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来自水果的生物活性组合物及其生产方法

阅读：575发布：2020-05-11

专利汇可以提供来自水果的生物活性组合物及其生产方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及来源于果汁的生物活性级分(成分)。所述生物活性级分不含或基本上不含展开青霉素和蛋白质。此外，所述生物活性级分具有抗氧化、自由基清除、润湿和缓冲性质。本发明还涉及一种分离生物活性级分的方法，所述生物活性级分来源于果汁且不含或基本上不含蛋白质和展开青霉素。本发明还涉及一种制备来源于果汁的生物活性级分的方法，所述生物活性级分是稳定的且不含或基本上不含展开青霉素和蛋白质。，下面是来自水果的生物活性组合物及其生产方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种分离来源于苹果(Pyrus malus)果汁的生物活性级分的方法，所述方法包括：
(i)在加工之前，在经过滤的自来水中彻底清洗，(ii)将整果研磨、压榨和过滤，从而以63-
69重量％的产率生产初始果汁；(iii)使用利用5N盐酸(HCl)进行的滴定法将所述初始果汁的pH从3.2-3.6调节至3；(iv)立即使所述初始果汁经历使用具有2.45GHz 频率和3,200瓦输出功率的特别设计的连续流动系统的微波照射，(v)离心以获得第一果汁清液层和第一沉淀物；(vi)使用利用25％氢氧化钠(NaOH)溶液进行的滴定法将第一果汁清液层的pH值从
3.0调节至8.0；(vii)立即使所述第一果汁清液层经历使用具有2.45GHz和3,200瓦输出功率的特别设计的连续流动系统的微波照射；(viii)离心以获得第二果汁清液层和第二沉淀物，(ix)使用利用5N盐酸(HCl)进行的滴定法将第二果汁清液层的pH值从8调节至3；和(x)对所述第二果汁清液层实施离心和过滤步骤以获得第三果汁清液层和第三沉淀物，(xi)在第三果汁清液层中添加防腐剂和稳定剂以获得经稳定的生物活性级分，(xii)在该方法期间，调节、监测和控制该方法期间的温度且保持低于30℃，除微波处理之外，在该微波处理中温度升至92-96℃，此时立即且快速地将其冷却回至低于30℃，(xiii)所述生物活性级分包含小于25微克/千克的展开青霉素和小于0.1％的总蛋白质含量。
2.如权利要求1的方法，其中所述防腐剂和稳定剂选自山梨酸钾、苯甲酸钠、偏亚硫酸氢钠、戊二醇或其混合物或组合。

说明书全文

来自水果的生物活性组合物及其生产方法

发明领域

[0001] 本发明涉及生物活性级分(成分)，其包含来源于果汁的经分离的生物活性级分，其不含或基本上不含展开青霉素和蛋白质。此外，所述生物活性级分具有抗氧化、自由基清除、润湿和缓冲活性和性质。

[0002] 发明背景

[0003] 苹果是所有饮食中的一部分，且其对于不同疾病的治疗价值是公知的(决定了胃分泌物的吸收、毒素的排除，具有利尿效果)。坚实度和糖含量是直接影响消费者购买新鲜苹果水果的重要品质属性。有机酸是水果口味的一个重要组成部分，且连同可溶性糖和芳香一起导致了新鲜苹果水果的整体感官品质。苹果酸是苹果水果中的主要有机酸[Campeanu，G.，G.Neata和G.Darjanschi(2009)，Chemical composition of the fruits of several apple cultivars growth as biological crop，Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 37(2)：161-164]。

[0004] 苹果酸是苹果的主要组分，发现其将肝脏保持在健康状况下且其有助于消化过程。由于某些酸可导致餐后血糖和胰岛素响应的降低，因此有机酸的含量可能也是值得关注的[Suni，M.，M.Nyman，N.-A.Eriksson，L. 和I. (2000)，Carbohydrate composition and content of organic acids in fresh and stored apples，
J.Sci.Food Agric.Journal of the Science of Food and Agriculture 80：1538-
1544]。已发现苹果，尤其是苹果皮具有有效的抗氧化活性，且可极大地抑制肝癌和结肠癌细胞的生长。苹果及其皮的总抗氧化活性为约83μmol维生素C当量，这意味着100g苹果(大约一份苹果)的抗氧化活性相当于大约1500mg维生素C。然而，100g苹果中的维生素C量仅为大约5.7mg。苹果中的维生素C占总抗氧化活性的不到0.4％[Boyer，J.和R.H.Liu(2004)]。

[0005] 苹果的植物化学成分及其健康益处是公知的[Nutrition Journal 3(5)：http://www.nutritionj.com/content/3/1/5，(Boyer和Liu，2004)]。Lee等[Lee，K，Y.Kim，D.Kim，H.Lee和C.Lee(2003)，Major phenolics in apple and their contribution to the total antioxidant capacity，Journal of Agriculture and Food Chemistry 51：6516-6520]发现六个苹果栽培品种间的抗坏血酸平均浓度为12.8mg/100g水果。苹果含有高浓度的类黄酮以及各种其他植物化学成分，且这些植物化学成分的浓度可取决于许多因素，例如苹果的栽培品种、收获、储存和加工。由于水果中促进健康的化合物的抗氧化活性，消费者对其含量越来越感兴趣[Robards，K.，P.D.Prenzler，G.Tucker，P.Swatsitang和W.Glover(1999)]。

[0006] 酚类化合物及其在水果氧化过程中的作用也是公知的[Food Chem.66：401-436]。果汁是由各种水果通过压碎和压榨而压出的流体。其可为澄清的、混浊的或浆状的。术语苹果汁液(apple cider)在美国通常用于意指着混浊的、未发酵的、未防腐处理的苹果汁(apple juice)；其含有细胞内和细胞外水分、碳水化合物(糖、果胶、半纤维素、纤维素、淀粉)、蛋白质、脂质、有机酸(苹果酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸、抗坏血酸)、单宁、酚酸和复合酚、维生素、矿物质、纤维、类胡萝卜素、花青苷、痕量叶绿素。这些固体归类为可溶性的，其易于在汁液中压出；和不溶性的，其主要由压榨残余物组成。尽管一些化合物的含量较小，但其可显著影响水果的吸引力、稳定性或健康价值。许多固有(水果特有的)和外来(加工相关性)因素会影响汁液的组成。如果汁液经加工或经澄清，则其被称为苹果汁[Principles and practices of small and medium-scale fruit juice processing，R.P.Bates，J.R.Morris和P.G.Crandall FAO(2001)Agricultural Services Bulletin]。

[0007] 存在于苹果汁中的苹果酸和/或苹果酸钠用于美容产品和食品中以用于调节pH值和有效缓冲的目的以及用作风味添加剂。苹果酸为α-羟基酸(AHA)，其可具有某种去角质作用，且存在要求该能力的产品。苹果酸钠可具有保湿和润湿性质。苹果酸天然且主要见于苹果中，其起温和去角质剂(exfoliator)的作用，同时为皮肤/头皮提供养分以作为三羧酸循环(TCA循环)或Krebs循环的组分。

[0008] 因此，苹果的组成、苹果的已知健康益处及其声称的预防疾病的能力表明，预期该水果可在饮料、皮肤、头发和口服护理产品及应用中具有长效。然而，在苹果水果中和苹果汁中存在某些不希望的组分，即展开青霉素和蛋白质。

[0009] 展开青霉素或4-羟基-4H-呋喃并(furo)[3,2-c]吡喃-2(6H)-酮是由曲霉菌(Aspegillus)和青霉菌(Penicillium)属的某些种类产生的真菌毒素。用于加工以生产汁液的苹果可能在运输期间因疏忽而受到损坏。一定百分比的具有不同程度损坏(腐烂)的水果可含有展开青霉素。苹果及其他水果在加工以生产汁液前受损是常见的。展开青霉素由各种霉菌产生，其主要感染苹果的发霉部分。移除水果的发霉和损坏部分可能无法消除全部展开青霉素，因为一些展开青霉素可迁移至果肉的完好部分中。展开青霉素也可在水果内部产生，即使水果可能未明显发霉。如果使用发霉的苹果来生产苹果汁，则展开青霉素进入汁液中。其不能被热处理如巴氏杀菌法破坏。展开青霉素是一种天然的人体毒素，因此可在细胞(包括发育中的胎儿)、免疫系统和神经系统内部具有遗传影响。苹果汁中的推荐建议水平为50微克展开青霉素/千克[Guidance on the control of patulin in directly pressed apple juice，http://www.newark-sherwooddc.gov.uk/ppimageupload]。

[0010] 扩展青霉(Penicillium expansum)是一种该类真菌，其引起苹果和其他水果的分解。英国农业、渔业和食品部(United Kingdom Ministry of Agriculture，Fisheries and Food)在其食品监管报告第36期(1993)“Mycotoxins Third Report”中指出，产生展开青霉素的扩展青霉是各种产品(例如苹果、桃、梨、香蕉、菠萝、杏、樱桃和葡萄)中的常见问题。其指出对苹果汁而言，混浊汁液中的展开青霉素水平通常高于澄清汁液中的水平(在其数据中所显示的最高含量分别为434微克/千克和118微克/千克)。由于真菌毒素对动物的毒性以及对人类的潜在毒性，真菌毒素为来自苹果或其他水果的成分中的不希望成分。展开青霉素的毒性活性，其致畸性、致癌性和致突变性是已知的且值得关注。

[0011] 国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission)作为联合国FAO/WHO联合食品标准计划的一部分，在其第28届会议(1997年6月)中就展开青霉素而言指出PMTDI(暂定最大容许摄入量)为每日每公斤体重0.4微克(即，0.4微克/公斤体重/日)。据报告，尽管苹果汁一般(尤其是单一浓度苹果汁，例如11.5度白利糖度)具有低于50微克/公升的展开青霉素含量，然而苹果汁有时可能受到重度污染。目前正考虑并推荐更低的推荐量(例如低于25微克展开青霉素/升或者甚至更低)。已知在一些苹果汁试样(其中大量使用风落果和/或腐烂水果)中高达1500微克/升。然而，苹果汁更通常地含有高达200微克/升的展开青霉素。

[0012] 美国专利6,248,382(米勒等)描述了用于降低果汁中展开青霉素浓度的方法，其包括将汁液提供至树脂材料，所述树脂材料具有大量的小于20埃最小孔隙宽度的微孔且至少孔隙表面能借助化学吸附力截留展开青霉素。所述树脂优选具有弱碱官能团且基本上不含中孔和大孔。所述树脂优选具有大于900m2/g(BET)的表面积且该树脂已超高交联且同时处于溶胀状态下。再生包括将所述树脂所保留的展开青霉素转化成更易使用氨或挥发性碱(优选由高pH溶液原位产生)冲洗出的衍生物。

[0013] S.Drusch等研究了展开青霉素在类似于含水汁液模型体系中的稳定性。在酸性pH下，抗坏血酸的存在降低了展开青霉素的稳定性。在34天后，与不含抗坏血酸的试样中的68-71％相比，在抗坏血酸存在下展开青霉素降至其初始浓度的30％。储存期间的条件(光、氧气和/或金属离子的存在)影响了展开青霉素的稳定性。此外，可通过产生羟基或通过添加相当稳定的二苯基-1-苦基偕腙肼(DPPH)而引发诱导展开青霉素的降解。该研究数据显示，展开青霉素通过抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸所产生的自由基而分解。抗坏血酸在氧气存在下通过游离金属离子催化而快速氧化，从而导致展开青霉素减少。在抗坏血酸完全氧化后，未观察到展开青霉素的进一步降解。与此相反，在金属螯合剂存在下，抗坏血酸的缓慢氧化诱导展开青霉素发生持续的缓慢氧化。由于在食品包装的顶部空间中的氧气含量低，在填充之前在诸如苹果汁的产品中添加抗坏血酸不能视为有效的去污染策略
[Stability of patulin in a juice-like aqueous model system in the presence of ascorbic acid，S.Drusch，S.Kopkaa和J.Kaedinga Food Chemistry，第100卷，第1期，
2007，第192-197页]。

[0014] 蛋白质(包括果汁中的哪些)可在敏感个体中引起蛋白质接触性皮炎。在与导致接触性皮炎的蛋白质材料接触后不久，该个体可在皮肤上经历诸如急性风疹或长出水泡的症状，通常伴随着瘙痒、灼痛和/或刺痛[V.Janssens等，“Protein contact dermatitis:myth or reality？”，British Journal of Dermatology 1995；132：1-6]。

[0015] 因此，非常需要获得并使用含有尽可能少的展开青霉素和尽可能少的蛋白质的苹果汁，且一个重要任务在于同时移除或显著降低苹果汁中的展开青霉素和蛋白质浓度。

[0016] 发明简述

[0017] 本发明还涉及一种分离生物活性级分的方法，所述生物活性级分来源于果汁且不含或基本上不含蛋白质和展开青霉素。本发明还涉及一种制备来源于果汁的生物活性级分的方法，所述生物活性级分是稳定化的且不含或基本上不含展开青霉素和蛋白质。

[0018] 发明详述

[0019] 本发明提供了一种用于移除或显著降低果汁中的展开青霉素和蛋白质含量的商业可行的方法。本发明的主要目的是移除获自各种苹果栽培品种(澳洲青苹(Granny Smith)、金冠苹果(Golden Delicious)、嘎啦苹果(Gala)、凯米欧苹果(Cameo)、麦金托什苹果(McIntosh)、布雷本苹果(Braeburn)等)的生物活性成分(级分)中的展开青霉素和蛋白质或显著降低其含量；然而，没有理由预期通过使用所述方法不能降低获自其他果汁(例如桃、梨、香蕉、李、苹果、菠萝、杏、樱桃、葡萄、蓝莓、覆盆子、黑莓、蔓越橘、柑橘、仙人掌果、油桃、石榴、橙、葡萄柚、蕃茄及其组合或混合物)的生物活性级分(成分)中的展开青霉素和蛋白质含量。

[0020] 本文所用的“基本上不含展开青霉素”意指由公定分析化学家协会(association of Official Analytical Chemists，AOAC)995.10，Patulin in Apple Juice的公定分析方法测得的含量小于25微克/千克。

[0021] 本文所用的“基本上不含蛋白质”意指由在Hitachi L-8900氨基酸分析仪上实施的水解和未水解氨基酸分析法测得的总蛋白质含量小于0.1％。

[0022] 包含本发明生物活性级分(成分)的配制剂可使用本领域技术人员熟知的方法制备。

[0023] 本文所用的“局部施用”通常是指涉及使用，例如通过使用手或施涂器如擦具将本发明的生物活性成分或含有这些生物活性成分的配制剂直接涂抹或铺展至外部皮肤上的技术。本发明的生物活性成分为“化妆品可接受的”。

[0024] 本文所用的术语“化妆品可接受的”是指生物活性成分、配制剂、化妆品活性剂或惰性成分适用于与哺乳动物组织(例如人类皮肤)接触而不具有不当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激、过敏反应等，且与合理的益处/风险比相称。

[0025] 应指出的是，取决于水果(例如苹果)栽培、生长年份和具体收获的条件，水果中的干物质含量可变化且其可影响果汁性质的一致性，且因此影响果汁来源的生物活性级分(成分)的再现性。

[0026] 本发明允许对初始果汁性质进行标准化以改善生物活性(级分)成分的再现性。初始果汁性质的标准化可通过利用苹果栽培和收获的一致条件而改善。

[0027] 将分离的生物活性级分(成分)与稳定剂组合。特别合适的稳定剂可包括但不限于防腐剂、稳定剂和/或其混合物。可将分离的生物活性成分进一步浓缩，随后稳定化以供在局部、口服用皮肤护理和功能性饮料应用中进一步利用。本发明的生物活性成分可进一步包含在本领域常用的递送体系中。

[0028] 一种制备来源于果汁且不含或基本上不含展开青霉素和蛋白质的分离生物活性级分的示例性方法包括收获、收集并清洗新鲜水果。制备新鲜水果生物质的合适步骤包括例如以下步骤：(1)保持水果的固有水分含量；(2)在收获期间保持水果的完整性；(3)使引起水果生物质生物降解的环境影响和时间因素最小化；和(4)在加工之前(例如在研磨和浸渍之前)清洁水果生物质。这些步骤各自将在下文论述。

[0029] 保持固有水分含量：

[0030] 收获应以避免因水分损失所导致的萎蔫方式进行。最佳条件为维持并保持天然水分含量的那些。

[0031] 在收获期间保持水果的完整性：

[0032] 水果生物质的收获以切碎、捣碎、压碎或其他类型的水果损伤得以避免或最小化的方式进行。对不可避免因所需设备的类型所致的切碎的大规模工业收获而言，要小心地使可导致所收集水果中的微生物生长，水分损失，氧化、聚合、异构化和水解过程(即，不希望的分解代谢过程)增强的损伤最小化。此外，尤其应注意使收获期间和随后的损伤最小化。

[0033] 使引起降解的环境影响和时间因素最小化：

[0034] 应使水果材料到加工设施的传送时间以及生物质在太阳、高温和其他不利环境因素下的暴露最小化以防止上文所述的不希望降解过程的影响。例如，在本发明的一个实施方案中，用于进一步加工的水果的传送时间距收获时间不超过30分钟。在另一实施方案中，对经历长距离运输的水果进行收获后程序处理，包括立即将水果生物质置于含有Styrofoam冷却剂的冷冻凝胶包装袋中以有助于在隔夜传送至加工设施期间维持新鲜度和天然水分含量。作为非限制性实例，对许多水果种类而言，有益的不仅是用于加工的传送时间最短，而且在于保持水果材料冷却(需要的话通过致冷)以防止和/或最小化加工之前和/或加工期间的不希望的降解。

[0035] 研磨和浸渍之前的清洁步骤：

[0036] 水果一经收获，则在进一步加工之前实施清洗步骤以移除水果中的碎屑。清洗通过在防止引发汁液从水果中释放、导致损伤或移除有价值组分的条件下使用低压冲洗短时间而实现。例如，在本发明的一个实施方案中，水果生物质的清洗在小于或等于1kg/cm2的水压下在小于或等于5分钟内完成。残余水洗液不含有任何绿色或黄色色素，这表明不存在后续损伤。从经清洗的水果生物质中移除过量水以保持干物质含量接近于天然水平。

[0037] 在收获水果之后，如上文所述实施水果的进一步加工以获得果汁。在一个实施方案中，对水果生物质实施研磨、浸渍和压榨以分离细胞内的内容物(即果汁)，且将其与主要含有细胞壁的富含纤维的压榨饼分离。

[0038] 合适的加工方案的一个实例包括下文所述的步骤。可使用锤磨机来研磨水果以在短时间内且在不显著提高生物质温度下获得小尺寸的水果组织颗粒。在一个实施方案中，使用改进的锤磨机来在小于或等于10秒的处理期间内产生最大尺寸小于或等于0.5厘米的经浸渍的水果颗粒，其中生物质的温升小于或等于5℃。

[0039] 使经研磨和浸渍的水果生物质的暴露最小化以防止上文所述的不希望的分解代谢过程的影响。在研磨和浸渍水果生物质之后，尽可能快地开始从富含纤维的材料(或压榨饼)中分离果汁。在短时间内且在不显著提高温度下处理水果生物质。在一个实施方案中，在研磨和浸渍之后，立即使用卧式连续螺杆压榨机(Compact Press“CP-6”，Vincent Corporation，FL)压榨水果生物质。锥体上的压力维持在24kg/cm2水平，螺杆速度为12rpm，且生物质的温升小于或等于5℃。

[0040] 初始果汁通常包含可吸收有价值果汁组分且还堵塞软管和泵的小纤维颗粒、淀粉、果胶物质、半纤维素和纤维素颗粒。应通过过滤或低速离心来移除上述颗粒。例如，在本发明的方法中，在利用水果细胞汁液之前经由四层尼龙织物过滤在压榨步骤后产生的初始果汁。

[0041] 一旦分离果汁，则水果细胞汁液即为相对稳定的胶态分散体，其中细胞器为分散相，而细胞质为连续相。随后根据如下方法处理果汁，所述方法包括：(1)实施“引发膜级分凝集步骤”，触发上述胶态分散体的失稳，从而获得失稳的果汁；和(2)对失稳的细胞汁液混合物实施“膜级分的分离步骤”，从而获得膜级分(包含细胞核、线粒体或其组合)和果汁清液层。在一个实施方案中，通过使所述细胞汁液经历频率为2.45GHz的电磁波而实现膜级分失稳的引发。在另一实施方案中，所用的频率大于2.45GHz且至多为7.0GHz。在另一实施方案中，所用的频率为有效实现膜级分失稳的2.45-7.0GHz的任何频率。在实现失稳之后，实施膜级分的分离步骤。该步骤包括例如使用包括过滤或离心或其组合在内的分离技术将失稳的果汁分离成膜级分和果汁清液层。

[0042] 在本发明的方法中可使用各种仪器来产生果汁失稳所需的电磁波，包括但不限于磁控管、电栅管(power grid tube)、速调管、速调四极管、正交场放大管、行波管和回旋管。一种该类仪器包括但不限于大功率磁控管。常规和工业用磁控管在915MHz和2.45GHz的频率下操作且可采用。然而，在这些频率下，可产生可使细胞汁液组合物变性的不希望的热量。因此，有利地使用在显著高于常规或工业用磁控管频率的频率下操作的电磁波，这允许果汁失稳，而不会因产生热量而引起不希望的变性。该频率通常高于常规微波磁控管的频率，即大于2.45GHz；在另一实施方案中大于2.45GHz且小于约7GHz；在另一实施方案中为约
3-约6GHz；在又一实施方案中为有效实现果汁失稳的2.45-7.0GHz的任何频率。在本发明的失稳步骤期间，有益地将果汁温度维持低于40℃，在另一实施方案中低于约35℃，在另一实施方案中低于约30℃，在另一实施方案中低于约25℃，在另一实施方案中低于约20℃。

[0043] 新鲜获得的膜级分为具有原料来源特有的颜色和特定气味的糊状物。膜级分主要由存在于水果中的疏水性化合物代表。膜级分的组成主要包括磷脂、膜蛋白质、有色体、痕量叶绿体、痕量叶绿素、细胞核、线粒体和类胡萝卜素。

[0044] 在制得来源于果汁的不含或基本上不含展开青霉素和蛋白质的生物活性级分之后，其随后经历稳定化步骤，从而获得稳定的果汁。在一个实施方案中，稳定化步骤包括在至少一种防腐剂、至少一种抗氧化剂和至少一种稳定剂的混合物中培育生物活性级分，从而获得稳定化的生物活性清夜级分。适用于本发明的防腐剂、抗氧化剂和稳定剂包括例如山梨酸钾、苯甲酸钠、偏亚硫酸氢钠和戊二醇。

[0045] 本发明还涉及一种适于局部施用于哺乳动物皮肤和/或头发的生物活性局部配制剂。所述组合物可为留存型产品，例如乳霜、敷料、凝胶、奶液、软膏、液体、喷雾施涂器及其组合；或洗净型产品，例如手洗餐具洗涤剂、液体洗手皂、块皂、沐浴液、香波、通用清洁剂及其组合。

[0046] 在一个实施方案中，所述生物活性局部配制剂包含局部有效量的本发明生物活性组合物。所述生物活性局部配制剂可进一步包含局部可接受的载体。合适的局部可接受的载体可包括但不限于亲水性乳霜基质、亲水性奶液基质、亲水性表面活性剂基质、亲水性凝胶基质、亲水性溶液基质、疏水性乳霜基质、疏水性奶液基质、疏水性表面活性剂基质、疏水性凝胶基质和/或疏水性溶液基质。在一个实施方案中，所述生物活性组合物可以以基于生物活性局部配制剂总重量为约0.001-约90％的量存在。

[0047] 下文实施例意欲阐述本发明的具体实施方案，但决不意欲限制本发明的范围。

[0048] 实例1—来自苹果水果(澳洲青苹栽培品种)的生物活性级分(成分)的制备

[0049] 下文为本发明方法的一个实施方案的相关方面的说明。

[0050] 自苹果农场的树上直接采集苹果整果。检查并移除有缺陷的水果。其后，在加工之前将苹果在经过滤的自来水中彻底清洗。然后将整果研磨(浸渍)，压榨并过滤以生产初始果汁，即化妆品成分 PM[INCI：苹果(Pyrus Malus/apple)汁；CAS RN 1310712-55-0]或功能性饮料成分PurecentiaTMPM的初始来源。

[0051] 在研磨、压榨和过滤之后，来源于苹果水果的初始苹果果汁的产率为约63-69％(重量/重量)。

[0052] 随后对初始果汁进行各种处理，包括pH调节、聚焦微波照射以及通过离心和过滤进行分离。在聚焦微波处理步骤之前，使用稀盐酸(HCl)溶液(5N)或25％氢氧化钠(NaOH)溶液调节初始汁液和中间清液层的pH值。使用利用5N盐酸(HCl)进行的滴定法调节约3.2-3.6pH的初始苹果汁，以将该细胞汁液的pH降至约3.0。然后，立即将该调节pH值的果汁暴露于使用具有2.45GHz频率和3,200瓦输出功率的特别设计的连续流动系统(Microwave Research&Applications，Inc.，Laurel，Md.)的微波照射中。该系统装备有恒定速度搅拌器BDC 1850(Caframo Ltd.，Wiarton，Ontario，Canada)和温度控制探针。持续该处理，直至微波室中的果汁温度达到约92-96℃，随后立即将经处理的果汁泵送通过与1HP再循环冷却器(6106P型，Polyscience Corporation，Niles，Ill.)连接的连续流动离心装置，从而获得清液层1和沉淀物1。然后，使用利用25％氢氧化钠(NaOH)溶液进行的滴定法调节清液层1的pH值以将清液层1的pH值由约3.0提高至约8.0。然后，立即将调节pH值的清液层1暴露于使用具有2.45GHz频率和3,200瓦输出功率的特别设计的连续流动系统(Microwave Research&Applications，Inc.，Laurel，Md.)的微波辐射中。该系统装备有恒定速度搅拌器BDC1850(Caframo Ltd.，Wiarton，Ontario，Canada)和温度控制探针。持续该处理，直至微波室中的清液层1的温度达到约92-96℃，随后立即将经处理的清液层1泵送通过与1HP再循环冷却器(6106P型，Polyscience Corporation，Niles，Ill.)连接的连续流动装置，从而获得清液层
2和沉淀物2。

[0053] 然后，使用利用5N盐酸(HCl)进行的滴定法调节清液层2的pH值以使清液层2的pH值由约pH 8.0降至约pH 3.0，并再次离心，从而获得清液层3和沉淀物3。随后在清液层3中添加合适的防腐剂和稳定剂，从而获得 PM或PurecentiaTMPM。

[0054] 微波处理的剂量率为约1380焦耳/秒。在聚焦微波照射步骤期间，不存在因蒸发所致的汁液清液层浓缩。所用系统为完全密封的且防止因蒸发所致的任何细胞内水分损失。

[0055] 在该方法期间，调节、监测和控制该方法期间的温度且保持低于30℃，除微波处理之外，在该微波处理中温度升至约92-96℃，此时立即且快速地将其冷却回至低于30℃。出人意料地发现化妆品成分 PM或功能性饮料成分PurecentiaTMPM中残余的生物成分为初始苹果汁中的不含或基本上不含展开青霉素和蛋白质的水溶性组分。

[0056] 实施例2—生物活性成分 PM(INCI：苹果汁)的特征和性质

[0057] 根据实施例1所述的方法制备生物活性成分 PM(INCI：苹果汁)。

[0058] 分析生物活性成分 PM以测定其各种物理化学和微生物特征。

[0059] PM(INCI：苹果汁)的选定物理化学特征和测试方法在下表1中给出。

[0060] 表1. PM(INCI：苹果汁)的选定物理化学特征和测试方法

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[0065] PM和PurecentiaTMPM易于以任何比例溶于水中且为生物可降解的成分。 PM满足皮肤护理行业关于总平板菌落计数、霉菌和酵母计数且不存在病
原体的要求。

[0066] PM和PurecentiaTMPM具有有效的防腐剂体系。

[0067] 在4-25℃的温度下储存于避光密闭容器中时，测得 PM和TM
Purecentia PM在至少12-18个月内是稳定的(即，保持物理和化学完整性)。

[0068] 表2包括与 PM的自由基清除活性相关的数据。

[0069] 表2. PM的DPPH(2,2-二苯基-1-苦基偕腙肼)自由基清除活性

[0070]

[0071] 方法

[0072] 通过动力学比色分析法测定DPPH(2,2-二苯基-1-苦基偕腙肼)的自由基清除活性，该动力学比色分析法适于与获自SUN-Sri(Rockwood，TN)的玻璃涂布聚丙烯96孔微量滴定盘(目录号400 062)和获自BioTek Instruments Inc(Winooski，VT)的Synergy 2微板读数器一起使用。在515nm 波长下测量吸光率。每个微板孔中的反应体积为200μL，且DPPH的初始浓度等于114μM。使用L-抗坏血酸作为阳性对照物。DPPH(Sigma D9132)和USP L-抗坏血酸(Sigma A-2218)获自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。计算反应的化学计量量且表示为猝灭1单位重量DPPH所需的单位重量测试品。这可容易地以单位重量试样的DPPH当量再次计算。该方法改编自W.Brand-Williams等“Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity”(公布于LWT-Food Science and Technology，第28卷，第1期，1995，第25-30页中)所述的程序。

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