技术领域
[0001] 本
发明涉及环境保护技术领域，更具体涉及一种降低畜禽粪便中大环内酯类耐药基因丰度的方法。
背景技术
[0002] 由于抗生素滥用而导致的大量抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes，ARGs)的出现和广泛传播已成为21世纪人类健康的重大威胁之一。在关注抗生素在环境中的残留、归趋及毒性作用的同时，ARGs的分布、起源、环境归趋及其对环境、人体健康的影响等亦成为了环境领域的关注焦点。畜禽养殖粪便是环境中日益严重的ARGs负担的主要贡献者。国内外研究者已证实农田施用抗生素残留粪便会大大增加农田中ARGs和耐药菌的数量和种类。然而，以畜禽粪便为原料的有机
肥料是提高
土壤有机质最有效的方式之一。因此，控制畜禽粪便中ARGs的丰度，是降低通过畜禽粪便向土壤环境中传播ARGs的一种极有效的方法。
[0003] 大量研究表明，养殖粪便的
有机肥料生产工艺，例如好
氧堆制、厌氧
发酵、物化消毒等等，除了能提高肥效，还能达到控制和去除大部分污染物的目标。大环内脂类类耐药基因在不同的报道中存在着很大的差别。目前市场上畜禽粪便有机肥料的生产方法多样，不同肥料生产工艺下形成的有机肥料的耐药基因含量也存在较大差异。可见，不同的有机肥生产工艺对畜禽粪便中耐药基因的去除能
力不同。
[0004] 因此，寻找有效的降低畜禽粪便中大环内脂类类耐药基因丰度的方法和工艺参数具有十分重要的意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种降低畜禽粪便中大环内酯类耐药基因丰度的方法。本发明所述方法将自然堆肥与赤子爱胜
蚯蚓堆肥两种方法结合；同时利用了自然堆肥与赤子爱胜蚯蚓堆肥的好处和优点，能够更好的降低畜禽粪便中大环内酯类耐药基因丰度，减少养殖业中的大环内酯类耐药因子向农田环境的释放，降低养殖废弃物资源化利用所带来的环境污染以及人类健康潜在
风险的问题，为养殖源有机肥的安全使用和循环农业的可持续发展提供保障。
[0006] 本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
[0007] 一种降低畜禽粪便中大环内酯类耐药基因丰度的方法，包括以下过程：
[0008] S1.调整控制新鲜畜禽粪便的含
水率为60～70％；然后加入秸秆
片段，并控制混合物料的含水率为50～60％；
[0009] S2.将步骤S1中的混合物料进行自然预堆肥15～20d；然后将堆肥物料铺设成为高15～18cm；
[0010] S3.向S2的堆肥物料中按照
密度为7000～8000条/m3接种赤子爱胜蚯蚓，然后在堆肥物料表面铺设一层厚度为2～3cm的土壤；并控制堆肥物料的含水率为60～70％；
[0011] S4.接种赤子爱胜蚓的堆肥物料置于阴凉
通风处，
温度保持在22～27℃，定期补水保持物料含水率，每隔三天进行翻堆保持通气，堆肥为期20～25天。
[0012] 蚯蚓堆肥是一种利用蚯蚓和堆肥物料中的
微生物共同作用以改善
有机废物的分解和稳定，并将其转换成
腐蚀质的堆肥处理。蚯蚓堆肥利用了蚯蚓挖穴、
摄食等活动，能有效改善土壤性质，同时蚯蚓以有机质为食，其前肠消化酶、体液会对畜禽粪便中的微生物产生影响，因此对畜禽粪便中的微
生物群落结构有重大影响。
[0013] 赤子爱胜蚯蚓(Eisenia foetida)属于正蚓科，爱胜蚓属，生长期短，繁殖能力强，
蛋白质含量高，食性广泛，饲养容易，适宜人工养殖，经济效益高，是目前世界上养殖最普遍的蚯蚓良种，其广泛应用于
农药毒性检测、生态环境检测等试验中，是生态毒理学研究中的模式物种。
[0014] 本发明所述方法将自然堆肥与赤子爱胜蚯蚓堆肥两种方法结合，其中自然堆肥一方面能够降低畜禽粪便中的一部分大环内酯类耐药基因的丰度，改变堆肥基质；一方面能够减少畜禽粪便中对赤子爱胜蚯蚓有毒害作用的生物和物质，使畜禽粪便更适合赤子爱胜蚯蚓的生存和活动；将两种方法结合使用，能够更好的降低畜禽粪便中大环内酯类耐药基因丰度。同时，赤子爱胜蚯蚓由于其含有的蛋白质高，当畜禽粪便堆肥发酵结束后，可将赤子爱胜蚯蚓风干
研磨后制成的蚯蚓粉可作为畜禽
饲料进行循环利用，经济效益高。
[0015] 优选地，步骤S1中，加入秸秆片段前畜禽粪便的含水率为60％。
[0016] 优选地，步骤S1中，混合物料中畜禽粪便与秸秆片段的
质量比为6.5～7.5:2.5～3.5；所述秸秆片段的长度为2～3cm。在畜禽粪便自然堆肥前，特定长度和质量的秸秆片段作为去除大环内酯类耐药基因的重要调理剂加入到畜禽粪便，可以
加速降低畜禽粪便自然堆肥后，堆肥物料中大环内脂类耐药基因的含量。
[0017] 更优选地，步骤S1中，混合物料中畜禽粪便与秸秆片段的质量比为7:3；所述秸秆片段的长度为2cm。
[0018] 优选地，步骤S2中，混合物料进行自然堆肥15d。自然堆肥是在通风处将新鲜猪粪堆置垒高进行好氧堆肥，每隔三天翻堆一次保持粪堆内空气流通。堆肥物料的高度为15～18cm。将堆肥物料铺设成为15～18cm厚，这一厚度是依据赤子爱胜蚯蚓的生活习性决定，便于赤子爱胜蚯蚓的生存和活动。
[0019] 优选地，步骤S3中，赤子爱胜蚯蚓的接种密度为7000～7500条/m3。
[0020] 优选地，所述赤子爱胜蚯蚓的体重为0.5～1.2g/条。
[0021] 优选地，步骤S4中蚯蚓堆肥时间为25天。
[0022] 优选地，所述畜禽粪便为猪粪便、
牛粪便、
马粪便、鸡粪便、鸭粪便或鹅粪便。
[0023] 与
现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0024] 本发明所述方法将自然堆肥与赤子爱胜蚯蚓堆肥两种方法结合，同时利用自然堆肥与赤子爱胜蚯蚓堆肥的好处和优点，两种堆肥方法相互有利，更好的降低畜禽粪便中大环内酯类耐药基因丰度，减少养殖业中的大环内酯类耐药因子向农田环境的释放，降低养殖废弃物资源化利用所带来的环境污染以及人类健康潜在风险的问题，为养殖源有机肥的安全使用和循环农业的可持续发展提供保障。
[0025] 同时，赤子爱胜蚯蚓由于其含有的蛋白质高，当畜禽粪便堆肥发酵结束后，可将赤子爱胜蚯蚓风干研磨后制成的蚯蚓粉可作为畜禽饲料进行循环利用，经济效益高。
具体实施方式
[0026] 下面结合具体
实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、
试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0027] 以下实施例中应用的畜禽粪便为农户散养型肉猪的猪粪，表观为黑褐色，较湿，臭味重，湿度为75％。
[0028] 实施例1
[0029] 一种降低畜禽粪便中大环内酯类耐药基因丰度的方法，处理过程为：
[0030] (1)将采集的新鲜猪粪自然风干，降低其含水率；然后加入长度约为2～3cm的秸秆片段，并控制混合物料的含水率；
[0031] (2)将步骤(1)中的混合物料进行自然堆肥；自然堆肥结束后将堆肥物料铺设成为高15～18cm；
[0032] (3)向步骤(2)的堆肥物料中接种赤子爱胜蚯蚓，然后在堆肥物料表面铺设一层厚度为2～3cm的土壤；并控制堆肥物料的含水率；
[0033] (4)接种赤子爱胜蚓的堆肥物料置于阴凉通风处，温度保持在22～27℃，定期补水保持物料含水率60～70％，每隔三天进行翻堆保持通气，堆肥为期20～25天。
[0034] 1、蚯蚓种类的选择
[0035] 测试蚯蚓的种类有3种，分别为赤子爱胜蚯蚓(Eisenia foetida)：属于正蚓科，爱胜蚓属，体长35-130毫米，一般短于70毫米，宽3-5毫米。
[0036] 参环毛蚓(Pheretima aspergillum)：又名广地龙，该品种个体较大，长120～400毫米，喜南方
气候，食肥沃土壤。
[0037] 白茎环毛蚓(Pheretima tschiliensis)：体长80～150毫米，喜南方气候和在肥沃的菜地、红薯田中生活。
[0038] 参照上述的方法，其中步骤(1)中猪粪的含水率为60％～70％，加入秸秆片段之后，含水率为50％～60％，且猪粪与秸秆片段的质量比为6.5～7.5:2.5～3.5。
[0039] 步骤(2)中自然堆肥时间为12～15天；然后将物料分装于不同的容器中，容器为直径20cm，高度20cm的敞口塑料圆柱形容器中。
[0040] 步骤(3)中，不同的容器中分别接种不同种的蚯蚓，按照蚯蚓种类不同，每一种蚯蚓接种5个容器，每个容器中接种45条，然后进行观察和堆肥。
[0041] 结果发现3种蚯蚓放入容器中后，出现大量逃逸的情况。为解决这一问题，在接种蚯蚓之后，分别在每个容器表面铺设2～3cm的正常土壤，然后进行观察和堆肥。
[0042] 结果，参环毛蚓和白茎环毛蚓仍然出现大量逃逸，表明这两种蚯蚓无法在猪粪环境中生存；而赤子爱胜蚯蚓则几乎不出现大量逃逸，表明赤子爱胜蚯蚓能够在猪粪环境中生存，则后续的试验中均采用赤子爱胜蚯蚓进行。
[0043] 2、大环内酯类耐药基因检测
[0044] 猪粪中大环内酯类耐药基因以ermA、ermB和ermF为检测对象，具体的检测过程为：
[0045] (1)猪粪样品采集后于-20℃保存，
冷冻干燥后备用；
[0046] (2)取冷冻干燥后的样品0.5g，按照Omega EZNATM soil DNA
试剂盒(Omega公司)说明提取DNA；
[0047] (3)随后以有机肥基因组DNA为模板，采用表2中所示的引物(表1引物序列为大环内脂类抗性基因引物序列，Koike S et al.,2010)进行
荧光定量PCR(qPCR)。荧光定量PCR扩增采用Takara公司提供的试剂盒MightyAmpTM for Realtime PCR Kit，ABI StepOnePlusTM实时荧光定量PCR仪。采用NanoDrop微量分光光度计对标准质粒DNA的浓度进行测定，建立质粒拷贝数与CT值对应关系的标准曲线。所有抗性基因标准曲线线性相关性良好(R2>0.99)，qPCR扩增效果(E)在99％～110％之间，可以用于目标基因的定量分析。
[0048] 利用参照基因16SrDNA对样品中的耐药基因进行校正：耐药基因相对丰度＝耐药基因绝对拷贝数/16SrDNA基因绝对拷贝数。
[0049] 表1供试引物序列
[0050]
[0051] 3.不同处理对畜禽粪便中大环内脂类耐药基因的影响
[0052] 设置4个处理组，其中处理组1为自然堆肥，具体为对猪粪进行通风、加水保持含水率在60～70％；
[0053] 处理组2为自然堆肥+秸秆处理，具体为猪粪在自然堆肥前按照猪粪与秸秆片段的质量比为7：3进行混合，然后再进行自然堆肥；
[0054] 处理组3为自然堆肥+蚯蚓+自然堆肥，具体为猪粪自然堆肥20-25天之后，按照7000～8000条/m3的密度接种赤子爱胜蚓，然后再进行自然堆肥；
[0055] 处理组4为自然堆肥+秸秆+蚯蚓，具体为猪粪在自然堆肥前按照猪粪与秸秆片段的质量比为7：3进行混合，然后再进行自然堆肥20-25天，堆肥结束后，按照7000～8000条/m3的密度接种赤子爱胜蚓，然后再进行自然堆肥。
[0056] 同时设置空白对照组，具体为猪粪采集回来后在通风处放置即可，不做任何处理。
[0057] 上述每个处理设置3个重复组，分别于第0、10、20、25、30天采集猪粪样品，进行大环内脂类耐药基因丰度测定，结果记录如表2所示。
[0058] 表2各处理组猪粪中大环内脂类耐药基因丰度的变化
[0059]
[0060] 分析表2中的数据发现，当处理时间为30天时，所有处理组的基因丰度都有所上升，因此自然堆肥阶段应持续20～25天为宜。
[0061] 通过比较处理组1和空白对照组，发现空白对照组25天后，ermA的基因丰度上升，而ermB、ermF基因丰度均有一定程度的下降，而与空表对照组相比较，处理组1处理第25天后，猪粪中的ermA、ermB、ermF的基因丰度均有一定程度的下降，且ermB、ermF基因丰度的下降程度高于空白处理组，表明自然堆肥具有降低猪粪中ermA、ermB、ermF基因丰度的作用，且自然堆肥也是蚯蚓堆肥前重要的必经工序，预实验发现蚯蚓接种在不经过短期自然堆肥的新鲜猪粪中会出现逃窜甚至死亡。
[0062] 通过比较空白对照组，处理组1和2，发现经处理组3处理第20～25天，猪粪中ermA、ermB、ermF基因相对丰度显著降低；相较于直接进行自然堆肥，添加秸秆之后在进行自然堆肥，猪粪中ermA、ermB、ermF基因丰度的下降效果更好，其原因为秸秆可能通过调整堆肥物料的
碳氮比达到一定降低耐药基因的效果，同时，合适的碳氮比对蚯蚓的生存繁殖有积极影响，对下一步蚯蚓堆肥
进程有积极作用。
[0063] 通过比较空白对照组，处理组1、2和3，发现经过处理组3处理第20～25天后，猪粪中ermA、ermB、ermF基因相对丰度下降的程度明显优于处理组1和2，表明自然堆肥后进行蚯蚓堆肥处理对猪粪中大环内脂类耐药基因有削减作用，效果对比处理组1有一定增强，对比处理组2也有一定增强。
[0064] 通过比较空白对照组，处理组1、2、3和4，发现经处理组4处理第20～25天后，猪粪中ermA、ermB、ermF基因相对丰度下降的最为显著，3种基因丰度的下降程度明显优于处理组1、2和3；可见先在猪粪中加入秸秆进行预堆肥，然后接种一定量的赤子爱胜蚓之后再次进行自然堆肥，且两次自然堆肥时间都控制在20-25天，对于猪粪中ermA、ermB、ermF基因相对丰度的下降最为有效。
[0065] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的
基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明
权利要求的保护范围之内。
