技术领域
[0001] 本
发明涉及一种酶法催化高产α-酮异己酸的方法，属于
生物工程技术领域。
背景技术
[0002] α-酮异己酸(KIC)，
别名酮亮
氨酸，是支链氨基酸亮氨酸的前体物质，是重要的有机合成，药物合成中间体，广泛应用在制药、食品和化学工业。目前KIC的生产方法包括化学合成法、
发酵法和生物催化法。化学合成法主要包括乙酰氨基
肉桂酸水解法、乙内酰脲与苯甲
醛合成法和海因法。但化学合成法对设备要求高，例如高温、高压等，产品得率低，后期分离纯化难度大，并且有的合成过程中会产生有毒有害的物质，对环境造成了污染。目前，有文献报道KIC可以直接通过谷氨酸棒杆菌发酵生产，但是产量只有9.23g/L，不仅产量低，而且发酵成本高，发酵过程会产生不同种类的副产物，不利于后期产品的分离纯化。2015年，有研究者建立了酶法转化亮氨酸生产α-酮异己酸这一路径，最高产量可以达到69.1g/L，但转化率为50.3％，不适于大规模的工业化生产。
[0003] L-氨基酸脱氨酶(L-AADs,EC1.4.3.2)又名L-氨基酸
氧化酶(L-AAO)，多为黄素蛋白，二聚体结构，每个亚基非共价结合一个黄素嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子。L-AADs能特异性催化L-氨基酸氧化脱氨基，经过亚氨基中间体，生成相应的
酮酸和氨，还
原型辅因子(FADH2)经再次氧化生成过氧化氢或水。L-AADs广泛存在于
哺乳动物、蛇毒、昆虫毒素、海兔、
真菌、细菌及藻类中。蛇毒L-AADs是这类酶家族中被研究最透彻的成员，但是由于制备困难，较难大规模使用。来自于细菌和真菌的L-AADs对大部分氨基酸具有催化活性，但是反应过程中生成过氧化氢，对细胞有毒害作用，不利于转化的进行。来自于奇异
变形杆菌(Proteus mirabilis)的脱氨酶其
定位在细胞膜当中，这类酶与细胞膜上的
电子传递链相关，电子经过电子传递链传递给细胞色素氧化酶，使分子氧还原为水，该过程不产生过氧化氢，这为异源表达氨基酸脱氨酶转化L-亮氨酸生产α-酮异己酸提供了可能。
发明内容
[0004] 本发明旨在通过异源表达一种L-AAD用于全细胞转化生产α-酮异己酸，这种转化生产过程条件温和，对设备要求低，只需一步反应，简便快捷，效率高。转化的过程中不用额外添加其他化学物质或者生物辅因子，降低了成本，减轻了对环境的污染。反应具有高选择性，产品纯度高，方便后期的分离与纯化，有利于大规模的工业化生产。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种产氨基酸脱氨酶的基因工程菌，能够表达SEQ ID NO.1所示的编码氨基酸脱氨酶的基因。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任意一种。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列的质粒为表达载体。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET-28a(+)为表达载体。
[0010] 本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌在食品、生物、医药领域的应用。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种构建高产α-酮异己酸的重组菌的方法，是表达了来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶，编码所述脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述构建方法是以Proteus mirabilis HI4320的基因组为模板，PCR扩增获得L-氨基酸脱氨酶基因，连接到表达载体pET-28a(+)中，将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)，筛选得到阳性转化子。
[0013] 本发明的第四个目的是提供一种生产α-酮异己酸的方法，所述方法是以所述基因工程菌为生物催化剂，全细胞转化含有L-亮氨酸的底物。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是将LB培养基中的
种子培养液按2％接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.4mM的IPTG，25℃诱导12h，收集湿细胞，以5-40g/L湿细胞、50-65g/L底物L-亮氨酸，在20-45℃条件下，转化4-24h。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述底物L-亮氨酸的浓度为65g/L。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述细胞浓度为20g/L。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述转化是30℃下转化20h。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述底物L-亮氨酸的浓度为65g/L，所述细胞浓度为20g/L。所述转化是30℃下转化20h。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，用于发酵的种子培养基每L含有：蛋白胨10g，
酵母粉3g，NaCl10g，蒸馏水定容。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，用于发酵的发酵培养基每L含有：胰蛋白胨12g，酵母膏24g，甘油4g，
磷酸二氢
钾2.31g，
磷酸氢二钾16.42g，蒸馏水定容。
[0021] 本发明还提供所述基因工程菌在食品、医药和化工领域制备含α-酮异己酸或其上下游产品方面的应用。
[0022] 有益效果：本发明实现了来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶在大肠杆菌中的异源表达，并且以此重组菌株转化L-亮氨酸生产α-酮异己酸。与现有的技术相比，本发明采用的方法，反应条件温和，对设备要求低，过程迅速，仅需20h，产量就能达到61.5g/L，摩尔转化率为95.7％。因此反应得到的产物纯度高，方便后期的分离与纯化，大大降低了生产α-酮异己酸的成本，有助于工业化大规模的生产。本发明大幅度提高了底物L-亮氨酸的利用率，增加了生产效益。
附图说明
[0023] 图1产物HPLC分析图谱：a，α-酮异己酸标准品；b，转化20h后的转化液。
[0024] 图2全细胞转化优化结果图：(a)，菌体量对转化的影响；(b)，底物浓度对转化的影响；(c)，转化
温度对转化的影响；(d)，转化时间对转化的影响。
具体实施方式
[0025] 种子培养基：蛋白胨10g，酵母粉3g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1L。
[0026] 发酵培养基：胰蛋白胨12g，酵母膏24g，甘油4g，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g，蒸馏水定容至1L。
[0027] 补料培养基：400g/L甘油，100g/L安琪酵母粉FM802，25g/L胰蛋白胨，配制200mL/罐，121℃灭菌20min；
[0028] 样品制备：取1mL转化后的溶液，离心机12,000rpm离心5min，取上清液经一定倍数稀释后，过0.22μm水系
膜过滤，滤液作为用来液相色谱分析。
[0029] α-酮异己酸含量的测定：戴安高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)，采用伯乐Aminex HPX-87H(300×7.8mm，9μm)色谱柱，流动相为浓度0.005M的H2SO4，流动相经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流速为0.6mL/min，柱温为35℃，在紫外检测
波长210nm下检测。
[0030] 转化率的计算：
[0031]
实施例1 L-氨基酸脱氨酶重组质粒的构建
[0032] 以Pr oteus mira bili s HI 4320的 基因组为 模板 ，以5’cgcggatccatgaacatttcaaggagaaagctac3’为正向引物，以5’
ccgctcgagcttcttaaaacgatccaaactaa3’为反向引物，(划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点)扩增获得的目的基因，所得目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR产物经过回收后酶切与表达载体pET-28a(+)相连接，构建获得重组质粒pET-28a-pma。
[0033] 实施例2重组大肠杆菌的构建
[0034] 将实施例1种重组质粒pET-28a-pma通过化学转化法转入克隆宿主E.coli JM109，挑取在LB卡那抗性平板上生长的单菌落，进行菌落PCR验证，然后挑选阳性转化子接种培养并提取质粒，双酶切验证正确后送去测序，序列正确的转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。
[0035] 实施例3重组大肠杆菌诱导表达L-氨基酸脱氨酶
[0036] 将实施例2中的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)从平板上挑取单菌落，接种到种子培养基中，过夜培养，以2％(v/v)的接种量转接到100mL发酵培养基，37℃、200rpm/min培养至OD600为0.6-0.8左右，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，25℃下诱导12h后收集菌体用于全细胞转化。
[0037] 实施例4重组大肠杆菌全细胞转化L-亮氨酸条件的优化
[0038] 以水作为全细胞转化的介质，转化的条件：
[0039] L-亮氨酸浓度为50g/L时，加入不同浓度的菌体(5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L)，37℃转化24h，结果如图2(a)所示，细胞浓度为20～40g/L时，产量达47.5～49.9g/L，转化率超过86.7％；当细胞浓度为40g/L时，产量为43.8g/L，转化率87.6％。当细胞浓度为20g/L，产量达到47.5g/L，转化率为96.1％。
[0040] 当细胞浓度为20g/L时，分别在不同浓度L-亮氨酸(55g/L、60g/L、65g/L、70g/L)条件下，37℃转化24h，，结果如图2(b)所示，L-亮氨酸浓度为55～65g/L时，产量达到47.5～56.6g/L，转化率超过80.1％；L-亮氨酸浓度为65g/L，产量达到56.6g/L，转化率为95.5％。
[0041] 在细胞浓度为20g/L，L-亮氨酸浓度为65g/L的条件下，分别在不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)下进行转化，结果如图2(c)所示，转化温度为20～40℃时，产量达到54.5～60.9g/L，转化率超过84.9％；转化温度为30℃时，产量达到60.9g/L，转化率达95％。
[0042] 在细胞浓度为20g/L，L-亮氨酸浓度为65g/L，转化温度为30℃时，比较不同转化时间对转化效果的影响，结果如图2(d)所示，转化时间为超过12h时，产量可以达到49.8g/L以上；转化时间为20h时，产量可以达到61.5g/L，转化率为95.7％，
时空产率为3.1g/L/h。
[0043] 实施例5 5L
发酵罐上进行全细胞转化L-亮氨酸生产α-酮异己酸
[0044] 发酵条件：初始装培养基3L，温度37℃，接种量5％，整个发酵过程中pH自然，搅拌转速600r/min，通气量1.0vvm，发酵2h菌体OD600为2.9～3.1，加入5g/L乳糖开始诱导培养，发酵5-6h菌体OD600为12.0～14.0，开始恒速补料，(补料培养基：400g/L甘油，100g/L安琪酵母粉FM802，25g/L胰蛋白胨，配制200mL/罐，121℃灭菌20min)。
[0045] 控制补料速率为14mL/h，发酵13h菌体OD600为28.0～30.0，结束发酵，收集菌体用于转化。
[0046] 转化条件：发酵罐搅拌转速为700rpm,通气量为1.5vvm，转化液pH控制为8.0，
温度控制为30℃，当底物投量为65g/L,菌体量为20g/L。4h达到最大产量，达到62.2g/L,转化率96.9％，生产强度达到15.6g/L/h。
[0047] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以
权利要求书所界定的为准。
