一种抗人Nogo－66受体蛋白疫苗的制备方法及其应用
阅读：274发布：2024-02-28
专利汇可以提供一种抗人Nogo－66受体蛋白疫苗的制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种制备抗人Nogo－66受体蛋白 疫苗 的方法，从人神经母细胞瘤(SK－N－SH)cDNA中，经PCR扩增得到全长hNgR基因，将扩增的 片段 插入至克隆载体中，再亚克隆至含6个His标签的表达载体pET28a(+)获得重组表达质粒pET28a－NgR。将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行诱导表达得到hNgR蛋白。抗NgR蛋白疫苗可以通过封闭NgR，阻断抑制因子的作用，从而促进脊髓损伤后神经元轴突的再生，减轻损伤区的组织 坏死 ，促进损伤脊髓的功能恢复，表明NgR蛋白疫苗具有 治疗 脊髓损伤的潜在应用价值，其避免了外源性 生物 制剂，比较容易被自身免疫系统清除的缺点，另外也克服了针对NgR的DNA疫苗接种后主要诱发细胞免疫，只有少数个体能诱导出体液免疫的特点。，下面是一种抗人Nogo－66受体蛋白疫苗的制备方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种抗人Nogo-66受体蛋白疫苗的制备方法，其步骤如下：
从人神经母细胞瘤(SK-N-SH)cDNA中，经PCR扩增得到全长hNgR基因，不 包含信号肽，所用引物如下：
上游引物：5′-TTGGATCCTGCCCAGGTGCCTGCGTATG；
下游引物：5′-TTAAGCTTCAGCAGGGCCCAAGCACTGTC；
将扩增的片段插入至克隆载体pUC19中，经测序鉴定正确后再亚克隆至含6 个His标签的表达载体pET28a(+)获得重组表达质粒pET28a-NgR；
经酶切及测序鉴定正确后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3) 中进行诱导表达。
2.如权利要求1所述的制备蛋白疫苗的方法，其特征在于，所获得的蛋白的核 苷酸序列如SEQ ID No.1。
3.如权利要求1或2所述的抗人Nogo-66受体蛋白疫苗在制备治疗或预防脊髓 损伤疾病的药中的应用。
4.如权利要求1或2所述的抗人Nogo-66受体蛋白疫苗在制备治疗或预防中枢 神经损伤疾病的药中的应用。
技术领域
本发明涉及蛋白疫苗的制备，尤其涉及抗人Nogo-66受体(NgR)蛋白疫苗的 制备方法及其在脊髓损伤修复治疗中的应用。
背景技术
目前已发现的来源于髓鞘的轴突再生抑制分子主要有三种：Nogo-A，MAG和 OMgp。这三种分子结构明显不同的蛋白质却有着一个共同的受体，即Nogo-66 受体(NgR)。NgR能够以高亲和力与这三种抑制分子结合，并将其抑制轴突再生 的信号转导至细胞内。
研究者曾使用脊髓匀浆或髓鞘提取物免疫动物来治疗脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)，结果表明，免疫后的机体可通过产生抗抑制分子的抗体来 封闭其抑制作用，由此促进动物损伤脊髓的功能恢复。但是，脊髓匀浆或髓鞘 提取物中的成分相当复杂，除了含有上述三种抑制分子外，还包括许多其它成 分。用它们来免疫动物，有诱发自身免疫病的危险，较理想的方案是使用几个 抑制分子或用它们的受体作为免疫原。Sicotte等用联合使用重组的Nogo-66和 MAG分子的片段作为免疫原免疫动物后，发现能够促进脊髓损伤后轴突的再生。 也有实验室将几个抑制分子的基因片段串联至一个重组质粒中构建成DNA疫苗， 发现也能在一定程度上促进脊髓损伤后的功能恢复。但是，用其受体NgR作为 免疫原，目前还未见报道。
研究者曾使用脊髓匀浆或髓鞘提取物免疫动物来治疗脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)，结果表明，免疫后的机体可通过产生抗抑制分子的抗体来 封闭其抑制作用，由此促进动物损伤脊髓的功能恢复。但是，脊髓匀浆或髓鞘 提取物中的成分相当复杂，除了含有上述三种抑制分子外，还包括许多其它成 分。用它们来免疫动物，有诱发自身免疫病的危险，较理想的方案是使用几个 抑制分子或用它们的受体作为免疫原。Sicotte等用联合使用重组的Nogo-66和 MAG分子的片段作为免疫原免疫动物后，发现能够促进脊髓损伤后轴突的再生。 也有实验室将几个抑制分子的基因片段串联至一个重组质粒中构建成DNA疫苗， 发现也能在一定程度上促进脊髓损伤后的功能恢复。但是，用其受体NgR作为 免疫原，目前还未见报道。
发明内容
本发明中制备抗人Nogo-66受体蛋白疫苗的方法如下所述。
从人神经母细胞瘤(SK-N-SH)cDNA中，经PCR扩增得到全长hNgR基因(不 包含信号肽)。所用引物如下：
上游引物：5′-TTGGATCCTGCCCAGGTGCCTGCGTATG；
下游引物：5′-TTAAGCTTCAGCAGGGCCCAAGCACTGTC；
其中上游引物含BamHI位点，下游引物含HindIII位点和终止密码子。将 扩增的片段插入至克隆载体pUC19中，经测序鉴定正确后再亚克隆至含6个Hi s 标签的表达载体pET28a(+)获得重组表达质粒pET28a-NgR。经酶切及测序鉴定 正确后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行诱导表达，并通过 SDS-PAGE和Western Blot对表达的目的蛋白进行鉴定。最后，采用Ni-NTA亲 合纯化系统(申能博彩公司)纯化出目的蛋白，并通过SDS-PAGE分析鉴定。
重组质粒pET28-hNgR的双酶切鉴定(BamHI和HindIII)和PCR鉴定结果均 显示，插入片断与预先设计一致(图1A)，DNA测序则进一步证明插入位点及序 列完全正确。随后，重组质粒pET28-hNgR转化至大肠杆菌诱导表达，SDS-PAGE 结果显示，经IPTG诱导后，该质粒可在大肠杆菌种表达一分子量为50KD左右 的蛋白，与目的蛋白的预期分子量一致；用抗His标签的抗体进行Westen Blot 鉴定，则进一步证明该条带即为带有6×His标签的hNgR融合蛋白。最终通过 Ni-NTA亲和纯化系统纯化，成功获得了免疫动物所需的且纯度较高的hNgR蛋白 (图1B，图1C)。本发明中抗人NgR蛋白疫苗可以在制备治疗或预防脊髓损伤的 药中加以应用，也可以在制备治疗或预防肢体瘫痪的药中加以应用。
本发明所公开的抗NgR蛋白疫苗可以通过封闭NgR，阻断抑制因子的作用， 从而促进脊髓损伤后神经元轴突的再生，减轻损伤区的组织坏死，促进损伤脊 髓的功能恢复，其避免了外源性生物制剂，比较容易被自身免疫系统清除的缺 点，另外也克服了针对NgR的DNA疫苗接种后主要诱发细胞免疫，只有少数个 体能诱导出体液免疫的特点。
附图说明
图1A是重组表达质粒pET28a-hNgR的双酶切及PCR鉴定结果图，其中M1， M2：DNA分子参照标准，1：质粒pET28a-hNgR经BamH I和HindIII酶切后电泳图， 2：质粒pET28a-hNgR的PCR电泳结果；
图1B是重组NgR蛋白的原核表达和纯化的SDS-PAGE结果图，其中1：未经 IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白，2：经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白，3：经纯化的 重组NgR蛋白；
图1C是重组NgR蛋白的Western Blot鉴定结果图，其中1：未经IPTG诱 导的大肠杆菌总蛋白，2：经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白；
图2是ELISA法检测大鼠血清中的抗NgR抗体结果图；
图3是免疫组化检测进入损伤脊髓组织中的抗NgR抗体结果图；
图4A是免疫组化检测损伤脊髓组织中NgR的表达，用兔抗NgR抗体进行免 疫组化染色结果显示图，其中标尺：50μm；
图4B是免疫组化检测损伤脊髓组织中NgR的表达，NgR免疫强度的定量分 析结果图(**，与对照组相比P＜0.01)；
图5A是抗NgR抗血清可逆转抑制分子MAG对神经突起生长的抑制作用，在 培养在经MAG包被的玻片上的小脑神经元培养液中，分别加入PBS对照组血清， 免疫前血清或NgR免疫血清后，神经元突起的生长情况图，其中标尺：25μm；
图5B是抗NgR抗血清可逆转抑制分子MAG对神经突起生长的抑制作用，统 计分析各组神经元平均突起长度图，其中数据表示为：均数±标准误(与对照 血清组或免疫前血清组相比，*，P＜0.05；**，P＜0.01)；
图6A是脊髓半横断模型行为学实验结果，BBB评分结果图(与对照组相比， *，P＜0.05；**，P＜0.01)；
图6B是脊髓半横断模型行为学实验结果，网格步行试验结果图(与对照组 相比，*，P＜0.05；**，P＜0.01)；
图7A是BDA顺行示踪结果显示NgR免疫可促进脊髓损伤后轴突的再生，对 照组和NgR免疫组头侧(距损伤中心上游大于5mm处)及尾侧(距损伤中心下 游大于5mm处)脊髓冠状切片图，在CST的投射部位，BDA标记上的背侧CST纤 维(箭头)，其中标尺：1mm；
图7B是BDA顺行示踪结果显示NgR免疫可促进脊髓损伤后轴突的再生，脊 髓矢状切面显示图，在对照组，所有的标记的纤维均停止在损伤中心(*)的上 游；而在NgR免疫组部分纤维可穿过损伤中心长入下游的脊髓组织中(箭头)， 其中标尺：1mm；
图7C是BDA顺行示踪结果显示NgR免疫可促进脊髓损伤后轴突的再生，损 伤下游(距损伤中心6-10mm)脊髓组织中再生的CST纤维的高倍图片，其中标 尺：100μm；
图7D是BDA顺行示踪结果显示NgR免疫可促进脊髓损伤后轴突的再生，对 照组及NgR免疫组CST纤维再生最大距离的散点分布图；
图8A是脊髓重物伤模型行为学实验结果，BBB评分结果图(与对照组相比， *，P＜0.05；**，P＜0.01；#，P＜0.01)；
图8B是脊髓重物伤模型行为学实验结果，网格步行试验结果图(与对照组 相比，*，P＜0.05；**，P＜0.01；#，P＜0.01)；
图9A是脊髓空洞三维重建结果，将包含损伤中心的一段1cm的脊髓进行连 续切片后用nurolucida软件进行三维重建图；
图9B是脊髓空洞三维重建结果，各组损伤空洞体积占脊髓总体积百分比的 统计分析图(*，P＜0.05)。
从人神经母细胞瘤(SK-N-SH)cDNA中，经PCR扩增得到全长hNgR基因(不 包含信号肽)。所用引物如下：
上游引物：5′-TTGGATCCTGCCCAGGTGCCTGCGTATG；
下游引物：5′-TTAAGCTTCAGCAGGGCCCAAGCACTGTC；
其中上游引物含BamHI位点，下游引物含HindIII位点和终止密码子。将 扩增的片段插入至克隆载体pUC19中，经测序鉴定正确后再亚克隆至含6个Hi s 标签的表达载体pET28a(+)获得重组表达质粒pET28a-NgR。经酶切及测序鉴定 正确后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行诱导表达，并通过 SDS-PAGE和Western Blot对表达的目的蛋白进行鉴定。最后，采用Ni-NTA亲 合纯化系统(申能博彩公司)纯化出目的蛋白，并通过SDS-PAGE分析鉴定。
重组质粒pET28-hNgR的双酶切鉴定(BamHI和HindIII)和PCR鉴定结果均 显示，插入片断与预先设计一致(图1A)，DNA测序则进一步证明插入位点及序 列完全正确。随后，重组质粒pET28-hNgR转化至大肠杆菌诱导表达，SDS-PAGE 结果显示，经IPTG诱导后，该质粒可在大肠杆菌种表达一分子量为50KD左右 的蛋白，与目的蛋白的预期分子量一致；用抗His标签的抗体进行Westen Blot 鉴定，则进一步证明该条带即为带有6×His标签的hNgR融合蛋白。最终通过 Ni-NTA亲和纯化系统纯化，成功获得了免疫动物所需的且纯度较高的hNgR蛋白 (图1B，图1C)。本发明中抗人NgR蛋白疫苗可以在制备治疗或预防脊髓损伤的 药中加以应用，也可以在制备治疗或预防肢体瘫痪的药中加以应用。
本发明所公开的抗NgR蛋白疫苗可以通过封闭NgR，阻断抑制因子的作用， 从而促进脊髓损伤后神经元轴突的再生，减轻损伤区的组织坏死，促进损伤脊 髓的功能恢复，其避免了外源性生物制剂，比较容易被自身免疫系统清除的缺 点，另外也克服了针对NgR的DNA疫苗接种后主要诱发细胞免疫，只有少数个 体能诱导出体液免疫的特点。
附图说明
图1A是重组表达质粒pET28a-hNgR的双酶切及PCR鉴定结果图，其中M1， M2：DNA分子参照标准，1：质粒pET28a-hNgR经BamH I和HindIII酶切后电泳图， 2：质粒pET28a-hNgR的PCR电泳结果；
图1B是重组NgR蛋白的原核表达和纯化的SDS-PAGE结果图，其中1：未经 IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白，2：经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白，3：经纯化的 重组NgR蛋白；
图1C是重组NgR蛋白的Western Blot鉴定结果图，其中1：未经IPTG诱 导的大肠杆菌总蛋白，2：经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白；
图2是ELISA法检测大鼠血清中的抗NgR抗体结果图；
图3是免疫组化检测进入损伤脊髓组织中的抗NgR抗体结果图；
图4A是免疫组化检测损伤脊髓组织中NgR的表达，用兔抗NgR抗体进行免 疫组化染色结果显示图，其中标尺：50μm；
图4B是免疫组化检测损伤脊髓组织中NgR的表达，NgR免疫强度的定量分 析结果图(**，与对照组相比P＜0.01)；
图5A是抗NgR抗血清可逆转抑制分子MAG对神经突起生长的抑制作用，在 培养在经MAG包被的玻片上的小脑神经元培养液中，分别加入PBS对照组血清， 免疫前血清或NgR免疫血清后，神经元突起的生长情况图，其中标尺：25μm；
图5B是抗NgR抗血清可逆转抑制分子MAG对神经突起生长的抑制作用，统 计分析各组神经元平均突起长度图，其中数据表示为：均数±标准误(与对照 血清组或免疫前血清组相比，*，P＜0.05；**，P＜0.01)；
图6A是脊髓半横断模型行为学实验结果，BBB评分结果图(与对照组相比， *，P＜0.05；**，P＜0.01)；
图6B是脊髓半横断模型行为学实验结果，网格步行试验结果图(与对照组 相比，*，P＜0.05；**，P＜0.01)；
图7A是BDA顺行示踪结果显示NgR免疫可促进脊髓损伤后轴突的再生，对 照组和NgR免疫组头侧(距损伤中心上游大于5mm处)及尾侧(距损伤中心下 游大于5mm处)脊髓冠状切片图，在CST的投射部位，BDA标记上的背侧CST纤 维(箭头)，其中标尺：1mm；
图7B是BDA顺行示踪结果显示NgR免疫可促进脊髓损伤后轴突的再生，脊 髓矢状切面显示图，在对照组，所有的标记的纤维均停止在损伤中心(*)的上 游；而在NgR免疫组部分纤维可穿过损伤中心长入下游的脊髓组织中(箭头)， 其中标尺：1mm；
图7C是BDA顺行示踪结果显示NgR免疫可促进脊髓损伤后轴突的再生，损 伤下游(距损伤中心6-10mm)脊髓组织中再生的CST纤维的高倍图片，其中标 尺：100μm；
图7D是BDA顺行示踪结果显示NgR免疫可促进脊髓损伤后轴突的再生，对 照组及NgR免疫组CST纤维再生最大距离的散点分布图；
图8A是脊髓重物伤模型行为学实验结果，BBB评分结果图(与对照组相比， *，P＜0.05；**，P＜0.01；#，P＜0.01)；
图8B是脊髓重物伤模型行为学实验结果，网格步行试验结果图(与对照组 相比，*，P＜0.05；**，P＜0.01；#，P＜0.01)；
图9A是脊髓空洞三维重建结果，将包含损伤中心的一段1cm的脊髓进行连 续切片后用nurolucida软件进行三维重建图；
图9B是脊髓空洞三维重建结果，各组损伤空洞体积占脊髓总体积百分比的 统计分析图(*，P＜0.05)。
具体实施方式
现结合本发明的具体实施方式来描述本发明中。
其中，NgR免疫强度分析，BBB评分，网格试验，损伤空洞体积比较采用t 检验；平均神经突起长度比较采用方差分析(ANOVA)。P＜0.05，认为有统计学 意义。
实施例1、人NgR基因的克隆、蛋白表达和纯化
从人神经母细胞瘤(SK-N-SH)cDNA中，经PCR扩增得到全长hNgR基因(不 包含信号肽)。所用引物如下：
上游引物：5′-TTGGATCCTGCCCAGGTGCCTGCGTATG；
下游引物：5′-TTAAGCTTCAGCAGGGCCCAAGCACTGTC；
其中上游引物含BamHI位点，下游引物含HindIII位点和终止密码子。将 扩增的片段插入至克隆载体pUC19中，经测序鉴定正确后再亚克隆至含6个Hi s 标签的表达载体pET28a(+)获得重组表达质粒pET28a-NgR。经酶切及测序鉴定 正确后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行诱导表达，并通过 SDS-PAGE和Western Blot对表达的目的蛋白进行鉴定。最后，采用Ni-NTA亲 合纯化系统(申能博彩公司)纯化出目的蛋白，并通过SDS-PAGE分析鉴定。
重组质粒pET28-hNgR的双酶切鉴定(BamH I和HindIII)和PCR鉴定结果均 显示，插入片断与预先设计一致(图1A)，DNA测序则进一步证明插入位点及序 列完全正确。随后，重组质粒pET28-hNgR转化至大肠杆菌诱导表达，SDS-PAGE 结果显示，经IPTG诱导后，该质粒可在大肠杆菌种表达一分子量为50KD左右 的蛋白，与目的蛋白的预期分子量一致；用抗His标签的抗体进行Westen Blot 鉴定，则进一步证明该条带即为带有6×His标签的hNgR融合蛋白。最终通过 Ni-NTA亲和纯化系统纯化，成功获得了免疫动物所需的且纯度较高的hNgR蛋白 (图1B，C)。
实施例2、动物免疫及抗体检测
用纯化的NgR蛋白作为抗原免疫SD大鼠(n＝20)。初次免疫，每只大鼠用 50μg抗原加完全弗氏佐剂(FCA，Sigma公司)进行背部皮下多点和后脚掌皮 下注射。以后每隔2w进行1次加强免疫，加强免疫时，每只大鼠用50μg抗原 加不完全弗氏佐剂(FIA，Sigma公司)进行背部皮下多点注射，对照组用等体 积的PBS代替抗原免疫(n＝15)。在加强免疫3次后，通过眼球采血分离血清 用ELISA法进行抗体效价检测。方法如下：首先将纯化的NgR抗原用0.05M碳 酸盐缓冲液(pH9.6)稀释后按100μl/孔(含50μg抗原)包被酶标板，置4 ℃冰箱过夜后弃上清；用洗涤液将包被好的酶标板洗涤3次，每次5min，然后 加入1％BSA-PBS封闭液，每孔200ul，37℃封闭2h；倾去封闭液，同上洗涤后， 加入不同稀释度的待检血清，每孔100ul，37℃孵育1.5h，洗涤后再加入1∶5000 稀释的羊抗大鼠IgG-HRP(华美公司)，每孔100ul，37℃孵育1h；洗涤后加入 底物缓冲液，室温显色10-20min后，每孔加入50ul的终止液终止反应。用酶 标仪读出490nm波长吸光度值(OD值)，OD值大于阴性孔3倍以上的判断为阳 性。设置免疫前血清作为阴性对照。
结果表明，所有经NgR免疫的大鼠均产生了抗NgR的抗体，且效价大于 1∶8000；免疫PBS的对照组大鼠血清中NgR抗体检测为阴性(图2)。为了鉴定 诱导的NgR抗体在脊髓损伤后是否能够透过血脑屏障进入损伤局部，我们分别 于损伤后3d及5w对对照组和NgR免疫组大鼠脊髓组织中的免疫球蛋白IgG进 行了免疫组化染色。结果显示，在损伤后3d，对照组和NgR免疫组IgG染色均 为阳性，表明，脊髓损伤后早期随着血脑屏障的破坏，血清中存在的正常及非 特异的IgG也可进入损伤部位。但在损伤后5w，对照组脊髓组织中IgG染色几 乎为阴性，而NgR免疫组脊髓中仍有大量的IgG存在于损伤中心及其两侧较大 的范围内(图3)，表明，5w后非特异的IgG已消失，留下的是对脊髓分子特异 的IgG，这些IgG应该是NgR疫苗诱导产生的抗NgR抗体。为了进一步鉴定5w 后留在脊髓的抗体确实是抗NgR抗体，我们用先前制备的兔抗NgR抗体进行了 免疫组化染色。结果显示，对照组损伤后脊髓中NgR的免疫反应较强，且在神 经元中分布较均匀；而在NgR免疫组损伤后大鼠的脊髓中，NgR的免疫反应明显 减弱，且有的在神经元膜上呈点状分布(图4)，提示NgR免疫产生的NgR抗体 在进入脊髓后已与其靶抗原NgR结合，因此，再用兔抗NgR抗体进行免疫组化 染色时，由于脊髓中大部分NgR分子已被疫苗产生的抗体封闭，其免疫反应明 显弱于对照组。
实施例3、神经突起生长试验
分离P7-9天大鼠的小脑置于D-Hanks液中，剥去脑膜，将组织剪成1-2mm3 的小块，用消化液(含0.25％胰蛋白酶的D-Hanks液)在37℃培养箱中消化 10-12min，然后以含10％胎牛血清的DMEM培养液终止反应。反复吹打得到胞悬 液，再以1500转/min的速度离心3min，弃去上清，沉淀下来的细胞用D-Hanks 液洗涤两次，用分步贴壁培养法分离纯化小脑神经元，即先将小脑中分离到的 细胞悬浮在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，接种在未铺过多聚赖氨酸的培养 皿上，培养5min，吸取未贴壁的细胞，弃掉已贴壁的细胞，主要为一些成纤维 细胞和部分星状胶质细胞。然后再将细胞接种在未铺过多聚赖氨酸的细胞培养 皿上，培养20min，轻轻摇动细胞培养皿，吸取未贴壁的细胞，弃掉已贴壁的细 胞，主要为星状胶质细胞和一些已贴壁的神经元细胞或少突胶质细胞。通过分 步贴壁的处理，可以得到相对较纯的小脑神经元。将收集的小脑神经元细胞离 心后直接用无血清培养液Neurobasal/B27(体积比为50∶1)重悬，然后接种至 包被有抑制分子MAG的玻片上，同时在培养液中分别加入免疫前，NgR免疫组和 对照组大鼠血清(1∶100)，每组设3个复孔，同样的实验重复3次。培养24h 后，固定细胞，用NF抗体(1∶100，Sigma公司)标记神经元，用Confocal每 组随机拍取几十个视野，用nurolucida软件(MicroBrightField Inc公司)测 量视野中每个神经元的突起，每组测量150个神经元，取其平均突起长度做统 计分析。
结果显示，加入免疫前血清和对照组血清的神经元平均突起长度分别为 12.09μm和13.63μm；而加入三个不同个体NgR免疫血清的神经元平均突起长 度明显增长，分别为23.27μm，24.78μm和19.17μm，差异具有显著性(其中NgR 免疫组个体1，个体2与对照血清组或免疫前血清组相比P＜0.01；个体3与对 照血清组或免疫前血清组相比P＜0.05，图5)。这一结果表明，抗NgR抗血清 可逆转抑制分子MAG对神经元突起生长的抑制作用。
实施例4、大鼠脊髓半横切模型
(1)脊髓半横切手术
脊髓半横切手术分为NgR免疫组(n＝15)和对照组(n＝10)。手术步骤如下： 大鼠用戊巴比妥钠50mg/kg麻醉后剃去背部毛发；75％酒精消毒皮肤，切开皮 肤，分离肌肉置椎管完全暴露；用咬骨钳咬去T9椎板至脊髓充分暴露，用做好 标记的显微手术剪半横断背侧脊髓，深度为1.6mm；依次缝合肌肉和皮肤。术中 注意保温，术后一周每天给予液体和抗生素预防感染，每天三次进行常规护理 直至动物恢复自主排尿。
(2)脊髓中抗体的免疫组化检测
为了观察诱导的抗NgR抗体在大鼠脊髓损伤后是否进入了脊髓损伤区域， 我们分别对NgR免疫组和对照组损伤后3d和5w的脊髓组织切片中的免疫球蛋 白IgG进行了免疫荧光染色。即将组织切片用含10％正常山羊血清的封闭液室 温封闭1h后，直接加入FITC标记的羊抗大鼠IgG的二抗，37℃孵育1h，Confocol 下观察结果并拍照。为了进一步观察诱导的抗NgR抗体进入损伤的脊髓后是否 能封闭其靶抗原NgR分子，我们进一步用兔抗大鼠NgR抗体分别对NgR免疫组 和对照组损伤后的脊髓组织切片进行了免疫荧光染色，用Confocal显微镜 (ZEISS LSM510)观察结果和拍照，并用软件对NgR的免疫荧光强度进行了统 计分析。
结果如图3显示，在脊髓损伤后3天和35天，用FITC标记的羊抗大鼠IgG 抗体检测NgR免疫组和对照组脊髓组织中的免疫球蛋白。在损伤后3d，对照组 和NgR免疫组IgG染色均为阳性；但在损伤后5w，对照组脊髓组织中IgG染色 几乎为阴性，而NgR免疫组脊髓中仍有大量的IgG存在于损伤中心及其两侧较 大的范围内。图片采自损伤中心头侧约2mm处的脊髓白质区域。
实施例5、行为学试验
开放场地试验(Open field locomotor test，BBB)，在损伤前1d，脊髓 横断术后1d，3d，1w，2w，4w和5w各进行一次BBB评分来评价大鼠后肢的运动功 能。将每只大鼠放置于一宽敞的场地中，自由活动4min，由两名观测者按照BBB 评分标准进行评分，将二人的评分均值用于统计分析。
网格步行试验(Grid walking)，在损伤后5w即处死前进行一次网格步行 试验。将大鼠置于一1m2的不规则的网格(0.5-5cm)上自由行走4min，由两名 观察者各计数一侧后肢的步数，若行走时后爪及脚跟掉入网格平面以下，则计 数为一次错步。同时计数一侧后肢行走的总步数和错误步数。计算错误步数占 总步数的百分比用于统计分析。
在脊髓半横切手术后1d，所有大鼠的的后肢均完全不能活动，BBB评分为0 分；从3d开始一直观察到5w大鼠的后肢功能逐渐恢复，但NgR免疫组大鼠的 BBB评分始终要高于对照组，且从2w开始一直到观察终点5w，两组的差异具有 显著性(P＜0.05，图6A)。在损伤后5w进行的网格步行实验结果也显示，NgR 免疫组大鼠后肢功能恢复要好于对照组，其后肢步行平均出错率分别为41.99 ％和23.42％(P＜0.05，图6B)。这表明，对于脊髓半横断损伤模型，NgR疫苗 可以明显促进损伤脊髓的功能恢复。
实施例6、皮质脊髓束顺行标记及免疫组化染色
在脊髓半横切损伤后3w，将NgR免疫组(n＝12)和对照组(n＝6)大鼠用 生物素化的葡聚糖胺(BDA，Molecular Probes公司)进行皮质脊髓束顺行标记， 方法如下：将大鼠麻醉后剪去头顶的毛发并定位置脑立体定位仪上；消毒皮肤， 切开头颅顶部中央皮肤，刮去骨膜，清晰暴露出前囟位点及其周围相应部位的 一片颅骨；先将立体定位仪定位出前囟位点，然后以前囟为坐标0点分别定位 以下6个位点：(±3mm，2mm)，(±2.5mm，0mm)，(±2mm，-1mm)，做好标记 后，钻去这一区域的颅骨并撕开表面的硬脑膜暴露出皮层，用微量注射针将10 ％的BDA立体注射至相应的6个位点，0.5μl/点，注射深度为1mm；缝合皮肤， 并给予抗生素预防感染。2w后即损伤后5w，将大鼠在麻醉状态下灌注固定，并 取出脑和脊髓标本，标本经后固定和蔗糖梯度脱水后进行冰冻切片。其中从损 伤中心头侧1cm到尾侧1cm的一段2cm脊髓进行矢状切片；损伤中心头侧 1.1-1.6cm和尾侧1.1-1.6cm两个节段进行冠状切片；切片厚度为20um。
BDA免疫组化染色：组织切片用先用PBS浸泡5min两次，然后用含1％H2O2 的PBS室温浸泡15min，经PBS清洗后用0.3％TritonX-100/PBS预渗透30min， 然后加入HRP耦联的avidin(1∶1500)室温孵育1-3h；PBS清洗后用DAB进行显 色5-10min，PBS清洗终止反应，切片经梯度酒精脱水和二甲苯透明后用中性树 胶进行封片，显微镜下观察结果。
免疫组化染色显示：在脊髓损伤上游11-16mm(头侧)的冠状切片上，对照 组和NgR免疫组CST相应的投射区域均可看到被标记上的神经纤维，二者并没 有明显差别；但在脊髓损伤下游11-16mm(尾侧)的冠状切片上，对照组(n＝6) 没看到被标记上的轴突，而在NgR免疫组(n＝12)中，有33％(n＝4)的大鼠 在相应投射区域仍能看到一些被标记上的轴突(图7A)。在包含损伤中心的一段 2cm长的脊髓矢状切片上，我们可以看到，在对照组中，被标记上的神经纤维均 停止在损伤中心的上游；而在NgR免疫组，有75％(n＝9)的个体，其部份标 记的轴突可跨过损伤区域延伸至损伤下游(图7B)。我们统计了NgR免疫组再生 轴突的长度，结果显示，在12个个体中，有9个个体的轴突有再生，其再生的 最大距离从7mm-15mm不等，其中有4个个体的再生距离超过了10mm(图7C)。
实施例7、大鼠脊髓重物坠落伤模型
我们将另一部分经NgR免疫的大鼠用于脊髓撞击伤模型制作，设NgR免疫 组(n＝5)和对照组(n＝4)。手术采用纽约大学脊髓重物坠落伤模型(NYU Impactor)，手术在保温垫上操作，具体方法如下：
(1)1％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉动物，剃去背部毛发；
(2)75％酒精消毒，切开皮肤，分离肌肉，暴露椎管；
(3)用咬骨钳咬去T9脊突，沿T9与T10间的脊间孔咬去锥板，充分暴露脊髓(直 径约2.5mm的圆形开口)；
(4)将大鼠固定于NYU重物坠落装置上，按物重10g，高度12.5mm的参数，在 暴露的脊髓处制造中等损伤程度的脊髓撞击伤模型。
术后每天三次进行排尿护理直至动物能进行主动排尿；术后三天每天按常 规给予补液及抗生素以预防感染。
实施例8、行为学试验(方法同前)
脊髓撞击伤大鼠在损伤前1d，损伤后1d，3d，1w及以后每周一次直至8w 进行一次BBB评分；从第2w到第8w，每周进行一次网格步行试验。
结果显示，在损伤后3d，NgR疫苗免疫组的BBB评分为3.167±0.289，与 对照组(1±0.632)相比具有显著性差异(P＜0.01)，且一直到观察终点-损伤 后8w，NgR疫苗免疫组的BBB评分始终高于对照组。在损伤后8w，NgR疫苗免 疫组的BBB评分已恢复到15.33±1.528，而对照组为13.33±1.516(P＜0.01， 图8A)。网格试验结果也显示，从损伤后2w开始，一直到8w，NgR疫苗免疫组 大鼠后肢步行时的出错率要显著低于对照组(P＜0.01，图8B)。这表明，对于重 物坠落脊髓损伤模型，NgR疫苗同样可以显著促进损伤脊髓的功能恢复。
实施例9、组织学观察
在脊髓损伤后8w，将动物灌注固定，取脊髓标本进行冰冻切片。将包含损 伤部位的1cm的脊髓片段(损伤中心头尾侧各0.5cm)进行连续的冠状切片并编 号，切片厚度为20μm。每个标本各取一套切片用Neurolucida软件对脊髓片段 进行三维重建，将空洞的体积除以整段脊髓的体积获得空洞的百分比用于统计 分析。
结果表明，在对照组，脊髓空洞的体积百分比在13.9％到29.7％之间，平 均为20.4％；而NgR蛋白免疫组脊髓的空洞体积百分比明显缩小，平均为9.4 ％(P＜0.05，图9)。
以上实验结果显示，在脊髓半横断损伤模型中，BDA顺行标记实验结果表明， 经NgR蛋白疫苗免疫的大鼠在脊髓损伤后，其切断的神经纤维可再生，并穿越 损伤区；在重物坠落脊髓损伤模型中；组织学结果显示，经NgR蛋白疫苗免疫 的大鼠在脊髓损伤后，其损伤区空洞面积显著缩小；行为学结果则证明，接种 NgR疫苗后，两种动物模型瘫痪后肢的功能都有明显的恢复。
序列表
<110>上海交通大学医学院
<120>一种抗人Nogo-66受体蛋白疫苗的制备方法及其应用
<130>/
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1924
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
ctgtgcgccc tgcgcgccct gcgcacccgc ggcccgagcc cagccagagc cgggcggagc
ggagcgcgcc gagcctcgtc ccgcggccgg gccggggccg ggccgtagcg gcggcgcctg
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gcccgaattg atgcggctgc cttcactggc ctggccctcc tggagcagct ggacctcagc
gataatgcac agctccggtc tgtggaccct gccacattcc acggcctggg ccgcctacac
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其中，NgR免疫强度分析，BBB评分，网格试验，损伤空洞体积比较采用t 检验；平均神经突起长度比较采用方差分析(ANOVA)。P＜0.05，认为有统计学 意义。
实施例1、人NgR基因的克隆、蛋白表达和纯化
从人神经母细胞瘤(SK-N-SH)cDNA中，经PCR扩增得到全长hNgR基因(不 包含信号肽)。所用引物如下：
上游引物：5′-TTGGATCCTGCCCAGGTGCCTGCGTATG；
下游引物：5′-TTAAGCTTCAGCAGGGCCCAAGCACTGTC；
其中上游引物含BamHI位点，下游引物含HindIII位点和终止密码子。将 扩增的片段插入至克隆载体pUC19中，经测序鉴定正确后再亚克隆至含6个Hi s 标签的表达载体pET28a(+)获得重组表达质粒pET28a-NgR。经酶切及测序鉴定 正确后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行诱导表达，并通过 SDS-PAGE和Western Blot对表达的目的蛋白进行鉴定。最后，采用Ni-NTA亲 合纯化系统(申能博彩公司)纯化出目的蛋白，并通过SDS-PAGE分析鉴定。
重组质粒pET28-hNgR的双酶切鉴定(BamH I和HindIII)和PCR鉴定结果均 显示，插入片断与预先设计一致(图1A)，DNA测序则进一步证明插入位点及序 列完全正确。随后，重组质粒pET28-hNgR转化至大肠杆菌诱导表达，SDS-PAGE 结果显示，经IPTG诱导后，该质粒可在大肠杆菌种表达一分子量为50KD左右 的蛋白，与目的蛋白的预期分子量一致；用抗His标签的抗体进行Westen Blot 鉴定，则进一步证明该条带即为带有6×His标签的hNgR融合蛋白。最终通过 Ni-NTA亲和纯化系统纯化，成功获得了免疫动物所需的且纯度较高的hNgR蛋白 (图1B，C)。
实施例2、动物免疫及抗体检测
用纯化的NgR蛋白作为抗原免疫SD大鼠(n＝20)。初次免疫，每只大鼠用 50μg抗原加完全弗氏佐剂(FCA，Sigma公司)进行背部皮下多点和后脚掌皮 下注射。以后每隔2w进行1次加强免疫，加强免疫时，每只大鼠用50μg抗原 加不完全弗氏佐剂(FIA，Sigma公司)进行背部皮下多点注射，对照组用等体 积的PBS代替抗原免疫(n＝15)。在加强免疫3次后，通过眼球采血分离血清 用ELISA法进行抗体效价检测。方法如下：首先将纯化的NgR抗原用0.05M碳 酸盐缓冲液(pH9.6)稀释后按100μl/孔(含50μg抗原)包被酶标板，置4 ℃冰箱过夜后弃上清；用洗涤液将包被好的酶标板洗涤3次，每次5min，然后 加入1％BSA-PBS封闭液，每孔200ul，37℃封闭2h；倾去封闭液，同上洗涤后， 加入不同稀释度的待检血清，每孔100ul，37℃孵育1.5h，洗涤后再加入1∶5000 稀释的羊抗大鼠IgG-HRP(华美公司)，每孔100ul，37℃孵育1h；洗涤后加入 底物缓冲液，室温显色10-20min后，每孔加入50ul的终止液终止反应。用酶 标仪读出490nm波长吸光度值(OD值)，OD值大于阴性孔3倍以上的判断为阳 性。设置免疫前血清作为阴性对照。
结果表明，所有经NgR免疫的大鼠均产生了抗NgR的抗体，且效价大于 1∶8000；免疫PBS的对照组大鼠血清中NgR抗体检测为阴性(图2)。为了鉴定 诱导的NgR抗体在脊髓损伤后是否能够透过血脑屏障进入损伤局部，我们分别 于损伤后3d及5w对对照组和NgR免疫组大鼠脊髓组织中的免疫球蛋白IgG进 行了免疫组化染色。结果显示，在损伤后3d，对照组和NgR免疫组IgG染色均 为阳性，表明，脊髓损伤后早期随着血脑屏障的破坏，血清中存在的正常及非 特异的IgG也可进入损伤部位。但在损伤后5w，对照组脊髓组织中IgG染色几 乎为阴性，而NgR免疫组脊髓中仍有大量的IgG存在于损伤中心及其两侧较大 的范围内(图3)，表明，5w后非特异的IgG已消失，留下的是对脊髓分子特异 的IgG，这些IgG应该是NgR疫苗诱导产生的抗NgR抗体。为了进一步鉴定5w 后留在脊髓的抗体确实是抗NgR抗体，我们用先前制备的兔抗NgR抗体进行了 免疫组化染色。结果显示，对照组损伤后脊髓中NgR的免疫反应较强，且在神 经元中分布较均匀；而在NgR免疫组损伤后大鼠的脊髓中，NgR的免疫反应明显 减弱，且有的在神经元膜上呈点状分布(图4)，提示NgR免疫产生的NgR抗体 在进入脊髓后已与其靶抗原NgR结合，因此，再用兔抗NgR抗体进行免疫组化 染色时，由于脊髓中大部分NgR分子已被疫苗产生的抗体封闭，其免疫反应明 显弱于对照组。
实施例3、神经突起生长试验
分离P7-9天大鼠的小脑置于D-Hanks液中，剥去脑膜，将组织剪成1-2mm3 的小块，用消化液(含0.25％胰蛋白酶的D-Hanks液)在37℃培养箱中消化 10-12min，然后以含10％胎牛血清的DMEM培养液终止反应。反复吹打得到胞悬 液，再以1500转/min的速度离心3min，弃去上清，沉淀下来的细胞用D-Hanks 液洗涤两次，用分步贴壁培养法分离纯化小脑神经元，即先将小脑中分离到的 细胞悬浮在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，接种在未铺过多聚赖氨酸的培养 皿上，培养5min，吸取未贴壁的细胞，弃掉已贴壁的细胞，主要为一些成纤维 细胞和部分星状胶质细胞。然后再将细胞接种在未铺过多聚赖氨酸的细胞培养 皿上，培养20min，轻轻摇动细胞培养皿，吸取未贴壁的细胞，弃掉已贴壁的细 胞，主要为星状胶质细胞和一些已贴壁的神经元细胞或少突胶质细胞。通过分 步贴壁的处理，可以得到相对较纯的小脑神经元。将收集的小脑神经元细胞离 心后直接用无血清培养液Neurobasal/B27(体积比为50∶1)重悬，然后接种至 包被有抑制分子MAG的玻片上，同时在培养液中分别加入免疫前，NgR免疫组和 对照组大鼠血清(1∶100)，每组设3个复孔，同样的实验重复3次。培养24h 后，固定细胞，用NF抗体(1∶100，Sigma公司)标记神经元，用Confocal每 组随机拍取几十个视野，用nurolucida软件(MicroBrightField Inc公司)测 量视野中每个神经元的突起，每组测量150个神经元，取其平均突起长度做统 计分析。
结果显示，加入免疫前血清和对照组血清的神经元平均突起长度分别为 12.09μm和13.63μm；而加入三个不同个体NgR免疫血清的神经元平均突起长 度明显增长，分别为23.27μm，24.78μm和19.17μm，差异具有显著性(其中NgR 免疫组个体1，个体2与对照血清组或免疫前血清组相比P＜0.01；个体3与对 照血清组或免疫前血清组相比P＜0.05，图5)。这一结果表明，抗NgR抗血清 可逆转抑制分子MAG对神经元突起生长的抑制作用。
实施例4、大鼠脊髓半横切模型
(1)脊髓半横切手术
脊髓半横切手术分为NgR免疫组(n＝15)和对照组(n＝10)。手术步骤如下： 大鼠用戊巴比妥钠50mg/kg麻醉后剃去背部毛发；75％酒精消毒皮肤，切开皮 肤，分离肌肉置椎管完全暴露；用咬骨钳咬去T9椎板至脊髓充分暴露，用做好 标记的显微手术剪半横断背侧脊髓，深度为1.6mm；依次缝合肌肉和皮肤。术中 注意保温，术后一周每天给予液体和抗生素预防感染，每天三次进行常规护理 直至动物恢复自主排尿。
(2)脊髓中抗体的免疫组化检测
为了观察诱导的抗NgR抗体在大鼠脊髓损伤后是否进入了脊髓损伤区域， 我们分别对NgR免疫组和对照组损伤后3d和5w的脊髓组织切片中的免疫球蛋 白IgG进行了免疫荧光染色。即将组织切片用含10％正常山羊血清的封闭液室 温封闭1h后，直接加入FITC标记的羊抗大鼠IgG的二抗，37℃孵育1h，Confocol 下观察结果并拍照。为了进一步观察诱导的抗NgR抗体进入损伤的脊髓后是否 能封闭其靶抗原NgR分子，我们进一步用兔抗大鼠NgR抗体分别对NgR免疫组 和对照组损伤后的脊髓组织切片进行了免疫荧光染色，用Confocal显微镜 (ZEISS LSM510)观察结果和拍照，并用软件对NgR的免疫荧光强度进行了统 计分析。
结果如图3显示，在脊髓损伤后3天和35天，用FITC标记的羊抗大鼠IgG 抗体检测NgR免疫组和对照组脊髓组织中的免疫球蛋白。在损伤后3d，对照组 和NgR免疫组IgG染色均为阳性；但在损伤后5w，对照组脊髓组织中IgG染色 几乎为阴性，而NgR免疫组脊髓中仍有大量的IgG存在于损伤中心及其两侧较 大的范围内。图片采自损伤中心头侧约2mm处的脊髓白质区域。
实施例5、行为学试验
开放场地试验(Open field locomotor test，BBB)，在损伤前1d，脊髓 横断术后1d，3d，1w，2w，4w和5w各进行一次BBB评分来评价大鼠后肢的运动功 能。将每只大鼠放置于一宽敞的场地中，自由活动4min，由两名观测者按照BBB 评分标准进行评分，将二人的评分均值用于统计分析。
网格步行试验(Grid walking)，在损伤后5w即处死前进行一次网格步行 试验。将大鼠置于一1m2的不规则的网格(0.5-5cm)上自由行走4min，由两名 观察者各计数一侧后肢的步数，若行走时后爪及脚跟掉入网格平面以下，则计 数为一次错步。同时计数一侧后肢行走的总步数和错误步数。计算错误步数占 总步数的百分比用于统计分析。
在脊髓半横切手术后1d，所有大鼠的的后肢均完全不能活动，BBB评分为0 分；从3d开始一直观察到5w大鼠的后肢功能逐渐恢复，但NgR免疫组大鼠的 BBB评分始终要高于对照组，且从2w开始一直到观察终点5w，两组的差异具有 显著性(P＜0.05，图6A)。在损伤后5w进行的网格步行实验结果也显示，NgR 免疫组大鼠后肢功能恢复要好于对照组，其后肢步行平均出错率分别为41.99 ％和23.42％(P＜0.05，图6B)。这表明，对于脊髓半横断损伤模型，NgR疫苗 可以明显促进损伤脊髓的功能恢复。
实施例6、皮质脊髓束顺行标记及免疫组化染色
在脊髓半横切损伤后3w，将NgR免疫组(n＝12)和对照组(n＝6)大鼠用 生物素化的葡聚糖胺(BDA，Molecular Probes公司)进行皮质脊髓束顺行标记， 方法如下：将大鼠麻醉后剪去头顶的毛发并定位置脑立体定位仪上；消毒皮肤， 切开头颅顶部中央皮肤，刮去骨膜，清晰暴露出前囟位点及其周围相应部位的 一片颅骨；先将立体定位仪定位出前囟位点，然后以前囟为坐标0点分别定位 以下6个位点：(±3mm，2mm)，(±2.5mm，0mm)，(±2mm，-1mm)，做好标记 后，钻去这一区域的颅骨并撕开表面的硬脑膜暴露出皮层，用微量注射针将10 ％的BDA立体注射至相应的6个位点，0.5μl/点，注射深度为1mm；缝合皮肤， 并给予抗生素预防感染。2w后即损伤后5w，将大鼠在麻醉状态下灌注固定，并 取出脑和脊髓标本，标本经后固定和蔗糖梯度脱水后进行冰冻切片。其中从损 伤中心头侧1cm到尾侧1cm的一段2cm脊髓进行矢状切片；损伤中心头侧 1.1-1.6cm和尾侧1.1-1.6cm两个节段进行冠状切片；切片厚度为20um。
BDA免疫组化染色：组织切片用先用PBS浸泡5min两次，然后用含1％H2O2 的PBS室温浸泡15min，经PBS清洗后用0.3％TritonX-100/PBS预渗透30min， 然后加入HRP耦联的avidin(1∶1500)室温孵育1-3h；PBS清洗后用DAB进行显 色5-10min，PBS清洗终止反应，切片经梯度酒精脱水和二甲苯透明后用中性树 胶进行封片，显微镜下观察结果。
免疫组化染色显示：在脊髓损伤上游11-16mm(头侧)的冠状切片上，对照 组和NgR免疫组CST相应的投射区域均可看到被标记上的神经纤维，二者并没 有明显差别；但在脊髓损伤下游11-16mm(尾侧)的冠状切片上，对照组(n＝6) 没看到被标记上的轴突，而在NgR免疫组(n＝12)中，有33％(n＝4)的大鼠 在相应投射区域仍能看到一些被标记上的轴突(图7A)。在包含损伤中心的一段 2cm长的脊髓矢状切片上，我们可以看到，在对照组中，被标记上的神经纤维均 停止在损伤中心的上游；而在NgR免疫组，有75％(n＝9)的个体，其部份标 记的轴突可跨过损伤区域延伸至损伤下游(图7B)。我们统计了NgR免疫组再生 轴突的长度，结果显示，在12个个体中，有9个个体的轴突有再生，其再生的 最大距离从7mm-15mm不等，其中有4个个体的再生距离超过了10mm(图7C)。
实施例7、大鼠脊髓重物坠落伤模型
我们将另一部分经NgR免疫的大鼠用于脊髓撞击伤模型制作，设NgR免疫 组(n＝5)和对照组(n＝4)。手术采用纽约大学脊髓重物坠落伤模型(NYU Impactor)，手术在保温垫上操作，具体方法如下：
(1)1％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉动物，剃去背部毛发；
(2)75％酒精消毒，切开皮肤，分离肌肉，暴露椎管；
(3)用咬骨钳咬去T9脊突，沿T9与T10间的脊间孔咬去锥板，充分暴露脊髓(直 径约2.5mm的圆形开口)；
(4)将大鼠固定于NYU重物坠落装置上，按物重10g，高度12.5mm的参数，在 暴露的脊髓处制造中等损伤程度的脊髓撞击伤模型。
术后每天三次进行排尿护理直至动物能进行主动排尿；术后三天每天按常 规给予补液及抗生素以预防感染。
实施例8、行为学试验(方法同前)
脊髓撞击伤大鼠在损伤前1d，损伤后1d，3d，1w及以后每周一次直至8w 进行一次BBB评分；从第2w到第8w，每周进行一次网格步行试验。
结果显示，在损伤后3d，NgR疫苗免疫组的BBB评分为3.167±0.289，与 对照组(1±0.632)相比具有显著性差异(P＜0.01)，且一直到观察终点-损伤 后8w，NgR疫苗免疫组的BBB评分始终高于对照组。在损伤后8w，NgR疫苗免 疫组的BBB评分已恢复到15.33±1.528，而对照组为13.33±1.516(P＜0.01， 图8A)。网格试验结果也显示，从损伤后2w开始，一直到8w，NgR疫苗免疫组 大鼠后肢步行时的出错率要显著低于对照组(P＜0.01，图8B)。这表明，对于重 物坠落脊髓损伤模型，NgR疫苗同样可以显著促进损伤脊髓的功能恢复。
实施例9、组织学观察
在脊髓损伤后8w，将动物灌注固定，取脊髓标本进行冰冻切片。将包含损 伤部位的1cm的脊髓片段(损伤中心头尾侧各0.5cm)进行连续的冠状切片并编 号，切片厚度为20μm。每个标本各取一套切片用Neurolucida软件对脊髓片段 进行三维重建，将空洞的体积除以整段脊髓的体积获得空洞的百分比用于统计 分析。
结果表明，在对照组，脊髓空洞的体积百分比在13.9％到29.7％之间，平 均为20.4％；而NgR蛋白免疫组脊髓的空洞体积百分比明显缩小，平均为9.4 ％(P＜0.05，图9)。
以上实验结果显示，在脊髓半横断损伤模型中，BDA顺行标记实验结果表明， 经NgR蛋白疫苗免疫的大鼠在脊髓损伤后，其切断的神经纤维可再生，并穿越 损伤区；在重物坠落脊髓损伤模型中；组织学结果显示，经NgR蛋白疫苗免疫 的大鼠在脊髓损伤后，其损伤区空洞面积显著缩小；行为学结果则证明，接种 NgR疫苗后，两种动物模型瘫痪后肢的功能都有明显的恢复。
序列表
<110>上海交通大学医学院
<120>一种抗人Nogo-66受体蛋白疫苗的制备方法及其应用
<130>/
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1924
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
ctgtgcgccc tgcgcgccct gcgcacccgc ggcccgagcc cagccagagc cgggcggagc
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