到40英尺高。在美国北部较冷较湿的地区，优选栽种美国梧桐和路路通。然而在最温暖的佛罗里达和加利福尼亚地区，桉树和松树可能生长良好。
[0047] 草是用于本发明的良好可再生生物质来源。细茎多年生草普遍存在于整个美国地区。例子包括柳枝稷、大须芒草以及其它天然品种，他们在美国很多地区快速生长，并且可以在重栽之前可以收获多达10年。包括甘蔗和象草的粗茎多年生植物可以在炎热并且潮湿气候的地区，例如福罗里达和夏威夷。例如玉米和高粱的一年生植物是通常种植用于食物的另一类型的草。
[0048] 油料植物也是用于本发明的一种良好的生物质来源。这样的植物包括例如产油的大豆和向日葵，他们可以用于制备生物燃料。其它一些具有良好产率的油料植物极少用作能源原料，这是因为他们残留的豆粕对于哺乳动物是有毒的，例如麻风树或蓖麻子植物，并且他们实际上良好的生物质农作物。另一个不同类型的油料作物是微藻类。这些小型水生植物具有在美国西南沙漠地区某些湖泊炎热、低浅、含盐的水中极快速生长的可能。
[0049] 在这点上，生物质一般得自产生大量植物和动物废物的林业、农业和工业的废弃产物。
[0050] 目前，林业废物是热和电的巨大来源，木材厂、纸浆厂和造纸厂使用他们来给工厂供能。另一种木材废物的来源通常是是木料采收作业后在森林中留下的树梢和树枝。
[0051] 其它木材废料的来源包括来自锯木厂的树皮和锯削，家具制备中产生的刨花，和来自纸浆厂和造纸厂的有机淤泥(或“料液”)。
[0052] 就像林业那样，大量的农作物残留物在收获后留在了田里。这些废物可以收集用于生物燃料制备。畜牧场产生很多粪便形式的“潮湿废物”。这些废物可以收集并通过本发明使用，以制备用于生物燃料制备的脂肪酸。
[0053] 人们产生很多形式的生物质废物，包括“城市木材废物”(例如航运货架和剩余的建筑木料)，垃圾的生物可降解部分(纸、食物、皮革和畜栏废物等等)和废物分解时垃圾释放的气体。甚至我们的污水可以用作能源，一些污水处理厂收集污水释放的甲烷，并且将其燃烧用于产热和产电，从而减少大气污染和全球变暖气体的排放。
[0054] 在本发明的一个具体实施方式中，本发明使用得自植物或动物的生物质。这些生物质材料可以是任何形式的，包括例如碎片原料、植物废物、动物废物等。
[0055] 这些植物生物质一般包含：约10-35％木质素；约15-35％半纤维素；和约30-60％纤维素。
[0056] 可用于本发明的植物生物质包括至少一种选自木材、纸、稻草、树叶、秕、壳、剪枝、草的成分，包括柳枝稷、芒属、麻、植物纸浆、玉米、豆粕、秸秆、甘蔗、甜菜、高粱、木薯、白杨、柳树、马铃薯废物、甘蔗渣、锯屑、以及混合的植物废物、油棕(棕榈油)和林木粉碎废物。
[0057] 在本发明的一个具体实施方式中，植物生物质可以得自至少一种选自柳枝稷，秸秆和混合的植物废物的植物。在另一个具体实施方式中，植物生物质得自柳枝稷，这是由于他较高水平的纤维素。
[0058] 需要注意的是，任何这样的生物质材料可以用于本发明的方法中。
[0059] 植物生物质最初可以经过预处理从而制备用于步骤(i)的混合物。预处理步骤有助于改变生物质的宏观和微观尺寸和结构，以及亚显微化学组成和结构，从而使碳水化合物部分向单糖的水解可以更快的完成，并且具有更高的产率。常规预处理过程在Nathan Mosier，Charles Wyman，Bruce Dale，Richard Elander，Y.Y.Lee，Mark Holtzapple，Michael Ladisch， ″ Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass，″Bioresource Technology：96，pp.673-686(2005)中公开，引入本文作为参考，并且将在下面进行讨论。
[0060] 预处理方法可以是物理的或者化学的。一些方法结合了两种效果(McMillan，1994；Hsu，1996)。出于分类的目的，将蒸汽和水从考虑用于预处理的化学试剂中排除，这是因为生物质中没有加入外来化学试剂。物理处理方包括粉碎(机械减少生物质颗粒尺寸)、蒸汽爆炸和水热。某些时候需要包括干法、湿法和震动球磨(Millett等，1979，River和Emert，1987，Sidirus和Koukios，1989)以及挤压磨(Tassinari等，1980，1982)的粉碎，以使得随后处理步骤中操作更简单。酸和碱可以促进水解，并且提高在预处理期间通过除去半纤维或木质素而从纤维回收葡萄糖的产率。通常使用的酸和碱包括，例如，分别为H2SO4和NaOH。纤维素溶剂是另一种类型的化学添加剂。将甘蔗渣、玉米秆、牛尾草和鸭茅中的纤维素溶解的溶剂可以获得纤维素到葡萄糖的90％转化(Ladisch等1978；Hamilton等，
1984)，并且显示在水解前使生物质结构断裂时，酶水解可以得到极大促进。已知碱性H2O2、臭氧、有机溶剂制浆(在含水乙醇中使用刘易斯酸、FeCl3、(Al)2SO4)、甘油、二 烷、苯酚或乙二醇属于使纤维素结构断裂并且促进水解的溶剂(Wood and Saddler，1988)。浓缩的无机酸(H2SO4、HCl)、氨水基的溶剂(NH3、肼)、质子惰性溶剂(DMSO)、金属复合物(高铁酒石酸钠、氢氧化镉乙二胺溶液和铜氨液)和湿氧化法也可以减少纤维素结晶性并且断裂木质素与纤维素的结合并溶解半纤维素。这些方法，虽然是有效的，但是当测定葡萄糖值(大约
5￠/lb)时，目前对于实践来讲太过昂贵。以下蒸汽爆炸、液体热水、稀释的酸、石灰和氨水预处理(AFEX)可能具有作为成本合算的处理的可能。
1984)，并且显示在水解前使生物质结构断裂时，酶水解可以得到极大促进。已知碱性H2O2、臭氧、有机溶剂制浆(在含水乙醇中使用刘易斯酸、FeCl3、(Al)2SO4)、甘油、二 烷、苯酚或乙二醇属于使纤维素结构断裂并且促进水解的溶剂(Wood and Saddler，1988)。浓缩的无机酸(H2SO4、HCl)、氨水基的溶剂(NH3、肼)、质子惰性溶剂(DMSO)、金属复合物(高铁酒石酸钠、氢氧化镉乙二胺溶液和铜氨液)和湿氧化法也可以减少纤维素结晶性并且断裂木质素与纤维素的结合并溶解半纤维素。这些方法，虽然是有效的，但是当测定葡萄糖值(大约
5￠/lb)时，目前对于实践来讲太过昂贵。以下蒸汽爆炸、液体热水、稀释的酸、石灰和氨水预处理(AFEX)可能具有作为成本合算的处理的可能。
[0061] 需要注意的是，任何这些预处理操作都可以用使用，以改变生物质从而获得用于本发明的混合物。在这点上，步骤(i)中的微生物可以适用于任何预处理操作，并且他们相关的残留化合物可以包括例如糠醛、羟甲基糠醛(HMF)、例如3，4-二羟基苯甲醛的酚类化合物、3-甲氧基-4-羟基-苯甲酸、肉桂酸、苯胺、香草醛醇以及例如氢氧化钠的复合钠、硝酸复合物或铵，这取决于选择的预处理方法。
[0062] 酸预处理是常见的预处理操作。通过酸水解的酸预处理和热处理可以用于制备在本发明步骤(i)中被接种的混合物。任何合适的酸都可以用于该步骤中，优选地是将半纤维素从纤维素水解掉的酸。一些可以使用的常见的酸包括选自盐酸、磷酸、硫酸或亚硫酸的无机酸。优选例如浓度为约0.5％-2.0％的硫酸。合适的有机酸可以是碳酸、酒石酸、柠檬酸、葡糖醛酸、乙酸、甲酸或类似的单或多聚羧酸。酸预处理一般还包括例如在约70℃-500℃的范围内，或约120℃-200℃的范围内加热混合物。
[0063] 这些酸预处理操作可以用来产生用于步骤(i)的混合物。
[0064] 需要注意的是，当生物质得自植物时，混合物包括纤维素、半纤维、木质素、糠醛、酚类化合物和乙酸的至少一种。
[0065] 在步骤(i)中，预处理操作之后，将混合物用至少一种微生物菌株接种，该菌株是细胞外纤维素生成者。该微生物可以产生一种或多种在一定条件下水解存在于混合物中纤维素和半纤维素的至少一种的纤维素酶，以制备葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维素糖的至少一种。
[0066] 纤维素酶指的是水解纤维素、半纤维素、和/或木质素的一组酶。其一般指的是由可以催化纤维分解(或水解)的例如古菌(archaea)、真菌、细菌、原生动物的微生物(即，细胞外纤维素生成者)产生的一类酶。然而，需要注意的是，也有其它类型微生物产生的纤维素酶。
[0067] 重要的是注意本发明可以使用任何可以产生一种或多种纤维素酶的细胞外和/或细胞内纤维素酶生产者，所述纤维素酶选自内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-糖苷酶、半纤维素酶和漆酶。可以用于本发明的产生纤维素酶的微生物的例子包括所附表1中的那些。
[0068] 因此，微生物产生的纤维素酶可以对步骤(i)中混合物实施酶水解。在酶水解结束时，所得培养基可能含有葡萄糖、纤维二糖、乙酸、糠醛、木质素、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和其它半纤维素糖。
[0069] 此外，本发明可以使用任何作为产生用于步骤(i)中酶水解的必需纤维素酶的纤维素酶生产者的微生物。照这样，任何产生细胞外和/细胞内纤维素酶的包括细菌、古菌的原核生物以及包括真菌的真核生物可以用作步骤(i)中的微生物。
[0070] 在一个具体实施方式中，细胞外和/或细胞内纤维素酶生产者是选自腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、杆菌属(Bacillus)、噬纤维菌属(Cytophaga)和生孢噬纤维菌属(Sporocytophaga)的真菌、古菌或细菌。根据另一个具体实施方式，细胞外和/或细胞内纤维素酶生产者可以是选自灰腐质霉(Humicola grisea)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、木素木霉(Trichoderma lignorum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、疣孢青霉(Penicillium verruculosum)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、热葡糖昔酶芽胞杆菌(Bacillus thermoglucosidasius)、噬纤维菌(Cytophaga spp.)和生孢噬纤维菌(Sporocytophaga spp.)的至少一种。
[0071] 此外，作为细胞外和/或细胞内漆酶生产者的微生物也可以用于本发明。因此，任何产生细胞外和/或细胞内漆酶的包括细菌，古菌的原核生物以及包括真菌的真核生物都可以用作步骤(i)中的微生物。在一个具体实施方式中，细胞外和/或细胞内漆酶生产者是选自腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、杆菌属(Bacillus)、噬纤维菌属(Cytophaga)和生孢噬纤维菌属(Sporocytophaga)的真菌、细菌或古菌。根据本发明另一个具体实施方式，细胞外和/或细胞内漆酶生产者可以是选自灰腐质霉(Humicola grisea)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、木素木霉(Trichoderma lignorum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、疣孢青霉(Penicillium verruculosum)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、热葡糖昔酶芽胞杆菌(Bacillus thermoglucosidasius)、噬胞菌(Cytophaga spp.)和生孢噬纤维素(Sporocytophaga spp.)的一种。可以用于本发明的产生漆酶的微生物的例子包括所附表1中的那些。
[0072] 在一个具体实施方式中，微生物菌株是真菌，更优选地，是需氧真菌，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)。
[0073] 此外，任何细胞外和/或细胞内纤维素酶生产者或细胞外和/或细胞内漆酶生产者可以用于本发明，以制备步骤(i)中酶水解必需的酶。例子包括列于所附表1和2中的那些。
[0074] 在本发明中，微生物的类型可以选择和/或发展为对所用植物生物质类型呈特异性。
[0075] 微生物菌株可以耐受由生物质预处理、例如酸或碱处理所产生的一种或多种化合物。这些在生物质预处理步骤中产生的化合物包括，例如，糠醛、3，4-二羟基苯甲醛、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸酸、肉桂酸、香草醛、香草醛醇、乙酸、木质素和其它残留盐或杂质。
[0076] 在一个优选的具体实施方式中，本发明的方法使用至少一种进化改良的并且对于所用具体生物质种类呈特异性的微生物。进化改良的微生物可以更有效地代谢(酶解)作为目标的经预处理的生物质，并且这些微生物可以更好的耐受残留化合物，例如糠醛和乙酸。在这点上，进化改良的微生物相对未改良的野生型形式的微生物可以具有对糠醛和乙酸更强的耐受性。
[0077] 进化改良的微生物还可以产生一种或多种纤维素酶和/或漆酶，它们更少地受木质素抑制和/或具有提高的代谢木质素的能力。照这样，进化改良的微生物可以具有提高的产生消化木质素的酶(例如漆酶)的能力。因此，相比未改良的野生型形式的微生物，进化改良的微生物产生的纤维素酶、半纤维素酶和/或漆酶可以具有较强的代谢具有木质素的纤维素和半纤维素的能力。
[0078] 由于使用了进化改良的微生物，本发明可以在步骤(i)的混合物/培养基中原位产生纤维素酶。结果是，不再需要从外界供应商购买昂贵的纤维素酶。相比生物燃料制备的传统方法，这降低了操作成本。此外，还由于使用了进化改良的微生物，不再需要将本发明中经酸预处理的混合物清洗和去毒，以除去通常会抑制生物燃料生产的糠醛、乙酸和盐(如在传统方法中)。通过除去清洗和去毒步骤，本发明相比生物燃料制备的传统方法还可以进一步减少操作成本。
[0079] 需要注意的是，进化改良的微生物定义为是被自然选择技术改良的微生物。这些技术包括，例如，连续移植(serial transfer)、连续稀释、遗传工程(Genetic Engine)、连续培养和恒化培养。美国专利US 6,686,194-B1中已经描述了一种方法和恒化培养装置(遗传动力，其可以避免连续培养中稀释抵抗)，引入本文以作参考。
[0080] 在一个具体实施方式中，微生物通过使用如PCT申请PCT/US05/05616或美国专利申请US No.11/508,286中公开的连续培养操作进行进化改良，两者均引入本文以作参考。
[0081] 通过以这种方式培养微生物，将产生有益的突变从而获得崭新的等位基因(即，基因变种)，该等位基因提高了特定环境中微生物的存活可能性和/或生长速率。
[0082] 照这样，本发明的微生物(例如，真菌、古菌、藻类或细菌)可以构成不同的菌株，其可以通过培养过程中获得的突变来鉴别，并且这些突变可以使新细胞从他们祖先的基因型特征中区分开来。因此，可以通过在自然选择过程中分离具有提高的繁殖速率的单体从而选择新的微生物菌株。
[0083] 选择用于进化改良微生物的参数。通过举例的方法，步骤(i)中的微生物可以通过自然选择技术进行进化改良，因此通过进化，其进化成为适用于所选择的特定碳源。这包括通过在所用的自然选择技术(例如连续培养)中的适应性来鉴别和选择最快生长的变异微生物，其比野生型在特定碳源上生长更快。这还包括选择当使用稀释酸预处理时，具有对糠醛和乙酸的提高的耐受力的突变微生物；或者选择产生一种或多种较少受木质素抑制的纤维素酶和/或漆酶和/或具有提高的代谢木质素能力的变异微生物。这还可以包括选择产生上述必要纤维素酶的微生物。
[0084] 需要注意的是，通过使用这些参数，任一种自然选择技术可以用于本发明以进化改良本发明中的微生物。
[0085] 因此，微生物可以以许多方式进化改良，因此它们的生长速率、成活力和作为生物燃料或其它碳氢化合物产品的实用性可以得到提高。因此，可以将微生物进化改良从而增强它们在特定底物上生长的能力，所述底物包含生物质和任何可能的与化学预处理有关的残留的化学药品。在这点上，微生物可以对特定生物质植物和最终相关的残留化学药品进行进化改良。
[0086] 微生物(例如真菌、藻类或细菌)优选地是自然存在且未通过DNA技术改良的。换句话讲，不需要将微生物遗传改良从而获得所需的特征。相应地，所需特征可以通过使用上述技术对微生物进化改良而获得。虽然如此，甚至遗传改良的微生物也可以通过重组DNA技术进化改良，从而增加它们的生长速率和/或改良物的成活力。
[0087] 在本发明的一个具体实施方式中，微生物是真菌，特别地，里氏木霉(Trichoderma reesei，也称为红褐肉座菌Hypocrea jecorina)，其已经通过连续培养进化改良。
[0088] 步骤(i)中的纤维素酶活性可以使用常规技术测定，从而评估纤维素酶活性水平，以确定何时通过进行步骤(ii)来抑制和/或停止微生物的生长。
[0089] 在本发明的步骤(ii)中，通过一种或多种常规技术抑制微生物的生长和酶产生，所述技术例如选自：热激、UV照射、射线照射、气体注射以及所述至少一种微生物的遗传改良(先于步骤(i))，使得所述至少一种遗传改良微生物的生长可以得到抑制，例如当温度增加到45℃时。同时，可以使用常规技术将细胞破裂，用于上清液中细胞内纤维素酶的释放。
[0090] 本发明的步骤(iii)包括将步骤(ii)混合物用至少一种藻类株系接种，所述藻类株系可以在一定条件下代谢所述葡萄糖、纤维二糖、木糖或其它半纤维素糖的至少一种，使得所述至少一种藻类株系产生一种或多种脂肪酸。
[0091] 优选地，上述至少一种藻类株系的生长实质上不被存在于混合物中的的一种或多种木质素、糠醛、盐和纤维素酶所抑制。
[0092] 藻类株系还可以生长在选自有氧、缺氧、光养和异养条件的一种或多种条件中。
[0093] 与微生物相似的，步骤(iii)中的藻类可以进化改良(使用上述自然选择技术)，从而用作脂肪酸、生物燃料、生物柴油和其它碳水化合物产品的改良的来源。在这方面，藻类可以培养用作一种生物燃料、生物柴油或基于碳氢化合物的产品。
[0094] 大多数藻类需要一定量的光照、二氧化碳和水。因此，藻类通常在开放的池塘和湖泊中培养。然而，当在这样一个“开放的”系统中培养藻类时，该系统容易受到其它藻类和细菌的污染。
[0095] 在一个具体实施方式中，本发明可以利用异养藻类(Stanier等，Microbial World，Fifth Edition，Prentice-Hall，Englewood Cliffs，New Jersey，1986，引入本文以作参考)，其可以在密闭的反应器中生长。
[0096] 虽然可以使用许多藻类种类，天然含有大量脂类的藻类是优选的，例如以藻类干重计包含约15-90％、约30-80％、约40-60％或约25-60％的脂类。在本发明的工作之前，认为天然包含高含量脂类和高含量生物碳氢化合物的藻类具有低生长速率。可以根据本发明制备进化改良的藻类株系，其显示出提高的生长速率。
[0097] 藻类生长的条件可以用于对藻类改良。例如，有值得考虑的证据表明，脂类的积累作为培养基中氮供应枯竭的响应而在藻类中发生。研究已经分析了培养基中除去氮的样品，并且观察到在这种条件下藻类的蛋白质含量降低，碳水化合物含量增加，然后接着是脂类含量增加(Richardson等，EFFECTS OF NITROGEN LIMITATION ON THE GROWTH OF ALGAE ON THE GROWTH AND COMPOSITION OF A UNICELLULAR ALGAE IN CONTINUOUS CULTURE CONDITIONS，Applied Microbiology，1969，第18卷，2245-2250页，1969，引入本文以作参考)。
[0098] 藻类可以通过多种技术进化改良，包括例如，连续移植、连续稀释、遗传工程、连续培养和恒化培养。任一这些技术可以用于改良藻类。在一个具体实施方式中，藻类可以通过连续培养而进化改良，如PCT申请PCT/US05/05616，或美国专利申请US11/508,286中所公开的，均引入本文作为参考。
[0099] 通过上述方式，藻类可以以多种方法进化改良，使得它们的生长速率、成活力以及作为生物燃料或其它碳氢化合物产品的实用性可以得到提高。相应地，藻类可以进化改良从而增强它们在特定底物上生长的能力。
[0100] 进化改良藻类的参数选择。通过例示的方式，步骤(iii)中的藻类可以通过例如连续培养的自然选择技术进化改良，从而通过进化，藻类进化成可以适合于使用特定选择的碳源。这包括通过适用所使用的自然技术来鉴别并且选择最快地生长的变种的藻类，所述藻类在特定碳源上比野生型生长更快。这还包括，例如，选择使用乙酸作为碳源的对木质素、糠醛和盐具有提高的耐受的藻类。需要注意的是，通过使用这些参数，任一自然选择技术可以在本发明中使用，从而将本发明中的藻类进化改良。
[0101] 在本发明中，在一定条件下这些进化改良的藻类代谢一种或多种选自葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维素糖和/或废甘油的化合物，并且该藻类使用乙酸作为碳源，使得所述至少一种藻类株系(algae strain)产生一种或多种脂肪酸。这些进化改良的藻类还可以在一种或多种选自有氧、缺氧、光养和异养条件的条件下生长。
[0102] 在一个具体实施方式中，当本发明的步骤(iii)在有氧和缺氧条件下实施时，藻类采用呼吸作用。
[0103] 在步骤(iii)中，与产生发酵作用副产物生产者的生物体使用相同量的碳源的藻类(the algae using the same amount of carbon source as an organism producing fermentation by-product producer)将只产生至多10％的二氧化碳。在这点上，与转化成二氧化碳的糖相比，更多的糖由藻类用于生长。任选地，微生物或藻类可以是不使用发酵作用的，并且因此在呼吸作用中产生更少副产物二氧化碳。
[0104] 同时，步骤(iii)中至少一种藻类株系优选地几乎不或不产生用于所述藻类生长抑制作用的抑制性副产物。
[0106] 需要注意的是，本发明可以使用任何在一定条件下代谢葡萄糖、纤维二糖、木糖或其它半纤维素糖的一种或多种的藻类株系，使得藻类株系产生一种或多种脂肪酸。
[0107] 通过例示的方式，步骤(iii)中的使用的藻类可以来自以下藻类分类：
[0108] (1)绿藻门(Division Chlorophyta)(绿藻)；
[0109] (2)蓝藻门(Division Cyanophyta)(蓝藻)；
[0110] (3)硅藻门(Division Bacillariophyta)(硅藻)；
[0111] (4)金藻门(Division Chrysophyta)；
[0112] (5)黄藻门(Division Xanthophyta)；
[0113] (6)隐藻门(Division Cryptophyta)；
[0114] (7)裸藻门(Division Euglenophyta)；
[0115] (8)褐藻门(Division Ochrophyta)；
[0116] (9)定鞭藻门(Division Haptophyta)；和
[0117] (10)甲藻门(Division Dinophyta)。
[0118] 更特别地，藻类可以来自以下藻类物种，其包括在上述分类内(括号内的数字与分类相应)：
[0119] 盒形藻属(Biddulphia)(8)；
[0120] 油球藻属(Pinguiococcus)(8)；
[0121] 骨条藻属(Skeletonema)(8)；
[0122] 球石藻属(Emiliania)(9)；
[0123] 三毛金藻属(Prymnesium)(9)；
[0124] 隐定藻(Crypthecodinium)(10)；
[0125] 项圈项圈藻(Anabaenopsis circularis)(2)；
[0126] 布朗纤维藻(Ankistrodesmus braunii)(1)；
[0127] 镰形纤维藻(A.falcatus)(1)；
[0128] 拟气球藻(Botrydiopsis intercedens)(5)；
[0129] (Bracteacoccus cinnabarinus)(1)；
[0130] B.engadiensis(1)；
[0131] B.minor(Chodat)Petrova(1)；
[0132] B.terrestris(1)；
[0133] 片球藻(Bracteacoccus sp.)(1)；
[0134] 片球藻(Bracteacoccus sp.)(1)；
[0135] Bumilleriopsis brevis(5)；
[0136] 草履缘孢藻(Chilomonas Paramecium)(6)；
[0137] Chlamydobotrys sp.(1)；
[0138] Chlamydomonas agloeformis(1)；
[0139] C.dysosmos(1)；
[0140] C.mundana Mojave strain Boron strain(1)；
[0141] 莱哈衣藻(-)株(C.reinhardi(-)strain)(1)；
[0142] 椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)(1)；
[0143] 原始小球藻(C.protothecoides)(1)；
[0144] 蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)(1)；
[0145] 蛋白核小球藻ATCC 7516(C.pyrenoidosa ATCC 7516)(1)；
[0146] 蛋白核小球藻C-37-2(C.pyrenoidosa C-37-2)(1)；
[0147] 蛋白核小球藻Emerson(C.pyrenoidosa Emerson)(1)；
[0148] 蛋白核小球藻7-11-05(C.pyrenoidosa 7-11-05)(1)；
[0149] 小球藻(C.vulgaris)(1)；
[0150] 小球藻ATCC 9765(C.vulgaris ATCC 9765)(1)；
[0151] 小球藻Emerson(C.vulgaris Emerson)(1)；
[0152] 小球藻Pratt-Trealease(C.vulgaris Pratt-Trealease)(1)；
[0153] 小球藻viridis变种(C.vulgaris var.viridis)(1)；
[0154] Chlorellidium tetrabotrys(5)；
[0155] Chlorocloster engadinensis(5)；
[0156] Chlorococcum macrostigmatum(1)；
[0157] 绿球藻(Chlorococcum sp.)(1)；
[0158] 弗氏绿胶藻(Chlorogloea fritschii)(2)；
[0159] 长绿梭藻(Chlorogonium elongatum)(1)；
[0160] (Coccomyxa elongata)(1)；
[0161] 小环藻(Cyclotella sp.)(3)；
[0162] (Dictyochloris fragrans)(1)；
[0163] 纤细裸藻(Euglena gracilis)(7)；
[0164] 纤细裸藻Vischer(E.gracilis Vischer)(7)；
[0165] 纤细裸藻bacillaris变种(E.gracilis var.bacillaris)(7)；
[0166] 纤细裸藻saccharophila变种(E.gracilis var.saccharophila)(7)；
[0167] 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)(1)；
[0168] Navicula incerta Grun.(3)；
[0169] N.pelliculosa(3)；
[0170] Neochloris alveolaris(1)；
[0171] N.aquatica Starr(1)；
[0172] N.gelatinosa Herndon(1)；
[0173] N.pseudoalveolaris Deason(1)；
[0174] 新绿藻(Neochloris sp.)(1)；
[0175] 有棱菱形藻相似变种(Nitzschia angularis var.affinis(3)(Grun.)perag.)；
[0176] N.chlosterium(Ehr.)(3)；
[0177] N.curvilineata Hust.(3)；
[0178] 丝状菱形藻(N.filiformis)(3)；
[0179] 碎片菱形藻(N.frustulum(Kurtz.))(3)；
[0180] N.laevis Hust.(3)；
[0181] 灰色念珠藻(Nostoc muscorum)(2)；
[0182] 马含棕鞭藻(Ochromonas malhamensis)(4)；
[0183] 短棘盘星藻(Pediastrum boryanum)(1)；
[0184] 二角盘星藻(P.duplex)(1)；
[0185] Polytoma obtusum(1)；
[0186] 眼点素衣藻(P.ocellatum)(1)；
[0187] 素衣藻(P.uvella)(1)；
[0188] Polytomella caeca(or coeca)(1)；
[0189] Prototheca zopfii(1)；
[0190] 圆头栅藻(Scenedesmus acuminatus)(1)；
[0191] (S.acutiformis)(1)；
[0192] S.costulatus Chod，var.chlorelloides(1)；
[0193] 二形栅藻(S.dimorphus)(1)；
[0194] 斜生栅藻(S.obliquus)(1)；
[0195] 四尾栅藻(S.quadricauda)(1)；
[0196] Spongiochloris excentrica(1)；
[0197] S.lamellata Deason(1)；
[0198] S.spongi osus(1)；
[0199] Spongi ochl ori s sp.(1)；
[0200] Spongiococcum alabamense(1)；
[0201] S.excentricum(1)；
[0202] S.excentricum Deason et Bold(1)；
[0203] S.multinucleatum(1)；
[0204] 杆裂丝藻(Stichococcus bacillaris)(1)；
[0205] 软克里藻(S.subtilis)(1)；
[0206] Tolypothrix tenuis(2)；
[0207] Tribonema aequale(5)；和小型黄丝藻(T.minus)(5)。
[0208] 在一个具体实施方式中，藻类可以来自绿藻门(小球藻属和原壁菌属(Protocheca))、鞭藻门(杜氏藻属(Dunaliella))、硅藻门(舟形藻属和菱形藻属)、褐藻门(棕鞭藻属)、甲藻门(螺沟藻属(Gyrodinium))和眼虫门(Euglenozoa)(裸藻属)。
更优选地，藻类是选自单肠藻(Monalanthus Salina)；丛粒藻(Botryococcus Braunii)；
原始小球藻(Chlorella prototecoides)；Outirococcus sp.；斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)；微绿球藻(Nannochloris sp.)；巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)(盐生杜氏藻D.Salina)；舟形藻(Navicula pelliculosa)；Radiosphaera negevensis；长耳盒形藻(Biddulphia aurita)；普通小球藻(Chlorella vulgaris)；谷皮菱形藻(Nitzschia palea)；丹麦棕鞭藻(Ochromonas dannica)；蛋白核小球藻(Chrorella pyrenoidosa)；
腰带多甲藻(Peridinium cinctum)；Neochloris oleabundans；多形卵囊藻(Oocystis polymorpha)；金色藻(Chrysochromulina spp.)；弯曲栅藻(Scenedesmus acutus)；栅藻(Scenedesmus spp.)；微小小球藻(Chlorella minutissima)；小定鞭金藻(Prymnesium parvum)；舟形藻(Navicula pelliculosa)；二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)；螺翼藻(Scotiella sp.)；小球藻(Chorella spp.)；纤细裸藻(Euglena gracilis)；和紫球藻(Porphyridium cruentum)的一种。
更优选地，藻类是选自单肠藻(Monalanthus Salina)；丛粒藻(Botryococcus Braunii)；
原始小球藻(Chlorella prototecoides)；Outirococcus sp.；斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)；微绿球藻(Nannochloris sp.)；巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)(盐生杜氏藻D.Salina)；舟形藻(Navicula pelliculosa)；Radiosphaera negevensis；长耳盒形藻(Biddulphia aurita)；普通小球藻(Chlorella vulgaris)；谷皮菱形藻(Nitzschia palea)；丹麦棕鞭藻(Ochromonas dannica)；蛋白核小球藻(Chrorella pyrenoidosa)；
腰带多甲藻(Peridinium cinctum)；Neochloris oleabundans；多形卵囊藻(Oocystis polymorpha)；金色藻(Chrysochromulina spp.)；弯曲栅藻(Scenedesmus acutus)；栅藻(Scenedesmus spp.)；微小小球藻(Chlorella minutissima)；小定鞭金藻(Prymnesium parvum)；舟形藻(Navicula pelliculosa)；二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)；螺翼藻(Scotiella sp.)；小球藻(Chorella spp.)；纤细裸藻(Euglena gracilis)；和紫球藻(Porphyridium cruentum)的一种。
[0209] 在另 一 个 具体 实 施 方式 中，藻 类株 系 是 原始 小 球藻 (Chlorella protothecoides)，并且已经使用上述的技术和操作通过连续培养进化改良。
[0210] 蓝细菌也可以用于本发明中。蓝细菌是常常称之为“蓝绿藻”的原核生物(单细胞生物)。虽然大多数藻类是真核的，是蓝细菌是最常见的例外。蓝细菌通常是单细胞的，但是可以观察到菌落形式或丝状体形式，他们中的一些区分成为不同角色。出于所主张的发明的目的，蓝细菌是考虑使用的藻类。
[0211] 原始小球藻(Chlorella protothecoides)和盐生杜氏藻(Dunaliella Salina)是已经进化改良的、培养并且收获用于生物柴油制备的物种。
[0212] 以下涉及培育不同类型的藻类，然后收获藻类用于制备生物柴油的目的的公开内容引入本文以作参考：
[0213] -Xu 等，HIGH QUALITY BIODESEL PRODUCTION FROM A MICROALGA CHLORELLA PROTHECOIDES BY HETEROTROPHIC GROWTH IN FERMENTERS，Journal of Biotechnology，第126卷，499-507，2006，
[0214] -Kessler，Erich，PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL CONTRIBUTIONS TO THE TAXONOMY OF THE GENUS PROTOTHECA，III.UTILIZATION OF ORGANIC CARBON AND NITROGEN COMPOUNDS，Arch Microbiol，第132卷，103-106，1982，
[0215] -Johnson D，1987，OVERVIEW OF THE DOE/SERI AQUATIC SPECIES PROGRAM FY1986 SOLAR ENERGY INSTITUTE，
[0216] -Pratt等，PRODUCTION OF PROTEIN AND LIPID BY CHLORELLA VULGARIS AND CHLORELLA PYRENOIDOSA，Journal of Pharmaceutical Sciences，第52 卷，第10 期，979-9842006，和
[0217] -Sorokin，MAXIMUM GROWTH RATES OF CHLORELLA IN STEADY-STATE AND IN SYNCHRONIZED CULTURES，Proc.N.A.S，第45卷，1740-1743，1959.
[0218] -J.E.Zajic 和 Y.S.Chiu，HETEROTROPHIC CULTURE OF ALGAE，Biochemical Engineering，Faculty of Engineering Science，University of Western Ontario，London.
[0219] 通过使用本发明的方法，将混合物使用步骤(iii)中至少一种藻类株系接种导致藻类在一定条件下代谢葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纤维糖的至少一种，使得所述至少一种藻类株系产生一种或多种包括脂肪酸的化合物。特别地，本发明步骤(iii)中包括为了一种或多种例如脂肪酸、碳氢化合物、蛋白质、色素、例如多糖和单糖的糖和甘油的化合物的细胞外和/或细胞内生产，培养进化改良的藻类并使其生长。
[0221] 在步骤(iv)中，脂肪酸、碳氢化合物、蛋白质、色素、例如多糖和单糖的糖和甘油可以从藻类中回收。回收步骤可以通过常规技术和其它技术完成，所述常规技术包括培养物中藻类的一次或多次分级从而获得含有化合物的成分，所述其它技术包括所述至少一种含有脂肪酸的藻类株系的过滤-离心分离、絮凝、溶剂萃取、酸碱萃取、超声波处理、微波、压榨、蒸馏、热蒸发、均质、加氢裂解(流化催化裂化)和干燥。
[0222] 在一个具体实施方式中，步骤(iv)中回收所得的上清液可以再使用。
[0224] 在这发明，本发明的藻类株系可以产生可以用作油脂精炼中加氢裂解原料的烃链，以制备一种或多种选自辛烷、汽油、石油溶剂油、火油、柴油和其它作为溶剂、塑料、油类、油脂和纤维的石油产品的化合物。
[0225] 直接酯基转移作用可以在藻类株系的细胞上完成，以制备用于生物柴油燃料的脂肪酸。直接酯基转移作用的方法是熟知的，包括破碎藻类细胞、释放脂肪酸并通过用甲醇或乙醇的碱或酸法的酯基转移作用以制得生物柴油燃料。
[0226] 本发明方法的另一个优点是藻类株系可以适用于使用通过酯基转移作用产生的废甘油作为碳源而不需预处理或精炼，以制备用于生物柴油生产的脂肪酸。
[0227] 粗甘油是酯基转移反应的副产物，其包括甘油和杂质，例如脂肪酸成分、油性成分、酸性成分、碱性成分、皂成分、醇成分(例如甲醇和乙醇)、溶剂(N-己烷)、盐和/或二醇。由于存在于粗甘油中杂质的数量和类型，微生物在粗甘油上表现为基本不生长到不生长。然而，可以使微生物(例如，藻类或细菌)进化改良从而利用粗甘油作为主要碳源。
[0228] 确定特定类型的微生物是否可以在粗甘油存在中生长的初期试验是精炼甘油试验。精炼甘油试验包括在含有精炼甘油的培养基中培养微生物。精炼甘油试验中使用的培养基可以具有或不具有例如葡萄糖的碳源。然而，精炼甘油试验中的培养基必须含有足够量的甘油，从而可以确定微生物表现出微生物的最小代谢能力。优选地，每升培养基含有10ml-50ml精炼甘油、0.1ml-100ml精炼甘油和2ml-15ml精炼甘油。
[0229] 如果精炼甘油试验获得阳性结果(即，微生物在培养基中生长)，那么可以将微生物进化改良从而在含有粗甘油的培养基中生长。培养基优选含有例如10-100％作为碳源的粗甘油、20-90％作为碳源的粗甘油、30-75％作为碳源的粗甘油、40-75％作为碳源的粗甘油或50.01-55％作为碳源的粗甘油。的确，一些微生物菌株已经进化改良从而可以生长在含有100％粗甘油的培养基中。
[0230] 使用预处理的生物质混合物中的特定碳源，根据本发明获得的产生细胞外和/或细胞内纤维素酶、半纤维素酶和漆酶的进化改良的微生物可以具有最大生长速率，其比未进化改性的同种微生物的生长速率大至少5％、优选地10％、15％、25％、50％、75％、100％、200％、25％-100％、25％-100％、50％-150％、25-200％、大于200％、大于300％或大于400％。
[0231] 使用预处理的生物质混合物中的步骤(i)中释放的多糖和单糖作为碳源，根据本发明获得的进化改良的藻类可以具有最大生长速率，其比未进化改良的同种的藻类的生长速率大至少5％、优选地10％、15％、25％、50％、75％、100％、200％、25％-100％、25％-100％、50％-150％、25-200％、大于200％、大于300％或大于400％。
[0232] 虽然可以想像的是，培养自生物柴油制备副产品的微生物的最重要商业用途将是使用微生物本身以制备例如生物燃料、生物柴油、“生物”-碳氢化合物产物、可再生碳氢化合物产物和基于脂肪酸的产品，本发明不仅限与该实施方式。例如，如果微生物是藻类，那么可使该藻类可以从生物燃料制品的副产品生长并且收获用作食品、药品和营养补充物。
[0233] 本发明获得的生物燃料可以直接使用或作为用于某些产品的石油的替代物。
[0234] 在另一个具体实施方式中，本发明的生物燃料(例如，生物柴油)可以作为与其它石油产品或石油替代物的掺混物使用，从而获得例如发动机汽油和馏出燃油组合物的燃料；例如溶剂和润滑油的精制非燃料产品；和例如石脑油和各种精炼气体的石油化工业的原料。
[0235] 例如，上述生物燃料可以直接用于，或与其它基于石油的产品掺混从而制备溶剂；涂料；漆；和印刷油墨；润滑油；用于汽车内燃机和其它机械的油脂；用于糖果制备。包装、蜡烛、火柴和擦亮剂中的蜡；石油凝胶；沥青；石油焦炭；和石油原料，其用作主要用于化学试剂、合成橡胶和各种塑料的得自石油的化学原料。
[0236] 在一个优选的具体实施方式中，根据本发明制备的生物柴油可以用于柴油发动机中，或与基于石油的馏出燃油成分以一定比例掺混，从而所得石油替代物的量可以是总组分重量的约5-95％、15-85％、20-80％、25-75％、50-75％和75-95％。这些成分可以以任何合适的方式混合。
[0237] 给压缩点火内燃机提供燃料的方法包括：将空气吸入压缩点火内燃机的汽缸；通过汽缸中活塞的压缩行程压缩空气；在逼近压缩行程末端时将含有生物柴油的燃料注射到压缩空气中；和通过压缩点火内燃机运作期间的汽缸中压缩热将燃料点燃。
[0238] 在另一个具体实施方式中，生物柴油可以用作润滑剂或用于给压缩点火内燃机提供燃料的方法中。
[0239] 可选地，生物燃料可以被进一步处理从而获得其它在石油中发现的碳氢化合物，例如链烷烃(例如，甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷和己烷)、芳香族化合物(例如，苯和萘)、环烷烃(例如，环己烷和甲基环戊烷)、烯烃(例如，乙烯、丁烯和异丁烯)、炔(例如，乙炔和丁二烯)。
[0240] 然后，所得碳氢化合物可以依次用于基于石油的产品，例如溶剂；涂料；漆；和印刷油墨；润滑油；用于汽车内燃机和其它机械的油脂；用于糖果制备。包装、蜡烛、火柴和擦亮剂中的蜡；石油凝胶；沥青；石油焦炭；和石油原料，其用作主要用于化学试剂、合成橡胶和各种塑料的得自石油的化学原料。
[0241] 下面的实施例对本发明的具体实施方式进行了举例说明。明显的是，可以做出各种变化和改进而不脱离如权利要求定义的本发明的范围。实施例
[0242] 本发明方法的一个示例性实施方式可参见附图4，并且详述如下。
[0243] 在该实施例中，切碎的柳枝稷的植物生物质材料经过酸水解的预处理(硫酸0.5-2.0％)和热处理(120℃-200℃)。
[0244] 该预处理过程产生了用于上述步骤(i)的混合物。该混合物包含纤维素、半纤维素、木质素、糠醛和乙酸。
[0245] 在步骤(i)中，(原位的酶制备)将该混合物在以下条件下用具有以下特性的进化改良微生物菌株——里氏木霉(Trichoderma Reesei)——接种：
[0246] ·使改良的里氏木霉(Trichoderma Reesei)进化，从而更有效地代谢预处理的柳枝稷，并且更好地耐受糠醛和乙酸(命名为EVG22030)。
[0247] ·所述菌株产生对柳枝稷特异性的外部纤维素酶。
[0248] ·在需氧环境中里氏木霉EVG22030的接种和生长。
[0249] ·微晶纤维素水解成葡萄糖、纤维二糖。
[0250] ·水解未经预处理有效处理的半纤维素糖。
[0251] 在培养和酶制备阶段后，通过50℃下的热激终止里氏木霉(Trichoderma Reesei)EVG22030的生长。
[0252] 在步骤(iii)中，将来自步骤(ii)的混合物在以下条件下用具有以下特性的进化改良的藻类株系——原始小球藻(Chlorella protothecoides)——接种：
[0253] ·在异养环境中使原始小球藻(Chlorella protothecoides)进化，从而使用从预处理的柳枝稷释放的碳源(通过EVG22030酶)，并且命名为EVG15018。
[0254] ·在异养环境中原始小球藻(Chlorella Protothecoides)EVG15018的接种和生长。
[0255] ·EVG15018代谢：葡萄糖、纤维二糖、木糖和其它半纤维素糖、废甘油，并且使用乙酸作为碳源。
[0256] ·木质素、糠醛和盐的存在不抑制生长。
[0257] ·EVG15018产生40％或更多的脂肪酸(细胞干重)。
[0258] ·然后使藻类在一定条件下生长，并且产生产物脂肪酸。
[0259] 然后将藻类细胞和脂肪酸通过过滤和细胞干燥回收。
[0260] 然后，在干细胞上实施直接酯基转移作用(超声波处理，通过甲醇或乙醇的碱法或酸法)以制备生物柴油燃料。还将废甘油回收和循环。所得生物柴油燃料可以直接用于任何汽车、火车、发电机、船等等的柴油发动机。
[0261] 虽然已参照本发明的操作性的实施方式具体地说明并且指出了本发明，但是本领域技术人员可以理解的是，在不脱离本发明精神的前提下，可以做出各种变化、改进、替换和省略。因此，本发明包括那些所付权利要求范围内的等价物。
[0262] 表1——产生细胞外和/细胞内纤维素酶的微生物生物体的实例
[0263]
[0264]
[0265]
[0266]
[0267]
[0268]
[0269]
[0270]
[0271]
[0272]
[0273]
[0274]
[0275]
[0276]
[0277] 表2——产生细胞外和/细胞内漆酶的微生物生物体的实例
[0278]
[0279]
[0280]
[0281]
[0282]
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