以下各
实施例所用的测量方法如下:
(1)有机酸的定量测定方法:采用液相色谱法(HPLC),单位为g/L,参见Oh,H.,Wee,Y.J.,Yun,J.S.,Han,S.H.,Jung,S.W.,Ryu,H.W.,2005.Lactic acidproduction from agricultural resources as cheap raw materials.Bioresour.Technol.96:1492-1498和Meynial-Salles,I.,Dorotyn,S.,Soucaille,P.A new process for thecontinuous production of succinic acid from glucose at high yield,titer,andproductivity[J].Biotechnology and Bioengineering.2008,99(1):129-135.
(2)还原糖的定量测定方法:采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法),单位为g/L,参见Miller,G.L.,1959.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination ofreducing sugar.Anal.Chem.31:426-429。
(3)黄姜皂素(皂苷元)的定量测定方法:液相色谱法,参见Song,J.,Tao W.Y.and Chen,W.Y.,2008.Ultrasound-accelerated enzymatic hydrolysis of solid leatherwaste.Journal of Cleaner Production.16:591-597.
实施例1 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
300克干黄姜块根粉碎后,加入900克水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度120℃、压力0.1MPa条件下,蒸汽爆破15min,冷却至室温;加入2400克水混匀,加入果胶酶2.4×104.U、纤维素酶4.8×104;混合均匀,在pH值4.0、温度45℃条件下搅拌20h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中加入α-淀粉酶2400U,在pH值5.0、温度50℃条件下搅拌20min,冷却至室温;再加入糖化酶2.4×104.U,在温度50℃搅拌20h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到90℃,保温5min,然后冷却至室温,离心分离收集上清液,所收集上清液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产乳酸的发酵培养基
生产乳酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖150g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉5g、氮源10g、K2HPO42g,调PH值至5.5;
所述氮源为:麸皮水解液过滤液;
所述麸皮水解液过滤液按如下方法制备:干麸皮加入3倍重量的水,混合均匀,再加入硫酸至终浓度0.8mol/L,在95℃温度下搅拌40min,冷却至室温,过滤后所收集滤液即为麸皮水解液过滤液。
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比5%的种子液,于pH值5、温度30℃条件下,搅拌转速50rpm,当发酵液中还原糖浓度为4g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环2批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值5、温度30℃条件下搅拌,搅拌速度50rpm,时间10h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸杆菌(鼠李糖乳酸杆菌L.rhamnosus HG 09F5-27);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为氢氧化钙溶液;氢氧化钙溶液浓度为400g/L;
所述微滤装置是装有孔径为0.10μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为150道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
所述每升纳滤截留液中,加入薯蓣皂苷酶10U,在pH值4.5、温度30℃条件下搅拌30min,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以石油醚为萃取溶剂,在85℃温度下萃取4h,在压力0.01Mpa、温度60℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素2.10克,乳酸34.09克。
实施例2 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
1千克干黄姜块根粉碎后,加入5千克水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度130℃、压力0.2MPa条件下,蒸汽爆破20min,冷却至室温;加入24千克水混匀,加入果胶酶1.2×105.U、纤维素酶2.5×105U;在pH值5.0、温度55℃条件下搅拌30h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中加入α-淀粉酶1.5×104U,在pH值7.0、温度95℃条件下搅拌40min,冷却至室温;再加入糖化酶1.5×105U,在温度65℃搅拌30h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到100℃,保温10min,然后冷却至室温,过滤分离收集滤液,所收集滤液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产乳酸的发酵培养基,
生产乳酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖200g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉10g、氮源20g、K2HPO45g,调PH值至7.0;
所述氮源为:玉米浆过滤液和麸皮水解液过滤液的组合;
所述麸皮水解液过滤液按如下方法制备:1千克干麸皮加入5千克水,混合均匀,再加入硫酸至终浓度1.2mol/L,在105℃温度下搅拌60min,冷却至室温,过滤后所收集滤液即为麸皮水解液过滤液。
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比10%的种子液,于pH值7、温度55℃条件下,搅拌,搅拌转速200rpm,当发酵液中还原糖浓度达到3g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环15批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母粉10g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值7、温度50℃条件下搅拌,搅拌速度200rpm,时间24h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸杆菌(德氏乳酸杆菌L.delbrueckii HG 07);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为氢氧化钙溶液;氢氧化钙溶液浓度为500g/L;
所述微滤装置是装有孔径为0.45μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为400道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
所述每升纳滤截留液中,加入薯蓣皂苷酶15U,在pH值7.0、温度40℃条件下搅拌40min,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以汽油为萃取溶剂,在95℃温度下萃取6h,在压力0.05Mpa、温度80℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素2.23克,乳酸35.09克。
实施例3 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
5千克干黄姜块根粉碎后,加入20千克水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度125℃、压力0.15MPa条件下,蒸汽爆破17min,冷却至室温;加入75千克水混匀,加入果胶酶5×105U、纤维素酶1×106U;在pH值4.5、温度50℃条件下搅拌25h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中加入α-淀粉酶5×104U,在pH值6.0、温度70℃条件下搅拌30min,冷却至室温;再加入糖化酶5×105U,在温度60℃搅拌25h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到95℃,保温8min,然后冷却至室温,过滤分离收集滤液,所收集滤液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产乳酸的发酵培养基,
生产乳酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖180g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉8g、氮源18g、K2HPO43g,调PH值至6.0;
所述氮源为:玉米浆过滤液和麸皮水解液过滤液的组合;
所述麸皮水解液过滤液按如下方法制备:干麸皮加入4倍重量的水,混合均匀,再加入硫酸至终浓度1.0mol/L,在100℃温度下搅拌50min,冷却至室温,过滤后所收集滤液即为麸皮水解液过滤液。
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比8%的种子液,于pH值6、温度32℃条件下,搅拌,搅拌转速100rpm,当发酵液中还原糖浓度达到2g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环10批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖15g、蛋白胨15g、酵母粉6g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值5.5、温度32℃条件下搅拌,搅拌速度100rpm,时间15h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸酵母菌(产乳酸工程酵母菌S.cerevisiae HG-006);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为氢氧化钠溶液;氢氧化钠溶液浓度为400g/L;
所述微滤装置是装有孔径为0.22μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为300道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
所述每升纳滤截留液中,加入薯蓣皂苷酶13U,在pH值6.0、温度32℃条件下搅拌35min,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以石油醚为萃取溶剂,在90℃温度下萃取5h,在压力0.02Mpa、温度70℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素2.36克,乳酸34.01克。
实施例4 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
10千克鲜黄姜块根磨浆后,加入20千克的水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度120℃、压力0.1MPa条件下,蒸汽爆破15min,冷却至室温;加入60千克水,加入果胶酶2.5×105U、纤维素酶5×105U,混合均匀,在pH值4.0、温度45℃条件下搅拌20h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中先加入α-淀粉酶3×104U,在pH值5.0、温度50℃条件下搅拌20min,冷却至室温;加入糖化酶2.5×105U,在温度50℃搅拌20~30h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到90℃,保温5min,然后冷却至室温,离心分离收集上清液,所收集上清液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产琥珀酸的发酵培养基,
生产琥珀酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖100g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉2g、氮源5g、K2HPO41g,调PH值至5.5;
所述氮源为:玉米浆过滤液、麸皮水解液过滤液和豆粕水解液过滤液的组合;
所述麸皮水解液过滤液和豆粕水解液过滤液按如下方法制备:干麸皮或干豆粕加入3倍重量的水,混合均匀,再加入硫酸至终浓度0.8mol/L,在95℃温度下搅拌40min,冷却至室温,过滤后所收集滤液即为麸皮水解液过滤液或豆粕水解液过滤液。
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比5%的种子液,于pH值5、温度33℃条件下,按速度0.5L/min通入二氧化碳并搅拌,搅拌转速50rpm,当发酵液中还原糖浓度达到0.5g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环8批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值5、温度30℃条件下搅拌,搅拌速度50rpm,时间10h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸杆菌(产琥珀酸杆菌Actinobacillus succinogenes HGLZD-103);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为氨水;氨水浓度为250g/L;
所述微滤装置是装有孔径为0.10μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为150道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
所述每升纳滤截留液中,加入薯蓣皂苷酶10U,在pH值4.5、温度30℃条件下搅拌30min,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以汽油为萃取溶剂,在85℃温度下萃取6h,在压力0.01Mpa、温度60℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素2.09克,琥珀酸23.61克。
实施例5 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
20千克鲜黄姜块根磨浆后,加入60千克水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度130℃、压力0.2MPa条件下,蒸汽爆破20min,冷却至室温;加入320千克水混匀,加入果胶酶8×105U、纤维素酶1.6×106U,混合均匀,在pH值5.0、温度55℃条件下搅拌30h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中α-淀粉酶1×105U,在pH值7.0、温度95℃条件下搅拌40min,冷却至室温;再加入糖化酶1×106U,在温度65℃搅拌30h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到100℃,保温10min,然后冷却至室温,离心分离收集上清液,或者过滤分离收集滤液,所收集上清液或滤液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产琥珀酸的发酵培养基,
生产琥珀酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖150g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉5g、氮源10g、K2HPO42g,调PH值至7.0;
所述氮源为:麸皮水解液过滤液和豆粕水解液过滤液的组合;
所述麸皮水解液过滤液和豆粕水解液过滤液按如下方法制备:干麸皮或干豆粕加入5倍重量的水,混合均匀,再加入硫酸至终浓度1.2mol/L,在105℃温度下搅拌60min,冷却至室温,过滤后所收集滤液即为麸皮水解液过滤液或豆粕水解液过滤液。
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比10%的种子液,于pH值7、温度33℃条件下,按速度1L/min通入二氧化碳并搅拌,搅拌转速200rpm,当发酵液中还原糖浓度达到1g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环12批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母粉10g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值7、温度50℃条件下搅拌,搅拌速度200rpm,时间24h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸杆菌(产琥珀酸杆菌Actinobacillus succinogenes HGLZD-103);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为氨水;氨水浓度为280g/L;
所述微滤装置是装有孔径为0.45μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为400道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
所述每升纳滤截留液中,加入薯蓣皂苷酶15U,在pH值7.0、温度40℃条件下搅拌40min,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以石油醚为萃取溶剂,在95℃温度下萃取6h,在压力0.05Mpa、温度80℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素2.11克,琥珀酸24.01克。
实施例6 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
50千克鲜黄姜块根磨浆后,加入125千克水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度124℃、压力0.18MPa条件下,蒸汽爆破17min,冷却至室温;加入350千克水混匀,加入果胶酶1.5×106U、纤维素酶3×106U,混合均匀,在pH值4.4、温度47℃条件下搅拌27h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中先加入α-淀粉酶1.75×105U,在pH值5.6、温度80℃条件下搅拌34min,冷却至室温;加入糖化酶2×106U,在温度60℃搅拌27h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到97℃,保温8min,然后冷却至室温,离心分离收集上清液,或者过滤分离收集滤液,所收集上清液或滤液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产琥珀酸的发酵培养基,
生产琥珀酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖115g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉2.6g、氮源6.7g、K2HPO41.2g,调PH值至5.9;
所述氮源为:玉米浆过滤液和豆粕水解液过滤液的组合;
所述豆粕水解液过滤液按如下方法制备:干豆粕加入3.6倍重量的水,混合均匀,再加入硫酸至终浓度1.1mol/L,在103℃温度下搅拌48min,冷却至室温,过滤后所收集滤液即为豆粕水解液过滤液。
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比8%的种子液,于pH值5.7、温度35℃条件下,按速度0.6L/min通入二氧化碳并搅拌,搅拌转速120rpm,当发酵液中还原糖浓度低于4.6g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环13批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖16g、蛋白胨16g、酵母粉6g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值6、温度35℃条件下搅拌,搅拌速度130rpm,时间16h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸杆菌(产琥珀酸杆菌Actinobacillus succinogenes HGLZD-103);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为纯氨气;
所述微滤装置是装有孔径为0.22μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为300道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
每升纳滤截留液中,加入硫酸,使硫酸终浓度为0.8mol/L,在95℃温度下搅拌4h,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以汽油为萃取溶剂,在90℃温度下萃取4.5h,在压力0.03Mpa、温度65℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素2.17克,琥珀酸25.26克。
实施例7 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
1千克干黄姜块根粉碎后,加入3千克水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度120℃、压力0.1MPa条件下,蒸汽爆破15min,冷却至室温;加入12千克水混匀,加入果胶酶8×104U、纤维素酶1.6×105U;混合均匀,在pH值4.0、温度45℃条件下搅拌20h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中同时加入α-淀粉酶8×103U、糖化酶8×104U,混合均匀后,在温度50℃搅拌20h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到90℃,保温5min,然后冷却至室温,过滤分离收集滤液,所收集滤液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产乳酸的发酵培养基,
生产乳酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖150g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉5g、氮源10g、K2HPO42g,调PH值至5.5;
所述氮源为:玉米浆过滤液;
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比5%的种子液,于pH值5、温度30℃条件下,搅拌,搅拌转速50rpm,当发酵液中还原糖浓度达到1.1g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环4批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值5、温度30℃条件下搅拌,搅拌速度50rpm,时间10h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸杆菌(鼠李糖乳酸杆菌L.rhamnosus HG 09F5-27);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为氢氧化钙溶液;氢氧化钙溶液浓度为450g/L;
所述微滤装置是装有孔径为0.10μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为150道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
所述每升纳滤截留液中,加入硫酸,使硫酸终浓度为1.2mol/L,在105℃温度下搅拌6h,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以石油醚为萃取溶剂,在85℃温度下萃取4h,在压力0.01Mpa、温度60℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素2.03克,乳酸33.20克。
实施例8 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
5千克干黄姜块根粉碎后,加入18千克水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度127℃、压力0.18MPa条件下,蒸汽爆破17min,冷却至室温;加入46千克的水混匀,加入果胶酶5×105U、纤维素酶1.25×106U;混合均匀,在pH值4.8、温度48℃条件下搅拌28h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中先加入同时加入α-淀粉酶7.5×104U、糖化酶7.5×105U,混合均匀后,在温度65℃搅拌30h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到96℃,保温6min,然后冷却至室温,离心分离收集上清液,所收集上清液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产琥珀酸的发酵培养基,
生产琥珀酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖130g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉3g、氮源6g、K2HPO41.7g,调PH值至6.8;
所述氮源为:玉米浆过滤液和豆粕水解液过滤液的组合;
所述豆粕水解液过滤液按如下方法制备:干豆粕加入4倍重量的水,混合均匀,再加入硫酸至终浓度0.9mol/L,在98℃温度下搅拌48min,冷却至室温,过滤后所收集滤液即豆粕水解液过滤液。
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比6%的种子液,于pH值6.5,34℃条件下,按速度0.8L/min通入二氧化碳并搅拌,搅拌转速180rpm,当发酵液中还原糖浓度达到0.5g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环9批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖16g、蛋白胨18g、酵母粉7g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值6.6、温度34℃条件下搅拌,搅拌速度70rpm,时间18h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸杆菌(产琥珀酸杆菌Actinobacillus succinogenes HGLZD-103);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为氢氧化钠溶液;氢氧化钠溶液浓度为500g/L;
所述微滤装置是装有孔径为0.22μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为200道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
所述每升纳滤截留液中加入硫酸,使硫酸终浓度为1.1mol/L,在102℃温度下搅拌5.5h,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以汽油为萃取溶剂,在88℃温度下萃取4.5h,在压力0.04Mpa、温度68℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素2.05克,琥珀酸22.67克。
实施例9 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
10千克鲜黄姜块根磨浆后,加入20千克的水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度130℃、压力0.2MPa条件下,蒸汽爆破20min,冷却至室温;加入120千克水混匀,每克鲜黄姜加入果胶酶4×105U、纤维素酶8×105U,混合均匀,在pH值4.4、温度55℃条件下搅拌29h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中同时加入α-淀粉酶3×104U、糖化酶2.5×105U,混合均匀后,在温度50℃搅拌20h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到96℃,保温7min,然后冷却至室温,离心分离收集上清液,所收集上清液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产琥珀酸的发酵培养基,
生产琥珀酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖140g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉4g、氮源6g、K2HPO41.8g,调PH值至7.0;
所述氮源为:玉米浆过滤液、麸皮水解液过滤液和豆粕水解液过滤液的组合;
所述麸皮水解液过滤液和豆粕水解液过滤液按如下方法制备:干麸皮或者干豆粕加入3倍重量的水,混合均匀,再加入硫酸至终浓度0.8mol/L,在105℃温度下搅拌60min,冷却至室温,过滤后所收集滤液即为麸皮水解液过滤液或豆粕水解液过滤液。
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比10%的种子液,于pH值5、温度35℃条件下,按速度0.8L/min通入二氧化碳并搅拌,搅拌转速170rpm,当发酵液中还原糖浓度低于2g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环11批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖15g、蛋白胨10g、酵母粉10g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值7、温度50℃条件下搅拌,搅拌速度50rpm,时间24h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸杆菌(产琥珀酸杆菌Actinobacillus succinogenes HGLZD-103);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为氨水;氨水浓度为270g/L;
所述微滤装置是装有孔径为0.10μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为400道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
所述每升纳滤截留液中加入硫酸,使硫酸终浓度为1.0mol/L,在100℃温度下搅拌5h,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以汽油为萃取溶剂,在88℃温度下萃取5h,在压力0.02Mpa、温度70℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素1.93克,琥珀酸21.60克。
实施例10 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
10千克鲜黄姜块根磨浆后,加入20千克的水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度130℃、压力0.2MPa条件下,蒸汽爆破20min,冷却至室温;加入120千克水混匀,每克鲜黄姜加入果胶酶4×105U、纤维素酶8×105U,混合均匀,在pH值4.4、温度55℃条件下搅拌29h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中同时加入α-淀粉酶5×104U、糖化酶5×105U,混合均匀后,在温度65℃搅拌30h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到96℃,保温7min,然后冷却至室温,离心分离收集上清液,所收集上清液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产琥珀酸的发酵培养基,
生产琥珀酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖140g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉4g、氮源6g、K2HPO41.8g,调PH值至7.0;
所述氮源为:玉米浆过滤液、麸皮水解液过滤液和豆粕水解液过滤液的组合;
所述麸皮水解液过滤液和豆粕水解液过滤液按如下方法制备:干麸皮或者干豆粕加入3倍重量的水,混合均匀,再加入硫酸至终浓度0.8mol/L,在105℃温度下搅拌60min,冷却至室温,过滤后所收集滤液即为麸皮水解液过滤液或豆粕水解液过滤液。
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比10%的种子液,于pH值5、温度35℃条件下,按速度0.8L/min通入二氧化碳并搅拌,搅拌转速170rpm,当发酵液中还原糖浓度低于2g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环11批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖15g、蛋白胨10g、酵母粉10g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值7、温度50℃条件下搅拌,搅拌速度50rpm,时间24h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸杆菌(产琥珀酸杆菌Actinobacillus succinogenes HGLZD-103);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为氨水;氨水浓度为260g/L;
所述微滤装置是装有孔径为0.10μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为400道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
所述每升纳滤截留液中加入硫酸,使硫酸终浓度为1.0mol/L,在100℃温度下搅拌5h,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以汽油为萃取溶剂,在88℃温度下萃取5h,在压力0.04Mpa、温度70℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素1.97克,琥珀酸21.40克。
实施例11 包括以下步骤:
1.黄姜皂苷释放步骤;
10千克鲜黄姜块根磨浆后,加入20千克的水,得到黄姜与水的混合物;再对黄姜与水的混合物依次进行如下处理:
在温度130℃、压力0.2MPa条件下,蒸汽爆破20min,冷却至室温;加入120千克水混匀,每克鲜黄姜加入果胶酶4×105U、纤维素酶8×105U,混合均匀,在pH值4.4、温度55℃条件下搅拌29h,得到黄姜淀粉溶液;
2.黄姜淀粉糖化步骤;
向所述黄姜淀粉溶液中同时加入α-淀粉酶4×104U、糖化酶4×105U,混合均匀后,在温度58℃搅拌25h,得到黄姜糖化液;
再将所述黄姜糖化液升温到96℃,保温7min,然后冷却至室温,离心分离收集上清液,所收集上清液即为黄姜酶解糖液;
3.发酵培养基配制步骤;
配制生产琥珀酸的发酵培养基,
生产琥珀酸的发酵培养基组成为:将所述黄姜酶解糖液浓度调整为含还原糖140g/L;每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉4g、氮源6g、K2HPO41.8g,调PH值至7.0;
所述氮源为:玉米浆过滤液、麸皮水解液过滤液和豆粕水解液过滤液的组合;
所述麸皮水解液过滤液和豆粕水解液过滤液按如下方法制备:干麸皮或者干豆粕加入3倍重量的水,混合均匀,再加入硫酸至终浓度0.8mol/L,在105℃温度下搅拌60min,冷却至室温,过滤后所收集滤液即为麸皮水解液过滤液或豆粕水解液过滤液。
4.有机酸发酵及皂苷富集步骤;
将发酵培养基送入发酵罐,对微滤装置、纳滤装置、发酵罐、泵以及连接它们的输液管道高温蒸汽灭菌,冷却到室温后,向发酵罐中接入体积比10%的种子液,于pH值5、温度35℃条件下,按速度0.8L/min通入二氧化碳并搅拌,搅拌转速170rpm,当发酵液中还原糖浓度低于2g/L时,发酵结束,用微滤装置过滤发酵液,截留的产有机酸菌细胞送回发酵罐继续使用,同时再向发酵罐中泵入已经灭菌的发酵培养基,进行下一批次发酵,如此循环11批次;每批次微滤装置的滤过液再用纳滤装置过滤,纳滤截留液收集备用,得到的纳滤透过液为有机酸溶液;
所述种子液按如下方法制备:每升水加入葡萄糖15g、蛋白胨10g、酵母粉10g,混合成种子培养基并灭菌,冷却至室温,得到无菌种子培养基;将产有机酸菌种接种于无菌种子培养基,在pH值7、温度50℃条件下搅拌,搅拌速度50rpm,时间24h,得到种子液;所述产有机酸菌种是产有机酸杆菌(产琥珀酸杆菌Actinobacillus succinogenes HGLZD-103);
发酵罐中发酵液pH值通过流加碱性中和剂控制,所述碱性中和剂为氨水;氨水浓度为270g/L;
所述微滤装置是装有孔径为0.10μm滤膜的过滤装置;所述纳滤装置是装有截留分子量为400道尔顿滤膜的过滤装置。
5.皂素制备步骤;
所述每升纳滤截留液中加入硫酸,使硫酸终浓度为1.0mol/L,在100℃温度下搅拌5h,得到黄姜皂素粗液;
再对黄姜皂素粗液以汽油为萃取溶剂,在88℃温度下萃取5h,在压力0.02Mpa、温度70℃条件下蒸馏萃取液去除萃取溶剂,得到黄姜皂素晶体。
生产结果:每100克干黄姜生产出皂素2.11克,琥珀酸21.87。