丙型肝炎病毒体外复制模型及其构建方法与应用
阅读：744发布：2024-01-28
专利汇可以提供丙型肝炎病毒体外复制模型及其构建方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种HCV体外复 制模 型及其构建方法与应用，其目的是提供一种具有较高HCV复制率、能够传代培养并接近自然感染状态的HCV体外感染细胞模型。同时提供了一种构建该体外复制模型的方法，即将几种HCV感染阳性血清混合用离心法接种体外培养的细胞系，然后改变HCV培养基中 铁 离子的浓度，使HCV高 水 平复制，经过多次病毒传代，得到HCV体外复制模型。可采用免疫学方法及核酸杂交方法检测。该模型可用于构建丙型 肝炎 病毒动物感染模型、丙型肝炎病毒复制机制研究、药物筛选和 疫苗 研制。，下面是丙型肝炎病毒体外复制模型及其构建方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种丙型肝炎病毒体外复制模型，其特征是感染了丙型肝炎病毒的体外 培养细胞。
2.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒体外复制模型，其特征在于：宿主 细胞为哺乳类细胞，包括肝源细胞、淋巴源细胞、肾源细胞、精子细胞。
3.一种如权利要求1或2所述的丙型肝炎病毒体外复制模型的构建方法， 包括以下步骤：
(1)筛选接种物；
(2)筛选敏感宿主细胞株；
(3)进行病毒接种与培养；
(4)优化病毒培养条件；
(5)细胞培养适应毒株的获得；
其中所述步骤(1)是将一个或一个以上丙型肝炎病毒感染患者血清混合； 所述步骤(2)中的敏感宿主细胞株为哺乳类细胞，包括肝源细胞、淋巴源 细胞、肾源细胞、精子细胞的一种；所述步骤(3)是以振摇法常温进行接 种，吸附后，离心法进行培养；所述步骤(4)是常规细胞培养基成分中含 有10-300μM的铁离子；所述步骤(5)是HCV感染细胞裂解上清液反复感 染正常宿主细胞，并经多次培养以获得体外细胞培养适应毒株。
4.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒体外复制模型的用途，该模型用 于筛选抗丙型肝炎病毒药物。
5.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒体外复制模型的用途，该模型用 于丙型肝炎病毒复制机制研究。
6.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒体外复制模型的用途，该模型用 于制备接种物，构建丙型肝炎病毒动物感染模型。
7.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒体外复制模型的用途，该模型用 于制备丙型肝炎病毒免疫疫苗。
技术领域
本发明涉及丙型肝炎病毒体外复制模型及其构建方法与应用，属于病 毒学技术及医药生物技术领域。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，简称：HCV)是单股正链RNA病 毒，属黄病毒家族。HCV引起的丙型肝炎是一种严重威胁人类健康的传染 病，全球统计有1.7亿人受到感染，而且每年新增300～400万例患者。由 于HCV容易变异，迄今还没有疫苗问世，这使得丙型肝炎的危害从某种意 义上说比乙肝更为严重。
现有技术中，丙型肝炎病毒基因组长约9.6kb，由相对较长的5’ NCR(341nt)、一个大的开放读码框、较短的3’NCR及polyA或polyU构成。 HCV的5’NCR在所有HCV分离株中是最保守的区域，属非编码区，含有内 在IRES，它可能介导多聚蛋白前体的帽非依赖性翻译，属调控单位；同属 非编码区的3’NCR对HCV的复制起重要作用。编码区含有结构蛋白和非结 构蛋白，仅有一个起始密码子，翻译成一个多聚蛋白前体，由病毒和宿主 的酶分别对该蛋白进行切割；其中，来自宿主的酶切割ns3编码的NS3病 毒酶类，再由病毒酶类对其它蛋白进行切割；ns5b基因编码病毒的NS5B 蛋白，具有RdRp活性，是HCV复制的关键酶。HCV在细胞内的复制是以正 链为模板复制出其中间体负链，再以负链为模板复制出其正链，因此HCV 负链的存在是HCV复制的标志。
现有技术中，HCV在被感染组织和血清中浓度较低，长期以来缺乏合适 的细胞培养系统和实用的动物模型。
HCV体外感染细胞模型对于深入认识HCV病原学特点、病毒复制机制及 致病机理、HCV保护性抗原的鉴定、疫苗研制及特异性抗HCV药物筛选等 是极为重要的工具。为此，国内外学者作了大量探索，主要有HCV感染细 胞模型和HCV转基因细胞模型两大类。HCV是一种嗜肝性病毒，人们首先 选用肝源性细胞来建立模型；此外，临床上发现HCV还可以侵犯肝外组织 如外周血细胞、肾细胞、精子细胞等。但这些HCV复制模型中，普遍存在 复制率低、周期长、不能用常规核酸杂交技术检测病毒复制，而仅靠RT-PCR 测定正、负链的合成。另外，人们试图加强复制采用基因转染的方法构建 的HCV复制模型大都没有肯定的病毒颗粒形成。因此提高HCV在体外培养 细胞中的感染率，尤其获得能够传代培养的适应体外细胞培养的毒株，为 HCV复制机制、药物筛选和疫苗研制提供接近自然感染状态的理想细胞模 型是本领域内研究人员急需解决的课题之一。
现有技术中，丙型肝炎病毒基因组长约9.6kb，由相对较长的5’ NCR(341nt)、一个大的开放读码框、较短的3’NCR及polyA或polyU构成。 HCV的5’NCR在所有HCV分离株中是最保守的区域，属非编码区，含有内 在IRES，它可能介导多聚蛋白前体的帽非依赖性翻译，属调控单位；同属 非编码区的3’NCR对HCV的复制起重要作用。编码区含有结构蛋白和非结 构蛋白，仅有一个起始密码子，翻译成一个多聚蛋白前体，由病毒和宿主 的酶分别对该蛋白进行切割；其中，来自宿主的酶切割ns3编码的NS3病 毒酶类，再由病毒酶类对其它蛋白进行切割；ns5b基因编码病毒的NS5B 蛋白，具有RdRp活性，是HCV复制的关键酶。HCV在细胞内的复制是以正 链为模板复制出其中间体负链，再以负链为模板复制出其正链，因此HCV 负链的存在是HCV复制的标志。
现有技术中，HCV在被感染组织和血清中浓度较低，长期以来缺乏合适 的细胞培养系统和实用的动物模型。
HCV体外感染细胞模型对于深入认识HCV病原学特点、病毒复制机制及 致病机理、HCV保护性抗原的鉴定、疫苗研制及特异性抗HCV药物筛选等 是极为重要的工具。为此，国内外学者作了大量探索，主要有HCV感染细 胞模型和HCV转基因细胞模型两大类。HCV是一种嗜肝性病毒，人们首先 选用肝源性细胞来建立模型；此外，临床上发现HCV还可以侵犯肝外组织 如外周血细胞、肾细胞、精子细胞等。但这些HCV复制模型中，普遍存在 复制率低、周期长、不能用常规核酸杂交技术检测病毒复制，而仅靠RT-PCR 测定正、负链的合成。另外，人们试图加强复制采用基因转染的方法构建 的HCV复制模型大都没有肯定的病毒颗粒形成。因此提高HCV在体外培养 细胞中的感染率，尤其获得能够传代培养的适应体外细胞培养的毒株，为 HCV复制机制、药物筛选和疫苗研制提供接近自然感染状态的理想细胞模 型是本领域内研究人员急需解决的课题之一。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种接近自然感染状态的丙型肝炎病毒体 外复制模型。
本发明提供的丙型肝炎病毒体外复制模型，是感染了人丙型肝炎病毒的 体外培养细胞，其中的丙型肝炎病毒来自丙型肝炎患者血清。该丙型肝炎 病毒体外复制模型是人丙型肝炎病毒多次在宿主细胞上活化、传代而获得 的具有较高复制率的感染细胞。所述宿主细胞为哺乳类细胞，包括肝源细 胞、淋巴源细胞、肾源细胞、精子细胞等。其中优选宿主细胞为肾源细胞、 肝源细胞、淋巴源细胞。
本发明的另一个目的在于提供一种构建丙型肝炎病毒体外感染复制模 型的方法。
本发明提供的丙型肝炎病毒体外复制模型的构建方法，是通过以下技 术方案实现的：
1.选择一种病毒接种方法，将1个及以上丙型肝炎病毒感染患者血清混 合，以振摇法进行接触、吸附，以离心法进行培养。
2.选择一种培养基，该培养基含有促进丙型肝炎病毒复制的铁离子。
3.选用感染细胞裂解上清液反复感染正常宿主细胞，经多次培养以获得具 有较高感染率、能引起细胞形态改变的丙型肝炎病毒毒株。
本发明所述的丙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法，具体有如下步 骤：
(1)筛选接种物；
(2)筛选敏感宿主细胞株；
(3)进行病毒接种与培养；
(4)优化病毒培养条件；
(5)细胞培养适应毒株的获得；
其中所述步骤(1)是将一个或一个以上丙型肝炎病毒感染患者血清混合； 所述步骤(2)中的敏感宿主细胞为哺乳类细胞，包括肝源细胞、淋巴源细 胞、肾源细胞、精子细胞的一种；所述步骤(3)是以振摇法常温进行接种， 吸附后，离心法进行培养；所述步骤(4)是常规细胞培养基成分中含有 10-300μM的铁离子；所述步骤(5)是HCV感染细胞裂解上清液反复感染 正常宿主细胞，并经多次培养以获得体外细胞培养适应毒株。
本发明优点在于：本发明所述的丙型肝炎病毒体外复制模型是采用现 有的病毒学技术，并在此基础上对接种病毒的种类、接种方法、培养基成 分进行了改造，从而获得能够进行体外传代，且能保持较高复制效率的丙 型肝炎病毒体外复制模型，并获得了体外细胞培养适应株。可以采用免疫 细胞化学及核酸杂交技术检测到该复制模型中丙型肝炎病毒特异性抗原的 表达及丙型肝炎病毒正、负链的表达。
本发明所述的丙型肝炎病毒复制模型的构建方法首次设计了上述(1)— —(4)重要步骤：筛选含高滴度的HCV-RNA阳性血清，采用离心培养法，获 得的初次体外感染细胞裂解上清液再感染正常宿主细胞，并改变HCV培养 液中铁离子浓度以提高复制率。本发明首次设计的上述(1)——(4)步骤，其 方法简便，切实可行；该步骤中的接种物选择方式、接种方法，可以缩短 HCV感染时间；首次设计的该上述丙型肝炎病毒培养基增加了体外细胞中 丙型肝炎病毒的复制水平。本发明在上述步骤(2)中的细胞可以是肝源细胞、 淋巴源细胞、肾源细胞及精子细胞。
本发明的复制模型已通过鉴定，并利用其进行抗丙型肝炎病毒药物筛 选及疫苗研究。
附图说明
图1为丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞RT-PCR分析图。
M：DNA Marker，DL2000；1：正链RNA的RT-PCR；2：负链RNA的 RT-PCR；
3，4：对照细胞RNA的RT-PCR
图2为丙型肝炎病毒(HCV)阳性血清体外感染Vero细胞原位杂交结 果图
A：正链探针原位杂交10×， B：正链探针原位杂交25×
C：负链探针原位杂交10×， D：负链探针原位杂交25×
图3为丙型肝炎病毒(HCV)阳性及阴性血清体外接种Vero细胞免疫 细胞化学检测图。
A：阴性对照Vero细胞；B：感染Vero细胞
图4 HCV阳性血清体外感染HepG2细胞免疫细胞化学检测图
图5为感染细胞裂解上清感染正常Vero细胞原位杂交结果图
A：正链探针原位杂交10×， B：正链探针原位杂交25×
C：负链探针原位杂交10×， D：负链探针原位杂交25×
图6为感染细胞裂解上清感染正常Vero细胞免疫细胞化学检测图。
图7为复苏第8代HCV感染的Vero细胞免疫细胞化学检测图
图8为获得的适应株HCV感染Vero细胞的形态
A：为正常短梭型Vero细胞，B：为感染长梭型Vero细胞
本发明提供的丙型肝炎病毒体外复制模型，是感染了人丙型肝炎病毒的 体外培养细胞，其中的丙型肝炎病毒来自丙型肝炎患者血清。该丙型肝炎 病毒体外复制模型是人丙型肝炎病毒多次在宿主细胞上活化、传代而获得 的具有较高复制率的感染细胞。所述宿主细胞为哺乳类细胞，包括肝源细 胞、淋巴源细胞、肾源细胞、精子细胞等。其中优选宿主细胞为肾源细胞、 肝源细胞、淋巴源细胞。
本发明的另一个目的在于提供一种构建丙型肝炎病毒体外感染复制模 型的方法。
本发明提供的丙型肝炎病毒体外复制模型的构建方法，是通过以下技 术方案实现的：
1.选择一种病毒接种方法，将1个及以上丙型肝炎病毒感染患者血清混 合，以振摇法进行接触、吸附，以离心法进行培养。
2.选择一种培养基，该培养基含有促进丙型肝炎病毒复制的铁离子。
3.选用感染细胞裂解上清液反复感染正常宿主细胞，经多次培养以获得具 有较高感染率、能引起细胞形态改变的丙型肝炎病毒毒株。
本发明所述的丙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法，具体有如下步 骤：
(1)筛选接种物；
(2)筛选敏感宿主细胞株；
(3)进行病毒接种与培养；
(4)优化病毒培养条件；
(5)细胞培养适应毒株的获得；
其中所述步骤(1)是将一个或一个以上丙型肝炎病毒感染患者血清混合； 所述步骤(2)中的敏感宿主细胞为哺乳类细胞，包括肝源细胞、淋巴源细 胞、肾源细胞、精子细胞的一种；所述步骤(3)是以振摇法常温进行接种， 吸附后，离心法进行培养；所述步骤(4)是常规细胞培养基成分中含有 10-300μM的铁离子；所述步骤(5)是HCV感染细胞裂解上清液反复感染 正常宿主细胞，并经多次培养以获得体外细胞培养适应毒株。
本发明优点在于：本发明所述的丙型肝炎病毒体外复制模型是采用现 有的病毒学技术，并在此基础上对接种病毒的种类、接种方法、培养基成 分进行了改造，从而获得能够进行体外传代，且能保持较高复制效率的丙 型肝炎病毒体外复制模型，并获得了体外细胞培养适应株。可以采用免疫 细胞化学及核酸杂交技术检测到该复制模型中丙型肝炎病毒特异性抗原的 表达及丙型肝炎病毒正、负链的表达。
本发明所述的丙型肝炎病毒复制模型的构建方法首次设计了上述(1)— —(4)重要步骤：筛选含高滴度的HCV-RNA阳性血清，采用离心培养法，获 得的初次体外感染细胞裂解上清液再感染正常宿主细胞，并改变HCV培养 液中铁离子浓度以提高复制率。本发明首次设计的上述(1)——(4)步骤，其 方法简便，切实可行；该步骤中的接种物选择方式、接种方法，可以缩短 HCV感染时间；首次设计的该上述丙型肝炎病毒培养基增加了体外细胞中 丙型肝炎病毒的复制水平。本发明在上述步骤(2)中的细胞可以是肝源细胞、 淋巴源细胞、肾源细胞及精子细胞。
本发明的复制模型已通过鉴定，并利用其进行抗丙型肝炎病毒药物筛 选及疫苗研究。
附图说明
图1为丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞RT-PCR分析图。
M：DNA Marker，DL2000；1：正链RNA的RT-PCR；2：负链RNA的 RT-PCR；
3，4：对照细胞RNA的RT-PCR
图2为丙型肝炎病毒(HCV)阳性血清体外感染Vero细胞原位杂交结 果图
A：正链探针原位杂交10×， B：正链探针原位杂交25×
C：负链探针原位杂交10×， D：负链探针原位杂交25×
图3为丙型肝炎病毒(HCV)阳性及阴性血清体外接种Vero细胞免疫 细胞化学检测图。
A：阴性对照Vero细胞；B：感染Vero细胞
图4 HCV阳性血清体外感染HepG2细胞免疫细胞化学检测图
图5为感染细胞裂解上清感染正常Vero细胞原位杂交结果图
A：正链探针原位杂交10×， B：正链探针原位杂交25×
C：负链探针原位杂交10×， D：负链探针原位杂交25×
图6为感染细胞裂解上清感染正常Vero细胞免疫细胞化学检测图。
图7为复苏第8代HCV感染的Vero细胞免疫细胞化学检测图
图8为获得的适应株HCV感染Vero细胞的形态
A：为正常短梭型Vero细胞，B：为感染长梭型Vero细胞
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例1.丙型肝炎病毒(HCV)阳性血清选择
筛选医院门诊急性丙型肝炎患者血清，经HAV、HBV、HDV、HIV检测为 阴性，未进行过抗病毒治疗，荧光定量PCR检测HCV-RNA效价＞106拷贝/ml 的2-3人份血清混合，过滤除菌后分装，-80℃存放。
实施例2.宿主细胞接种：
1.实验材料
(1)细胞株：Vero细胞，HepG2细胞，MA104细胞，HEK293细胞。 接种物：HCV感染患者阳性血清，来自中国人民解放军302医院病毒室，3 人份，指标及定量检测如实施例1所述。正常血清对照，经HAV、HBV、HCV， HDV、HIV指标检测为阴性。
(2)实验所用培养基及试剂：细胞培养液：含10％FBS的DMEM培养基； 维持液，含2-5％FBS的DMEM培养基；感染培养液为含有不同浓度亚铁离 子(硫酸亚铁、氯化亚铁或硫酸亚铁铵等)的细胞培养液或维持液。
2.实验方法
(1)对数期细胞以0.25％胰酶+0.02％EDTA消化，调细胞浓度为1×106个 /ml，2ml加入35mm培养皿或6孔细胞培养板内(内置的盖玻片备免疫细 胞化学测定及核酸杂交测定用)，5％CO2培养箱内24-48h。
(2)病毒接种：细胞长满80％后，去除培养基，并以DMEM培养基洗涤2次， 以DMEM培养基稀释阳性混合血清，终浓度10-20％，接种细胞表面，每 孔或皿0.5ml，室温轻摇30min，37℃孵育后，加入含2％FBS的培养基 (维持液)，离心培养。弃接种物，换用含10％FBS的感染培养液。5％CO2， 37℃孵育2-5d。设阴性血清对照，和不加铁离子对照。
(3)实验条件：分别从离心速度，吸附时间、培养基中铁离子浓度三方面 考察HCV感染率。转速分别设0g/min，600g/min，1000g/min，1500g/min， 2000g/min；37℃吸附时间分别设0min，30min，60min，90min，120 min；亚铁离子的浓度分别选用0μM，10μM，50μM，75μM，100μM， 150μM，200μM，300μM。
(4)采用实施例5方法测定
结果显示：转速在600-2000g/min，37℃孵育时间在30-120min，均 能够缩短HCV感染的时间及穿入宿主细胞的量而不明显改变细胞本身的状 态；亚铁离子在10-300μM能够增加HCV的复制。优选条件为转速600-2000 g/min，孵育时间在60-90min，亚铁离子浓度为50-150μM。在此条件下， 在所选用的细胞株均得到较高的感染率。
实施例3.巢式RT-PCR(nRT-PCR)法测定丙型肝炎病毒(HCV)体外感染模 型中HCV正、负链的表达：
细胞经胰酶消化、冰预冷的PBS洗涤两次，以100μl的PBS悬浮。TRIZOL 法提取血清和感染细胞的总RNA。
以HCV的保守区5‘NCR的cDNA为模板设计内、外侧引物，以总RNA 为模板，以外侧下游引物R1反转录获cDNA第一链，再以内测上、下游引 物F2和R2扩增，获正链RNA的RT-PCR产物；以RNA为模板以外侧上游 引物F1反转录获cDNA第一链，再以内测上、下游引物F2和R2扩增，获 负链RNA的RT-PCR产物。
如果HCV不复制，提取的总RNA中不存在负链RNA，则无法用F1反转 录cDNA第一链，即测不到负链RNA的RT-PCR产物，反之亦然。结果见附 图1及其附图说明。
实施例4.原位杂交法检测丙型肝炎病毒(HCV)体外感染模型HCV正、负 链的表达：
以带有HCV-cDNA的质粒为模板，以不对称PCR法制备单链DNA，以德 国宝灵曼公司的地高辛标记试剂盒进行标记，制备DIG标记正、负链探针。 细胞爬片经多聚甲醛固定后，进行原位杂交测定，显微镜下观察照相，阳 性信号为细胞内蓝紫色颗粒。结果见附图2及其附图说明。
实施例5.免疫细胞化学法测定丙型肝炎病毒(HCV)体外感染模型中HCV 抗原的表达
细胞爬片固定后，以抗HCV-NS3单克隆抗体为一抗，羊抗鼠HGP-IgG 为二抗，SABC法进行免疫细胞化学测定，显微镜下观察，阳性信号为细胞 内棕色颗粒。结果见附图3与附图4及其附图说明。
实施例6.连续传代法测定丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型HCV的传代：
使用实施例2方法得到体外第一代复制病毒，经传代扩增后，将感染 细胞裂解，离心后上清，以10FFU/细胞的MOI感染正常贴壁后细胞，用与 实施例2相同HCV感染培养基培养，此为第二代，依次类推。原位杂交及 免疫细胞化学测定感染率，方法同实施例4与实施例5。结果：该方法获 得的病毒可传10代以上。见附图5、附图6与附图7及其附图说明。
实施例7.琼脂培养法测定丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型裂解上清液 的HCV感染率：
感染细胞反复冻融3-4次裂解细胞，离心后取上清为HCV液，以维持 液10倍比稀释病毒，接种长成单层的细胞，接种方法同实施例2，稀释度 为101～108，培养24h。
配制软固体DMEM培养基，凝固前倒入上述细胞，37℃孵育继续48h。 冲洗掉琼脂，以PBS洗涤，进行免疫细胞化学测定，方法同实施例5，阳 性结果作半定量记录，镜下计数200个细胞中阳性细胞的数量。结果：感 染细胞裂解上清中的HCV病毒量(MOI)＞1012FFU/ml(multiplicity of infection，MOI；focus forming units，FFU)，即每毫升病毒液可形成 灶性克隆数目大于1012。
实施例8.丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养适应株获得
病毒接种并传代6-8次后，更换含2-5％FBS，50-150μM亚铁离子的 DMEM培养基维持培养，连续传代该株感染细胞，获HCV体外细胞培养适应 株，该株病毒对宿主细胞引起形态学改变，即细胞由短梭型变成细长梭型。 方法同实施例4与实施例5。结果见附图8及其附图说明。
实施例9.抗病毒药物对丙型肝炎病毒(HCV)体外复制的抑制作用
使用实施例2方法，得到HCV感染模型，选用第三代病毒感染的细胞 接种96孔板，细胞贴壁后，选取病毒唑、γ-INF、α2β-INF及5‘非编 码区的硫代反义寡核苷酸作为供试品，以各药物无毒浓度进行药物实验， 作用7天终止，其间换液一次。使用实施例4、实施例5方法进行药效测 定，灰度扫描定量测定药效；以原位细胞ELISA方法及流式仪测定HCV的 抗原表达；结果表明，病毒唑对HCV的抑制率可达28％，病毒唑和γ-INF 联合用药可达40％，硫代反义寡核苷酸可达55％以上。
实施例10.丙型肝炎病毒体外复制模型在疫苗研制中的应用
将该模型获取的病毒液以蔗糖密度梯度离心法进行纯化，以1/3000 甲醛37℃灭活10d，PEG2000浓缩后，测定蛋白含量，以PBS稀释成1mg/ml， 与福氏完全佐剂以1∶1混合，免疫C57/BL小鼠，选择背部、皮内、多点 注射，每个点0.1ml。初次免疫后7d，同量加强免疫一次。肌肉或静脉， 每点0.1-0.5ml，ELISA法测定血清效价。取免疫血清进行病毒中和实验及 细胞杀伤、病毒抑制实验，以估测免疫血清的体液免疫保护及细胞免疫保 护效应。结果表明HCV的体液免疫保护能力较弱，即血清的病毒中和能力 较差，但能够诱导较强的细胞免疫反应。
实施例11.丙型肝炎病毒动物感染模型的构建
利用纯化的病毒液静脉注射经射线辐射及过量铁离子处理的恒河猴， 跟踪测定猴体内病毒量；取阳性猴血清继续感染同种经预处理的动物。血 清学鉴定接种动物的转氨酶、载毒量，肝穿刺测定肝组织的病理改变及HCV 的复制，结果表明利用该体外复制模型制备的HCV可以感染动物。
实施例1.丙型肝炎病毒(HCV)阳性血清选择
筛选医院门诊急性丙型肝炎患者血清，经HAV、HBV、HDV、HIV检测为 阴性，未进行过抗病毒治疗，荧光定量PCR检测HCV-RNA效价＞106拷贝/ml 的2-3人份血清混合，过滤除菌后分装，-80℃存放。
实施例2.宿主细胞接种：
1.实验材料
(1)细胞株：Vero细胞，HepG2细胞，MA104细胞，HEK293细胞。 接种物：HCV感染患者阳性血清，来自中国人民解放军302医院病毒室，3 人份，指标及定量检测如实施例1所述。正常血清对照，经HAV、HBV、HCV， HDV、HIV指标检测为阴性。
(2)实验所用培养基及试剂：细胞培养液：含10％FBS的DMEM培养基； 维持液，含2-5％FBS的DMEM培养基；感染培养液为含有不同浓度亚铁离 子(硫酸亚铁、氯化亚铁或硫酸亚铁铵等)的细胞培养液或维持液。
2.实验方法
(1)对数期细胞以0.25％胰酶+0.02％EDTA消化，调细胞浓度为1×106个 /ml，2ml加入35mm培养皿或6孔细胞培养板内(内置的盖玻片备免疫细 胞化学测定及核酸杂交测定用)，5％CO2培养箱内24-48h。
(2)病毒接种：细胞长满80％后，去除培养基，并以DMEM培养基洗涤2次， 以DMEM培养基稀释阳性混合血清，终浓度10-20％，接种细胞表面，每 孔或皿0.5ml，室温轻摇30min，37℃孵育后，加入含2％FBS的培养基 (维持液)，离心培养。弃接种物，换用含10％FBS的感染培养液。5％CO2， 37℃孵育2-5d。设阴性血清对照，和不加铁离子对照。
(3)实验条件：分别从离心速度，吸附时间、培养基中铁离子浓度三方面 考察HCV感染率。转速分别设0g/min，600g/min，1000g/min，1500g/min， 2000g/min；37℃吸附时间分别设0min，30min，60min，90min，120 min；亚铁离子的浓度分别选用0μM，10μM，50μM，75μM，100μM， 150μM，200μM，300μM。
(4)采用实施例5方法测定
结果显示：转速在600-2000g/min，37℃孵育时间在30-120min，均 能够缩短HCV感染的时间及穿入宿主细胞的量而不明显改变细胞本身的状 态；亚铁离子在10-300μM能够增加HCV的复制。优选条件为转速600-2000 g/min，孵育时间在60-90min，亚铁离子浓度为50-150μM。在此条件下， 在所选用的细胞株均得到较高的感染率。
实施例3.巢式RT-PCR(nRT-PCR)法测定丙型肝炎病毒(HCV)体外感染模 型中HCV正、负链的表达：
细胞经胰酶消化、冰预冷的PBS洗涤两次，以100μl的PBS悬浮。TRIZOL 法提取血清和感染细胞的总RNA。
以HCV的保守区5‘NCR的cDNA为模板设计内、外侧引物，以总RNA 为模板，以外侧下游引物R1反转录获cDNA第一链，再以内测上、下游引 物F2和R2扩增，获正链RNA的RT-PCR产物；以RNA为模板以外侧上游 引物F1反转录获cDNA第一链，再以内测上、下游引物F2和R2扩增，获 负链RNA的RT-PCR产物。
如果HCV不复制，提取的总RNA中不存在负链RNA，则无法用F1反转 录cDNA第一链，即测不到负链RNA的RT-PCR产物，反之亦然。结果见附 图1及其附图说明。
实施例4.原位杂交法检测丙型肝炎病毒(HCV)体外感染模型HCV正、负 链的表达：
以带有HCV-cDNA的质粒为模板，以不对称PCR法制备单链DNA，以德 国宝灵曼公司的地高辛标记试剂盒进行标记，制备DIG标记正、负链探针。 细胞爬片经多聚甲醛固定后，进行原位杂交测定，显微镜下观察照相，阳 性信号为细胞内蓝紫色颗粒。结果见附图2及其附图说明。
实施例5.免疫细胞化学法测定丙型肝炎病毒(HCV)体外感染模型中HCV 抗原的表达
细胞爬片固定后，以抗HCV-NS3单克隆抗体为一抗，羊抗鼠HGP-IgG 为二抗，SABC法进行免疫细胞化学测定，显微镜下观察，阳性信号为细胞 内棕色颗粒。结果见附图3与附图4及其附图说明。
实施例6.连续传代法测定丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型HCV的传代：
使用实施例2方法得到体外第一代复制病毒，经传代扩增后，将感染 细胞裂解，离心后上清，以10FFU/细胞的MOI感染正常贴壁后细胞，用与 实施例2相同HCV感染培养基培养，此为第二代，依次类推。原位杂交及 免疫细胞化学测定感染率，方法同实施例4与实施例5。结果：该方法获 得的病毒可传10代以上。见附图5、附图6与附图7及其附图说明。
实施例7.琼脂培养法测定丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型裂解上清液 的HCV感染率：
感染细胞反复冻融3-4次裂解细胞，离心后取上清为HCV液，以维持 液10倍比稀释病毒，接种长成单层的细胞，接种方法同实施例2，稀释度 为101～108，培养24h。
配制软固体DMEM培养基，凝固前倒入上述细胞，37℃孵育继续48h。 冲洗掉琼脂，以PBS洗涤，进行免疫细胞化学测定，方法同实施例5，阳 性结果作半定量记录，镜下计数200个细胞中阳性细胞的数量。结果：感 染细胞裂解上清中的HCV病毒量(MOI)＞1012FFU/ml(multiplicity of infection，MOI；focus forming units，FFU)，即每毫升病毒液可形成 灶性克隆数目大于1012。
实施例8.丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养适应株获得
病毒接种并传代6-8次后，更换含2-5％FBS，50-150μM亚铁离子的 DMEM培养基维持培养，连续传代该株感染细胞，获HCV体外细胞培养适应 株，该株病毒对宿主细胞引起形态学改变，即细胞由短梭型变成细长梭型。 方法同实施例4与实施例5。结果见附图8及其附图说明。
实施例9.抗病毒药物对丙型肝炎病毒(HCV)体外复制的抑制作用
使用实施例2方法，得到HCV感染模型，选用第三代病毒感染的细胞 接种96孔板，细胞贴壁后，选取病毒唑、γ-INF、α2β-INF及5‘非编 码区的硫代反义寡核苷酸作为供试品，以各药物无毒浓度进行药物实验， 作用7天终止，其间换液一次。使用实施例4、实施例5方法进行药效测 定，灰度扫描定量测定药效；以原位细胞ELISA方法及流式仪测定HCV的 抗原表达；结果表明，病毒唑对HCV的抑制率可达28％，病毒唑和γ-INF 联合用药可达40％，硫代反义寡核苷酸可达55％以上。
实施例10.丙型肝炎病毒体外复制模型在疫苗研制中的应用
将该模型获取的病毒液以蔗糖密度梯度离心法进行纯化，以1/3000 甲醛37℃灭活10d，PEG2000浓缩后，测定蛋白含量，以PBS稀释成1mg/ml， 与福氏完全佐剂以1∶1混合，免疫C57/BL小鼠，选择背部、皮内、多点 注射，每个点0.1ml。初次免疫后7d，同量加强免疫一次。肌肉或静脉， 每点0.1-0.5ml，ELISA法测定血清效价。取免疫血清进行病毒中和实验及 细胞杀伤、病毒抑制实验，以估测免疫血清的体液免疫保护及细胞免疫保 护效应。结果表明HCV的体液免疫保护能力较弱，即血清的病毒中和能力 较差，但能够诱导较强的细胞免疫反应。
实施例11.丙型肝炎病毒动物感染模型的构建
利用纯化的病毒液静脉注射经射线辐射及过量铁离子处理的恒河猴， 跟踪测定猴体内病毒量；取阳性猴血清继续感染同种经预处理的动物。血 清学鉴定接种动物的转氨酶、载毒量，肝穿刺测定肝组织的病理改变及HCV 的复制，结果表明利用该体外复制模型制备的HCV可以感染动物。
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