本发明涉及生长激素的一种新溶液及其配制所需器材。此溶液可在较长时间内保持清彻，在机械振荡下也可保持清彻。

生长激素（somatotropins），亦即growth  hormones，是由多种动物垂体腺分泌的多肽激素。这类激素具有多种治疗用途，其合成物可用于治疗人类脑垂体缺陷，胃肠道出血和加速骨折、挫伤和其它创伤的愈合过程。通过不同的施药方法和注射，还可以促进动物肉、乳的生产。（参见：

E.J.  Turman，“Some  Effects  of  Pituitary  Anterior  Growth  Factor”Thesis：Purdue  University，April，1953;L.J.Machlin，J.Anim.Sci.35：794-800（1972）;T.R.Kasser  et  al.，J.Anim.Sci.53：420-426;L.J.Machlin，J.Dairy  Sci.56：575-580（1973））.

生长激素这类蛋白质的加工和使用常常需用其溶液，然而，溶解的生长激素如蛋白质会被疏水界面吸附从而产生继发性反应。如“变性”。即吸附的生长激素分子形状发生改变。另外，吸附的生长激素分子的聚集作用还会产生可溶或不可溶的聚合形式。这种聚集作用表现的例子是，当搅拌和振荡生长激素的水溶液时，溶液混浊，或生长激素失去生物活性。（参见A.F.Henson等人，J.Colloid  Interface  Sci.32：162（1970））

当生长激素从溶液中沉淀出来以后，沉淀出的蛋白质就不能再用，因此，需要有一种在搅拌振荡后不会混浊，贮存较长一段时间仍能保持清彻的溶液。

本发明公开的生长激素溶液将能较长时间地保持清彻，并且在机械振荡下也不会产生混浊和沉淀。此溶液包括冷冻干燥的生长激素组合物，该组合物每2-8份盐酸精氨酸含约1份生长激素（重量比），冷冻干燥前此组合物的PH值在7.2-8.5之间，溶解于稀释液中。如果冷冻干燥前生长激素组合物的PH值低于7.8，稀释液含有乙二胺四乙酸（EDTA）一种非离子表面活化剂和一种缓冲剂;如果冷冻干燥前生长激素组合物的PH值为7.8或更高，则此稀释液包括EDTA和一种非离子表面活化剂，发需要还可包括一种合适的缓冲剂或非缓冲介质。虽然两种介质均可使用，但如果加入非缓冲介质，就不可再加缓冲剂。

本发明还提供配制此溶液的器材，包括一个装有冷冻干燥的生长激素组合物（每2-8份盐酸精氨酸1份生长素（重量比））的小瓶，还包括另一个装有生物适合的稀释液的小瓶，内装EDTA和一种非离子表面活化剂。另外，如前所述，根据冷冻干燥前生长激素组合物的PH值，此稀释液还可含有一种缓冲剂或非缓冲介质。如果冷冻干燥前生长激素组合物的PH值小于7.8，小瓶内还应含有一种缓冲剂。如PH等于或大于7.8，小瓶内可选地含有一种缓冲剂或非缓冲介质。可将此稀释液加入冷冻干燥后的生长激素组合物中，摇动所得混合物，使生长激素溶解。

本发明提供能较长时间地保持清彻并且在机械振荡、摇动和涡流搅拌下仍不混浊和不会产生沉淀的生长激素溶液。所谓能保持“清彻”的生长激素溶液是生长激素溶于稀释剂后不沉淀的溶液。此溶液在贮存几日，一般至少五日之后仍保持清彻，此溶液一般在25℃下至少五日保持清彻。如贮存温度稍高，此溶液仍可保持清彻，只是保存时 间可能缩短。一种保持清彻的溶液，其在360nm处的表观吸光度（0.0360）小于0.10。

本生长激素溶液晶民含冷冻干燥的生长激素组合物，冷冻干燥前的PH值至少为7.2，一般在7.2-8.5之间。如果冷冻干燥前生长激素合成物的PH值小于7.8，稀释液则包括EDTA，一种非离子表面活化剂和一种合适的缓冲剂，以稳定最终的生长激素溶液。如果冷冻干燥前生长激素组合物的PH值大于或等于7.8，稀释液则包括EDTA，一种非离子表面活化剂和可选地包括一种缓冲剂或非缓冲介质。虽然两种介质都可使用，但如果加入非缓冲介质，则最好不要再加缓冲剂。如果冷冻干燥前生长激素组合物的PH值大于或等于7.8，缓冲剂和非缓冲介质都不是必需的，但其中任何一种均可调节和保持所得生长激素溶液的等渗性以免其变为高渗溶液，这在动物注射生长激素溶液中是必需的。适当添加物的选择基于许多因素，包括例如价钱（FDA，GRAS  List中列有），高压灭菌能力，化学稳定性，与生长激素无相互作用以及生物适合性。

冷冻干燥的生长激素组合物的制备为将盐酸精氨酸溶于生长激素中，调节溶液的PH值至7.2以上，以7.2-8.5为宜，然后用过滤和离心法除去不溶物质，将生长激素和盐酸精氨酸溶液用已知技术的标准程序冷冻干燥。

冷冻干燥的溶液通常包括，每2-8份盐酸精氨酸1份生长激素（重量比），最好为每3份盐酸精氨酸1份生长激素。因此，此溶液最好包括10-150mg/ml生长激素和30-450mg/ml盐酸精氨酸，最终PH值不小于7.2。最适宜的是，冷冻干燥的溶液包括30mg/ml生长激素和90mg/ml盐酸精氨酸，其最终PH值在7.2-8.5之间。

本发明中冷冻干燥的生长激素组合物中的生长激素可为任何一类生长激素，包括天然或合成的牛、猪、人、鸟、羊或马的生长激素， 最好用猪的生长激素。此处名词“生长激素”是指包括完整的天然激素或合成的生长激素及共具有促生长能力的衍生物。衍生物包括具有生物活性的断片或此类多肽激素的类似物。例如δ-7猪生长激素（delta  7  porcine  somatotropin），它具有与猪生长激素相同的氨基排列，比成熟、完整的猪生长激素少首七个氨基酸（见European  Patent  Application  Publication  No.0  104  920  to  Biogen  N.V.）.此处术语“生物活性”是指该多肽用于活体后对其生物过程有显著的影响。

本发明中所用的生长激素可以是金属结合的生长激素。金属结合的生长激素由在含有生长激素的水溶液中加入过渡金属盐产生。这些过渡金属盐与生长激素产生不溶复合物，从溶液中沉淀出来。金属结合的生长激素含有生长激素分子和金属离子，如Zn+2，Cu+2，Co+2，Mn+2Fe+2和Fe+3，其中金属离子和生长激素分子中某些氨基酸残基上的氮原子以配位键相连。金属结合的生长激素可作为制备冷冻干燥的生长激素组合物的原料。尽管冷冻干燥的生长激素合成物中含有金属，但一旦经冷冻干燥，金属就不再与生长激素相连。当用于生物体时，产物中的过渡金属对生长激素的生物活性并无任何显著的不利影响。

本发明的生长激素溶液可通过将冷冻干燥的生长激素组合物溶于稀释液中制备，最终溶液PH值至少为7.2，一般为约7.2-8.5，最好为7.2-8.2之间。如果溶液的PH值大于8.5，蛋白质将会降解。一般地，1ml稀释液中溶解约0.5-40mg冷冻干燥的生长激素组合物，生长激素溶液的最终浓度以每毫升稀释液10-30mg冷冻干燥的生产激素组合物为宜，最好为每毫开稀释液约20mg冷冻干燥的生长激素组合物。冷冻干燥的生长激素组合物的重量为其中所含盐酸精氨酸和生长激素重量之和。

如果配制生长激素溶液的生长激素组合物冷冻干燥前的PH值小于7.8，则稀释液含EDTA，一种非离子表面活化剂和一种缓冲剂。另一 方面，如果生长激素组合物的PH值大于或等于7.8，则稀释液含有EDTA，一种非离子表面活化剂和可选地含有一种缓冲剂或非缓冲介质。如果稀释液含缓冲剂，则最终生长激素溶液的PH值将与缓冲液的PH值一致，但如果稀释液是非缓冲的，则生长激素组合物的PH值将决定最终生长激素溶液的PH值。

如果最终生长激素的溶液PH值在约7.2-7.6之间，稀释液中所用EDTA的浓度应至少为1.5mM，最好为1.5mM-10mM。如果最终生长激素溶液的PH值大于7.6，则稀释液中所用EDTA的浓度至少为1.0mM，最宜在1.0mM至10mM之间。

适用于稀释剂中的表面活化剂包括：聚氧乙烯-23-月桂醚（布里剂Brij35），吐温80，聚氧乙烯-20-鲸蜡醚（布里剂Brij58）以及其它具有相似亲水/疏水平衡（HLB）的聚氧乙烯非离子表面活化剂。现有技术表明此类非离子表面活化剂可稳定和保持纯化酶的活性。（见T.Kitani  et  al.  Eur.J.Biochem.119：177-181（1981）;M.Pritchard  et  al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.100：1597-1603（1981）;Seely  et  al.Biochemistry，Vol.21，No.14，3394-3399（1982））。一般地，所用表面活化剂的浓度范围为约为0.08%-2.0%。如果表面活化剂用Brij35，则Brij的浓度至少为0.08%，最好在0.1%-0.2%之间。如果表面活化剂用吐温80或Brij58，则其浓度以0.1%-1.0%为宜。

如果冷冻干燥前生长激素的PH值大于或等于7.2小于7.8，则稀释液中的缓冲剂可增加生长激素溶液的稳定性。缓冲剂可以是盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris  HCl），磷酸盐或其它中性与受体相容的PH缓冲剂。一般地，加入缓冲剂的浓度范围为约0.2-0.5M。如果用Tris  HCl 作缓冲剂，Tris  HCl的浓度至少为0.2M，宜为0.2M-0.3M。

如果冷冻干燥前生长激素合成物的PH值大于或等于7.8，稀释液中可根据需要加入前面所述的缓冲剂或非缓冲介质，以调节或保持生长溶液的等渗性。非缓冲介质也应与受体相容。这类非缓冲介质包括蔗糖、海藻糖或氯化钠。如果用非缓冲介质。其浓度应为0.05M-0.5M。如果非缓冲介质用蔗糖或海藻糖，适宜的浓度范围是0.1-0.3M。如非缓冲介质用氯化钠，浓度以0.05M-0.15M为宜。

制备本发明的器材包括装有前述冷冻干燥的生长激素组合物的小瓶和另一装有前述稀释液的小瓶。将稀释液注入冷冻干燥的生长激素化合物中振荡使生长激素溶解。

本发明的生长激素溶液可用于进一步加工或直接施用于动物体。此溶液在室温下（一般为25℃）可保存至少5天不混浊。此溶液还可贮存于稍高一些的温度下，尽管其贮存时间可能缩短。此溶液在振荡、搅动等机械振荡下也不会沉淀出长生激素。溶液中的生长激素可保持生物活性，可按常规技术施用于动物体以促进生长。

本发明还可用以下实施例说明，但这些实施例并不构成对本发明范围的限定。

实施例

以下实施例中溶液的清彻度用目视法和/或360nm下测定表观光密度（0.D.360）来测定，此波长下生长素没有内吸收。生长激素溶液装在样品比色杯中，0.D.360用Shimadzu  UVU  160分光光度计测定。不含生长激素的稀释液作为对照。所有实验均用石英比色杯。实施例中“清彻”是指0.D.360小于0.10的溶液。

实施例1

按照欧洲专利申请第83300803.9号所公开的方法制备32克锌合猪生长激素（PST），将其和90克盐酸精氨酸溶于1升无菌水中，用盐酸或氢氧化钠水溶液将PH值调至7.8，用聚二氟乙烯膜过滤，除去不溶物质，然后对此透明液体进行冷冻干燥。生成物（命名为“冷冻干燥的猪生长激素（PST）组合物）含有每90克盐酸精氨酸约30克PST，过滤过程损失原33克PST中10%的不溶PST。

实施例2

在含有0.639g  PST和21.6ml  PH值为9.8，0.46M的碳酸钠缓冲液的非锌合PST溶液中加入1.92克固体盐酸精氨酸，搅拌，使精氨酸溶解，滴加1M氢氧化钠溶液调节PH值至7.8。生成溶液含有约30mg/mlPST和90mg/ml精氨酸。用移液管将溶液的等分试样（7.2ml）移入三个50ml的小瓶中，冷冻至-80℃然后进行冷冻干燥。

冷冻干燥的PST组合物易溶于200mM  Tris  HCl，2mM  EDTA，0.15%Brij  35中（PH为7.8），浓度为20mg/ml（溶解时间小于3分钟）。用目视法观察到生成溶液是清彻的。

实施例3

准备以下的溶液：

1.  0.2  M  Tris  HCl,  2  mM  EDTA,  0.15%  Brij  35,

pH  7.8

2.  "  "  "  "  "  "  ",

pH  7.4

3.  2  mM  EDTA,  0.15%  Brij  35,  pH  7.8

将锌合的PST（Zn-PST），非金属结合的PST（non-Zn  PST）以及冷冻干燥的PST组合物（用实施例1的方法制备）分别溶于以上溶液，振荡2分钟（浓度为5mg/ml  PST或20mg/ml冷冻干燥的PST组合物 ）。振荡2分钟后所得溶液的清彻度用目视法和在360nm测定浊度的方法测定。如表1所示，只有冷冻干燥的PST组合物在此条件下可得到清彻的溶液。结果如表1所示：

表1

PST  溶液  OD360

Zn-pST  #1  0.522

〃  #2  0.504

〃  #3  0.381

non-Zn  pST  #1  0.242

〃  #2  0.347

〃  #3  0.186

冷冻干燥的PST组合物

〃  #1  0.019

〃  #2  0.019

〃  #3  0.019

实施例4

配制以下的稀释液：

1.  0.2M  2mM

Tris  HCl  EDTA  PH7.8  含有  0.15%  BriJ35。

2.  〃  〃  〃  〃  〃  0.125%  〃  。

3.  〃  〃  〃  〃  〃  0.10%  〃  。

4.  〃  〃  〃  〃  〃  0.08%  〃  。

5.  〃  〃  〃  〃  〃  0.06%  〃  。

6.  〃  〃  〃  〃  〃  0.04%  〃  。

7.  〃  〃  〃  〃  〃  0.00%  〃  。

称七份等分的40mg冷冻干燥的PST组合物（用实施例1的方法制备）分别置入七个13×100的试管中，分别用2ml以上的稀释液溶解。所得溶液用涡动搅拌器（调至4.5）搅动30秒，用目视法和分光度法测定0.D.360，其结果如表2所示：

表2

不同稀释液对重组PST机械稳定性的影响

稀释液编号  表现  O.D.360

1  清彻  0.040

2  清彻  0.047

3  清彻  0.072

4  清彻  0.092

5  稍混浊  0.257

6  稍混浊  0.484

7  非常混浊  1.708

如表2所示，在此条件下涡动搅拌稀释液中冷冻干燥的生长激素组合物，只有所含Brij35浓度大于0.08%的溶液可保持清彻，而所含Brij35浓度小于0.08%的生长激素溶液在涡动搅拌后不能保持清彻。

实施例5

称40mg等分的冷冻干燥的PST组合物于2英钱的玻璃小瓶中，然后用含有200mM  Tris  HCl，0.10%  Brij35和以下EDTA浓度和最终PH值的稀释液溶解：

1.  2.0  mM  EDTA,  pH  7.2

2.  0.25  mM  〃  ,  pH  7.4

3.  0.50  mM  〃  ,  〃

4.  1.00  mM  〃  ,  〃

5.  1.50  mM  〃  ,  〃

6.  2.00  mM  〃  ,  〃

7.  0.25  mM  〃  ,  pH  7.6

8.  0.50  mM  〃  ,  〃

9.  1.00  mM  〃  ,  〃

10.  1.50  mM  〃  ,  〃

11.  2.00  mM  〃  ,  〃

12.  0.25  mM  〃  ,  pH  7.8

13.  0.50  mM  〃  ,  〃

14.  1.00  mM  〃  ,  〃

15.  1.50  mM  〃  ,  〃

16.  2.00  mM  〃  ,  〃

将这些样品置于25℃恒温箱中，在不同时间用肉眼观察其清彻度，结果如表3所示

表3

不同稀释液对重组PST溶液稳定性的影响

溶液#  1天  5天  10天

1  清彻  清彻  清彻

2  稍混浊  稍混浊  非常混浊

3  清彻  混浊  非常混浊

4  清彻  稍混浊  混浊

5  清彻  清彻  清彻

6  清彻  清彻  清彻

7  清彻  混浊  非常混浊

8  清彻  稍混浊  非常混浊

9  清彻  稍混浊  混浊

10  清彻  稍混浊  清彻

11  清彻  稍混浊  清彻

12  清彻  混浊  非常混浊

13  清彻  清彻  混浊

14  清彻  清彻  稍混浊

15  清彻  清彻  清彻

16  清彻  清彻  清彻

如表3所示，此条件下含有浓度大于1.5mM  EDTA，PH为7.2-7.6的生长激素溶液在将冷冻干燥的PST合成物溶于稀释液后至少10天保持清彻。而此条件下含有浓度大于1.0mM  EDTA，PH值大于7.6的生长激素溶液在将冷冻干燥的PST合成物溶于稀释液后仍能至少5天保持清彻。

实施例6

称40mg等分成16份的冷冻干燥的PST合成物置入16个两英钱的小瓶中，加入以下稀释液2ml;

与稀释液9-14重组后的样品的最终PH值为7.8-7.9（或约等于冷冻干燥前PST/精氨酸溶液最后调节的PH值）。这些样品置于25℃恒温箱中保温6天，然后测定其混浊度（0.D.360）结果。如表4所示。

表4

不同稀释液对重组PST溶液稳定性的影响

溶液  #  6天后(O.D.360)

1  0.021

2  0.064

3  0.264

4  0.537

5  0.658

6  0.064

7  0.084

8  0.979

9  0.025

10  0.025

11  0.025

12  0.025

13  <0.03

14  <0.03

如表4中溶液1-5所示，含有0.15%  Brij35和1.5mM  EDTA，PH值为7.4的稀释液中所含Tris  HCl浓度大于200mM时，此生长激素溶液可保持清彻。如表4中溶液6-8所示，除含有0.15%的Brij35和200mM  Tris  HCl，PH为7.2之外，还必须有浓度大于1.5mM的EDTA方可使生长激素溶液保持6天清彻。表4中溶液9-14显示，当稀释液含有0.15%Brij  35，2mM  EDTA和或1%，5%，10%蔗糖溶液，或是0.2M，0.1M，0.0M氯化钠溶液，样品最终PH值为7.8-7.9时，生长激素的溶液可保持6天清彻。