丁二酸，又称琥珀酸(succsinic acid )，分子式为C4H6O4，分子量为118.09， 是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。
丁二酸是工业上一种重要的四碳化合物，它作为有机合成原材料、中间产 物或专业化学制品广泛应用于食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和 材料工业。它最大的市场是表面活性剂、清洁剂、绿色溶剂、离子鳌合剂、生 物可降解塑料等领域。在食品行业中作为酸化剂、pH改良剂、风味物质和抗菌 剂，以及作为原料或中间体用于医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产(Appl Microbiol Biotechnol，1999，51：545-552)。此外，丁二酸盐还可以用做反刍动 物和单胃动物如猪的饲料添加剂以及植物的助长剂。目前，丁二酸和它的大多 数衍生物的生产还处在进一步研究和开发阶段。
目前已开发出多项技术将丁二酸转化为重要的工业化学品，包括N-甲基吡 咯烷酮、1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT树 脂)、己二酸等。其中许多化工产品都是以苯为原料合成的，苯是石油或煤化工 产品，资源紧缺，不可再生。目前已大约有250种以苯为原料的化工产品可以 通过丁二酸为原料来生产。因此，全球对丁二酸的需求不断增加。
工业上丁二酸的生产方法主要为化学方法，主要有石蜡氧化法、轻油氧化 法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氢法以及以乙烯和一氧化碳为原料的 电解氧化法。目前，国内外主要使用的是催化加氢法。
以化学方法获得丁二酸，不可避免地要消耗大量不可再生的石化原料，还 对环境造成严重污染，存在转化率低，易污染环境等弊端。
丁二酸的生产可通过化学合成方法或者发酵方法来进行，由于石化原料的 日趋减少，用微生物发酵碳水化合物生产丁二酸的方注日益受到人们的重视。 由于发酵法生产丁二酸是以可再生糖源(如葡萄糖)和二氧化碳作为主要原料，因 此微生物发酵法生产丁二酸，具有成本低和摆脱对石化原料依赖的优点，而且 开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，更加显示了环境友好特征。
丁二酸是继柠檬酸后最具市场潜力的发酵有机酸产品，但目前大都还是用 化学方法生产。1999年全球丁二酸的需求量为27万吨，2001年为48万吨，2002 年的市场需求量为59万吨。以大约10万吨/年的幅度递增。根据美国Michigan大 学MBI研究所的估计，在未来几年内，丁二酸的年需求将达到100万吨的水平。
丁二酸是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌代谢的重要中间产物。产丁二酸的 微生物有：丙酸产生菌，例如Propionibacterium sp.；典型的肠杆菌，例如E.coli、 Pectinatus sp.；瘤胃菌，例如Actinobacillus succinogenes、Bacteroides amylophilus、 Brebibacterium divaricatum、Succinimonas amylolytica、Succinivibrio dextrinisolvens、Wolinella succinogenes、Ruminococcus flavefaciens等。此外， 一些乳酸菌的菌株也可产生少量的丁二酸。
其中产丙酸菌可积累低浓度的丁二酸，从瘤胃中分离出来的瘤胃菌如琥珀 酸丝状菌Fibrobacter Succinogenes(Weimer，1993)、琥珀酸弧菌Succinivibrio dextrinisolvens(O’Herrin and Kenealy，1993)、Bacteroides ruminicola(Howlett， 1976)、Bacteroides amylophilus(Caldwell，1969)等也可产丁二酸，且产量比 丙酸菌高。但瘤胃菌发酵有许多低产量的副产物，发酵不稳定，多数菌株在生 产上不能满足工业生产在经济上的要求。虽然有报道琥珀酸放线杆菌 Actinobacillus succinogenesATCC55618(US 5,504,004，1996；US 5,723,322，1998) 产丁二酸含量70g/L，产率80％以上、厌氧螺菌Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC 29305(US 5,143,833，US 5,143,834和US 5,168,055， 1992)产丁二酸43g/L，产率91％。基因工程菌E.coli AFP111/pTrc99A-pyc产 丁二酸99.2g/L，产率110％(Vemuri，J.Industrial Microbiology&Biotechnology， 2002)。但在国内，这些菌株不容易获得，并且培养发酵条件要求高，不宜用于 国内的工业生产。因此，在国内自主创新地筛选能耐受高浓度丁二酸的微生物 菌株，并且研究出一种能够生产高浓度丁二酸的发酵方法是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产丁二酸的菌种和方法，该菌株是 一株能有效生产丁二酸的新菌株，用该菌株发酵廉价的糖质原料生产丁二酸的 方法。
以下是本发明技术方案的详细描述。
微生物菌株的筛选与鉴定：
在本发明中，建立了一个快速有效的筛选高产丁二酸菌株的模型。根据产 丁二酸菌株其细胞代谢过程中产生较高的富马酸脱氢酶(Van der Werf，Arch Microbiol，1997)这一点特性，设计出以富马酸钠为唯一碳源的选择性平板， 筛选出能够利用富马酸的菌株。由于富马酸脱氢酶能够将富马酸转化丁二酸， 而富马酸在酸性条件下呈浑浊状，因此可以挑选透明圈较大的菌落以筛选出富 马酸脱氢酶较高的菌株。
本发明从牛、羊等食草反刍类动物的瘤胃中采样，取瘤胃消化物于含富马 酸的富集培养基中厌氧富集培养2-4次，再涂布于以富马酸钠为唯一碳源的选择 性分离平板上，在充满CO2的环境中培养。挑选透明圈较大的菌落，再用装有 发酵培养基的试管，厌氧发酵初筛，2-3天后取清液，点样到硅胶层析薄板上， 于苯∶乙酸乙酯∶乙酸体积比为2∶1∶0.03系统中展层，用溴酚兰显色。将保 留有丁二酸显包斑点的菌株再转接于装有发酵培养基的三角瓶中进行厌氧发酵 复筛，36-72h，用HPLC法(Lichrospher C18 250×4.6mm，5μm；流动相50 mmol/L KH2PO4，pH 2.8，紫外检测波长210nm)测定丁二酸的含量。经过对多个 瘤胃样品的大量菌株筛选工作，从分离出来的近数百株瘤胃细菌中共初筛选出 近几十株产丁二酸的菌株，最后复筛得到杂酸较少，遗传稳定性好的产丁二酸 菌株SW0580菌株。
本发明筛选得到的能有效积累丁二酸的微生物SW0580，经16S rRNA基因 测定和按《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》生理生化鉴定，认为属巴斯德菌 科(pasteurellaceae)放线杆菌属(Actinobacillus)的琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)。该菌的细胞成棒状，不运动，无芽孢，在营养肉汤培养基中可 见典型的放线杆菌特征，即散开的类球颗粒组成貌似“密码”的杆菌(摩尔斯 电码和链状呈摩尔斯电码形)。格兰氏阴性，兼性厌氧。100％CO2环境下，菌 体单独生长、成群生长和成链生长。在TSB琼脂培养基上的菌落成环形、完整、 灰色、半透明，在有CO2存在时，37℃条件下培养24h后，直径可达1～1.5mm。 在空气中培养时菌体黏着在平板上。菌株在平板、斜面上保存一周后，有明显 的衰亡现象。
微生物菌株的种子培养与发酵：
种子培养基的组成为：葡萄糖5-15g/L，酵母膏5-10g/L，玉米浆5-15g/L， Na2HPO4·12H2O 0.5-2.0g/L，NaH2PO4·2H2O 0.2-2.0g/L，混合维生素1-10ml/L， pH 6.0-7.0。
发酵培养基：糖质原料20-100g/L，氮源1-50g/L，酵母膏5-25g/L，Na2HPO4 ·12H2O 1.0-5.0g/L，NaH2PO4·2H2O 1.0-5.0g/L，NaCl 1.0-5.0g/L，MgCl2 0.1-5.0g/L， CaCl2 0.1-5.0g/L，乙酸钠0.1-5.0g/L，生物素1-5ml/L，混合维生素1-10ml/L，培 养基pH3～8。
所述混合维生素组成为：B12 5mg，B6 100mg，叶酸20mg，核黄素20mg， 硫胺素20mg，烟酸20mg，泛酸50mg，对氨基苯甲酸50mg，蒸馏水定容至 1000ml。
种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121℃，15min。维生素等热敏 性材料配制后0.2μ膜滤除菌，接种前加入。
将实验菌株接种到种子培养基中，100ml三角瓶装液20～80ml，于30-40℃ 在充满CO2的环境中静止、或在有氧的条件下震荡，培养24-48h。
按1％-10％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30～40℃， 发酵在通CO2或N2的厌氧条件下，厌氧培养1-4d。
用于发酵的糖质原料碳源可以是葡糖糖，果糖，麦芽糖，木糖，蔗糖，乳 糖，半乳糖，乳清，及木薯、玉米、甜菜或木质纤维素的水解物或糖浆。豆饼 粉、玉米浆、尿素、或硫酸铵等无机铵盐可作为培养基的氮源，发酵培养基中 还含有磷酸盐、乙酸钠等无机盐和生物素及混合维生素。发酵在通CO2或N2气 体的厌氧环境下进行，30-40℃静止或搅拌培养，并用碳酸盐、或氨水、或液碱 维持发酵液中的pH在5.5-7.0。
本发明的有益效果：本发明的特点是从新鲜瘤胃中分离了有效产生丁二酸 的琥珀酸放线杆菌CGMCC 1593，其在厌氧等适合条件下，能显著地积累丁二 酸，产丁二酸达到10-50g/L，最高达到40g/L以上，可满足实现工业生产在经 济上要求。
本发明突出的优点是利用廉价的玉米、木薯等可再生的农副产品为原料发 酵生产丁二酸，是一种可持续的生产方法，可缓解丁二酸化学合成的石化资源 紧张问题，对环境友好。
以下是琥珀酸放线杆菌CGMCC 1593筛选、鉴定及发酵生产丁二酸的实施 例。但本发明并不限于所列出的几个实例。
生物材料样品保藏：琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)SW0580 菌株已于2006年1月23日保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No1593。

实施例1
从无锡市某肉牛屠宰场刚宰杀牛的新鲜瘤胃中采样，取瘤胃中消化物，接 种于装有80mL含富马酸钠的富集培养基的三角瓶中，37℃厌氧培养约36-48h， 按10％的接种量再进行两次富集。取富集培养物用PBS(0.145mol/L氯化钠， 0.01mol/L磷酸钠水溶液)稀释并涂布于以富马酸钠为唯一碳源的平板筛选培养 基的选择性平板上，培养48h。挑选透明圈较大的菌落，接种至装有5mL发酵 培养基的试管中，厌氧培养36h。用TCL法测定上清液，160个菌落中共选出 72株类似丁二酸斑点的菌落。
其中：富集培养基(g/L)：玉米浆20，葡萄糖15，富马酸钠5.88，CaCl2 0.2， MgCO3 10，K2HPO4 3.0，NaCl 1.0，(NH4)2SO4 1.0，MgCl2 0.2。
平板筛选培养基(g/L)：富马酸钠25，蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 5，NaHCO3 2，半胱氨酸盐酸盐1，琼脂20。种子培养基(g/L)：葡萄糖5，酵母膏5，玉 米浆5，Na2HPO4·12H2O 0.5，NaH2PO4·2H2O 0.5，混合维生素1ml/L，pH 6.5。
初筛发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏5，NaCl2 1，MgCl2 2，Na2HPO4 0.5，NaH2PO4 0.5，MgCO3 10，混合维生素1ml/。pH值均调为6.5。
实施例2
将保留的菌株转接于装有5mL上述发酵培养基的试管中，37℃厌氧培养 36h。取5mL培养液转接到装有80ml同样发酵培养基的三角瓶中，并补加灭过 菌的碳酸钙，控制pH6.5，37℃厌氧培养48h后，过滤，用HPLC法测定上清液 中丁二酸的含量。多数菌株乳酸含量较高，仅有II-80号(实验室编号为SW0580) 产丁二酸显著。
表1  部分试验菌株的产酸情况

实施例3
对筛选的SW0580菌株按《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》进行生理生 化特性鉴定(见表2)，并按精编分子生物学实验指南的方法提取染色体DNA， 以Y1和Y2为正向和反向引物(Y1：ATTGAACGCTGGCGGCAGGC，Y2： CGGGCGGTGTGTACAAGGCC)，用PCR扩增16S rRNA基因，委托上海申能 博生物科技有限公司进行16S rDNA测序，得到本菌株部分16S rRNA基因片断 后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rRNA基因序列， 并进行同源性比对(表3)。基于16S rDNA序列分析和生理生化特性鉴定，结 合对该菌的生长和发酵特性进行研究，与最接近(或同源性最高)的菌株 Actinobacillus succinogenes ATCC 55618比较，其生理生化特性中利用柠檬酸盐、 H2S反应、色氨酸(吲哚)有不同，因此认为是琥珀酸放线杆菌的变种，拟命名 为琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)SW0580，此菌株已保存在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1593。
表2  生理生化特性鉴定结果对照表


CGMCC 1593菌株的16S rDNA序列(1289bp)
CGGTAACGGG TGGAAAGCTT GCTTTCCATG CTGACGAGTG GCGGACGGGT GAGTAATGCT  60
TGGGGATCTG GCTTATGGAG GGGGATAACG ACGGGAAACT GTCGCTAATA CCGCGTAATG  120
TCTAAGGACT AAAGGGTGGG ATTTTCGGAC CGCCCGCCAT AAGATGAGCC CAAGTGGGAT  180
TAGGTAGTTG GTGGGGTAAA GGCCTACCAA GCCGACGATC TCTAGCTGGT CTGAGAGGAT  240
GACCAGCCAC ACTGGAACTG AGACACGGTC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA  300
TATTGCGCAA TGGGGGCAAC CCTGACGCAG CCATGCCGCG TGAATGAAGA AGGCCTTCGG  360
GTTGTAAAGT TCTTTCGGTG GTGAGGAAGG CGGATAAGTT AACAGCTTAT TCGATTGACG  420
TTAGCCACAG AAGAAGCACC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGGAGGGTG  480
CGAGCGTTAA TCGGAATAAC TGGGCGTAAA GGGCACGCAG GCGGCTATTT AAGTGAGATG  540
TGAAATCCCC GGGCTTAACC TGGGAACTGC ATTTCAGACT GGGTAGCTAG AGTACTTTAG  600
GGAGGGGTAG AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATGTGGAGG AATACCGAAG  660
GCGAAGGCAG CCCCTTGGGA ACGTACTGAC GCTCATGTGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA  720
GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCTGTA AACGCTGTCG ATTTGGGGAT TGGGCGATAA  780
GCCTGGTGCC CGAAGCTAAC GTGATAAATC GACCGCCTGG GGAGTACGGC CGCAAGGTTA  840
AAACTCAAAT GAATTGACGG GGGCCCGCAC AAGCGGTGGA GCATGTGGTT TAATTCGATG  900
CAACGCGAAG AACCTTACCT ACTCTTGACA TCCTCAGAAT CCGGTAGAGA TATCGGAGTG  960
CCTTCGGGAA CTGAGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTT GTGAAATGTT  1020
GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT ATCCTTTGTT GCCAGCATGT AGAGATGGGA  1080
ACTCAAAGGA GACTGCCGGT GATAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGTC AAGTCATCAT  1140
GGCCCTTACG AGTAGGGCTA CACACGTGCT ACAATGGCGT ATACAGAGGG AAACGAGCCC  1200
GCGAGGGGGA GTGAATCTCA GAAAGTGCGT CGTAGTCCGG ATTGGAGTCT GCAACTCGAC  1260
TCCATGAAGT CGGAATCGCT AGTAATCGC                                    1289
其中，组成为A25.7％；C21.3％；G32.6％；T20.4％；)
表3  16S rDNA序列同源性(或相似性)比较
  菌株名称   GenBank编号   序列同源性   (％)   CGMCC 1593   100   Actinobacillus capsulatus   M75062   92   Actinobacillus genomo sp.52418-03   AY749139   94   Actinobacillus indolicus STRAINH 1271   AF268963   94   Actinobacillus lignieresii F 127   AF247722   94   Actinobacillus minor H1275   AF268944   94   Actinobacillus muris   AF024526   93   Actinobacillus pleuropneumoniae   MCCM_00189   AF224283   93   Actinobacillus porcitonsillarum   AF486274   94   Actinobacillus succiniciproducens ATCC55618   AF024525   99   Actinobacillus succinogenes CCUG 43843   AY362898   99   Acidithiobacillu thiooxidans   AF359941   94   Haemophilus haemoglobinophilus CCUG 3714   AY362907   95   Haemophilus parahaemolyticus   HPA295746   94   Histopphilus somni 2336   AF549388   93   Histophilus somni   AB176900   93   Mannheimia sp.R19.2   AF53894   94   Mannheimia sp.BA597/9   AY465370   94   Mannheimia sp.BJ3956.1   AY425295   94   Mannheimia succiniciproducens MBE55E   AE016827   94   Mannheimia varigena V1835   AY425282   94   Pasteurella haemolytica PH704   PHU57072   94   Pasteurella aerogens MCCM0155O   AF224288   93   Pasteurellaceaegen sp.CCUG28030   AF024527   93   Escherichia coli   J01695   88
实施例4
将CGMCC No.1593接种到含不同葡萄糖浓度的上述发酵培养基中，发酵培 养基组成为：糖质原料20-100g/L，氮源1-50g/L，酵母膏5-25g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0-5.0g/L，NaH2PO4·2H2O 1.0-5.0g/L，NaCl 1.0-5.0g/L，MgCl2 0.1-5.0g/L，CaCl2 0.1-5.0g/L，乙酸钠0.1-5.0g/L，生物素1-5ml/L，混合维生素1-10m/L，培养基 pH3～8；所述混合维生素组成为：B12 5mg，B6 100mg，叶酸20mg，核黄素20mg， 硫胺素20mg，烟酸20mg，泛酸50mg，对氨基苯甲酸50mg，蒸馏水定容至 1000ml。控制pH6.5，在充满CO2或N2的环境中37℃静止培养2-4天，用HPLC 测定发酵液中丁二酸的含量。
当葡糖糖浓度为60g/L时，发酵4天时发酵液中丁二酸的浓度达到25.81g/L。 当葡糖糖浓度为80g/L时，发酵4天时发酵液中丁二酸的浓度达到32g/L。
实施例5
将60g/L乳糖、或蔗糖、或麦芽糖代替上述发酵培养基中的葡萄糖，并接入 培养好的CGMCC No.1593种子，用2mol/L Na2CO3调节发酵液pH维持在6.5， 按上述的条件进行发酵，发酵4天测定发酵液中的丁二酸及杂酸。结果如表4：
表4  CGMCC No.1593菌株对不同糖的发酵产酸
  丁二酸含量   (g/L)   乙酸含量   (g/L)   乳酸含量   (g/L)   甲酸含量   (g/L)   麦芽糖   35.29   10.03   0.68   0.92   蔗糖   21.16   1.10   14.07   0   乳糖   27.54   6.79   0   0   葡糖糖   25.81   11.36   1.13   0
实施例6
将木薯或玉米磨粉，过40目筛，取木薯粉或玉米粉200g，加1L水调和， 加1ml液化酶(杰能科公司，无锡)搅匀，100℃保温1h。用木薯和玉米粉水解 糖代替上述发酵培养基中的葡糖糖(含还原糖60g/L)，接入培养好的CGMCC No.1593，按上述的条件进行发酵，发酵4天测定发酵液中的丁二酸及杂酸。结 果如表5：
表5  CGMCC1 No 1593菌株对木薯和玉米粉水解糖的发酵产酸
  丁二酸含量   (g/L )   乙酸含量   (g/L)   乳酸含量   (g/L)   甲酸含量   (g/L )   木薯水解糖   29.30   8.19   0.93   3.82   玉米粉水解糖   25.35   6.90   1.03   3.46   葡糖糖   25.81   11.36   1.13   0
实施例7
按实施例6，用木薯粉水解糖作为发酵培养基中的糖源，按含还原糖 20～150g/L配制不同浓度的发酵培养基，接入培养好的CGMCC 1 No.593，按上 述的条件进行发酵，发酵4天后测定发酵液中的丁二酸及杂酸含量(因测出的 乳酸含量都低于1g/L，所以表中未显示)。结果如表6：
表6  CGMCC No.1593菌株对不同浓度木薯粉水解糖的发酵产酸
  木薯液化   糖(g/L )   发酵结束   pH   菌浓   OD660   残糖   (g/L)   丁二酸含   量(g/L )   乙酸含量   (g/L)   甲酸含量   (g/L)   20   6.23   1.97   5.01   11.51   4.90   2.96   40   6.84   3.33   9.30   25.93   6.13   4.00   60   6.64   3.69   9.13   29.30   8.19   3.82   80   6.60   4.36   27.03   35.08   14.26   9.90   100   6.63   4.61   42.06   36.45   15.25   11.30   120   6.74   4.58   57.73   32.82   14.27   12.05   140   6.21   4.54   36.29   27.65   12.35   10.29   150   6.18   4.47   40.55   28.08   12.62   10.93