制造双特异性抗体的方法，双特异性抗体和此类抗体的治疗用途
阅读：106发布：2020-05-12
专利汇可以提供制造双特异性抗体的方法，双特异性抗体和此类抗体的治疗用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及二价双特异性单克隆 抗体 (bbmAb)或其变体，以及通过在 哺乳动物 细胞系中共表达两种不同单克隆抗体的经修饰的Fc-5突变的衍 生物 来制造此类抗体的方法。，下面是制造双特异性抗体的方法，双特异性抗体和此类抗体的治疗用途专利的具体信息内容。
1.一种适合在共同宿主细胞中共表达的双特异性抗体，其中所述抗体包含：
a.第一部分，所述第一部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有λ野生型的第一可变轻链(VL1)和野生型的第一可变重链(VH1)以及带有杂二聚化修饰的第一恒定重链(CH1)，所述VH1特异性结合至第一靶标，以及
b.第二部分，所述第二部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有κ野生型的第二可变轻链(VL2)和野生型的第二可变重链(VH2)以及带有与所述第一恒定重链的杂二聚化修饰互补的杂二聚化修饰的第二恒定重链(CH2)，所述VH2与不同于所述第一靶标的第二靶标特异性结合，
其中当所述第一部分和所述第二部分在共同宿主细胞中共表达时，形成双特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二恒定重链是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，优选IgD、IgE或IgG，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgG1。
3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其中其中所述第一可变轻链是λ1型，并且所述第二可变轻链是κ6型。
4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二恒定重链是IgG1，并且其中
a.所述第一恒定重链具有产生杵结构的点突变，并且所述第二恒定重链具有产生臼结构的点突变，或
b.所述第一恒定重链具有产生臼结构的点突变，并且所述第二恒定重链具有产生杵结构的点突变，并且任选地
c.所述第一和第二恒定重链具有导致二硫键的突变。
5.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其包含第一免疫球蛋白VH1结构域、第一免疫球蛋白VL1结构域、第二免疫球蛋白VH2结构域和第二免疫球蛋白VL2结构域，其中：
a.所述第一免疫球蛋白VH1结构域包含(例如依次)：
i.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；或
ii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:79，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:80，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:81；和b.所述第一免疫球蛋白VL1结构域包含(例如依次)：
i.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94或
ii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:95，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:96，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:97；和c.所述第二免疫球蛋白VH2结构域包含(例如依次)：
i.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；或
ii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:47，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:49；和d.所述第二免疫球蛋白VL2结构域包含(例如依次)：
i.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62或
ii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:63，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:65。
6.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其包含第一免疫球蛋白VH1结构域、第一免疫球蛋白VL1结构域、第二免疫球蛋白VH2结构域和第二免疫球蛋白VL2结构域，其中：
a.所述第一免疫球蛋白VH1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:85，
b.所述第一免疫球蛋白VL1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:101，
c.所述第二免疫球蛋白VH2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:53，并且
d.所述第二免疫球蛋白VL2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:69。
7.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其包含第一免疫球蛋白重链、第一免疫球蛋白轻链、第二免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白轻链，其中：
a.所述第一条免疫球蛋白重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:87，
b.所述第一免疫球蛋白轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:103，
c.所述第二条免疫球蛋白重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55，并且
d.所述第二免疫球蛋白轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。
8.一种用于选择根据权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括：
a.第一步骤：选择所述第一部分和所述第二部分；
b.第二步骤：在共同宿主细胞中共表达所述第一部分和所述第二部分，产生包含所述第一部分和所述第二部分的双特异性抗体；
c.第三步骤：通过从正确匹配的双特异性抗体中去除错配的片段来纯化所述双特异性抗体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中第三步骤纯化产生双特异性抗体，所述双特异性抗体是至少60％(质量)、70％(质量)、80％(质量)、85％(质量)纯，例如至少90％(质量)纯、
95％(质量)、96％(质量)、97％(质量)、98％(质量)或99％(质量)纯。
10.一种用于通过在共同宿主细胞中共表达来制造根据权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括
a.第一步骤：产生至少一个编码所述第一部分和所述第二部分的载体；
b.第二步骤：将所述至少一个载体引入所述共同宿主细胞；
c.第三步骤：选择特异性表达所述双特异性抗体的细胞；
d.第四步骤：在细胞表达所述双特异性抗体的条件下培养所选细胞；和
e.第五步骤：纯化所述双特异性抗体，所述双特异性抗体是至少60％(质量)、70％(质量)、80％(质量)、或85％(质量)纯，例如至少90％(质量)纯、95％(质量)、96％(质量)、97％(质量)、98％(质量)或99％(质量)纯。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一步骤包括产生编码所述第一部分的第一载体和编码所述第二部分的第二载体。
12.一种表达系统，所述表达系统包含至少一个载体和选择标志物，所述至少一个载体包含编码根据权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体的第一部分或第二部分的多核苷酸。
13.根据权利要求12所述的表达系统，所述表达系统包含：
a.编码第一选择标志物(sm I)的多核苷酸；
b.编码第二选择标志物(sm II)的多核苷酸，所述sm II不同于所述第一选择标志物(sm I)。
14.根据权利要求12或13所述的表达系统，其中所述第一选择标志物(sm I)是叶酸转运蛋白或编码突变的叶酸受体的多核苷酸，其中与野生型叶酸受体相比所述突变的叶酸受体具有降低的叶酸结合亲和力，并且所述第二选择标志物(sm II)是DHFR。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的表达系统，其中所述第一选择标志物(sm I)是潮霉素，并且所述第二选择标志物(smII)是Neo/G418。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的表达系统，所述表达系统包含两个表达载体，其中：
a.第一载体，其包含至少编码第一选择标志物(sm I)的多核苷酸和至少编码所述第一部分的多核苷酸；和
b.第二载体，其包含至少编码第二选择标志物(sm II)的多核苷酸和至少编码所述第二部分的多核苷酸。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的表达系统，所述表达系统包含在编码所述重链的多核苷酸下游的终止密码子和位于所述终止密码子下游的编码免疫球蛋白膜锚的多核苷酸。
18.一种选择用于根据权利要求8-11中的任一项所述的方法的共同宿主细胞的方法，所述方法包括
a.第一步骤：提供多个宿主细胞，所述多个宿主细胞包含根据权利要求12-17中任一项所述的表达系统；和
b.在针对所述选择标志物具有选择性的条件下培养所述多个宿主细胞，从而获得表达目的产物的宿主细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中使用选择性培养基：
a.包含有限浓度的叶酸；和/或
b.包含浓度500nM或更低的叶酸；和/或
c.包含选自以下浓度的叶酸：
i.1000nM-100pM；
ii.100nM-1nM；
iii.15nM-1nM；
iv.10nM-1nM；和
v.10nM-2.5nM；和/或
d.包含DHFR抑制剂；和/或
e.包含抗叶酸剂；和/或
f.包含浓度500nM或更低的抗叶酸剂；和/或
g.包含选自以下浓度的MTX：
i.500nM-3nM；
ii.100nM-10nM；
iii.50nM-10nM；和
iv.50nM和/或
h.包含高达所述叶酸浓度20倍的浓度的抗叶酸剂；和/或
i.包含所述叶酸浓度10-20倍的浓度的抗叶酸剂；和/或
j.包含浓度高达15nM和等摩尔浓度高达MTX 20倍的叶酸。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述宿主细胞包含根据权利要求17所述的表达系统，其中所述第一或第二部分的至少一部分被表达为包含所述免疫球蛋白跨膜锚或其片段的融合多肽，并且其中所述融合多肽被展示在所述宿主细胞的表面上，所述方法还包括以下步骤：
a.使所述多个宿主细胞与结合所述融合多肽的检测化合物接触；
b.根据结合到所述细胞表面的所述检测化合物的存在或数量，选择至少一个宿主细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述检测化合物包含所述第一或第二靶标或者其衍生物以及至少一个检测标记。
22.根据权利要求10或11所述的方法，其中第五步骤纯化所述双特异性抗体包括亲和色谱和/或离子交换色谱。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述色谱包括
a.第一步骤捕获；
b.第二步骤精制；以及任选地
c.第三步骤进一步精制。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一步骤捕获用选自由以下组成的组的原理进行：Fc结合亲和色谱，例如蛋白A或蛋白G；λ轻链特异性亲和色谱，例如，LambdaFabSelectTM；κ轻链特异性亲和色谱，例如KappaSelectTM；抗独特型亲和色谱，例如所述第一部分或所述第二部分；基于靶标的亲和色谱，例如使用所述第一靶标或所述第二靶标的亲和色谱；离子交换色谱，例如CaptoTM粘附或FractogelTMEMD SO3；和疏水相互作用色谱。
25.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述第二步骤精制用选自由以下组成的组的原理进行：Fc结合亲和色谱，例如蛋白A或蛋白G；λ轻链特异性亲和色谱，例如，LambdaFabSelectTM；κ轻链特异性亲和色谱，例如KappaSelectTM；抗独特型亲和色谱，例如所述第一部分或所述第二部分；基于靶标的亲和色谱，例如使用所述第一靶标或所述第二靶标的亲和色谱；离子交换色谱，例如CaptoTM粘附或FractogelTMEMD SO3；疏水相互作用色谱；和病毒失活。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第三步骤进一步精制用选自由以下组成的组的原理进行：单独的或组合的，Fc结合亲和色谱，例如蛋白A或蛋白G；λ轻链特异性亲和色谱，例如，LambdaFabSelectTM；κ轻链特异性亲和色谱，例如KappaSelectTM；抗独特型亲和色谱，例如所述第一部分或所述第二部分；基于靶标的亲和色谱，例如使用所述第一靶标或所述第二靶标的亲和色谱；离子交换色谱，例如CaptoTM粘附或FractogelTMEMD SO3；疏水相互作用色谱；和病毒失活。
27.根据权利要求23任一项所述的方法，所述方法选自：
a.第一步骤蛋白A捕获，例如MabSelectTMSuReTM；第二步骤λ轻链亲和色谱，例如LambdaFabSelectTM；以及第三步骤κ轻链亲和色谱，例如KappaSelectTM；或b.第一步骤蛋白A，例如MabSelectTMSuReTM，第二步骤κ轻链亲和色谱，例如KappaSelectTM，和第三步骤λ轻链亲和色谱，例如LambdaFabSelectTM；或TM
c.第一步骤κ轻链亲和色谱，例如KappaSelect ，和第二步骤λ轻链亲和色谱，例如LambdaFabSelectTM；或
d.第一步骤λ轻链亲和色谱，例如LambdaFabSelectTM，和第二步骤κ轻链亲和色谱，例如KappaSelectTM。
28.根据权利要求8-11或18-27中任一项所述的方法，其中所述细胞系选自由以下组成的组：CHO细胞；非生产性杂交瘤，例如Sp 2/0或NS0；人源细胞系，例如HEK或PER.C6；幼仓鼠肾脏(BHK)衍生细胞；酵母或丝状真菌；原核细菌，例如大肠杆菌或荧光假单胞菌；植物衍生细胞；藻类；和纤毛虫。
29.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-7中任一项所述的抗体、和药学上可接受的载体。
30.根据权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体或根据权利要求29所述的药物组合物，用作药物。
31.根据权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体或根据权利要求29所述的药物组合物，用于治疗炎性体相关疾病。
32.根据权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体或根据权利要求29所述的药物组合物，用于治疗根据权利要求31所述的炎性体相关疾病，其中所述炎性体相关疾病选自由以下组成的组：镰状细胞病、血管病变、缺血再灌注损伤、心血管疾病、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、血管功能障碍、骨骼肌缺血、肺结节病、纤维化、疟疾、血液透析依赖性慢性肾病和克罗恩病。
33.一种治疗炎性体相关障碍的方法，所述方法包括对患有炎性体相关障碍的受试者施用有效量的根据权利要求1-7所述的双特异性抗体或根据权利要求29所述的药物组合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述炎性体相关障碍是镰状细胞病、血管病变、缺血再灌注损伤、心血管疾病、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、血管功能障碍、骨骼肌缺血、肺结节病、纤维化、疟疾、血液透析依赖性慢性肾病或克罗恩病。
制造双特异性抗体的方法，双特异性抗体和此类抗体的治疗
用途
[0002] 本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并且特此通过引用以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2018年5月30日，名称为PAT057716-WO-PCT_SL.txt并且大小为68,498字节。
技术领域
[0003] 本发明涉及二价双特异性单克隆抗体(bbmAb)或其变体，以及通过在哺乳动物细胞系中共表达两种不同单克隆抗体的所说的杵臼结构(knob-into-hole)修饰的、FC突变的衍生物来制造此类抗体的方法。
背景技术
[0004] 双特异性抗体，即结合两个不同表位的抗体，是本领域众所周知的。产生双特异性抗体的一种方法是所说的杵臼结构(KiH)方法，例如Merchant等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],16:677-681(1998)描述的，其中通过引入点突变如Y349C、T366S、L368A、Y407V来修饰第一重链IgG以显示臼样结构；并且通过引入点突变S354C、T366W(Merchant等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],16:677-681(1998),第678页,表1)来修饰第二重链IgG以显示杵样结构。然后，两个不同的IgG结构相互作用形成二价双特异性抗体(bbmAb)，即由四个不同的轻链和两个不同的重链组成的异四聚体蛋白。
[0005] 当在同一宿主细胞系中表达两个经KiH修饰的mAb时，所需的bbmAb统计上仅占表达蛋白质的25％，但75％是所说的与产品相关的杂质(Klein,Ch.等人,2012)。
[0006] 解决该问题的一些方法是本领域已知的，例如通过应用进一步的序列修饰以促进正确的H-L结合来促进bbmAb的正确形成(有关概述，请参见Klein,Ch.等人,2012；Kontermann,R.和Brinkmann,U.,2015)。但是，此类其他修饰可能会增加抗药物抗体的风险。
[0007] 在WO 12023053A2或WO 04009618A2中披露了另一种产生bbmAb的方法，其利用共享的重链或轻链与不同的可变链组合。然而，保持任一重链恒定不变会显著降低可筛选结合物的抗体库的多样性。
[0008] 在US9212230中披露了产生bbmAb的另一种方法，其要求携带不同修饰的mAb的单独表达和纯化。最后，将所得的mAb体外改组以形成预期的bbmAb。这种体外改组是一个复杂的附加过程步骤，需要仔细的验证和分析评估，并且可能会大大增加成本。
[0009] 因此，现有的产生bbmAb的方法可能会限制可用于筛选结合物的抗体库的多样性，或者可能无法以足够具有成本效益的方式提供足够的总产率、纯度和产物品质，从而无法大规模生产用于临床开发和商业化。另外，蛋白链的任何修饰固有地增加了诱导抗药物抗体的风险。因此，仅需要最少的蛋白质工程的方法在临床上可能是有利的。
发明内容
[0010] 需要提供一种用于生产二价双特异性抗体的改进方法。特别地，需要一种用于制造二价双特异性单克隆抗体(bbmAb)的方法，所述方法确保以合理的成本适于临床开发和商业化生产的足够的总产率、纯度和产物品质。
[0011] 本发明尤其提供了一种生产bbmAb的方法，所述bbmAb具有以下一个或多个优点：由于不需要共享轻链或重链，它可以使用大型抗体库来鉴定结合物，除驱动H链二聚化的突变外，不需要任何广泛的蛋白质工程，因此限制了抗药抗体的风险，因为它是在共同细胞系中完成表达而具有成本效益，因此可以在一种细胞培养过程中生产bbmAb，而无需进行特定的体外改组，并且它可以生产出适合类使用的高品质材料，因为产物相关杂质可以有效地去除。
[0012] 本发明可用于鉴定κ和λ型抗体，其中轻链未显示出与对应物的重链的强混杂结合。这使得抗体适合用于本发明的方法。所述方法的优点是可以取消其中两条轻链都交换原始重链结合伴侣(这导致产物相关的H1L2-H2L1型杂质)的抗体组合。这是有利的，因为使用现有技术的纯化方法不容易耗尽这类与产物相关的杂质。
[0013] 如下所示，本发明的实施例使得能够通过使用CHO共表达来生产bbmAb，其产率和品质适合于生物制品的临床开发和商业化。
[0014] 在本发明的第一方面，提供了适合在共同宿主细胞中共表达的双特异性抗体，其中所述抗体包含：a)第一部分，所述第一部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有λ野生型可变轻链(VL1)和野生型可变重链(VH1)(其特异性结合至第一靶标)以及带有杂二聚化修饰的第一恒定重链(CH1)，以及b)第二部分，所述第二部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有κ野生型可变轻链(L2)和野生型可变重链(H2)(其与不同于第一靶标的第二靶标特异性结合)以及带有与第一恒定重链的杂二聚化修饰互补的杂二聚化修饰的第二恒定重链(CH2)，其中当第一部分和第二部分在共同宿主细胞中共表达时，形成双特异性抗体。
[0015] 在第一方面的另一个实施例中，适合在共同宿主细胞中共表达的双特异性抗体在通过从正确匹配的双特异性抗体中去除错配的片段纯化所述双特异性抗体后产生至少60％(质量)、70％(质量)、80％(质量)、85％(质量)纯，例如至少为90％(质量)纯、95％(质量)、96％(质量)、97％(质量)、98％(质量)或99％(质量)纯的双特异性抗体。
[0016] 双特异性抗体的第一和第二恒定重链可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，优选IgD、IgE或IgG。在一个优选的实施例中，第一和第二恒定重链是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，最优选IgG1。在一个实施例中，第一可变轻链是λ型，并且第二可变轻链是κ型。
[0017] 在特别优选的实施例中，第一可变轻链是λ1型，并且第二可变轻链是κ6型。
[0018] 第一恒定重链和第二恒定重链可以是IgG1，其中第一恒定重链具有产生杵结构的点突变，并且第二恒定重链具有产生臼结构的点突变，或者第一恒定重链具有产生臼结构的点突变并且第第二恒定重链具有产生杵结构的点突变。任选地，第一恒定重链和第二恒定重链可以另外具有导致二硫键的突变。
[0019] 在一个实施例中，双特异性抗体包含第一免疫球蛋白VH1结构域、第一免疫球蛋白VL1结构域、第二免疫球蛋白VH2结构域和第二免疫球蛋白VL2结构域，其中第一免疫球蛋白VH1结构域包含(例如依次)：高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；或高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:79，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:80，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:81；并且第一免疫球蛋白VL1结构域包含(例如依次)：高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:
94或高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:95，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:96，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:97；第二免疫球蛋白VH2结构域包含(例如依次)：高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；或高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:47，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:49；并且第二免疫球蛋白VL2结构域包含(例如依次)：高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62或高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:63，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:65。
94或高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:95，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:96，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:97；第二免疫球蛋白VH2结构域包含(例如依次)：高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；或高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:47，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:49；并且第二免疫球蛋白VL2结构域包含(例如依次)：高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62或高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:63，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:65。
[0020] 在一个实施例中，双特异性抗体包含第一免疫球蛋白VH1结构域、第一免疫球蛋白VL1结构域、第二免疫球蛋白VH2结构域和第二免疫球蛋白VL2结构域，其中：第一免疫球蛋白VH1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:85，第一免疫球蛋白VL1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:101，第二免疫球蛋白VH2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:53，第二免疫球蛋白VL2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:69。
[0021] 在一个实施例中，双特异性抗体包含第一免疫球蛋白重链、第一免疫球蛋白轻链、第二免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白轻链，其中：第一免疫球蛋白重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:87，第一免疫球蛋白轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:103，第二免疫球蛋白重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55，第二免疫球蛋白轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。
[0022] 根据第二方面，提供了一种根据第一方面的选择双特异性抗体的方法，所述方法包括：第一步骤：选择第一部分和第二部分；第二步骤：在共同宿主细胞中共表达所述第一部分和所述第二部分，产生包含所述第一部分和所述第二部分的双特异性抗体；第三步骤：通过从正确匹配的双特异性抗体中去除错配的片段来纯化所述双特异性抗体。在一个实施例中，第三步骤纯化产生双特异性抗体，其是至少60％(质量)、70％(质量)、80％(质量)、
85％(质量)纯，例如至少90％(质量)纯、95％(质量)、96％(质量)、97％(质量)、98％(质量)或99％(质量)纯。
85％(质量)纯，例如至少90％(质量)纯、95％(质量)、96％(质量)、97％(质量)、98％(质量)或99％(质量)纯。
[0023] 根据第三方面，提供了一种根据第一方面通过在共同宿主细胞中共表达来制造双特异性抗体的方法，所述方法包括：第一步骤：产生至少一个编码第一部分和第二部分的载体；第二步骤：将所述至少一个载体引入共同宿主细胞；第三步骤：选择特异性表达所述双特异性抗体的细胞；第四步骤：在细胞表达所述双特异性抗体的条件下培养所选细胞；以及第五步骤：纯化所述双特异性抗体，其是至少60％(质量)、70％(质量)、80％(质量)、85％(质量)纯，例如至少90％(质量)纯、95％(质量)、96％(质量)、97％(质量)、98％(质量)或99％(质量)纯。
[0024] 在一个实施例中，第一步骤包括产生编码第一部分的第一载体和编码第二部分的第二载体。
[0025] 根据第四方面，一种表达系统，所述表达系统包含至少一个载体(其包含编码根据第一方面的双特异性抗体的第一部分或第二部分的多核苷酸)和选择标志物。
[0026] 在一个实施例中，表达系统包含编码第一选择标志物(sm I)的多核苷酸；和编码第二选择标志物(sm II)的多核苷酸，其不同于第一选择标志物(sm I)。
[0027] 在一个实施例中，第一选择标志物(sm I)是叶酸转运蛋白或编码突变的叶酸受体的多核苷酸，其中与野生型叶酸受体相比突变的叶酸受体具有降低的叶酸结合亲和力，并且第二选择标志物(sm II)是DHFR。
[0028] 在一个实施例中，第一选择标志物(sm I)是潮霉素，并且第二选择标志物(sm II)是Neo/G418。
[0029] 在一个实施例中，表达系统包含两个表达载体，其中：第一载体，其包含至少编码第一选择标志物(sm I)的多核苷酸和至少编码第一部分的多核苷酸；第二载体，其包含至少编码第二选择标志物(sm II)的多核苷酸和至少编码第二部分的多核苷酸。
[0030] 表达系统可包含在编码重链的多核苷酸下游的终止密码子和位于终止密码子下游的编码免疫球蛋白膜锚的多核苷酸。
[0031] 根据第五方面，提供了一种用于选择在根据前述方面的方法中使用的共同宿主细胞的方法，所述方法包括提供多个宿主细胞的第一步骤，所述多个宿主细胞包含根据前述方面的表达系统；并且在针对选择标志物具有选择性的条件下培养所述多个宿主细胞，从而获得表达目的产物的宿主细胞。
[0032] 在一个实施例中，所述选择性培养基选自下组的培养基，所述培养基包含有限浓度的叶酸；和/或包含浓度500nM或更低的叶酸；和/或包含选自以下浓度的叶酸：1000nM-100pM；100nM-1nM；15nM-1nM；10nM-1nM；和10nM-2.5nM；和/或包含DHFR抑制剂；和/或包含抗叶酸剂；和/或包含浓度500nM或更低的抗叶酸剂；和/或包含选自以下浓度的MTX：500nM-
3nM；100nM-10nM；50nM-10nM；和50nM；和/或包含高达叶酸浓度20倍的浓度的抗叶酸剂；和/或包含叶酸浓度10-20倍的浓度的抗叶酸剂；和/或包含浓度高达15nM和等摩尔浓度高达MTX 20倍的叶酸。
3nM；100nM-10nM；50nM-10nM；和50nM；和/或包含高达叶酸浓度20倍的浓度的抗叶酸剂；和/或包含叶酸浓度10-20倍的浓度的抗叶酸剂；和/或包含浓度高达15nM和等摩尔浓度高达MTX 20倍的叶酸。
[0033] 在一个实施例中，宿主细胞包含表达系统，其中第一或第二部分的至少一部分被表达为包含免疫球蛋白跨膜锚或其片段的融合多肽，其中所述融合多肽被展示在所述宿主细胞的表面上，还包括以下步骤：使多个宿主细胞与结合融合多肽的检测化合物接触；根据结合到细胞表面的检测化合物的存在或数量，选择至少一个宿主细胞。
[0034] 在一个实施例中，检测化合物包含第一或第二靶标或者其衍生物以及检测标记。
[0035] 在一个实施例中，纯化双特异性抗体的第五步骤包括亲和色谱和/或离子交换色谱。
[0036] 在一个实施例中，色谱包括第一步骤捕获；第二步骤精制；以及任选的第三步骤精制。
[0037] 在一个实施例中，第一步骤捕获用选自由以下组成的组的原理进行：Fc结合亲和色谱，例如蛋白A或蛋白G；λ轻链特异性亲和色谱，其在本领域中是众所周知的，并且可商购TM获得，例如，LambdaFabSelect ；κ轻链特异性亲和色谱，其在本领域是众所周知的，并且可商购获得，例如KappaSelectTM；抗独特型亲和色谱，例如第一部分或第二部分；基于靶标的亲和色谱，例如使用第一靶标或第二靶标的亲和色谱；离子交换色谱，其在本领域是众所周知的，并且可商购获得，例如CaptoTM粘附或FractogelTM EMD SO3；和疏水相互作用色谱。
[0038] 在一个实施例中，第二步骤精制用选自由以下组成的组的原理进行：Fc结合亲和色谱，例如蛋白A或蛋白G；λ轻链特异性亲和色谱，例如，LambdaFabSelectTM；κ轻链特异性亲和色谱，例如KappaSelectTM；抗独特型亲和色谱，例如第一部分或第二部分；基于靶标的亲和色谱，例如使用第一靶标或第二靶标的亲和色谱；离子交换色谱，例如CaptoTM粘附或FractogelTM EMD SO3；疏水相互作用色谱；和病毒失活。
[0039] 在一个实施例中，第三步骤精制用选自由以下组成的组的原理进行：Fc结合亲和TM色谱，例如蛋白A或蛋白G；λ轻链特异性亲和色谱，例如，LambdaFabSelect ；κ轻链特异性亲和色谱，例如KappaSelectTM；抗独特型亲和色谱，例如第一部分或第二部分；基于靶标的亲和色谱，例如使用第一靶标或第二靶标的亲和色谱；离子交换色谱，例如CaptoTM粘附或FractogelTM EMD SO3；疏水相互作用色谱；和病毒失活。
[0040] 在一个实施例中，所述方法包括第一步骤蛋白A捕获，例如MabSelectTM SuReTM；第二步骤λ轻链亲和色谱，例如LambdaFabSelectTM；以及第三步骤κ轻链亲和色谱，例如KappaSelectTM；或第一步骤蛋白A，例如MabSelectTM SuReTM，第二步骤κ轻链亲和色谱，例如KappaSelectTM，和第三步骤λ轻链亲和色谱，例如LambdaFabSelectTM；或第一步骤κ轻链亲TM TM和色谱，例如KappaSelect ，和第二步骤λ轻链亲和色谱，例如LambdaFabSelect ；或第一步骤λ轻链亲和色谱，例如LambdaFabSelectTM，和第二步骤κ轻链亲和色谱，例如KappaSelectTM。
[0041] 在一个实施例中，细胞系选自由以下组成的组：CHO细胞、非生产性杂交瘤(non-producing hybridoma)(例如Sp2/0或NS0)、人源细胞系(例如HEK或PER.C6)、幼仓鼠肾脏(BHK)衍生细胞、酵母或丝状真菌、原核细菌(例如大肠杆菌(E.coli)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence))、植物衍生细胞、藻类和纤毛虫。
[0042] 根据第六方面，提供了一种药物组合物，其包含根据第一方面的抗体和药学上可接受的载体。
[0043] 根据第七方面，提供了根据第一方面的抗体或根据第六方面的药物组合物，用作药物。
[0044] 根据第七方面，提供了根据第一方面的抗体或根据第六方面的药物组合物，用于治疗炎性体相关疾病。
[0045] 根据第八方面，提供了根据第一方面的抗体或根据第六方面的药物组合物，用于治疗炎性体相关疾病，其中所述炎性体相关疾病选自由以下组成的组：镰状细胞病、血管病变、缺血再灌注损伤、心血管疾病、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、血管功能障碍、骨骼肌缺血、肺结节病、纤维化、疟疾、血液透析依赖性慢性肾病和克罗恩病。
[0046] 根据第九方面，提供了一种治疗炎性体相关障碍的方法，所述方法包括向患有炎性体相关障碍的受试者施用有效量的根据第一方面的抗体或根据第六方面的药物组合物。
[0047] 炎性体相关障碍可以是镰状细胞病、血管病变、缺血再灌注损伤、心血管疾病、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、血管功能障碍、骨骼肌缺血、肺结节病、纤维化、疟疾、血液透析依赖性慢性肾病或克罗恩病。附图说明
[0048] 图1是根据实施例的载体设置的示意性概述；
[0049] 图2A-2E示出了根据实施例的色谱图。图2A是根据实施例的去糖基化的完整bbmAb的RP-UV色谱图。图2B是根据实施例的完整的去糖基化的bbmAb1的解卷积质谱。图2C是显示根据实施例的木瓜蛋白酶消化的bbmAb片段的RP-UV色谱图。图2D是显示根据实施例的bbmAb的IdeS消化片段的RP-UV色谱图。图2E是显示根据实施例的去糖基化和DTT还原的bbmAb片段的RP-UV色谱图。
[0050] 图3A-3D示出了根据实施例的RP-UV色谱图。图3A是显示根据实施例的bbmAb在培养后的表达纯度谱的色谱图。图3B是根据实施例的bbmAb在用LambdaFabSelectTM捕获后的色谱图。图3C是根据实施例的bbmAb在用MabSelectTM SuReTMTM捕获后的色谱图。图3D是根据实施例的bbmAb在用LambdaFabSelectTMTM捕获、用FractogelTM EMD SO3精制和超滤之后的色谱图。
[0051] 图4A-4M是双特异性错配的不同选项的示意图。图4A是mAb1杵(λ)单体的示意图，其中数字1代表可变重链结构域，数字2代表第一恒定重链结构域，数字3代表第二恒定重链结构域，数字4代表第三恒定重链结构域。数字5代表可变轻链结构域，数字6代表可变重链结构域。图4B是mAb1杵(λ)同二聚体的示意图。图4C是mAb2臼(κ)单体的示意图，其中数字7代表可变重链结构域，数字8代表第一恒定重链结构域，数字9代表第二恒定重链结构域，数字10代表第三恒定重链结构域。数字11代表可变轻链结构域，数字12代表恒定重链结构域。图4D是mAb2臼(κ)同二聚体的示意图。图4E是具有一个CH/LC错配的mAb1杵同二聚体的示意图。图4F是具有两个CH/LC错配的mAb1杵同二聚体的示意图。图4G是具有一个CH/LC错配的mAb1杵同二聚体的示意图。图4H是具有一个CH/LC错配的mAb2臼同二聚体的示意图。图4I是具有两个CH/LC错配的mAb2臼同二聚体的示意图。图4J是具有一个CH/LC错配的mAb2臼同二聚体的示意图。图4K是具有一个κ(CH/LC)错配的bbmAb1的示意图。图4L是带有一个λ(CH/LC)错配的bbmAb1的示意图。图4M是带有两个CH/LC错配的bbmAb1的示意图。
[0052] 图5显示了根据实例的基于ECL的亲和力测定的滴定曲线。
[0053] 图6A-6B示出了根据实例的两个图。
[0054] 图7A-7B示出了根据实例的两个图。
[0055] 图8A-8B显示了根据实例的mRNA表达水平。
[0056] 图9A-9B显示了根据实例的mRNA表达水平。
[0057] 图10A-10B示出了根据实例的两个图。
[0058] 图11是示出根据实例的统计相关性的图。
具体实施方式
[0059] 本公开是尤其基于意想不到的发现，即具有λ(lambda)型轻链的某些抗体可以与具有κ(kappa)型轻链的某些抗体共表达以形成所需的bbmAb。
[0060] 不希望受理论的束缚，每条轻链和/或重链的CDR都可以显著影响哪些λ(lambda)型轻链可能与某些具有κ(kappa)轻链的抗体共表达以成功获得形成的bbmab。
[0061] 具有λ(lambda)型轻链的抗体(其可与某些具有κ(kappa)型轻链的抗体共表达形成所需的bbmAb，在以下也称为单特异性结合物)可以通过以下产生：使用提供机会获得κ或λ型抗体的两种类型抗体的技术，例如噬菌体展示文库，例如HuUCAL 或HuCAL(莫弗西斯公司(MorphoSys))，或使用转基因小鼠，其中相关的人免疫球TM
蛋白序列已通过基因工程引入动物基因组中，例如OmniAb抗体(OMT公司)、Kymouse (Kymab公司)、Trianni MouseTM(Trianni公司)或AlivaMab Mouse(Ablexis公司)(参考)可产生κ或λ型抗体。产生这种单特异性结合物的方法在专业领域中是众所周知的，并且被广泛地用于产生针对目的靶标的κ或λ单特异性结合物的多样化组。就相关的生物学参数例如亲和力或效力来表征各个单特异性结合物，并例如针对与判断所说的可开发性特征(这在该领域也是众所周知的)有关的理化特征进行筛选(例如，Lorenz等人,American Pharmaceutical Review[美国药学评论],2014年8月)。表现出最佳特征的单特异性结合物最终在例如CHO细胞中共表达，如下文更详细描述。仅通过共表达测试组合，其中结合至第一靶标的κ型抗体与结合至第二靶标的λ型抗体组合，反之亦然。最终共表达产物和相关的产物相关杂质的详细表征，目的旨在选择一种产生最佳谱的组合，尤其是仅显示一条轻链(例如L1，轻链1，例如λ)与错误的重链(例如H2，重链2)的少量混杂结合的那些。所述方法的优点是可以取消其中两条轻链都交换原始重链结合伴侣(这导致产物相关的H1L2-H2L1型杂质)的抗体组合。
这是有利的，因为使用现有技术的纯化方法不容易耗尽这类与产物相关的杂质。下面更详细地概述了如何共表达单个抗体以及如何分析共表达产物的程序。
蛋白序列已通过基因工程引入动物基因组中，例如OmniAb抗体(OMT公司)、Kymouse (Kymab公司)、Trianni MouseTM(Trianni公司)或AlivaMab Mouse(Ablexis公司)(参考)可产生κ或λ型抗体。产生这种单特异性结合物的方法在专业领域中是众所周知的，并且被广泛地用于产生针对目的靶标的κ或λ单特异性结合物的多样化组。就相关的生物学参数例如亲和力或效力来表征各个单特异性结合物，并例如针对与判断所说的可开发性特征(这在该领域也是众所周知的)有关的理化特征进行筛选(例如，Lorenz等人,American Pharmaceutical Review[美国药学评论],2014年8月)。表现出最佳特征的单特异性结合物最终在例如CHO细胞中共表达，如下文更详细描述。仅通过共表达测试组合，其中结合至第一靶标的κ型抗体与结合至第二靶标的λ型抗体组合，反之亦然。最终共表达产物和相关的产物相关杂质的详细表征，目的旨在选择一种产生最佳谱的组合，尤其是仅显示一条轻链(例如L1，轻链1，例如λ)与错误的重链(例如H2，重链2)的少量混杂结合的那些。所述方法的优点是可以取消其中两条轻链都交换原始重链结合伴侣(这导致产物相关的H1L2-H2L1型杂质)的抗体组合。
这是有利的，因为使用现有技术的纯化方法不容易耗尽这类与产物相关的杂质。下面更详细地概述了如何共表达单个抗体以及如何分析共表达产物的程序。
[0062] 以特异性抗体为例，主要是mAb2以轻链Vκ6与IL-1β结合，而mAb1以轻链Vλ1与IL-18结合。
[0063] 在一个优选的实施例中，使用了根据Ridgway等人，(1996)的两种抗体的Fc部分的KiH修饰。还测试了其他抗体。
[0064] 如下面的具体实施例所示，优选的实施例bbmAb1用单个共同的细胞系表达，从而确保生物学或诊断所需的足够的总产率、纯度和产物质量以进行临床开发和商业化。
[0065] 1.定义
[0067] 术语“IL-18”是IL-18多肽、白介素-18多肽、IFN-γ诱导因子或干扰素-γ诱导因子或INF-γ诱导因子的同义词。除非另有说明，术语“IL-18”是指人IL-18。IL-18是本领域技术人员众所周知的，例如可以从 国际公司( International Corporation)在产品编号#B001-5下获得。在整个说明书中，术语IL-18可互换地涵盖前-IL-18(成熟的IL-18在蛋白酶切割之前的前体)和成熟的IL-18(在蛋白酶切割后)，除非具体地说明意思是前-或成熟形式。
[0068] 术语“IL-1β”或“IL-1b”是IL-1β多肽和白介素1β多肽的同义词。除非另有说明，否则术语“IL-1β”是指人IL-1β。IL-1β是本领域技术人员众所周知的，并且例如可以从义翘神州公司(Sino Biological)在产品编号#10139-HNAE-5下获得。
[0069] 术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或其功能片段。天然存在的抗体通常包含四聚体，其通常由至少两条重(H)链和至少两条轻(L)链构成。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(通常由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成)构成。重链可以属于任何同种型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链包括κ(kappa)链和λ(lambda)链。重链和轻链可变区通常负责抗原识别，而重链和轻链恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，其间穿插有称为框架区(FR)的较保守区。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
[0070] 如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)是指全长抗体或抗体的一个或多个片段，这些片段保留特异性结合至IL-18或IL-1β抗原的能力。已经显示，全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,1989,Nature[自然]341:544-546)；以及分离的互补决定区(CDR)。
[0071] 此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过使它们能够形成为单一蛋白链的柔性接头来相连，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426；和Huston等人,(1988)Proc Natl Acad Sc[美国国家科学院院刊]；.85:
5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。
5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。
[0072] 在整个说明书中，术语“分离的”是指免疫球蛋白、抗体或多核苷酸(视情况而定)存在于与自然环境中不同的物理环境中。
[0073] 在整个说明书中，互补决定区(“CDR”)是根据卡巴特(Kabat)定义来定义的，除非指明CDR是根据另一定义来定义的。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”[具有免疫学重要性的蛋白序列],第5版,美国国立卫生研究院,公共卫生事业部,马里兰州贝塞斯达市(“卡巴特”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“乔西亚”编号方案)，和ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist[免疫学者],7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育免疫学与比较免疫学],27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)。例如，对于经典形式，根据卡巴特，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据乔西亚，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合卡巴特和乔西亚二者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基编号为大约26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，并且VL中的CDR氨基酸残基编号为大约27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)(根据“卡巴特”编号)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR区。
[0074] 按照惯例，重链中的CDR区通常称为H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，轻链中的CDR区通常称为L-CDR1、LCDR2和L-CDR3。它们在从氨基末端到羧基末端的方向上顺序编号。
[0075] 如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组合物的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
[0076] 如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有框架区和CDR区二者都衍生自人来源的序列的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自此类人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik等人,(2000),J Mol Biol[分子生物学杂志]；296:57-86所述。
[0077] 本发明的人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变或通过在体内体细胞突变来引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括衍生自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。
[0078] 术语“人单克隆抗体”是指具有可变区的展现出单一结合特异性的抗体，其中框架区和CDR区均衍生自人序列。
[0079] 如本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从动物(例如，小鼠)(所述动物对于人免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；从转化以表达人抗体的宿主细胞中(例如，从转染瘤中)分离的抗体；从重组组合的人抗体文库中分离的抗体；以及通过任何其他方式(其涉及全部或部分的人免疫球蛋白基因的剪接)制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中构架区和CDR区衍生自人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施例中，可以对此类重组人抗体进行体外诱变(或，当使用转基因人Ig序列的动物时，进行体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是衍生自人种系VH和VL序列的和与其相关的序列，这些序列在体内可能不天然存在于人抗体种系库中。
[0080] 短语“识别抗原的抗体”和“对抗原有特异性的抗体”在本文中与术语“与抗原特异性地结合的抗体”可互换使用。
[0081] 如本文所用，“特异性结合IL-18”的结合分子旨在指以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小的KD结合人IL-18的结合分子。
[0082] 如本文所用，“特异性结合IL-1β”的结合分子旨在指以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小的KD结合人IL-1β的结合分子。
[0083] 与IL-18以外的抗原发生交叉反应的结合分子是指以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小的KD结合该抗原的结合分子。与IL-1β以外的抗原发生交叉反应的结合分子是指以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小的KD结合该抗原的结合分子。
[0084] “不与特定抗原交叉反应”的结合分子旨在指在标准结合测定中对这些蛋白质表现出基本上不可检测的结合的结合分子。
[0085] 如本文所用，术语“拮抗剂”是指在活化化合物存在下抑制信号传导活性的结合分子。例如，在IL-18的情况下，IL-18拮抗剂将是在人细胞测定(如IL-18依赖性干扰素-γ(IFN-γ)生产测定)中存在IL-18时在人血细胞中抑制信号传导活性的结合分子。人血细胞中IL-18依赖性IFN-γ生产测定的实例在以下实例中更详细地描述。
[0086] 术语二价双特异性抗体或多个二价双特异性抗体是指与两个不同靶标(例如IL-18和IL-1β)结合的抗体。
[0087] 双特异性抗体是“异二聚体”，这意味着一部分来自对第一靶标特异性的第一抗体，并且另一部分来自对第二靶标特异性的第二抗体。“异二聚修饰”是对形成异二聚双特异性抗体的抗体的一个或两个部分的修饰，旨在促进这种形成。打算形成双特异性抗体的两个IgG1部分的Fc结构域的异二聚修饰的实例是在第一重链中具有大氨基酸(aa)侧链(S354C，T366W)的“杵”和在第二重链中引入了小氨基酸侧链(Y349C，T366S，L368A，Y407V)的“臼”以及在CH3区中连接两条重链的另外二硫桥(Merchant等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],16:677-681(1998),第678页,表1)。
[0088] 如本文所用，“无激动活性”的抗体旨在指在基于细胞的测定中不存在和/或存在靶标的情况下不显著增加靶依赖性信号传导活性的结合分子，例如在IL-18的情况下，在人血细胞IFN-γ生产测定中在不存在和/或存在IL-18的情况下不显著增加IL-18依赖性信号传导活性。在下面的实施例中更详细地描述了这类测定。
[0089] 如本文所使用的术语“Kassoc”或“Ka”意在是指特定结合分子-抗原相互作用的结合速率，而如本文所使用的术语“Kdis”或“Kd”意在是指特定结合分子-抗原相互作用的解离速率。如本文所使用的，术语“KD”意在是指解离常数，其获得自Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域中充分确立的方法确定抗体的KD值。用于测定抗体的KD的方法是通过使用表面等离子共振，如 系统。
[0090] 如本文使用的，术语“亲和力”是指结合分子和抗原在单个抗原位点处的相互作用强度。
[0091] 如本文所用，针对对抗体的术语“高亲和力”是指针对靶抗原的KD为1nM或更小的抗体。
[0092] 如本文所使用的，术语“受试者”包括人和非人动物。
[0094] 如本文所用，术语“优化的核苷酸序列”意指核苷酸序列已被改变为使用在产生细胞或生物(通常为真核细胞，例如巴斯德毕赤酵母的细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中优选的密码子编码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列工程化以完全保留最初由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述起始核苷酸序列也称为“亲本”序列。本文优化的序列已被工程化以具有在CHO哺乳动物细胞中优选的密码子；然而，本文还设想了这些序列在其他真核细胞中的优化表达。
[0095] 术语“同一性”是指至少两个不同序列之间的相似性。该同一性可以表示为同一性百分比，并且可以通过标准比对算法(例如基本局部比对工具(BLAST)(Altshul等人,(1990)J MoI Biol[分子生物学杂志]；215:403-410))；Needleman等人,(1970)J MoI Biol[分子生物学杂志]；48:444-453的算法；或Meyers等人,(1988)Comput Appl Biosci[计算应用生物科学]；4:11-17的算法)确定。一组参数可以是具有空位罚分12、空位延伸罚分4、以及移码空位罚分5的Blosum 62评分矩阵。也可使用已经整合到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller,(1989)CABIOS；4(1):1-17的算法，使用PAM 120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性。通常通过比较相似长度的序列来计算同一性百分比。
[0096] 术语“免疫应答”是指例如上述细胞或肝脏产生的淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致对入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞(或在自身免疫或病理性炎症的情况下，正常的人细胞或组织)的选择性损害、破坏或从人体中消除。
[0097] “信号转导途径”或“信号传导活性”是指通常通过蛋白质-蛋白质相互作用(如生长因子与受体的结合)引起的生物化学因果关系，导致信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分。通常，所述传递涉及引起信号转导的系列反应中一种或多种蛋白质上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特异性磷酸化。倒数第二个过程典型地包括细胞核事件，导致基因表达发生变化。
[0098] 在整个说明书中，术语“中和”及其语法变化是指，视情况而定，在结合蛋白或抗体存在下，靶标的生物学活性全部或部分降低。
[0099] 术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则所述术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，这些核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))
[0100] “多核苷酸”或“核酸”中的核苷酸可以包含修饰，包括碱基修饰，例如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、酰基苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)和氨基磷酸酯。
[0101] 术语“载体”是指适合于转化或转染宿主细胞并且包含指导和/或控制(与宿主细胞结合)一个或多个与其可操作地连接的异源编码区的表达的核酸序列的任何分子或实体(例如核酸，质粒，噬菌体或病毒)。
[0102] 术语“共表达”是指在所有多肽共同的单个宿主细胞中一起表达不同的多肽。双特异性抗体的共表达是指形成功能性双特异性抗体的不同部分在单个共同的宿主细胞中表达。共表达可通过在表达宿主细胞中掺入若干种表达载体，例如针对双特异性抗体的每半部分各自一个载体，或通过掺入编码双特异性抗体的所有部分的一个表达载体来实现。
[0103] 术语“错配”是指预期的蛋白质复合物的不同部分(例如双特异性抗体)未按预期复合，这意味着蛋白质复合物的外观或行为不符合预期。在双特异性抗体的情况下错配的实例如图4所示。
[0104] 编码结合分子、抗体或其片段的序列的“保守变体”是指包含保守氨基酸修饰的序列。“保守氨基酸修饰”旨在指不显著地影响或改变包含所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可以通过本领域中已知的标准技术将修饰引入本发明内容的结合蛋白中，这些标准技术是如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代还可以涵盖典型地通过化学肽合成而非通过生物系统中的合成而掺入的非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括但不限于肽模拟物(氨基酸部分的反向或倒向形式)。
[0105] 术语“表位”是免疫系统识别的抗原的一部分，例如抗体或其片段。在本说明书中，术语“表位”可互换地用于构象表位和线性表位。构象表位由抗原氨基酸序列的不连续部分组成，而线性表位由抗原的氨基酸连续序列形成。
[0106] 术语“治疗(treat、treating、treatment)”、“预防(prevent、preventing、prevention)”包括治疗性治疗、预防性治疗和应用，其中可降低受试者发展为障碍的风险或其他风险因素。治疗不需要完全治愈障碍，并且包括减轻症状或潜在的风险因素。如本文所用，人抗体或其片段包含作为特定种系序列“的产物”或“衍生自”特定种系的重链或轻链可变区或全长重链或轻链，如果所述抗体的可变区或全长链是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得的话。此类系统包括用感兴趣的抗原对携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫或用感兴趣的抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。作为人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体或其片段可以通过以下方式来照此鉴定：比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列，并且选择序列中与人抗体的序列最接近(即，最高同一性％)的人种系免疫球蛋白序列。作为特定人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变而含有与种系序列相比的氨基酸差异。然而，所选人抗体的氨基酸序列典型地与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少
90％相同，并且含有在与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠类种系序列)相比时将所述人抗体鉴定为是人抗体的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体的氨基酸序列可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％或至少95％或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。典型地，衍生自特定人种系序列的人抗体将展示与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人抗体可以展示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的不超过5个或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
90％相同，并且含有在与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠类种系序列)相比时将所述人抗体鉴定为是人抗体的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体的氨基酸序列可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％或至少95％或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。典型地，衍生自特定人种系序列的人抗体将展示与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人抗体可以展示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的不超过5个或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
[0107] 人抗体可以通过本领域技术人员已知的许多方法产生。人抗体可以通过杂交瘤方法使用人骨髓瘤或小鼠-人异种骨髓瘤细胞系制备(Kozbor,J Immunol[免疫杂志]；(1984)133:3001；Brodeur,Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications[单克隆分离抗体的生产技术与应用],第51-63页,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker Inc),1987)。可替代的方法包括使用噬菌体文库或转基因小鼠，它们均利用人可变区库(Winter G；(1994)Annu Rev Immunol[免疫学年度综述]12:433-455,Green LL,(1999)J Immunol Methods[免疫方法杂志]231:11-23)。
[0108] 现在可获得若干个转基因小鼠品系，其中它们的小鼠免疫球蛋白基因座已被人免疫球蛋白基因区段代替(Tomizuka K,(2000)Proc Natl Acad Sci[美国科学院院刊],97:722-727；Fishwild DM(1996)Nature Biotechnol[自然生物技术]14:845-851；Mendez MJ,(1997)Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156)。在抗原激发后，这种小鼠能够产生人抗体库，可以从中选择目的抗体。特别值得注意的是TrimeraTM系统(Eren R et al,(1988)Immunology 93:154-161)(其中将人淋巴细胞移植到了受辐照的小鼠中)选择性淋巴细胞分离抗体系统(SLAM，Babcook et al,Proc Natl Acad Sci(1996)93:7843-7848)，其中有效地使人(或其他物种)淋巴细胞通过大量池化体外分离抗体生成程序，然后进行解卷积，有限稀释和选择程序以及XenomouseTM(Abgenix公司)。可从Morphotek公司使用MorphodomaTM技术获得另一种方法。
[0109] 噬菌体展示技术可用于产生人抗体及其片段(McCafferty；(1990)Nature[自然],348:552-553和Griffiths AD等人(1994)EMBO 13:3245-3260)。根据该技术，将分离的抗体可变结构域基因框内克隆到丝状噬菌体(例如M13或fd)的蛋白基因的主要或次要外壳中，并作为功能性分离的抗体片段展示(通常在辅助噬菌体的帮助下)在噬菌体颗粒的表面。基于分离的抗体的功能特性的选择导致选择编码表现出这些特性的分离的抗体的基因。噬菌体展示技术可用于从人B细胞制备的文库中选择抗原特异性抗体，所述人B细胞取自患有疾病或障碍的个体，或者可替代地取自未免疫的人供体(Marks；J Mol Bio[分子生物学杂志](1991)222:581-591)。当需要包含Fc结构域的完整的人分离的抗体时，必须将噬菌体展示的衍生片段重新克隆到包含所需恒定区并建立稳定表达细胞系的哺乳动物表达载体中。
[0110] 亲和力成熟的技术(Marks；Biotechnol[生物技术](1992)10:779-783)可用于提供结合亲和力，其中通过用天然存在的变体顺序地替换H和L链可变区并在改善的结合亲和力的基础上进行选择来改善人初次分离抗体的亲和力。现在也提供了这种技术的变体，例如“表位压印”(WO 93/06213；Waterhouse；Nucl Acids Res[核酸研究](1993)21:2265-2266)。
[0111] 当在纯化的双特异性抗体的上下文中使用时，术语“纯”涉及不同的双特异性抗体组合和构建体在所选细胞中在其中细胞表达双特异性抗体的条件下共表达后和使用完整的UPLC-MS质量筛选方法的蛋白A纯化之后的纯度和同一性。纯或纯度是指形成的异二聚体和同二聚体bbmAb的相对定量。使用本发明的方法，可以观察到正确形成的异二聚体bbmAb1和bbmAb2，基于完整的质量信号强度，其相对纯度超过85％。
[0112] 2.IL-18抗体
[0113] 在披露的方法中使用的特别优选的IL-18抗体或其抗原结合片段是人抗体。
[0114] 为便于参考，下表1中提供了基于Kabat定义和Chothia定义的特异性IL-18抗体(称为mAb1)高变区的、以及VL和VH结构域以及完整的重链和轻链的氨基酸序列。
[0115] 表1.mAb1的高变区(CDR)、可变结构域(VH和VL)和全链的氨基酸序列。编码mAb1的VL的DNA列出在SEQ ID NO:18中。编码mAb1的VH的DNA列出在SEQ ID NO:8中。
[0116]
[0117] 在一个实施例中，所述IL-18抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:3。在一个实施例中，所述IL-18抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:5，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:6。
[0118] 在一个实施例中，所述IL-18抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:12并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:13。在一个实施例中，所述IL-18抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:14，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:15并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:16。
[0119] 在一个实施例中，所述IL-18抗体或其抗原结合片段包含至少一个免疫球蛋白VH结构域和至少一个免疫球蛋白VL结构域，其中：a)所述免疫球蛋白VH结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:3；或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:5，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:6；以及b)所述免疫球蛋白VL结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:12，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:13或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:14，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:15，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:16。
[0120] 在一个实施例中，所述IL-18抗体或其抗原结合片段包括：a)包含SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)；b)包含SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)；c)包含SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和包含SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；d)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域；e)包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；f)包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域；g)包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；h)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；i)包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；j)包含SEQ ID NO:19的轻链；k)包含SEQ ID NO:9的重链；或l)包含SEQ ID NO:19的轻链和包含SEQ ID NO:9的重链。
[0121] 在一些实施例中，IL-18抗体或其抗原结合片段(例如，mAb1)包含SEQ ID NO:7的三个CDR。在其他实施例中，IL-18抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:17的三个CDR。在其他实施例中，IL-18抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的三个CDR和SEQ ID NO:17的三个CDR。在一些实施例中，IL-18抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:9的三个CDR。在其他实施例中，IL-18抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19的三个CDR。在其他实施例中，IL-18抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:9的三个CDR和SEQ ID NO:19的三个CDR。
[0122] 在一个实施例中，所述IL-18抗体或其抗原结合片段(例如，mAb1)选自人IL-18抗体，所述人IL-18抗体至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，所述免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:3；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，所述免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:12，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:13。
[0123] 在一个实施例中，所述IL-18抗体或其抗原结合片段(例如，mAb1)选自人IL-18抗体，所述人IL-18抗体至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，所述免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:5，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:6；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，所述免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:14，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:15，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:16。
[0124] 在一个实施例中，所述IL-18抗体或其抗原结合片段选自包含抗原结合位点的单链抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合位点包含：a)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:3；和b)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:
12，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:13；和c)肽接头，其与第一结构域的N-末端和第二结构域的C-末端结合或与第一结构域的C-末端和第二结构域的N-末端结合。
12，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:13；和c)肽接头，其与第一结构域的N-末端和第二结构域的C-末端结合或与第一结构域的C-末端和第二结构域的N-末端结合。
[0125] 在一个实施例中，所述IL-18抗体或其抗原结合片段(例如，mAb1)选自包含抗原结合位点的单链抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合位点包含：a)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:5，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:6；和b)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:14，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:15，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:16；和c)肽接头，其与第一结构域的N-末端和第二结构域的C-末端结合或与第一结构域的C-末端和第二结构域的N-末端结合。
[0126] 在所披露的方法中使用的IL-18抗体或其抗原结合片段的VH或VL结构域可以具有与在SEQ ID NO:7和17中列出的VH或VL结构域基本上相同的VH和/或VL结构域。本文披露的人IL-18抗体可包含与SEQ ID NO:9所示的重链基本相同的重链和/或与SEQ ID NO:19所示的轻链基本相同的轻链。本文披露的人IL-18抗体可包含：含有SEQ ID NO:9的重链和含有SEQ ID NO:19的轻链。本文披露的人IL-18抗体可以包含：a)一条重链，其包含具有与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的可变结构域和人重链的恒定部分；和b)一条轻链，其包含具有与SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的可变结构域和人轻链的恒定部分。
[0128] 3.IL-1β抗体
[0129] 在披露的方法中使用的特别优选的IL-1β抗体或其抗原结合片段是人抗体。
[0130] 为便于参考，下表2中提供了基于Kabat定义和Chothia定义的特异性IL-1β抗体(称为mAb2)高变区的、以及VL和VH结构域以及完整的重链和轻链的氨基酸序列。
[0131] 表2.mAb2的高变区(CDR)、可变结构域(VH和VL)和全链的氨基酸序列。编码mAb2的VL的DNA列出在SEQ ID NO:38中。编码mAb2的VH的DNA列出在SEQ ID NO:27中。
[0132]
[0133]
[0134] 在一个实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:21，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:22，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:23。在一个实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:24，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:25，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:26。
[0135] 在一个实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:31，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:32并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:33。在一个实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:34，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:35并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:36。
[0136] 在一个实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包含至少一个免疫球蛋白VH结构域和至少一个免疫球蛋白VL结构域，其中：a)所述免疫球蛋白VH结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:21，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:22，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:24，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:25，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；以及b)所述免疫球蛋白VL结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:31，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:32，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:33或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:34，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:35，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:36。
[0137] 在一个实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包括：a)包含SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)；b)包含SEQ ID NO:37中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)；c)包含SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和包含SEQ ID NO:37中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；d)包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域；e)包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；f)包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域；g)包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；h)包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；i)包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；j)包含SEQ ID NO:37的轻链；
k)包含SEQ ID NO:29的重链；或l)包含SEQ ID NO:39的轻链和包含SEQ ID NO:29的重链。
k)包含SEQ ID NO:29的重链；或l)包含SEQ ID NO:39的轻链和包含SEQ ID NO:29的重链。
[0138] 在一些实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段(例如，mAb2)包含SEQ ID NO:37的三个CDR。在其他实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:27的三个CDR。在其他实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:37的三个CDR和SEQ ID NO:27的三个CDR。在一些实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的三个CDR。在其他实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:29的三个CDR。在其他实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的三个CDR和SEQ ID NO:29的三个CDR。
[0139] 在一个实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段(例如，mAb2)选自人IL-1β抗体，所述人IL-1β抗体至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，所述免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:21，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:22，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，所述免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:31，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:32，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:33。
[0140] 在一个实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段(例如，mAb2)选自人IL-1β抗体，所述人IL-1β抗体至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，所述免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:24，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:25，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，所述免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:34，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:35，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:36。
[0141] 在一个实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段选自包含抗原结合位点的单链抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合位点包含：a)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:21，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:22，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；和b)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:31，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:32，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:33；和c)肽接头，其与第一结构域的N-末端和第二结构域的C-末端结合或与第一结构域的C-末端和第二结构域的N-末端结合。
[0142] 在一个实施例中，所述IL-1β抗体或其抗原结合片段(例如，mAb2)选自包含抗原结合位点的单链抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合位点包含：a)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:24，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:25，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；和b)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:34，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:35，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:36；和c)肽接头，其与第一结构域的N-末端和第二结构域的C-末端结合或与第一结构域的C-末端和第二结构域的N-末端结合。
[0143] 在所披露的方法中使用的IL-1β抗体或其抗原结合片段的VH或VL结构域可以具有与在SEQ ID NO:27和37中列出的VH或VL结构域基本上相同的VH和/或VL结构域。本文披露的人IL-1β抗体可包含与SEQ ID NO:29所示的重链基本相同的重链和/或与SEQ ID NO:39所示的轻链基本相同的轻链。本文披露的人IL-1β抗体可包含：含有SEQ ID NO:29的重链和含有SEQ ID NO:39的轻链。本文披露的人IL-1β抗体可以包含：a)一条重链，其包含具有与SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的可变结构域和人重链的恒定部分；和b)一条轻链，其包含具有与SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的可变结构域和人轻链的恒定部分。
[0144] 用于披露的方法、试剂盒和方案的其他优选的IL-1β拮抗剂(例如抗体)是以下列出的那些：美国专利号：7,446,175或7,993,878或8,273,350，将其通过引用以其整体并入本文。
[0145] 4.Fc修饰
[0146] 除了在框架或CDR区内进行的修饰之外或作为在框架或CDR区内进行的修饰的替代方案，可以将本发明的抗体工程化以包含Fc区内的修饰，通常是为了改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰的(例如，一个或多个化学部分可以附接至抗体)或被修饰以改变其糖基化，从而再次改变抗体的一种或多种功能特性。以下更详细地描述了这些实施例中的每一个。Fc区中的残基编号是Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案的编号。
[0147] 在一个实施例中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。所述方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区中半胱氨酸残基的数目，以便例如促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
[0148] 在另一个实施例中，使抗体的Fc铰链区突变以缩短抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域中，使得抗体具有相对于天然Fc铰链结构域SpA结合而言受损的葡萄球菌蛋白质A(SpA)结合。该方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
[0149] 在另一个实施例中，修饰抗体以增加其生物半衰期。可以采用各种方法。例如，可以引入以下突变中的一种或多种：如在美国专利号6,277,375中由Ward所述的T252L、T254S、T256F。可替代地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体，以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
[0150] 在又其他实施例中，通过用不同的氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基置换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
[0151] 在另一个实施例中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基置换，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中进一步详细描述。
[0152] 在另一个实施例中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中进一步描述。
[0153] 在另一个实施例中，修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加抗体对Fcγ受体的亲和力。该方法由Presta在PCT公开WO 00/42072中进一步描述。此外，已经定位了人IgG1上的FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点并且已经描述了具有改良的结合的变体(参见Shields,R.L.等人,2001J.Biol.Chen.[生物化学杂志]276:6591-6604)。
[0154] 在某些实施例中，使用IgG1同种型的Fc结构域。在一些具体的实施例中，使用了IgG1 Fc片段的突变变体，例如沉默的IgG1 Fc，其可降低或消除融合多肽介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或与Fcγ受体结合的能力。IgG1同种型沉默突变体的实例，其中如Hezareh等人,J.Virol(2001)；75(24):12161-8所述，在氨基酸位置234和235处亮氨酸残基被丙氨酸残基取代。
[0155] 在某些实施例中，Fc结构域是防止Fc结构域的位置297糖基化的突变体。例如，Fc结构域在位置297处含有天冬酰胺残基的氨基酸取代。这种氨基酸取代的实例是用甘氨酸或丙氨酸置换N297。
[0156] 沉默的效应子功能可以通过抗体Fc区的突变获得，并且在本领域已有描述：LALA和N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.[当前生物技术观点]vol.20(6):685-691)；和D265A(Baudino等人,2008,J.Immunol.[免疫学杂志]181:6664-69；Strohl,W.,同上)；和DAPA(D265A和P329A)(Shields RL.,J Biol Chem.[生物化学杂志]2001；276(9):
6591-604；美国专利公开号US2015/0320880)。沉默Fc IgG1抗体的实例包含所说的LALA突变体，所述突变体在IgG1 Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变。沉默IgG1抗体的另一个实例包含D265A突变。沉默IgG1抗体的另一实例是所说的DAPA突变体，所述突变体包含IgG1 Fc氨基酸序列中的D265A和P329A突变。另一个沉默IgG1抗体包含N297A突变，所述突变导致无糖基化/非糖基化的抗体。用于提供沉默的效应子功能的其他Fc突变描述于PCT公开号WO
2014/145806(例如，在WO 2014/145806的图7中)，通过引用整体并入本文。来自WO 2014/
145806的沉默IgG1抗体的一个实例包含E233P、L234V、L235A和S267K突变以及G236(G236del)的缺失。来自WO 2014/145806的沉默IgG1抗体的另一个实例包含E233P、L234V和L235A突变，以及G236(G236del)的缺失。来自WO 2014/145806的沉默IgG1抗体的另一个实例包含S267K突变。
6591-604；美国专利公开号US2015/0320880)。沉默Fc IgG1抗体的实例包含所说的LALA突变体，所述突变体在IgG1 Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变。沉默IgG1抗体的另一个实例包含D265A突变。沉默IgG1抗体的另一实例是所说的DAPA突变体，所述突变体包含IgG1 Fc氨基酸序列中的D265A和P329A突变。另一个沉默IgG1抗体包含N297A突变，所述突变导致无糖基化/非糖基化的抗体。用于提供沉默的效应子功能的其他Fc突变描述于PCT公开号WO
2014/145806(例如，在WO 2014/145806的图7中)，通过引用整体并入本文。来自WO 2014/
145806的沉默IgG1抗体的一个实例包含E233P、L234V、L235A和S267K突变以及G236(G236del)的缺失。来自WO 2014/145806的沉默IgG1抗体的另一个实例包含E233P、L234V和L235A突变，以及G236(G236del)的缺失。来自WO 2014/145806的沉默IgG1抗体的另一个实例包含S267K突变。
[0157] 在还另一个实施例中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过以下方式来完成：例如，改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。这种方法更详细地描述于Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
[0158] 另外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这类改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述，并且可用作宿主细胞，在所述宿主细胞中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖基化。因此，在一个实施例中，本发明的抗体通过在表现出岩藻糖基化模式的细胞系(例如编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因表达缺陷的哺乳动物细胞系)中的重组表达而产生。Presta在PCT公开WO 03/035835中描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，还导致在所述宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还参见Shields,R.L.等人,2002J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO
99/54342描述了如下细胞系，所述细胞系被工程化以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在工程化细胞系中表达的抗体显示出增加的二等分GlcNac结构，所述二等分GlcNac结构导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,1999Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180)。可替代地，本发明的抗体可以在酵母菌或丝状真菌中产生，所述酵母菌或丝状真菌针对哺乳动物样糖基化模式工程化，并且能够产生缺乏作为糖基化模式的岩藻糖的抗体(参见例如EP1297172B1)。
99/54342描述了如下细胞系，所述细胞系被工程化以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在工程化细胞系中表达的抗体显示出增加的二等分GlcNac结构，所述二等分GlcNac结构导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,1999Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180)。可替代地，本发明的抗体可以在酵母菌或丝状真菌中产生，所述酵母菌或丝状真菌针对哺乳动物样糖基化模式工程化，并且能够产生缺乏作为糖基化模式的岩藻糖的抗体(参见例如EP1297172B1)。
[0159] 本发明考虑的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化以例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，通常在一个或多个PEG基团附接至该抗体或抗体片段的条件下使所述抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可以通过酰化反应或烷基化反应采用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施例中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明的抗体。参见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
[0160] 本发明考虑的抗体的另一种修饰是至少本发明的抗体的抗原结合区与血清蛋白(例如人血清白蛋白或其片段)的缀合物或蛋白融合物以增加所得分子的半衰期。这样的方法例如在Ballance等人EP0322094中描述。
[0161] 本发明考虑的抗体的另一种修饰是一种或多种修饰，以增加异二聚双特异性抗体的形成。本领域可用的多种方法可用于增强双特异性抗体例如bbmAb的两个重链结构域的二聚化，如以下中披露的：EP 1870459A1；美国专利号5,582,996；美国专利号5,731,168；美国专利号5,910,573；美国专利号5,932,448；美国专利号6,833,441；美国专利号7,183,076；美国专利申请公开号2006204493A1、和PCT公开号WO 2009/089004A1，其内容整体结合于此。
[0162] 例如，在PCT公开号WO 1996/027011、Ridgway等人,(1996)和Merchant等人(1998)中披露了使用杵臼结构产生双特异性抗体。
[0163] (1)杵臼结构(KIH)
[0164] 本发明的多特异性分子(例如多特异性抗体或抗体样分子)可以包含一个或多个(例如多个)对一个或多个恒定结构域(例如对CH3结构域)的突变。在一个实例中，本发明的多特异性分子包含两个多肽，每个多肽包含抗体的重链恒定结构域，例如，CH2或CH3结构域。在实例中，两个重链恒定结构域，例如，多特异性分子的CH2或CH3结构域包含一个或多个突变，所述突变允许两个链之间的异二聚体缔合。一方面，一个或多个突变布置在多特异性例如双特异性抗体或抗体样分子的两条重链的CH2结构域上。在一个方面，一个或多个突变布置在多特异性分子的至少两个多肽的CH3结构域上。在一个方面，对包含重链恒定结构域的多特异性分子的第一多肽的一个或多个突变产生“杵”并且对包含重链恒定结构域的多特异性分子的第二多肽的一个或多个突变产生“臼”，使得包含重链恒定结构域的多特异性分子的多肽的异二聚化产生“杵”以与“臼”界面接合(例如，相互作用，例如，第一多肽的CH2结构域与第二多肽的CH2结构域相互作用，或第一多肽的CH3结构域与第二多肽的CH3结构域相互作用)。如本文所用的术语，“杵”是指至少一个氨基酸侧链，所述氨基酸侧链从包含重链恒定结构域的多特异性分子的第一多肽的界面上突出并且因此可定位于在与包含重链恒定结构域的多特异性分子的第二多肽的界面中的互补性“臼”中以稳定异多聚物，并且从而有利于异多聚物形成(例如相对于同多聚物)。所述杵可存在于最初的界面中或可合成引入(例如，通过改变编码所述界面的核酸)。用于形成杵的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且可优选选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在优选实施例中，用于形成突起的最初残基具有小侧链容积，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
[0165] “臼”是指至少一个氨基酸侧链，所述氨基酸侧链凹进包含重链恒定结构域的多特异性分子的第二多肽的界面中并且因此容纳包含重链恒定结构域的多特异性分子的第一多肽的相邻交界表面上的相应的杵。所述臼可存在于最初的界面中或可以合成方式引入(例如，通过改变编码界面的核酸)。用于形成臼的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。最优选的是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在优选实施例中，用于形成臼的最初的残基具有大的侧链容积，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
[0166] 在一个优选的实施例中，第一CH3结构域在残基366、405或407(根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案)处突变以产生“杵”或“臼”(如上所述)，并且与第一CH3结构域异二聚化的第二CH3结构域在以下位置发生突变：根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案，残基407(如果在第一CH3结构域中残基366被突变)、残基349(如果在第一CH3结构域中残基405被突变)、或残基366(如果在第一CH3结构域中残基407被突变)，以产生与第一个CH3域的“杵”或“臼”互补的“臼”或“杵”。
[0167] 在另一个优选的实施例中，第一CH3结构域在残基366(根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案)处突变，以产生“杵”或“臼”(如上所述)，并且与第一CH3结构域异二聚化的第二CH3结构域在残基366、368和/或407(根据Edelman等人,PNAS,
1969五月,63(1):78-85的EU编号方案)处突变，以产生与第一CH3结构域的“杵”或“臼”互补的“臼”或“杵”。在一个实施例中，对第一CH3结构域的突变在位置366处引入了酪氨酸(Y)残基。在实施例中，对第一CH3的突变是T366Y。在一个实施例中，对第一CH3结构域的突变在位置366处引入色氨酸(W)残基。在实施例中，对第一CH3的突变是T366W。在实施例中，对与第一CH3结构域(在位置366处进行了突变(例如，具有在位置366处引入的酪氨酸(Y)或色氨酸(W)，例如，包含突变T366Y或T366W))异二聚体化的第二CH3结构域的突变包含在位置366处的突变、在位置368处的突变和在位置407处的突变，所述位置是根据Edelman等人,PNAS,
1969五月,63(1):78-85的EU编号方案。在实施例中，在位置366处的突变引入了丝氨酸(S)残基，在位置368处的突变引入了丙氨酸(A)，并且在位置407处的突变引入了缬氨酸(V)。在实施例中，所述突变包含T366S、L368A和Y407V。在一个实施例中，多特异性分子的第一CH3结构域包含突变T366Y，并且与第一CH3结构域异二聚体化的第二CH3结构域包含突变T366S、L368A和Y407V，反之亦然。在一个实施例中，多特异性分子的第一CH3结构域包含突变T366W，并且与第一CH3结构域异二聚体化的第二CH3结构域包含突变T366S、L368A和Y407V，反之亦然。
1969五月,63(1):78-85的EU编号方案)处突变，以产生与第一CH3结构域的“杵”或“臼”互补的“臼”或“杵”。在一个实施例中，对第一CH3结构域的突变在位置366处引入了酪氨酸(Y)残基。在实施例中，对第一CH3的突变是T366Y。在一个实施例中，对第一CH3结构域的突变在位置366处引入色氨酸(W)残基。在实施例中，对第一CH3的突变是T366W。在实施例中，对与第一CH3结构域(在位置366处进行了突变(例如，具有在位置366处引入的酪氨酸(Y)或色氨酸(W)，例如，包含突变T366Y或T366W))异二聚体化的第二CH3结构域的突变包含在位置366处的突变、在位置368处的突变和在位置407处的突变，所述位置是根据Edelman等人,PNAS,
1969五月,63(1):78-85的EU编号方案。在实施例中，在位置366处的突变引入了丝氨酸(S)残基，在位置368处的突变引入了丙氨酸(A)，并且在位置407处的突变引入了缬氨酸(V)。在实施例中，所述突变包含T366S、L368A和Y407V。在一个实施例中，多特异性分子的第一CH3结构域包含突变T366Y，并且与第一CH3结构域异二聚体化的第二CH3结构域包含突变T366S、L368A和Y407V，反之亦然。在一个实施例中，多特异性分子的第一CH3结构域包含突变T366W，并且与第一CH3结构域异二聚体化的第二CH3结构域包含突变T366S、L368A和Y407V，反之亦然。
[0168] 另外的空间或“偏移”(例如杵臼结构)突变描述于PCT公开号WO 2014/145806(例如，WO 2014/145806的图3、图4和图12)、PCT公开号WO 2014/110601、和PCT公开号WO 2016/086186、WO 2016/086189、WO 2016/086196和WO 2016/182751(其内容整体结合于此)中。
KIH变体的实例包含含有L368D和K370S突变的第一恒定链，其与包含S364K和E357Q突变的第二恒定链配对。
KIH变体的实例包含含有L368D和K370S突变的第一恒定链，其与包含S364K和E357Q突变的第二恒定链配对。
[0169] 适用于本发明的任何多特异性分子的另外的杵臼结构突变对进一步描述于例如WO 1996/027011和Merchant等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],16:677-681(1998)(其内容通过引用整体并入本文)中。
[0170] 在本文描述的任何实施例中，CH3结构域可以另外突变以引入一对半胱氨酸残基。不受理论束缚，据信，引入能够形成二硫键的一对半胱氨酸残基向异二聚化的多特异性分子提供了稳定性。在实施例中，根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案，第一CH3结构域在位置354处包含半胱氨酸，并且根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案，与第一CH3结构域异二聚化的第二CH3结构域在位置349处包含半胱氨酸。在实施例中，多特异性分子的第一CH3结构域包含在位置354处的半胱氨酸(例如，包含突变S354C)和在位置366处的酪氨酸(Y)(例如，包含突变T366Y)，并且与第一CH3结构域异二聚体化的第二CH3结构域包含在位置349处的半胱氨酸(例如，包含突变Y349C)、在位置366处的丝氨酸(例如，包含突变T366S)、在位置368处的丙氨酸(例如，包含突变L368A)、和在位置407处的缬氨酸(例如，包含突变Y407V)。在实施例中，多特异性分子的第一CH3结构域包含在位置354处的半胱氨酸(例如，包含突变S354C)和在位置366处的色氨酸(W)(例如，包含突变T366W)，并且与第一CH3结构域异二聚体化的第二CH3结构域包含在位置349处的半胱氨酸(例如，包含突变Y349C)、在位置366处的丝氨酸(例如，包含突变T366S)、在位置
368处的丙氨酸(例如，包含突变L368A)、和在位置407处的缬氨酸(例如，包含突变Y407V)。
368处的丙氨酸(例如，包含突变L368A)、和在位置407处的缬氨酸(例如，包含突变Y407V)。
[0171] (2)可替代的杵臼(Knob and Hole)：IgG异二聚化
[0172] 一方面，通过在衍生自IgG1抗体类别的CH3结构域中引入一个或多个突变来增加多特异性分子的多肽链的(例如，半抗体的)异二聚化。在一个实施例中，根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案，突变包括对一个CH3结构域的K409R突变与在第二CH3结构域中的F405L突变配对。根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案，另外的突变也可以或可替代地在位置366、368、370、399、405、407和409处。优选地，包含此类突变的多肽的异二聚化在还原条件下，例如，在25℃-37℃，例如，25℃或37℃下，10-100mM 2-MEA(例如，25、50、或100mM 2-MEA)持续1-10，例如，1.5-5，例如，5小时实现。
[0173] 使用本领域公知的技术将本文所述的氨基酸置换引入CH3结构域。通常，使用Mutagenesis:a Practical Approach[诱变：实用方法]中描述的技术对编码一个或多个重链的DNA进行基因工程化。寡核苷酸介导的诱变是制备编码两条杂合重链的DNA的取代变体的优选方法。如Adelman等人,(1983)DNA,2:183所述，该技术是本领域众所周知的。
[0174] IgG异二聚化策略描述于例如WO 2008/119353、WO 2011/131746和WO 2013/060867中，其内容通过引用整体并入本文。
[0175] 在本文描述的任何实施例中，CH3结构域可以另外突变以引入一对半胱氨酸残基。不受理论束缚，据信，引入能够形成二硫键的一对半胱氨酸残基向异二聚化的多特异性分子提供了稳定性。在实施例中，根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案，第一CH3结构域在位置354处包含半胱氨酸，并且根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案，与第一CH3结构域异二聚化的第二CH3结构域在位置349处包含半胱氨酸。
[0176] (3)极性桥
[0177] 一方面，多特异性分子的多肽链(例如半抗体)的异二聚化通过引入基于“极性桥接”原理的突变而增加，所述基本原理是将在两条多肽链的结合界面制造残基以与异二聚体构型中具有相似(或互补性)物理性质的残基相互作用，同时与同型二聚体构型中具有不同物理性质的残基相互作用。特别地，设计这些突变从而在异二聚体形成中，极性残基与极性残基相互作用，而疏水残基与疏水残基相互作用。相比之下，在同型二聚体形成中，突变残基，从而极性残基与疏水残基相互作用。异二聚体构型中有利的相互作用和同型二聚体构型中不利的相互作用一起作用使得CH3结构域形成异二聚体比形成同型二聚体的可能性更大。
[0178] 在一个示例性实施例中，以上突变是在CH3结构域的残基364、368、399、405、409和411的一个或多个位置处产生的，氨基酸编号根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-
85的EU编号方案。
85的EU编号方案。
[0179] 一方面，一个或多个选自由以下组成的组的突变：Ser364Leu、Thr366Val、Leu368Gln、Asp399Lys、Phe405Ser、Lys409Phe和Thr411Lys被引入两个CH3结构域之一。(Ser364Leu：位置364处的丝氨酸的最初残基被亮氨酸置换；Thr366Val：位置366处的苏氨酸的最初残基被缬氨酸置换；Leu368Gln：位置368处的亮氨酸的最初残基被谷氨酰胺置换；
Asp399Lys：位置399处的最初残基天冬氨酸被赖氨酸置换；Phe405Ser：位置405处的最初残基苯丙氨酸被丝氨酸置换；Lys409Phe：位置409处的最初残基赖氨酸被苯丙氨酸置换；
Thr411Lys：位置411处的苏氨酸的最初残基被赖氨酸置换。)
Asp399Lys：位置399处的最初残基天冬氨酸被赖氨酸置换；Phe405Ser：位置405处的最初残基苯丙氨酸被丝氨酸置换；Lys409Phe：位置409处的最初残基赖氨酸被苯丙氨酸置换；
Thr411Lys：位置411处的苏氨酸的最初残基被赖氨酸置换。)
[0180] 在另一方面，可以将选自由以下组成的组的一个或多个突变来引入另一个CH3：Tyr407Phe、Lys409Gln和Thr411Asp(Tyr407Phe：位置407处的最初残基酪氨酸被苯丙氨酸置换；Lys409Glu：位置409处的最初残基赖氨酸被谷氨酸置换；Thr411Asp：位置411处的苏氨酸的最初残基被天冬氨酸置换)。
[0181] 另一方面，一个CH3结构域具有一个或多个选自由以下组成的组的突变：Ser364Leu、Thr366Val、Leu368Gln、Asp399Lys、Phe405Ser、Lys409Phe和Thr411Lys，而另一个CH3结构域具有一个或多个选自由以下组成的组的突变：Tyr407Phe、Lys409Gln和Thr411Asp。
[0182] 在一个示例性实施例中，一个CH3结构域的位置366处的苏氨酸的最初残基被缬氨酸置换，而另一个CH3结构域的位置407处的酪氨酸的最初残基被苯丙氨酸置换。
[0183] 在另一个示例性实施例中，一个CH3结构域的位置364处的丝氨酸的最初残基被亮氨酸置换，而在相同CH3结构域的位置368处的亮氨酸的最初残基被谷氨酰胺置换。
[0184] 在又另一个示例性实施例中，一个CH3结构域的位置405处的苯丙氨酸的最初残基被丝氨酸置换并且这一CH3结构域的位置409处的赖氨酸的最初残基被苯丙氨酸置换，而另一CH3结构域的位置409处的赖氨酸的最初残基被谷氨酰胺置换。
[0185] 在又另一个示例性实施例中，一个CH3结构域的位置399处的天冬氨酸的最初残基被赖氨酸置换，并且相同CH3结构域的位置411处的苏氨酸的最初残基被赖氨酸置换，而另一CH3结构域的位置411处的苏氨酸的最初残基被天冬氨酸置换。
[0186] 使用本领域公知的技术将本文所述的氨基酸置换引入CH3结构域。通常，使用Mutagenesis:a Practical Approach[诱变：实用方法]中描述的技术对编码一个或多个重链的DNA进行基因工程化。寡核苷酸介导的诱变是制备编码两条杂合重链的DNA的取代变体的优选方法。如Adelman等人,(1983)DNA,2:183所述，该技术是本领域众所周知的。
[0187] 极性桥策略描述于例如WO 2006/106905、WO 2009/089004个K.Gunasekaran等人(2010)The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],285:19637-19646(其内容通过引用整体并入本文)中。
[0188] 另外的极性桥突变描述于，例如，PCT公开号WO 2014/145806(例如，WO 2014/145806的图6)，PCT公开号WO 2014/110601，和PCT公开号WO 2016/086186、WO 2016/
086189、WO 2016/086196和WO 2016/182751(其内容整体结合于此)中。极性桥变体的实例包含含有N208D、Q295E、N384D、Q418E和N421D突变的恒定链。
086189、WO 2016/086196和WO 2016/182751(其内容整体结合于此)中。极性桥变体的实例包含含有N208D、Q295E、N384D、Q418E和N421D突变的恒定链。
[0189] 在本文描述的任何实施例中，CH3结构域可以另外突变以引入一对半胱氨酸残基。不受理论束缚，据信，引入能够形成二硫键的一对半胱氨酸残基向异二聚化的多特异性分子提供了稳定性。在实施例中，根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案，第一CH3结构域在位置354处包含半胱氨酸，并且根据Edelman等人,PNAS,1969五月,63(1):78-85的EU编号方案，与第一CH3结构域异二聚化的第二CH3结构域在位置349处包含半胱氨酸。
[0190] 用于增强异二聚化的其他策略描述于例如WO 2016/105450、WO 2016/086186、WO 2016/086189、WO 2016/086196、WO 2016/141378和WO 2014/145806和WO 2014/110601(其各自的全部内容通过引用整体并入本文)中。任何所述策略均可用于本文所述的多特异性分子。
[0191] 在实施例中，将本文讨论的两个或更多个修饰组合在单个双特异性抗体例如bbmAb中。
[0192] 5.实例1：bbmAb bbmAb1的产生
[0193] 通过举例的方式，以下描述特异性bbmAb的产生，以使本领域技术人员能够实施本发明。
[0194] 所得的bbmAb，bbmAb1是双特异性IgG1，具有LALA沉默突变，同时与两个不同的靶标IL-1β和IL-18结合。所述抗体结合两个不同的抗原结合臂(Fab片段)，而针对IL-1β的Fab基于mAb2，并包含κ轻链(Vk6)。针对IL-18的Fab基于mAb1，并由λ轻链(Vλ1)构成。为了在表达过程中驱动Fc结构域的异二聚化，在mAb1重链中带有大氨基酸(aa)侧链(S354C和T366W)的“杵”和带有小aa侧链(Y349C、T366S、L368A、Y407V)的“臼”被引入mAb2重链。
[0195] 为便于参考，下表3中提供了基于Kabat定义和Chothia定义的CJM112高变区的、以及VL和VH结构域以及完整的重链和轻链的氨基酸序列。
[0196] 表3.bbmAb1的高变区(CDR)、可变结构域(VH和VL)和全链的氨基酸序列。编码第一VL的DNA在SEQ ID NO:102中列出，编码第二VL的DNA在SEQ ID NO:70中列出。编码第一VH的DNA在SEQ ID NO:86中列出，编码第二VH的DNA在SEQ ID NO:54中列出。
[0197]
[0198]
[0199] 在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白重链可变结构域(VH1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78。在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白重链可变结构域(VH1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:79，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:80，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:81。在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白重链可变结构域(VH1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:82，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:83，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:84。
[0200] 在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白重链可变结构域(VH2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46。在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白重链可变结构域(VH2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:47，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:49。在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白重链可变结构域(VH2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:50，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:52。
[0201] 在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白轻链可变结构域(VL1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94。在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白轻链可变结构域(VL1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:95，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:96，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:97。在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白轻链可变结构域(VL1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:98，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:99，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:100。
[0202] 在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白轻链可变结构域(VL2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62。在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白轻链可变结构域(VL2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:63，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:65。在一个实施例中，所述IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白轻链可变结构域(VL2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:66，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:67，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:68。
[0203] 在一个实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含第一免疫球蛋白VH1结构域和第一免疫球蛋白VL1结构域，其中：a)所述第一免疫球蛋白VH1结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:79，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:80，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:81；或iii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:82，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:83，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:84并且b)所述第一免疫球蛋白VL1结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:95，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:96，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:97或iii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:98，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:99，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:100。
[0204] 在一个实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含第二免疫球蛋白VH2结构域和第二免疫球蛋白VL2结构域，其中：a)所述第二免疫球蛋白VH2结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:47，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:49；或iii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:50，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:52并且b)所述第二免疫球蛋白VL2结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:63，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:65或iii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:66，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:67，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:68。
[0205] 在一个实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含：a)包含SEQ ID NO:85中所列出的氨基酸序列的第一免疫球蛋白重链可变结构域(VH1)；b)包含SEQ ID NO:101中所列出的氨基酸序列的第一免疫球蛋白轻链可变结构域(VL1)；c)包含SEQ ID NO:85中所列出的氨基酸序列的第一免疫球蛋白VH1结构域和包含SEQ ID NO:101中所列出的氨基酸序列的第一免疫球蛋白VL1结构域；d)包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VH1结构域；e)包含SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VL1结构域；f)包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VH1结构域；g)包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VL1结构域；h)包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VH1结构域以及包含SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VL1结构域。i)包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VH1结构域以及包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VL1结构域；j)包含SEQ ID NO:103的第一轻链；k)包含SEQ ID NO:87的第一重链；或l)包含SEQ ID NO:103的第一轻链和包含SEQ ID NO:87的第一重链。
[0206] 在一个实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含：a)包含SEQ ID NO:53中所列出的氨基酸序列的第二免疫球蛋白重链可变结构域(VH2)；b)包含SEQ ID NO:69中所列出的氨基酸序列的第二免疫球蛋白轻链可变结构域(VL2)；c)包含SEQ ID NO:53中所列出的氨基酸序列的第二免疫球蛋白VH2结构域和包含SEQ ID NO:69中所列出的氨基酸序列的第二免疫球蛋白VL2结构域；d)包含SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VH2结构域；e)包含SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VL2结构域；f)包含SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VH2结构域；g)包含SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VL2结构域；h)包含SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VH2结构域以及包含SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VL2结构域。i)包含SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VH2结构域以及包含SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VL2结构域；j)包含SEQ ID NO:81的第二轻链；k)包含SEQ ID NO:55的第二重链；或l)包含SEQ ID NO:81的第二轻链和包含SEQ ID NO:55的第二重链。
[0207] 在一些实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:53的三个CDR。在其他实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:69的三个CDR。在其他实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:53的三个CDR和SEQ ID NO:69的三个CDR。在一些实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:85的三个CDR。在其他实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:101的三个CDR。在其他实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:85的三个CDR和SEQ ID NO:101的三个CDR。
[0208] 在一些实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:85的三个CDR。在其他实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:101的三个CDR。在其他实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:85的三个CDR和SEQ ID NO:101的三个CDR。在一些实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:53的三个CDR。在其他实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:69的三个CDR。在其他实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:53的三个CDR和SEQ ID NO:69的三个CDR。在一个实施例中，L-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:85的三个CDR，SEQ ID NO:101的三个CDR，SEQ ID NO:53的三个CDR和SEQ ID NO:69的三个CDR。
[0209] 在一个实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体的第一部分选自人IL-18抗体，其至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，所述免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，所述免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94。此外，IL-18/IL-1β双特异性抗体的第二部分选自人IL-1β抗体，其至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，所述免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，所述免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62。
[0210] 在一个实施例中，IL-18/IL-1β双特异性抗体的第一部分选自人IL-18抗体，其至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，所述免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，所述免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94。此外，IL-18/IL-1β双特异性抗体的第二部分选自人IL-1β抗体，其至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，所述免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，所述免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，所述可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62。
[0211] 在所披露的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体的第一VH1或VL1结构域可以具有与在SEQ ID NO:85和101中列出的VH或VL结构域基本上相同的第一VH1和/或第一VL1结构域。本文披露的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含与SEQ ID NO:87所示的重链基本相同的第一重链和/或与SEQ ID NO:103所示的轻链基本相同的第一轻链。本文披露的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含：含有SEQ ID NO:87的第一重链和含有SEQ ID NO:103的第一轻链。本文披露的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含：A)第一重链，其包含具有与SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的可变结构域和具有杂二聚化修饰的人重链的恒定部分；和b)第一轻链，其包含具有与SEQ ID NO:101中所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的可变结构域和人轻链的恒定部分。人重链的恒定部分可以是IgG1。在一个实施例中，IgG1是没有效应子突变的人IgG1。在一个实施例中，人重链IgG1包含沉默突变N297A、D265A或L234A和L235A的组合。在一个特定的实施例中，根据SEQ ID NO:87，人重链IgG1包含沉默突变，其是L234A和L235A的组合。
[0212] 在所披露的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体的第二VH2或VL2结构域可以具有与在SEQ ID NO:53和69中列出的VH或VL结构域基本上相同的第二VH2和/或第一VL2结构域。本文披露的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含与SEQ ID NO:55所示的重链基本相同的第二重链和/或与SEQ ID NO:71所示的轻链基本相同的第二轻链。本文披露的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含：含有SEQ ID NO:53的第二重链和含有SEQ ID NO:69的第二轻链。本文披露的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含：a)第二重链，其包含具有与SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的可变结构域和具有杂二聚化修饰的人重链的恒定部分(其与第一重链的异二聚化互补)；和b)第二轻链，其包含具有与SEQ ID NO:69中所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的可变结构域和人轻链的恒定部分。人重链的恒定部分可以是IgG1。在一个实施例中，IgG1是没有效应子突变的人IgG1。在一个实施例中，人重链IgG1包含沉默突变N297A、D265A或L234A和L235A的组合。在一个特定的实施例中，根据SEQ ID NO:55，人重链IgG1包含沉默突变，其是L234A和L235A的组合。
[0213] 用于在披露的方法、试剂盒和方案中用作双特异性抗体的第一部分的其他优选的IL-18拮抗剂(例如抗体)是以下列出的那些：美国专利号：9,376,489，将其通过引用以其整体并入本文。
[0214] 用于在披露的方法、试剂盒和方案中用作双特异性抗体的第二部分的其他优选的IL-1β拮抗剂(例如抗体)是以下列出的那些：美国专利号：7,446,175或7,993,878或8,273,350，将其通过引用以其整体并入本文。
[0215] (1)载体设计
[0216] 根据以下设置产生两个载体，载体A和载体B。针对抗体部分mAb1(抗IL18 IgG1)设计了载体A。重链1的恒定区被两个点突变修饰，如在SEQ ID NO:87的位置366所见的T到W，以及如在SEQ ID NO:87的位置354所见的S到C，用于产生杵结构并实现Cys桥连。此外，重链1的恒定区被点突变修饰，如在SEQ ID NO:87的位置234所见的L到A，以及如在SEQ ID NO:
87的位置235所见的L到A(所说的LALA)，用于FC效应子功能的部分沉默。所述抗体具有λ1型的轻链可变区，Vλ1。
87的位置235所见的L到A(所说的LALA)，用于FC效应子功能的部分沉默。所述抗体具有λ1型的轻链可变区，Vλ1。
[0217] 针对抗体部分mAb2(抗IL-1βIgG1)设计了载体B。重链2的恒定区被四个点突变修饰，如在SEQ ID NO:55的位置366所见的T到S、如在SEQ ID NO:55的位置368所见的L到A、如在SEQ ID NO:55的位置407所见的Y到V，以及如在SEQ ID NO:55的位置349所见的Y到C，用于产生臼结构并实现额外的Cys桥连。所述臼结构与杵结构相互作用，以促进双特异性抗体的产生。此外，所述重链2的恒定区用两个LALA突变修饰，如在SEQ ID NO:55的位置234所见的L到A，如SEQ ID NO:55的位置235所见的L到A，用于FC效应子功能的沉默。所述抗体具有κ6型轻链可变区，Vκ6。
[0218] 载体A和B分别带有DHFR和新霉素选择标志物的组合以及FOLR和潮霉素选择标志物的组合。叶酸是嘌呤和蛋氨酸合成所必需的维生素，需要由哺乳动物细胞从培养基中吸收。存在于表达质粒A上的“叶酸受体”(FolR)是突变的FolR，其对叶酸的亲和力改变，促进叶酸从培养基向哺乳动物细胞的运输。鉴于高亲和力的叶酸受体在培养的CHO细胞中仅弱表达，因此表达重组FolR的细胞在低叶酸条件下(50nM)具有明显的生长优势。所述FolR选择标志物在载体B处编码
[0219] 除FolR外，“二氢叶酸还原酶”(DHFR)作为选择标志物存在于载体A上。DHFR将叶酸转化为用于嘌呤和蛋氨酸合成的重要前体。MTX是叶酸的化学类似物。它与DHFR上的游离结合位点竞争，从而阻断了酶。过表达外源DHFR的细胞可以处理高浓度的MTX，从而使在补充了MTX的培养基中生长的细胞具有明显的选择性优势。组合的FolR和DHFR选择是本领域技术人员所熟知的，并且例如在专利文件WO 2010/097240A1中披露的，其全部内容通过引用并入本文。MTX是本领域技术人员所熟知的，并且例如在专利文件WO 2010/097239A1中披露的，其全部内容通过引用并入本文。表达载体是本领域技术人员所熟知的，并且例如在专利文件WO 2009/080720A1中披露的，其全部内容通过引用并入本文。
[0220] 图1给出了两个载体的示意图。
[0221] (2)宿主细胞系和转染
[0222] 将亲本CHO细胞系用作宿主细胞系，用于产生表达bbmAb1的细胞系。宿主细胞系衍生自本领域技术人员熟知的CHO-K1细胞系，其方式描述于例如专利申请WO 2015092737和WO 2015092735中，将两者通过援引以其全文并入本文。
[0223] 来自CHO系的单个小瓶用于制备bbmAb1重组细胞系。CHO系在化学成分确定的培养基中制备。
[0224] 细胞在化学成分确定的培养基中生长。
[0225] 每次转染添加一μg的SwaI线性化的质粒DNA、编码bbmAb的表达载体A&B。转染反应在化学成分确定的培养基中进行。
[0226] 根据制造商的说明，使用AMAXA Gene Pulser通过电穿孔进行转染。用于转染的亲本CHO细胞处于指数生长期，具有高于95％的细胞活力。总计，用5x 106个细胞/转染进行三次转染。
[0227] 转染后立即将细胞转移到含有中等大小的化学成分确定的培养基的摇瓶中。
[0228] 在开始选择过程之前，将细胞库在36.5℃和10％CO2下孵育48小时。
[0229] (3)细胞选择和分选
[0230] 如上所述，使用由单个表达载体A和B编码的选择标志物进行选择过程。两种蛋白质(FolR和DHFR)都参与相同的分子途径；所述FolR将叶酸和叶酸类似物MTX转运到细胞中，所述DHFR将其转化为用于嘌呤和蛋氨酸合成的重要前体。结合它们作为选择原理，可以采用特定的强选择方案来富集表达两种重组蛋白的重组细胞。
[0231] 在低叶酸条件下转染和生长48小时后，通过向化学成分确定的培养基中添加10nM MTX来施加另外的选择压力。在MTX选择开始后22天，出现了主要由MTX抗性细胞组成的库群。池回收后，将细胞冷冻并制备细胞沉淀。在化学成分确定的培养基中建立标准批次，以确定bbmAb的浓度。
[0232] 蛋白A HPLC方法用于确定带有Fc部分的所有产物和相关杂质的完整种类，而反相色谱(RPC)用于获得有关各个级分分布的指纹图谱-各个峰通过MS方法确定。
[0233] 产生bbmAb1的CHO细胞池已用于FACS克隆程序，以获得单个化的克隆细胞系，作为所有进一步评估的起始材料。描述了使用FACS分析的细胞选择，例如在专利申请US20110281751中，其全部内容通过引用并入本文。
[0234] 表达bbmAb1的单个克隆CHO细胞系通过荧光激活细胞分选(FACS)产生。为了能够进行FACS分选，将细胞与FITC标记的抗IgG1Fab孵育30分钟，并在用于FACS辅助单细胞分选(这是本领域技术人员所熟知的方法)之前，在PBS中洗涤两次。
[0237] 在“单细胞”模式下，“纯度掩模”设置为最大，因此只有不含颗粒或其它细胞的液滴被分选。
[0239] 为了验证和记录单克隆来源，并在FACS克隆后第0天确认单细胞状态，使用成像系统拍摄了96孔板所有孔的图像。
[0240] 一式两份目测检查涉及bbmAb1生产克隆的第0天的图像，确认由所述成像系统拍摄的各孔的图像中只有一个单细胞能被鉴定。
[0241] 这突出了bbmAb1生产克隆的单细胞起源。
[0242] (4)细胞扩增
[0243] FACS克隆后，最初的几周将克隆通过机器人系统处理，然后手动处理，逐步从96孔、24孔向摇床扩大，最后进行生物反应器培养，以评估效果(bbmAb表达的生产率和质量)，这是本领域技术人员所熟知的。
[0244] 在扩增/培养过程中，重组CHO细胞在化学成分确定的培养基中培养，在所述培养基中补充了最终浓度为10nM的甲氨蝶呤(MTX)。
[0245] 细胞每周传代2-3次至新鲜培养基中，并在整个研究过程中保持在对数生长期。
[0246] 通过蛋白A HPLC评估生产率，通过反相色谱(RPC)确定初始产物质量谱。
[0247] 所有的冷冻储备物均在补充了7.5％DMSO的培养基中产生。
[0248] (5)克隆稳定性
[0249] 通过不同的分析方法对从池和克隆中分离的bbmAb进行了仔细评估，来判断产物特性和质量参数，以确保选择最合适的生产克隆。
[0250] 另外，对生产克隆进行了生产稳定性过度分析，以确保选择最合适的生产克隆。
[0251] 使用先有技术水平下不同的分析方法来评估克隆稳定性：亲和液相色谱、反相色谱、FACS和MS。
[0252] (6)生产
[0253] (a)上游处理
[0254] bbmAb材料在摇瓶或波浪补料分批培养中生产。在化学成分确定的培养基中，将池或克隆(例如PSL)的冷冻储备物融化，并在所需的时间内扩增，来获得所需数量的细胞以接5
种生产培养物，典型的种子细胞密度为4.0x 10 个细胞/ml。单个培养物的培养时间为13-
14天。在培养过程中，进行过程中对照以监测bbmAb的浓度和上清液的质量谱。在培养过程结束时，通过离心(例如，摇床)或深度过滤将细胞与培养上清液分离，然后进行无菌过滤，然后再进行进一步的DSP处理。
种生产培养物，典型的种子细胞密度为4.0x 10 个细胞/ml。单个培养物的培养时间为13-
14天。在培养过程中，进行过程中对照以监测bbmAb的浓度和上清液的质量谱。在培养过程结束时，通过离心(例如，摇床)或深度过滤将细胞与培养上清液分离，然后进行无菌过滤，然后再进行进一步的DSP处理。
[0255] (b)下游处理
[0256] 基于格式设计和共表达方法，不仅完整的产物bbmAb1和常见的杂质(例如聚集体、DNA和宿主细胞蛋白)，而且还有mAb1和mAb2衍生的单体、同二聚体和错配轻/重链bbmAb1变体(如图4所示)预期在细胞培养和细胞碎片去除后的上清液中。错配轻/重链bbmAb1变体(图4E至4M)被怀疑具有与完整的bbmAb1相同的生物物理特性，其在制备规模下不易去除。
[0257] 方法I：通过在MabSelectTM SuReTM上捕获进行纯化，在LambdaFabSelectTM和KappaSelectTM上进行精制
[0258] 带有Fc部分的bbmAb1和bbmAb1变体通过在MabSelectTM SuReTM上的第一步亲和液相色谱(ALC)步骤从无细胞上清液中捕获。通过在LambdaFabSelectTM上进行第一步精制，去除仅包含κ轻链的bbmAb1变体(mAb2臼，图4C和4D)和HCP，并通过在KappaSelectTM上进行第二步精制去除仅包含λ轻链的bbmAb1变体(mAb1杵，图4A和4B)和HCP。
[0259] 在整个方法中，在室温下使用4分钟停留时间(RT)进行色谱。上样前，用4个柱体积(CV)的20mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.0)平衡所有柱。为了从产物中去除非特异性结合的杂质，例如宿主细胞蛋白(HCP)、培养基成分和DNA，将来自摇瓶的无细胞bbmAb1上清液上样至ALC柱后，色谱柱用4CV 250mM精氨酸-HCl、1M NaCl、88mM NaOH(pH 9.0)和3CV平衡缓冲液洗涤。bbmAb1和潜在的bbmAb1变体分别通过使用50mM乙酸(pH 3.0)和50mM乙酸/HCl(pH 2.0)从KappaSelectTM和LambdaFabSelectTM上洗脱。产物峰收集开始并结束于0.5AU/cm或
0.25Au/cm(280nm)。用0.1M或1M Tris将bbmAb1洗脱液的pH调节至～pH 5.0，然后分别保存在2℃-8℃进行分析评估。方法II：通过在LambdaFabSelectTM上捕获进行纯化，在CaptoTM粘附(CaptoTM adhere)和FractogelTM EMD SO3上进行精制
0.25Au/cm(280nm)。用0.1M或1M Tris将bbmAb1洗脱液的pH调节至～pH 5.0，然后分别保存在2℃-8℃进行分析评估。方法II：通过在LambdaFabSelectTM上捕获进行纯化，在CaptoTM粘附(CaptoTM adhere)和FractogelTM EMD SO3上进行精制
[0260] 在第二方法中，通过在LambdaFabSelectTM上进行亲和液相色谱从无细胞的上清液中捕获仅包含λ轻链的完整bbmAb1和bbmAb1变体(mAb1杵单体和同二聚体，图4A和4B)。为了灭活可能存在的包膜病毒，对ALC洗脱液进行了低pH处理，然后在Capto粘附和FractogelTM EMD SO3上进行了两个色谱精制步骤，以去除产物相关的杂质、DNA和HCP。随后，可能存在的病毒通过纳米过滤去除，然后使用切向流过滤进行最终浓缩和缓冲液交换步骤。
[0261] a)LambdaFabSelectTM上的亲和液相色谱(ALC)
[0262] 在整个方法中，在18℃-28℃下使用3.6-4.4分钟的停留时间(RT)进行ALC。首先，ALC柱用4-6CV 20mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.0)平衡。然后将来自波或生物反应器的澄清的无细胞bbmAb1上清液以7-23g/L的上样密度上样至LambdaFabSelectTM柱。在用4-6CV 50mM乙酸洗脱产物之前，先用4-6CV 250mM精氨酸-HCl、1M NaCl、88mM NaOH(pH 9.0)进行柱洗涤，并用3-5CV平衡缓冲液进行第二次洗涤。从0.5-2.0Au/cm(280nm)上升和0.5-2.0Au/cm(280nm)下降收集产物峰。使用3-5CV 120mM磷酸、167mM乙酸(pH 1.5)清洗LambdaFabSelectTM柱，然后用3-5CV 20mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.0)重新平衡并在4-6CV 20％乙醇中储存。
[0263] b)病毒灭活
[0264] 使用0.3M磷酸将ALC洗脱液的pH值调节至pH 3.4-3.6。随后将蛋白溶液在此低pH下孵育60-90分钟，然后用1M Tris将pH调节至7.3-7.7。使用Millipore B1HC Pod过滤器进行深度过滤步骤，流速为100-300LMH，然后使用0.45/0.2μm SartoporeTM无菌过滤器进行无菌过滤。
[0265] c)CaptoTM粘附上的多峰阴离子交换色谱(MAC)
[0266] 在整个方法中，MAC在18℃-28℃在流通模式下使用4-6分钟的停留时间进行。首先，MAC柱用7-9CV 20mM Tris/Tris-HCl(pH 7.5)平衡。然后将低pH处理的ALC洗脱液以175-350g/L的上样密度上样至CaptoTM粘附柱。在0.5-2.0AU/cm(280nm)上升处产物峰收集开始。然后用5-7CV平衡缓冲液洗涤MAC柱，并且在0.5-2.0AU/cm(280nm)下降处产物峰收集结束。随后，用6-8CV 100mM乙酸汽提CaptoTM粘附柱，然后用3-5CV 0.5M NaOH进行原位清洗步骤，并保存在3-5CV0.1M NaOH中。
[0267] d)FractogelTMEMD SO3上的阳离子交换色谱
[0268] FractogelTMEMD SO3上的CEC在18℃-28℃在结合-洗脱模式下进行。在平衡、汽提、CIP和存储过程中使用6-8分钟的停留时间，在上样、洗涤和洗脱过程中使用8-10分钟的停留时间。CEC柱用6-8CV 20mM琥珀酸、35.1mM NaOH(pH 6.0)平衡。然后将MAC渗滤液以35-70g/L的上样密度上样至柱。随后，将CEC柱用5-7CV平衡缓冲液洗涤。使用的10％至90％的
20mM琥珀酸、500mM NaCl、37.4mM NaOH(pH 6.0)的线性盐梯度进行洗脱，超过15CV。bbmAb1产物峰的收集起始于0.1-0.4AU/cm上升处，至在300nm处的20％-40％最大峰高。用3-5CV
1M NaCl汽提FractogelTMEMD SO3柱，然后用3-5CV 0.5M NaOH进行原位清洗步骤，并保存在
3-5CV 0.1M NaOH中。
20mM琥珀酸、500mM NaCl、37.4mM NaOH(pH 6.0)的线性盐梯度进行洗脱，超过15CV。bbmAb1产物峰的收集起始于0.1-0.4AU/cm上升处，至在300nm处的20％-40％最大峰高。用3-5CV
1M NaCl汽提FractogelTMEMD SO3柱，然后用3-5CV 0.5M NaOH进行原位清洗步骤，并保存在
3-5CV 0.1M NaOH中。
[0269] e)纳米过滤
[0270] 可能存在的病毒通过使用PlanovaTM 20N纳米过滤器和0.5/0.1μm Millipore SHR-P预过滤器进行纳米过滤去除。预过滤和纳米过滤通过施加0.7-0.9巴的压差进行。
[0271] f)切向流过滤和配制
[0272] 为了浓缩和渗滤bbmAb1，在18℃-28℃下在MilliporeTM PelliconTM 3RC 30kDa膜上进行切向流过滤步骤。首先，使用0.5至1.2巴的进料流压力和0.3-0.6巴的跨膜压力(TMP)，以1000g/m2至60-80g/L的最大上样密度浓缩经过纳米过滤的bbmAb1蛋白溶液。然后，在0.8至1.8巴的进料流压力和0.4-0.9巴的TMP下，用7-9个渗滤体积的20mM组氨酸/组氨酸-HCl(pH 6.0)对bbmAb1进行渗滤。在1.4-3.0巴的进料流压力和0.7-1.5巴的TMP的条件下，进行第二浓缩步骤至134±10g/L。最后将超滤的bbmAb1蛋白溶液配制成100±10g/L和0.04％(w/v)聚山梨醇20的浓度。最终原料药(DS)通过0.2μm过滤器过滤，并在≤-60℃下冷冻保存。
[0273] (7)分析表征和纯度评估
[0274] (a)完整bbmAb及其变体的LC-MS筛选
[0275] 将100μg蛋白A纯化的bbmAb样品在96孔板中冻干，并在100μl50mM Tris-HCl pH 7.5)缓冲液中于37℃通过PNGaseF(新英格兰实验室(New England Biolabs))去糖基化18小时。通过LC-ESI-MS在连接到Synapt G2 Q-TOF质谱仪(沃特世公司(Waters))的H-Class UPLC(沃特世公司)上测量样品。在80℃柱温下使用MassPREP微型脱盐柱2.1x 5mm(沃特世公司)。以0.3ml/min的速度施加以下线性梯度：流动相A：在水中的0.1％甲酸，流动相B：在乙腈中的0.1％Fa：0-2min5％B，2-12min5％-90％B，然后以0.5ml/min的速度进行如果个洗涤步骤。MS参数：ESI+解析模式，毛细管电压3kV，采样锥40V，源温度150℃，去溶剂化温度
400℃。系统用NaCl校准溶液校准，锁定质量为亮氨酸脑啡肽(Leucin Enkephalin)。使用UNIFI 1.6软件(沃特世公司)通过自动MaxEnt1解卷积(质量范围60kDa-150kDa，谐波抑制)处理数据。bbmAb种类和错配变体的鉴定和相对定量基于与理论预期质量的匹配和解卷积质谱的相对质量信号强度。
400℃。系统用NaCl校准溶液校准，锁定质量为亮氨酸脑啡肽(Leucin Enkephalin)。使用UNIFI 1.6软件(沃特世公司)通过自动MaxEnt1解卷积(质量范围60kDa-150kDa，谐波抑制)处理数据。bbmAb种类和错配变体的鉴定和相对定量基于与理论预期质量的匹配和解卷积质谱的相对质量信号强度。
[0276] (b)bbmAb1的LC-MS表征
[0277] 完整的去糖基化的bbmAb：将纯化的bbmAb1抗体在20mM Tris-HCl pH 7.5中稀释至1mg/ml，并使用2μl PNGaseF酶(新英格兰生物技术公司(New England Biolabs))在37下去糖基化4小时。通过添加三氟乙酸(TFA)至2％来终止消化。
[0278] 还原的去糖基化的bbmAb：将bbmAb1在20μl的0.1M Tris-HCl pH 7.5中稀释至5mg/ml。添加2μl PNGase F，并在37℃下孵育4小时，然后将80μl变性缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，6M盐酸胍)和1μl的1M DTT添加到混合物中。在37℃孵育1小时后，将样品用1μl TFA酸化。
[0279] 木瓜蛋白酶将bbmAb消化为Fab和Fc。将bbmAb1与消化缓冲液(20mM琥珀酸，35.1mM NaOH，pH 6.0，1mM Cys-HCl，1mM EDTA)混合至5mg/ml，然后添加木瓜蛋白酶(罗氏公司(Roche)，德国)至终浓度为5μg/ml(蛋白酶/蛋白质比例为1:1000)，并在震荡下在37℃孵育2小时。孵育后，通过添加碘乙酰胺溶液至终浓度1.2mM来终止溶液。
[0280] IdeS将bbmAb消化为F(ab’)2和Fc。将100μg bbmAb1与切割缓冲液(50mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 6.6)混合，并在37℃下用100U IdeS蛋白酶(Fabricator，Genovis公司)消化过夜。孵育后，通过添加TFA至终浓度2％来终止溶液。
[0281] 还原的LysC消化-肽图分析。(根据Rombach-Riegraf等人，PlosOne，2014年)使用150μl变性溶液(6M盐酸胍，50mM Tris-HCl，5mM Na2EDTA，pH 8.0)使200μg蛋白质变性，以及通过添加1.5μl的1M DTT使其还原，并在37℃孵育1小时。通过添加3μl的1M碘乙酰胺然后在黑暗中在37℃孵育进行烷基化。用1μl的1M DTT淬灭反应。还原/烷基化后，将750μl消化缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8)添加到样品中。然后通过两次添加4μl的1μg/μl胞内蛋白酶LysC溶液(和光公司(日本大阪市))对样品进行消化，并分别在37℃下孵育1小时和3小时。
添加5μl TFA以淬灭消化。
添加5μl TFA以淬灭消化。
[0282] LC-MS测量。使用装备有BEH C4 RP柱(1.7μm，2.1x 100mm， 沃特世公司)和Xevo G2 TOF质谱仪(沃特世公司，米尔福德)的沃特世公司UPLC H-Class对蛋白质样品进行LC-MS系统分析。洗脱液为A：在水中的0.1％TFA和B：在乙腈中的0.09％TFA。将所述柱设置为80℃。流速为0.2ml/min。蛋白质以40min的如下梯度洗脱：0-5min 10％B，5-10min 10％-30％B，10-25min 30％-40％B，25-26min 40％-95％B，26-28min 95％，28-40min
10％B。
10％B。
[0283] MS设置：ESI(+)TOF模式，解析模式，质量范围400Da-4000 Da，扫描时间1s，毛细管电压3kV，采样锥25V-40V。系统使用NaCsI溶液校准。
[0284] 使用CSH130 C18 2.1mm x 150，1.7μm(沃特世公司，米尔福德)，在与Synapt G2 Q-TOF质谱仪(沃特世公司)结合的H-Class UPLC(沃特世公司)上通过RP-LC-MS分析肽消化物。流动相A：在水中的0.1％TFA和流动相B：在乙腈中的0.09％TFA。以下列梯度从柱上洗脱肽：在40℃柱温下，0-5min 0％B，5-10min 0-2％B，10-40min 2％-20％B，40-120min 20％-40％B，120-135min 40％-70％。在214nm处记录UV色谱图，并以低能量(4eV)和高能量碎裂E
(30V-55V)的MS实验以正ES(+)解析模式进行MS数据采集。锁定质量是亮氨酸脑啡肽(沃特世公司)。
(30V-55V)的MS实验以正ES(+)解析模式进行MS数据采集。锁定质量是亮氨酸脑啡肽(沃特世公司)。
[0285] 数据处理和评估通过MassLynx 4.2或UNIFI 1.6软件(沃特世公司)进行。MaxEnt1算法用于蛋白质质谱的解卷积。理论质量计算是使用GPMAW 9.2软件(光屋数据公司(Lighthouse data))进行的。
[0286] (c)反相色谱
[0287] bbmAb样品在使用Poroshell 300SB-C8 RP色谱柱(2.1mm x 75mm，5μm(安捷伦公司(Agilent)))的安捷伦公司1260HPLC上进行分析。柱温设置为80℃，流速为2ml/min，流动相A：90％水，10％乙腈，0.1％TFA，0.3％PEG-300，流动相B：10％水，90％乙腈，0.1％TFA，0.3％PEG-300。使用的梯度是：0-5min 22％-37％B，5.0-5.1min 100％B，5.1-6min 100％B，6.1.-8.5min 22％B。在210nm处记录UV信号。使用ChromeleonTM 6.8软件(赛默飞世尔公司(Thermo Scientific)))控制和执行数据采集和评估。
[0288] (d)尺寸排阻色谱
[0289] 使用安捷伦公司1260系统，将bbmAb1样品经过孔径为250A的TSK凝胶G3000SWXL(Tosoh#808541，5μm，7.8mm x 300mm)SEC柱。流动相为150mM磷酸钾溶液，pH 6.5，流速为0.4ml/min，柱温为30℃。在210nm处记录UV。使用ChromeleonTM 6.8(赛默飞世尔公司)进行数据采集和峰积分。
[0290] (e)毛细管电泳CE-SDS
[0291] 对于非还原性CE-SDS，将bbmAb样品与样品缓冲液(0.1磷酸钠/1.0％SDS，pH 6.6)混合，然后与碘乙酰胺溶液混合。为了还原CE-SDS，将蛋白质与0.1M Tris/1％SDS样品缓冲液(pH 8.0)混合，并用5％(v/v)巯基乙醇还原。两种样品都在70℃下进行了10min的热变性步骤。
[0292] 在配有总毛细管长度为30cm的裸露熔融石英毛细管(50μm，375OD，67cm，贝克曼公司(Beckman))并填充贝克曼公司SDS MW筛分凝胶缓冲液的贝克曼公司PA 800系统上分析样品。在15kV和25℃毛细管温度下，从负极性到正极性完成分离，通过UV在214nm检测。使用TMChromeleon 6.8软件处理和积分电泳图。
[0293] (f)毛细管区带电泳CZE
[0294] 在装有214nm UV检测器的贝克曼公司Coulter PA 800药物分析系统上进行分离。在总长度为40cm的熔融石英毛细管(50μm ID)上用20kV的毛细管电压在25℃且正极性下分离蛋白质。运行缓冲液：400mM 6-氨基己酸/乙酸pH 5.7，含2mM TETA和0.03％Tween 20。使用ChromeleonTM 6.8软件执行峰积分。
[0295] (8)分析结果
[0296] 使用完整的UPLC-MS质量筛选方法在蛋白A纯化后，分析共表达后不同双特异性抗体组合和构建体的纯度和同一性。该方法用于确认和相对定量来自细胞上清液的异二聚体和同二聚体。可以观察到正确形成的异二聚体bbmAb1和bbmAb2，基于完整的质量信号强度，其相对纯度超过85％。在筛查中观察到的主要杂质是具有两个κ轻链、两个λ轻链和HC臼二聚体分子的错配抗体。
[0297] 表4.bbmAb1-bbmAb11的分析结果总结。
[0298]
[0299]
[0300] 名称l是λ链，k是κ链。
[0301] mAb3是抗体类型VH3，Vk1。
[0302] mAb4是抗体类型VH3，Vk1。
[0303] mAb5是mAb1的嫁接版本(VH1，Vl1)。
[0304] mAb6是mAb2的嫁接版本(VH1_46，Vk3)。
[0305] mAb7是抗体类型VH3，Vk1。
[0306] mAb8是抗体类型VH1_2，Vk2。
[0307] mAb9是抗体类型VH5，Vk6。
[0308] mAb10是抗体类型VH1_46，Vk6。
[0309] mAb11是抗体类型VH3，Vk3。
[0310] mAb12是抗体类型VH3，Vk2。
[0311] 更加详细地表征bbmAb1，以使用若干样品制备方法以及其他分离技术评估通过LC-MS的不同纯化步骤后所有形成的产物变体和杂质。在用PNGaseF酶进行去糖基化并随后注入RP-LC-MS装置后，确定完整的2步纯化(λ/CEC)产物的质量。完整的bbmAb1的解卷积质谱图证实了共表达和λ选择纯化后杵臼结构异二聚体的正确形成。λ选择纯化后，没有主要杂质像同二聚体或部分抗体那样被检测到。样品还原和去糖基化后，可以确认四个不同抗体链的身份。
[0312] 为了检查链错配和其他低水平杂质，纯化的样品用木瓜蛋白酶消化，以分析单个Fab和Fc片段。测得的片段质量再次证实了不同Fab臂(杵-λ，臼-κ)的正确形成以及杵臼结构Fc片段的正确形成。可以发现水平<1％的错配Fab片段(Fab4，杵-κ)。测试了通过有限的LysC消化生成Fab片段的另一种方法，所述方法可以在合并和克隆选择过程中允许更快的样品制备。
[0313] 测试了使用IdeS(Fabricator)酶的另一种消化策略，以产生Fc和F(ab’)2片段。在该实验中，观察到Fc异二聚体的质量和正确形成的异二聚体F(ab’)2。Fc异二聚体的存在也证明了bbmAb1的Fc部分中正确形成了另外的二硫键，因为否则只会产生质量更小的Fc/2片段。
[0314] 用LC-MS进行LysC肽图分析可以确认所述分子的身份，其中肽的总序列覆盖率为99％。
[0315] 纯化的样品的具体结果如图2所示。特别地，去糖基化的完整双特异性mAb的RP-UV色谱图如图2A所示。木瓜蛋白酶消化的bbmAb1片段如图2C所示。IdeS消化的bbmAb1片段如图2D所示。去糖基化的和DTT还原的bbmAb1片段如图2E所示。完整的去糖基化的双特异性mAb bbmAb1的解卷积质谱图如图2B所示。
[0316] 结果显示在表5中。
[0317] 表5.通过RP-LC-MS分配测得的bbmAb1质量
[0318]
[0319]
[0320] 在应用上述不同步骤后获得的提高的纯度见图3。图3A是显示培养后表达谱的色TM TM TM谱图，图3B是用LambdaFabSelect 捕获后的色谱图，图3C是用MabSelect SuRe 捕获后的色谱图，图3D是用LambdaFabSelectTM捕获、通过FractogelTMEMD SO3精制和超滤后的色谱图。
[0321] 最终的2步纯化(λ/CEC)双特异性bbmAb1通过表6中列出的方法进一步分析。总体而言，材料显示出高纯度，而聚集体或降解产物含量低，这是通过若干种分离方法(例如尺寸排阻色谱(SEC)、CE-SDS和毛细管区带电泳(CZE))检测到的。
[0322] 表6.纯化的bbmAb1的纯度分析
[0323]
[0324] 还已经测试了其他抗体的另外组合。表4显示了获得的分析结果的总结。
[0325] 6.实例2：bbmAb1的体外活性
[0326] bbmAb1的结合活性在各种不同的细胞测定中进行了测试。
[0327] (1)材料与方法
[0328] (a)用于溶液平衡滴定(SET)测定
[0329] 使用了以下材料：
[0330] 生物素化的重组人IL-18(BTP25828)
[0331] 重组食蟹猴IL-1β(诺华公司(Novartis))
[0332] SULFO-TAG标记的抗人IgG抗体(细观发现公司(Meso Scale discovery，MSD)#R32AJ-5)
[0333] 与MSD SULFO-TAG NHS酯缀合的山羊抗人Fab特异性抗体(杰克森免疫研究公司(Jackson Immuno Research)#109-005-097，MSD#R91AN-1)，BSA(西格玛公司(Sigma)#A-9647)
[0334] 具有表面活性剂的MSD读取缓冲液T(MSD#R92TC-1)
[0335] 磷酸盐缓冲盐水(PBS)10x(技术创新公司(Teknova)#P0195)Tris缓冲盐水pH 7.5(TBS)10x(技术创新公司#T1680)Tween-20(弗卢卡公司(Fluka)#93773)
[0336] 聚丙烯微量滴定板(MTP)(葛莱娜公司(Greiner)#781280)
[0337] 384孔板，标准(MSD#L21XA)
[0338] (b)用于细胞测定和SET测定
[0339] 如IL-1β抗体部分所述的mAb2。
[0340] 如IL-18抗体部分所述的mAb1。
[0341] 如实例1中所述的bbmAb1。
[0342] 购自MBL国际公司(MBL Int.Corp.)的重组人IL-18(BTP 25829)(#B001-5)[0343] 重组绒猴IL-1β(诺华公司)
[0344] 重组绒猴IL-18(诺华公司)
[0345] 重组人IL-12(#573008)购自博奇公司(Biolegend)KG-1细胞系(ATCC#CCL-246)[0346] 正常人皮肤成纤维细胞(#CC-2509)购自龙沙公司(Lonza)
[0347] 绒猴皮肤成纤维细胞(#42637F(510))
[0348] HEK-BlueTMIL-18/IL-1β细胞(#hkb-il18)购自InvivoGen公司
[0349] 从血沉棕黄层(得自Blustspendezentrum Bern公司)中分离PBMC
[0350] 绒猴血是从SILABE，Niederhausbergen获得
[0351] IL-6ELISA：人(博奇公司，#430503)；绒猴(U-CyTech生物科学公司(U-CyTech biosciences)，CT974-5)
[0352] IFNγELISA：人(BD555142)和绒猴(U-CyTech生物科学公司#CT340A)
[0353] 用于检测SEAP的QUANTI-BlueTM测定(#rep-qb1)购自InvivoGen公司
[0354] 细胞培养基：RPMI 1640(英杰公司(Invitrogen)#31870)，其补充了10％胎牛血清(英杰公司#10108-157)，1％L-谷氨酰胺(英杰公司#25030-03)，1％青霉素/链霉素(英杰公司#15140-148)，10μM 2-巯基乙醇(Gibco公司#31350-010)，5mM Hepes(Gibco公司#15630-080)
[0355] 圆底组织培养处理的96孔板(Costar公司#3799)
[0356] 平底组织培养处理的96孔板(Costar公司#3596)
[0357] Ficoll-PacqueTMPlus(GE医疗健康生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences)#17-1440-02)PBS 1X，不含钙和镁(Gibco公司#14190094)带有多孔屏障的Leucosep管，50ml，聚丙烯(Greiner bio-one公司#227290)Falcon 15ml聚丙烯锥形管(BD#352096)
[0358] Falcon 50ml聚丙烯锥形管(BD#352070)
[0359] (c)通过SET进行亲和力测量
[0360] SET单个靶标结合测定
[0361] 抗原的22个连续1.6n稀释液(最高浓度：huIL-18，5nM；marIL-18，10nM；huIL-1β，0.5nM；marIL-1β，0.5nM)在样品缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.02％Tween-20的PBS)中制备，并添加了恒定浓度的抗体(对于IL-18读数为10pM，对于IL-1β读数1pM)。将体积为60μl/孔的每种抗原-抗体混合物一式两份分配到384孔聚丙烯微量滴定板(MTP)中。
样品缓冲液作为阴性对照，仅包含抗体的样品作为阳性对照(无抗原的最大电化学发光信号，Bmax)。将板密封并在室温(RT)下在摇床上孵育过夜(o/n，至少16小时)。
样品缓冲液作为阴性对照，仅包含抗体的样品作为阳性对照(无抗原的最大电化学发光信号，Bmax)。将板密封并在室温(RT)下在摇床上孵育过夜(o/n，至少16小时)。
[0362] IL-18读数：用30μl/孔生物素化的huIL-18(0.1μg/ml，PBS)包被链霉亲和素包被的384孔MSD阵列MTP，并在振荡器上于室温孵育1小时。
[0363] IL-1β读数：将标准384孔MSD阵列MTP用在PBS中稀释的30μl/孔的huIL-1(3μg/ml，PBS)(作为捕获剂)包被，并在4℃孵育过夜。
[0364] 在室温(RT)下，用50μl/孔的封闭缓冲液(含5％BSA的PBS)封闭平板1小时(h)。洗涤(TBST，含有0.05％Tween 20的TBS)后，将体积为30μl/孔的平衡抗原-抗体混合物从聚丙烯MTP转移到包被的MSD板上，并在室温下孵育20min。另外的洗涤步骤后，将在样品缓冲液中稀释的30μl磺基标签标记的抗IgG检测抗体(0.5μg/ml)添加至每个孔中，并在振荡器上于室温孵育30min。洗涤MSD板，并添加35μl/孔的MSD读取缓冲液，并在室温下孵育5min。电化学发光(ECL)信号由MSD Sector Imager 6000生成并测量。
[0365] SET同时靶结合测定
[0366] 测定A除外，如上所述进行SET测定：平衡过程(抗体/抗原混合物)在一个靶标过量(500pM的IL18或IL-1β)存在下进行，同时评估另一个靶标的KD。
[0367] 测定B：平衡过程(抗体/抗原混合物)是用连续稀释的两个靶标在一种混合物中同时进行(恒定浓度的抗体10pM，最高抗原浓度见上文)。然后如上所述分析相同混合物在IL18和IL-1β包被的板上的游离抗体浓度。
[0368] SET数据已导出到MS Excel加载项软件Xlfit。从每次测定中的重复测量来计算平均ECL信号。通过从所有数据点减去最低值对数据进行基线调整，并针对相应的抗原浓度作图以生成滴定曲线。KD值通过将图用以下拟合来确定：
[0369] 单特异性Ab的1:2结合模型
[0370]
[0371] 杵臼结构双特异性Ab的1:1结合模型
[0372]
[0373] 其中
[0374] y)减去空白的ECL信号
[0375] Bmax：抗原浓度为零时的最大ECL信号
[0376] [IgG]：应用的抗体浓度
[0377] [Fab]：应用的总Fab浓度
[0378] KD：解离平衡常数
[0379] x：应用的抗原浓度
[0380] (d)细胞培养
[0381] KG-1细胞在补充有10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI 5 6
1640中生长，密度为2x 10至1x 10个活细胞/mL。
1640中生长，密度为2x 10至1x 10个活细胞/mL。
[0382] 正常人成纤维细胞和狨猴成纤维细胞在包括bFGF(1ng/ml，CC-4065)、胰岛素(5μg/ml，CC-4021)和2％FCS(CC-4101)的FBM(Clonetics公司，CC-3131)中生长。使用成纤维细胞基础培养基(龙沙公司(LONZA)#CC-3131)作为饥饿培养基。
[0383] HEK-BlueTM IL-18/IL-1β细胞在生长培养基(DMEM、4.5g/l葡萄糖、10％(v/v)胎牛血清、50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素、100mg/ml NormocinTM、2mM L-谷氨酰胺，补充有30μg/ml的杀稻瘟菌素、200μg/ml的HygroGoldTM和100μg/ml的ZeocinTM)中生长。
[0384] 根据制造商的说明，使用LeucoSep管从血沉棕黄层中新鲜分离出人外周血单核细胞(PBMC)。简而言之，通过以1,000×g离心30秒将13ml的Ficoll-Paque预装在14ml的LeucoSep管中。用等体积的PBS稀释肝素化的全血样品，并将25ml稀释的血液添加到LeucoSep管中。将细胞分离管在室温下以800×g不间断离心15min。收集细胞悬浮液层，将细胞在PBS中洗涤两次(分别以640×g和470×g进行10分钟，两次连续洗涤)并重悬于培养基中，然后计数。
[0385] 将狨猴血液收集在肝素化试管中，并使用70μm细胞过滤器(BD生物科学公司#352350)过滤
[0386] (e)IL-1β中和测定
[0387] 基本上如(Gram 2000)所述进行成纤维细胞中的IL-1β诱导的IL-6产生测定，仅进行少量修改。简而言之，将成纤维细胞以5x 103个细胞/孔(100μl中)的密度接种在96孔平底组织培养板中。第二天，在添加重组IL-1β/化合物溶液混合物(表中所示的IL-1β浓度)之前，将细胞在饥饿培养基中饥饿5小时。通过将重组IL-1β与浓度范围的化合物在37℃孵育30min来预先制备IL-1β/化合物溶液混合物。在37℃下o/n孵育后收集细胞上清液，并通过ELISA确定释放的IL-6的量。根据以下进行PBMC中IL-1β诱导的IL-6产生测定。将PBMC以3x
105个细胞/孔(100μl中)接种在96孔组织培养板中，并与重组IL-1β/化合物溶液混合物在
37℃下孵育24小时(表中所示的IL-1β浓度)。通过将重组IL-1β与浓度范围的化合物在37℃孵育30min来预先制备IL-1β/化合物溶液混合物。刺激24小时后收集细胞上清液，并通过ELISA确定释放的IL-6的量。
105个细胞/孔(100μl中)接种在96孔组织培养板中，并与重组IL-1β/化合物溶液混合物在
37℃下孵育24小时(表中所示的IL-1β浓度)。通过将重组IL-1β与浓度范围的化合物在37℃孵育30min来预先制备IL-1β/化合物溶液混合物。刺激24小时后收集细胞上清液，并通过ELISA确定释放的IL-6的量。
[0388] (f)IL-18中和测定
[0389] 基本上根据以下进行所述测定。将密度为3x 105/孔的KG-1细胞(预先在PBS+1％FCS中饥饿1小时)或PBMC接种到圆底96孔细胞培养板中，并与重组IL-18/IL-12的溶液混合物以及浓度范围的化合物(表中所示的IL-18/IL-12浓度)一起孵育。在37℃下孵育24小时后，收集上清液，并通过ELISA确定释放的IFNγ的量。对于用狨猴血液进行的测定，使用85μl血液/孔。
[0390] (g)HEK-BlueTM细胞中双重IL1β/IL-18中和
[0391] 所述测定基本上按照制造商的处理程序中所述进行。简而言之，将HEK-BlueTM细胞以4x 104/孔的密度接种到96孔细胞培养板中，并与重组IL-1β和IL-18的溶液混合物(以产生1:1SEAP信号)以及浓度范围的化合物一起孵育。在37℃下孵育24小时后，收集上清液，并根据制造商的说明使用QUANTI-BlueTM方法确定释放的SEAP的量。
[0392] 将所有数据导出到EXCEL软件，并通过使用EXCEL/XLfit4或GraphPad Prism软件绘制针对逻辑曲线拟合函数的剂量应答曲线来计算IC50值。
[0393] (2)结果
[0394] (a)对重组人和狨猴IL1β和IL-18的亲和力
[0395] 通过溶液平衡滴定(SET)滴定(图5)测量bbmAb1对人和狨猴重组IL-1β和IL-18蛋白的结合亲和力，并将产生的KD值与mAb2对IL-1β和mAb1对IL-18结合的KD值进行比较。图5显示了在溶液中基于ECL的亲和力测定的滴定曲线，抗体的恒定浓度：对于IL-18读数为10pM，对于IL-1β读数为1pM；抗原稀释度：最高浓度：huIL-18，5nM；marIL-18，10nM；huIL-1β，0.5nM；marIL-1β，0.5nM。实线表示使用上述模型的数据的拟合。虚线指示95％置信区间，n＝3。
[0396] 在单个靶标结合测定中比较结合亲和力，与mAb1对人和狨猴IL-18相比，bbmAb1对二者显示出相似的平均KD(表7)。对于人IL-1β结合，与mAb2(0.6pM)相比，bbmAb1(2.6pM)的平均KD值略高，但仍在相同的低pM范围内。在同时双重靶标结合测定中的后续测量(表8)证实，bbmAb1对IL-1β的结合KD值与临床前以及临床级材料情况下的mAb2值相似。因此，bbmAb1对人和狨猴中的靶标都具有结合亲和力，其分别类似于mAb2和mAb1。
[0397] 表7.通过SET测定的对重组人(hu)和狨猴(mar)IL-1β和IL-18的亲和力(单个靶标结合测定)
[0398]
[0399] 除了单个靶标结合结果外，还通过应用在评估结合KD值过程中一个靶标相对于另一个靶标过量(测定A)或通过应用以连续稀释的两个靶标的混合物(测定B)，来研究bbmAb1的同时双重靶标结合亲和力(表8)。同时进行IL-1β/IL-18亲和力测定显示，测定A(一种抗原过量)和测定B(以连续稀释的两种抗原的混合物)之间无显著差异，这证明两个靶标同时结合而不会影响另一个靶标的结合。此外，使用同时双重结合测定获得的KD值与使用标准测定(表7；在没有第二抗原的情况下)获得的KD值相似，这证明bbmAb1可以独立结合两种抗原。因此，bbmAb1同时且独立地结合人IL-1β和IL-18二者，并与对应的狨猴蛋白完全交叉反应。
[0400] 表8.通过SET测定的对重组人(hu)和狨猴(mar)IL-1β和IL-18的亲和力(同时靶标结合测定)
[0401]
[0402] (b)bbmAb1在人和绒猴细胞测定中的中和活性
[0403] 评估了bbmAb1对两种细胞因子(IL1β和IL-18)的中和活性(mAb2mAb1)。另外，评估了使用绒猴细胞测定系统的bbmAb1中和绒猴IL-1β和IL-18的效力(参见d部分)。
[0404] (c)人细胞中的单独和同时的IL-1β和IL-18中和
[0405] bbmAb1对IL-1β的中和活性是通过抑制人皮肤成纤维细胞(IL-1β以6pM使用)和人PBMC(IL-1β以60pM使用)中重组IL-1β诱导的IL-6产生来评估的。通过抑制KG-1细胞和人PBMC(两种细胞均被3nM重组人IL-18和1ng/ml重组人IL-12激活)中的重组IL-18诱导的IFN-γ产生来测量bbmAb1对IL-18的中和活性。始终将bbmAb1对IL-1β和IL-18的抑制效力分别与mAb2或mAb1进行比较。取决于测定，bbmAb1的平均IC50值在亚nM或个位数nM范围内，而直接比mAb2(对于IL-1β)和mAb1(对于IL-18)分别多达2-4倍高(表9和表10)。与mAb2/mAb1的二价形式相比，bbmAb1的单价形式但也可能是KiH突变是bbmAb1效力存在细微差异的原因。
[0406] 表9.在人皮肤成纤维细胞和人PBMC中与mAb2相比，bbmAb1中和IL-1β的平均IC50值。*在重组人IL-1β(针对皮肤成纤维细胞为6pM，针对PBMC为60pM)刺激的人皮肤成纤维细胞或PBMC中IL-6的产生的抑制。显示的是平均值±SEM(n＝3PBMC和n＝6人皮肤成纤维细胞)
[0407]
[0408] 表10.在KG-1细胞和人PBMC中与mAb1相比，bbmAb1中和IL-18的平均IC50值。**重组人IL-18(3nM)和人IL-12(1ng/ml)刺激的KG-1细胞或PBMC中的IFNγ的产生的抑制。显示的是平均值±SEM(n＝3KG-1和n＝4PBMC)
[0409]
[0410] bbmAb1能够同时中和IL-1β和IL-18的生物活性，如HEK BlueTM报告细胞(其应答重组IL-1β和IL-18的1+1刺激产生SEAP)所示(表11)。只有通过mAb2和mAb1的组合才能在该测定系统中实现对SEAP的类似抑制，而不能通过使用单个抗体来实现。
[0411] 表11.根据HEK BlueTM细胞中SEAP报告子活性，同时中和IL-1β和IL-18的平均IC50值。显示的是n＝5个实验的平均值±SEM。
[0412]
[0413]
[0414] (d)bbmAb1在绒猴细胞测定中对绒猴IL-1β和绒猴IL-18的中和活性
[0415] 为了证明bbmAb1在绒猴中的抑制活性，用绒猴细胞和人细胞进行了相似的体外测定，但是使用重组绒猴IL-1β和IL-18进行刺激。当评估对绒猴皮肤成纤维细胞中重组绒猴IL-1β诱导的IL-6产生的抑制作用时，bbmAb1表现出亚nM效力，其IC50值比mAb2高2至3倍(表12)。用绒猴IL-1β刺激的人皮肤成纤维细胞测试bbmAb1产生与用人IL-6相似的抑制谱。
[0416] 表12.bbmAb1在绒猴和人成纤维细胞中抑制重组绒猴IL-1β诱导的IL-6的产生。*重组绒猴IL-1β(18pM)刺激的绒猴或人皮肤成纤维细胞中IL-6的产生的抑制。显示了3个单独实验(A、B和C)的结果。
[0417]
[0418] bbmAb1的单位数至两位数nM IC50值证实了bbmAb1对用绒猴血细胞进行的IFNγ产生测定中测试的绒猴IL-18的中和活性(表3-7)。当测量人IFNγ的产生时，用绒猴IL-18刺激的人PBMC测试bbmAb1会产生类似的抑制谱。
[0419] 因此，在使用绒猴应答细胞的功能测定中，bbmAb1显示与绒猴IL-1β和绒猴IL-18完全交叉反应。
[0420] 表13.绒猴全血或人PBMC中重组绒猴IL-18诱导的IFNγ产生的抑制的平均IC50值。**用重组绒猴IL-18(所示浓度)和人IL-12(10ng/ml)刺激的绒猴全血(每种化合物/条件n＝3)或人PBMC(n＝6)中IFNγ产生的抑制。显示的是平均值±SEM
[0421]
[0422] 已证明，与原始mAb—mAb2和mAb1相比，在多种不同的细胞测定中，KiH型IL-1β/IL-18双特异性mAb保留了对两个单独靶标IL-1β和IL-18的高亲和力结合以及细胞因子中和效力。不仅针对人细胞因子/细胞证明了bbmAb1的双重IL-1β和IL-18中和特性，而且针对相应的绒猴细胞因子/细胞也证明了bbmAb1的双重IL-1β和IL-18中和特性，从而促进了适当的毒理学研究。在一些针对IL-1β和IL-18中和的细胞测定中产生的高达2至4倍更高的IC50值可能是bbmAb1单价结合而不是mAb2和mAb分别二价结合的结果。但是，bbmAb1对细胞因子的双重中和可能导致体内的累加或协同抑制活性，这在我们的体外细胞系统中可能无法充分体现。
[0423] 7.实例3：IL-1β和IL-18联合刺激和阻断在PBMC中的影响
[0424] 效应细胞因子IL-1β和IL-18的炎性体激活依赖性切割导致诱导继发性促炎介质，不仅在全身而且在炎症部位促进免疫细胞募集/活化。在两种不同的致死性全身炎症小鼠模型(a)LPS注射模型和(b)FCAS小鼠(激活NLRP3中的错义突变)中，与单一IL-1β或单一IL-18不存在/抑制相比，同时不存在/抑制IL-1β和IL-18对致死性更具保护作用，证明免疫激活的累加或协同机制(Brydges 2013，van den Berghe 2014)。bbmAb1是人/绒猴IL-1β/IL-
18反应性双特异性mAb，无啮齿动物交叉反应性，因此无法在小鼠模型中进行测试。因此，我们使用LPS/IL-12体外模拟炎性体依赖性途径激活来刺激人PBMC，以揭示bbmAb1中和组合的IL-1β/IL-18的累加或协同抑制作用，并使用微阵列进行了无偏向基因表达分析。作为一项补充活动，我们还比较了来自用重组IL-1β和重组IL-18的组合或单独的单一细胞因子刺激的不同供体的PBMC的基因表达谱。
18反应性双特异性mAb，无啮齿动物交叉反应性，因此无法在小鼠模型中进行测试。因此，我们使用LPS/IL-12体外模拟炎性体依赖性途径激活来刺激人PBMC，以揭示bbmAb1中和组合的IL-1β/IL-18的累加或协同抑制作用，并使用微阵列进行了无偏向基因表达分析。作为一项补充活动，我们还比较了来自用重组IL-1β和重组IL-18的组合或单独的单一细胞因子刺激的不同供体的PBMC的基因表达谱。
[0425] (1)材料与方法
[0426] (a)细胞培养和ELISA
[0427] RPMI 1640(英杰公司#31870或Gibco公司#61870-010)，其补充了10％胎牛血清(英杰公司#10108-157)，1％L-谷氨酰胺(英杰公司#25030-03)，1％青霉素/链霉素(英杰公司#15140-148)，10μM 2-巯基乙醇(Gibco公司#31350-010)，5mM Hepes(Gibco公司#15630-080)
[0428] 重组人IL-1β购自义翘神州公司(#10139-HNAE-5)
[0429] 重组人IL-18购自MBL(#B001-5)
[0430] 重组人IL-12购自博奇公司(#573008)
[0431] IFNγELISA：MAX标准套装，博奇公司，#430103或BD OptEIA人IFNγELISA套装，BD#555142
[0432] IL-6ELISA：MAX标准套装，博奇公司，#430503
[0433] IL-26ELISA：云克隆公司(Cloud Clone Corp)#SEB695Hu
[0434] 如IL-1β抗体部分所述的mAb2。
[0435] 如IL-18抗体部分所述的mAb1。
[0436] 如实例1中所述的bbmAb1。
[0437] LPS来自肠炎沙门氏菌血清型肠炎沙门菌，西格玛公司#L7770
[0438] 从血沉棕黄层(得自Blustspendezentrum Bern公司)中分离PBMC
[0439] 圆底组织培养处理的96孔板(Costar公司#3799)平底组织培养处理的96孔板(Costar公司#3596)Ficoll-Pacque TMPlus(GE医疗健康生命科学公司#17-1440-02)PBS 1X，不含钙和镁(Gibco公司#14190094)
[0440] Falcon 15ml聚丙烯锥形管(BD#352096)Falcon 50ml聚丙烯锥形管(BD#352070)[0441] 具有多孔屏障的LeucosepTM管，50ml，Greiner bio-one公司#227290细胞筛70μM，BD生物科学公司(BD Biosciences)#352350
[0442] 台盼蓝，西格玛公司#T8154
[0443] RNA分离，数量和质量测量以及qPCR：
[0444] 无核酸酶的水，Ambion公司#AM9938
[0445] Rnase Zap，Ambion公司#AM9780
[0446] 1.5ml Eppendorf管，无菌，无Rnase和Dnase
[0447] RLT缓冲液，凯杰公司(Qiagen)#1015762
[0448] Rneasy小型试剂盒，凯杰公司#74104
[0449] 不含RNase的DNase的套装，凯杰公司#79254
[0450] 安捷伦公司RNA 6000Nano试剂盒，安捷伦公司#5067-1511
[0451] 芯片引发站，安捷伦公司#5065-4401
[0452] IKA涡旋混合器
[0453] Ambion公司#9780
[0454] 安捷伦公司2100生物分析仪
[0455] 高容量cDNA反转录试剂盒，应用生物系统公司(Applied Biosystems)，#PN4374966
[0456] 无Nase薄壁带盖盖的0.2ml PCR管，Ambion公司#AM12225
[0457] MicroAmp Optical 384孔反应板，应用生物系统公司#4309849
[0458] TaqMan GenEx预混液，应用生物系统公司#4369514
[0459] PCR引物(应用生物系统公司)
[0460] 靶标 测定ID Taqman 颜色/淬灭剂IFNγ Hs00989291_m1 FAM-MGB
IL-26 Hs00218189_m1 FAM-MGB
RPL27 Hs03044961_g1 FAM-MGB
HPRT1 Hs02800695_m1 FAM-MGB
IL-26 Hs00218189_m1 FAM-MGB
RPL27 Hs03044961_g1 FAM-MGB
HPRT1 Hs02800695_m1 FAM-MGB
[0461] PBMC制备：根据制造商的说明，通过在Leucosep管中进行Ficoll-Paque梯度离心，从血沉棕黄层中分离出PBMC。简而言之，将15mL的Histopaque放入50mL的LeucosepTM管中，并在室温下以1300rpm离心30秒。用移液器将血沉棕黄层的30mL稀释悬浮液添加到Histopaque溶液的顶部，在室温下以1000g不间断离心15min。丢弃血浆(约20ml)，收集界面环(＝人PBMC)并转移到50ml falcon管中。管中充满50mL无菌PBS，并且在室温下以1200rpm离心5min一次。将该离心重复2次。轻轻弃去上清液，将细胞重悬于50mL PBS中，其中PBS中含2％FCS和2mM EDTA。使用70μm细胞筛过滤细胞悬浮液，并使用台盼蓝染色(500μL台盼蓝+200μL细胞+300μL PBS)对细胞计数。
[0462] LPS/IL-12刺激PBMC：根据以下方法准备在上清液中的细胞因子产生。将250`000个细胞/孔(最终体积为100ul)分配到96孔圆形底板中。使用浓度在0.3ug/ml至3000ug/ml之间的LPS，连同10ng/ml的重组IL-12。在37℃和10％CO2下24小时后收获上清液。
[0463] 根据以下从细胞沉淀物中进行RNA提取。将3x 106个细胞/孔以1000ul终体积分配到平底24孔板中。使用3ug/ml的LPS连同10ng/ml的重组IL-12。在37℃和10％CO2 24小时后，收获细胞。
[0464] 用重组细胞因子刺激PBMC：将12孔板的每孔的7x 106个PBMC用于1.5ml最终的完全RPMI培养基中。以如下终浓度添加重组细胞因子：10ng/ml重组IL-1β，3nM重组IL-18、1ng/ml重组IL-12。在37℃和10％CO2下在4小时和24小时后收集上清液和细胞。
[0465] RNA分离，数量和质量评估：沉淀细胞，将沉淀在含2％β-巯基乙醇的350μl凯杰公司RTL缓冲液中裂解，并在-20℃或-80℃冷冻，直到收集到所有研究样品。使用凯杰公司标准方案进行RNA分离。简而言之，在所有样品中添加350μl 70％乙醇，然后转移到RNeasy离心柱，并在8000g离心15秒。丢弃流过液后，添加350μl缓冲液RW1，将柱在8000g下离心15秒，以洗涤离心柱膜。根据制造商的说明制备DNase I孵育混合溶液，并将其添加到RNeasy离心柱中，并在室温孵育15min。用350μl和500μl缓冲液RW1洗涤后，将RNeasy离心柱放入新的2ml收集管中，并全速离心1min。最终通过将35μl无RNase的水直接添加到离心柱膜并以
8000g离心1min以洗脱RNA来收集RNA。使用Nanodrop ND-1000测量RNA的量，并将RNA储存在-20℃。根据制造商的说明进行RIN测量以评估RNA质量。简而言之，将1μl RNA或梯度移液到安捷伦公司RNA 6000Nano芯片中，并使用安捷伦公司2100生物分析仪进行测量。
8000g离心1min以洗脱RNA来收集RNA。使用Nanodrop ND-1000测量RNA的量，并将RNA储存在-20℃。根据制造商的说明进行RIN测量以评估RNA质量。简而言之，将1μl RNA或梯度移液到安捷伦公司RNA 6000Nano芯片中，并使用安捷伦公司2100生物分析仪进行测量。
[0466] 通过qPCR分析细胞因子基因表达：
[0467] 按照制造商的说明执行所述方法。简而言之，使用高容量cDNA逆转录试剂盒根据说明将400ng的RNA逆转录。将cDNA溶液在无RNA/DNA的水中稀释1/10，然后将1μl cDNA转移到384孔反应板中，然后与1μl 20X 基因表达测定靶标FAM基因和10μl 2x 基因表达预混液混合和10μl不含RNA/DNA的水混合。将板加载到应用生物系统公司ViiATM7实时PCR系统上，并使用以下仪器设置：
[0468]
[0469] 用于这项研究的看家基因是HPRT1和RLP27。使用以下公式计算靶标基因的相对表达水平：
[0470] 1)Ct[参考]＝(Ct[HPRT1]+Ct[RLP27])/2
[0471] 2)dCt[参考]＝40-Ct[参考]
[0472] 3)dCt[靶标]＝Ct[靶标]-Ct[参考]
[0473] 4)ddCt＝dCt[参考]-dCt[靶标]
[0474] 5)相对靶基因表达＝2^ddCt
[0475] 根据以下方法进行微阵列。样品由CiToxLAB France在Affymetrix HG_U133_Plus2微阵列上处理。在GeneSpring 11.5.1(安捷伦技术公司，加利福尼亚州圣克拉拉)中对它们进行了RMA归一化和分析。路径分析是使用独创性途径分析(Ingenuity Pathway Analysis，IPA)和Nextbio(依诺米那公司(Illumina))进行的。这两个数据集被独立地处理。
[0476] 最初，数据由CiToxLAB进行标准质量控制(QC)，使用在Rstudio套件和GeneSpring(PCA，杂交对照)中的R脚本(MA_AffyQC.R)进行内部QC。随后，将其过滤以消除不可靠的表达水平：保留实体(探针组)，在任何1个实验条件中至少100％的样品具有高于20百分位的值。
[0477] 使用GeneSpring中的“火山图过滤器(filter on volcano plot)”功能鉴定了差异表达基因(DEG)。使用具有未配对的T检验的过滤基因(表达介于20.0百分位-100.0百分位之间)，校正p值低于0.05且倍数变化高于2.0的探针组被认为是差异表达的。在可能的情况下，即在LPS(NUID-0000-0202-4150)的研究中，使用了Benjamini-Hochberg多重测试校正。
[0478] 对于细胞因子刺激实验，使用以下公式计算协同作用：信号A+B/(信号A+信号B-对照)≥1.5
[0479] 各自的特征(或DEG列表)用于计算Fisher精确检验情况下的p值，所述值代表观察所述特征与公共数据集的“疾病基因列表”(病灶相比于非病灶)之间重叠的统计意义。为此，将列表上载到依诺米那公司基础空间关联引擎(以前的Nextbio)中，并使用元分析(Meta-Analysis)功能和针对疾病的关键字搜索进行比较。
[0480] 将所有数据导出到EXCEL软件，并通过使用EXCEL/XLfit4或GraphPad Prism软件绘制针对逻辑曲线拟合函数的剂量应答曲线来计算IC50值。使用GraphPad Prism软件通过单因素ANOVA，然后进行Dunnett多重比较来分析治疗组之间的差异，并认为结果在p<0.05上具有统计学意义。
[0481] (2)结果
[0482] (a)bbmAb1在抑制全血中LPS/IL-12诱导的IFNγ产生方面非常有效
[0483] 将人全血暴露于补充有10ng/ml IL-12的LP S会导致IFNγ应答，所述应答很大程度上(但不完全)取决于血细胞产生的“天然”IL-18。IL-12的添加可能通过上调应答细胞上的IL-18受体来增强LPS诱导的IFNγ应答。
[0484] 在使用的实验条件下，使用mAb1的IL-18中和只会导致不完全的IFNγ产生抑制，而IL-1β阻断(使用mAb2)对IFNγ应答的影响很小。有趣的是，与单个细胞因子中和(图6)相比，bbmAb1或mAb2和mAb1的组合对IL-1β和IL-18的组合性抑制更加深刻和完全地抑制了IFNγ的产生。图6显示了bbmAb1、mAb2、mAb1或组合的mAb2&mAb1(Combo)对全血中LPS(0.3μg/ml)/IL-12诱导的IFNγ的抑制(典型抑制曲线如图6A所示)。在100nM处使用bbmAb1、mAb1或mAb2对全血中n＝4个单个供体的IFNγ抑制百分比(平均值和SEM如图6B所示)。
[0485] 在我们的细胞测定中，除IFNγ外，没有其他被测试的细胞因子(IL-2、-4、-6、-8、-10、-13和TNFα)被IL-1β和IL-18的组合性中和累加地抑制(数据未显示)。考虑到双特异性分子的单价形式，bbmAb1的效力与mAb2和mAb1的组合(combo)处于相同范围。
[0486] (b)在LPS/IL-12激活的人PBMC中，与单一IL-1β或IL-18抑制相比，IFNγ被bbmAb1(即组合的IL-1β/IL-18抑制)累加抑制
[0487] 需要进行无偏转录组学评估，以便使用bbmAb1通过组合的IL-1β/IL-18抑制来揭示另外的累加作用(IFNγ除外)。由于全血不是用于转录组学分析的最佳材料，因此我们将LPS/IL-12刺激测定条件(如上文材料和方法部分所述)适应到人PBMC样品。通过使用来自总共9个供体的PBMC，我们可以证实bbmAb1累加地抑制IFNγ蛋白分泌到PBMC上清液(图7)。与全血实验相比，IFNγ产生被抑制，比所使用的各个mAb低约10倍浓度。重要的是，在IFNγ的mRNA水平上显示了相似的抑制模式(图7)，这证实了样品适用于基于无偏微阵列的基因表达分析。图7显示了在人PBMC中，bbmAb1、mAb2和mAb1(浓度各为10nM)对LPS(0.3μg/ml)/IL-12诱导的IFNγ蛋白产生(图7A)和IFNγ基因表达(图7B)的抑制。显示的是在n＝9个供体±SEM中的抑制百分比。***p<0.05(单因素ANOVA)
[0488] Affymetrix微阵列是用来自PBMC的n＝5个单个供体进行的，这些供体从上述材料和方法部分所述的LPS/IL-12刺激实验中取样。不巧的是，基因表达谱的整体评估证实了强烈的LPS/IL-12刺激作用，PCA显示每个供体聚簇，而不是受刺激或未受刺激的组内的化合物。但是，将LPS/IL-12刺激的样品与受刺激加bbmAb1的样品针对差异表达基因进行比较，揭示了被使用bbmAb1的组合的IL-1β/IL-18阻断所下调的基因名单(表14)。除了IFNγ基因的强烈下调(其重新确认我们的微阵列数据)外，与单一IL-1β抑制(通过mAb2)或IL-18抑制(通过mAb1)相比，IL-26基因也是另一种被bbmAb1累加抑制的细胞因子基因(参见图8)。图8和图9显示了微阵列数据得出的IFNγ和IL-26的基因表达水平，以及在LPS(0.3ug/ml)/IL-12刺激的PBMC中在24小时时bbmAb1、mAb2和mAb1(每个10nM)的抑制作用。图8A(IFNγ)和图
8B(IL-26)中显示了单个供体的值，图9A(IFNγ)和图9B(IL-26)中显示了n＝5个供体的抑制百分比(平均值±SEM)。
8B(IL-26)中显示了单个供体的值，图9A(IFNγ)和图9B(IL-26)中显示了n＝5个供体的抑制百分比(平均值±SEM)。
[0489] 表14.差异表达的基因(仅在LPS/IL-12刺激的样品中bbmAb1和对照组之间下调的基因)。FC＝倍数变化。
[0490]
[0491]
[0492] (c)IL-26是另一种在LPS/IL-12刺激的PBMC中被bbmAb1累加抑制的促炎性细胞因子
[0493] 为了进一步证实使用bbmAb1通过组合的IL-1β/IL-18阻断最有效地抑制LPS/IL-12驱动的IL-26基因表达和蛋白质产生，所述研究扩展到总共n＝9个PBMC供体，并通过qPCR研究IL-26基因表达，通过ELISA研究IL-26蛋白产生。如图10所示，其在很大程度上证实了通过微阵列方法获得的IL-26基因表达的抑制(图10A)。有趣的是，通过添加mAb，上清液中IL-26蛋白的水平在24小时时仅部分降低(图10B)。造成这种差异的原因尚不清楚，但可能与IL-26基因表达和蛋白质产生之间的动力学差异以及与IFNγ相比IL-26的消耗差异有关。但是，与mAb2和mAb1相比，bbmAb1在降低PBMC上清液中的IL-26蛋白水平方面表现出优势。图10显示在人PBMC中，bbmAb1、mAb2和mAb1(各10nM)对LPS(0.3ug/ml)/IL-12诱导的IL-
26基因表达(通过qPCR)(图10A)和IL-26蛋白水平(图10B)的抑制。n＝9个单个PBMC供体的抑制百分比(平均值和SEM)。***p<0.05(单因素ANOVA)。
26基因表达(通过qPCR)(图10A)和IL-26蛋白水平(图10B)的抑制。n＝9个单个PBMC供体的抑制百分比(平均值和SEM)。***p<0.05(单因素ANOVA)。
[0494] (d)与疾病相关的IL1β/IL18信号传导特征
[0495] 将先前建立的PBMC培养条件(其中重组IL-1β刺激导致IL-6产生或重组IL-18/IL-12刺激导致IFNγ产生)组合起来，以揭示累加或协同的下游靶标基因或特征(数据未显示)。在两个不同的时间点(6小时和24小时)对来自n＝4个供体的PBMC进行采样，进行Affymetrix微阵列评估，以进行基因表达谱的无偏评估。揭示了在IL-1β和IL-18组合的刺激下在6小时和24小时协同上调的基因(数据未显示)。在IL-1β/IL-18组合中添加IL-12可大大提高一系列上调基因的协同作用。单一或组合的IL-1β/IL-18途径刺激(仅上调的基因)产生的信号特征被用于询问遍及自身免疫性疾病患者的数据集。例如，图11显示了与公共结节病数据集的相关性。P值(通过Fisher精确检验计算得出)显示出与若干比较健康组织和结节病患者患病组织的公共研究的显著相关性。组织包括皮肤以及肺、泪腺和眼眶。在所有数据集中，IL1β/IL18信号传导的组合显示出与疾病的最佳相关性，其次是IL-1β和IL-
18。与5种结节病组织“患病相对健康”DEG相比，PBMC中的IL-1β/IL-18差异上调基因(DEG)(x轴)。P值(y轴)代表观察到特征与“疾病基因列表”之间的重叠的统计意义。黑色条柱是来自皮肤结节病病灶的皮肤相对于来自健康患者的皮肤。浅灰色条柱是来自皮肤结节病病灶的皮肤相对于非病灶的皮肤。白色条柱是来自结节病患者的泪腺相对于来自正常人的泪腺。深灰色条柱是来自结节病患者的眼眶前组织对于来自正常人的眼眶前组织。条纹条柱是进行性纤维化、肺结节病的肺样品相对于结节性自限性肺结节病的肺样品。
18。与5种结节病组织“患病相对健康”DEG相比，PBMC中的IL-1β/IL-18差异上调基因(DEG)(x轴)。P值(y轴)代表观察到特征与“疾病基因列表”之间的重叠的统计意义。黑色条柱是来自皮肤结节病病灶的皮肤相对于来自健康患者的皮肤。浅灰色条柱是来自皮肤结节病病灶的皮肤相对于非病灶的皮肤。白色条柱是来自结节病患者的泪腺相对于来自正常人的泪腺。深灰色条柱是来自结节病患者的眼眶前组织对于来自正常人的眼眶前组织。条纹条柱是进行性纤维化、肺结节病的肺样品相对于结节性自限性肺结节病的肺样品。
[0496] (e)结论
[0497] LPS和重组IL-12用于在体外培养的前24小时内模拟病原体相关分子模式(PAMP)依赖性的NLRP3炎性体激活。其证明，通过使用bbmAb1，IL-1β和IL-18的组合性抑制累加地作用以减少/抑制LPS/IL-12刺激的PBMC中IFNγ的产生。先前描述了IL-12与IL-18协同作用以诱导T、B、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞中的IFNγ产生(如Nakanishi，2001年所述)，但现在可以在所使用的实验条件下证明IL-1β对IFNγ产生了累加的刺激作用。因此，PBMC与LPS/IL-12的共孵育有效地驱动了“天然”IL-1β和IL-18(这两者均有助于强烈的IFNγ应答)的产生。通过使用无偏微阵列转录组学，鉴定到另外的基因，相对于单一IL-1β或IL-18阻断，所述基因被组合的IL-1β/IL-18中和累加地下调。其中包括IL-26，其是IL-20细胞因子亚家族(IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26)的成员，IL-26在大多数脊椎动物物种中都保守，但在大多数啮齿动物品系(包括小鼠和大鼠)中却不存在(Donnelly 2010年)。它通过由IL-20R1和IL-10R2链组成的异二聚体受体复合物传递信号。IL-26受体主要在非造血细胞类型上表达，特别是在上皮细胞上。据报道，血清中以及尤其是RA患者的滑液中，IL-26水平升高(Corvaisier 2012)，其中IL-26可能作为促进Th17细胞生长和分化的因子起作用。不巧的是，LPS/IL-12刺激PBMC样品的强烈作用阻碍了由IL-1β和IL-18的组合性阻断所诱导的另外的基因/途径的发现。然而，IFNγ和IL-26以及IL-22在一定程度上也在通过重组IL-1β和IL-18在PBMC中组合的刺激而协同上调的基因中，这证实了这两个因素是这个激活途径的下游效应子。因此，细胞因子的IL-20亚家族(包括IL-26和IL-22)似乎强烈依赖于来自IL-1β和IL-18的同时信号。在充分注意单个信号特征的选择性以及阻断的潜在功效的前提下，这些比较有助于表明各个途径在结节病等疾病中均具有活性。
[0498] 8.实例4：治疗用途
[0499] 在涉及先天性和适应性免疫组分的炎性体驱动的炎性病症中，IL-1β和IL-18的组合靶向可能代表比单一细胞因子阻断更有效的治疗策略。IL-1β和IL-18的同时中和靶向先天免疫组分和适应性免疫组分二者，所述组分包括中性粒细胞、Th1/Tc1和NK细胞、免疫细胞和内皮细胞上的粘附分子以及促炎性细胞因子(例如IL-6、IFNγ和IL-17)。在临床前的家族性寒冷自身免疫综合征(FCAS)小鼠模型中获得的数据支持阻断IL-1β和IL-18二者的优势，所述FCAS由组成型Nlrp3炎性体激活和IL-1β和IL-18的过度产生驱动(Brydges，2013年)。在所述模型中，当IL-1β或IL-18信号传导被基因地消融后，在小鼠中实现了FCAS病情的部分恢复，证明两种细胞因子都参与疾病的发病机理。重要的是，与只灭活两种细胞因子中的一种的小鼠相比，缺少IL-18和IL-1β二者信号传导的FCAS小鼠患病更少，这证明了双重IL-1β/IL-18中和的累加作用。在另一只小鼠模型中也证明了IL-1β和IL-18中和的累加作用，其中向小鼠注射高剂量的LPS以引起败血性休克(van den Berghe，2014年)。在此模型中，IL-1β和IL-18二者的遗传缺陷或通过中和抗体对两种细胞因子的组合性中和可以完全防止LPS致死，而单一细胞因子缺陷/中和只能部分地起到保护作用。
[0500] 同时靶向IL-1β和IL-18二者的双特异性抗体的整体临床策略可能代表比目前可用的选择更有效的治疗手段。为了鉴定候选疾病，使用临床前和转化研究以证明IL-1β和IL-18下游途径都积极参与了候选疾病的潜在病理生理。有新的证据表明，慢性肺结节病是一种由炎性体驱动的疾病，其涉及先天性和适应性免疫二者。此外，初步发现指示IL-1β和IL-18效应细胞因子在此疾病中均起重要作用。因此，结节病代表一个理想的时机来证明bbmAb1在具有确定的、慢性的组织炎症的疾病中具有双重特异性。bbmAb1在结节病中的功效可能导致其他间质性肺疾病的发展，所述疾病例如由于二氧化硅或铍引起的过敏性(职业性)肺疾病。其他候选疾病是涉及其他器官组织的肉芽肿性炎症，例如克罗恩病。
[0501] 具有组织损伤和内皮功能障碍的血管炎症也代表bbmAb1的潜在靶标。功能障碍的内皮细胞可以对有效的抗炎治疗产生应答，即使在存在固定的血管内缺损的情况下，所述应答也可以导致改善的血管流量。最近的文献证据鉴定出，镰状细胞病(SCD)通过高比例的组成型血管内溶血而具有强烈的炎性体驱动组分。来自慢性RBC裂解的危险信号(尿酸，血红素/Fe3+，其他细胞内成分)的释放引起的炎性体激活触发炎性体受体、触发所述炎性体受体的激活并导致血管内炎症级联反应，从而使内皮细胞粘附分子上调、中性粒细胞和血小板的激活，其导致内皮细胞的慢性激活。SCD患者中此类持续的血管炎症会导致复发的、痛苦的血管闭塞危象和慢性组织损伤的急性发作。初步的内部证据对IL-18和IL-1β在SCD的潜在疾病过程中的参与提供支持。因此，通过bbmAb1治疗减少SCD患者的基础炎症，可以减轻慢性本底炎症并预防与相关的终末器官损害相伤的急性危象，预防急性镰状细胞危象和相关的终末器官损伤，并通过降低相关的慢性疼痛和疲劳来改善患者的生活质量。在SCD患者中证明bbmAb1的治疗功效可能导致其他涉及高比例溶血的慢性炎性病症的慢性或急性发展，所述慢性炎性病症例如疟疾和血液透析依赖性慢性肾病。可能受益于IL-1β和IL-18二者调节的其他适应症是与缺血-再灌注组织损害相关的适应症，例如心血管疾病或所有类型伤口的改善性愈合，但尤其是烧伤的最严重的软组织损伤。
[0502] 因此，在本发明的一个实施例中，治疗炎性体相关障碍的方法包括向患有炎性体相关障碍的受试者施用有效量的本文披露的bbmAb，例如bbmAb1。潜在炎性体相关障碍包括cryopyrin相关的自体炎症综合征(CAPS)、家族性地中海热(FMF)、系统性幼年特发性关节炎(systemic juvenile idiopathic arthritis，SJIA)、狼疮性肾炎、糖尿病性肾病、急性肾脏损伤、肾性高血压、IgA肾病、肾小球肾炎(glomerulonephritis，GN)、额颞痴呆(frontotemporal dementia，FTD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、癫痫、中风、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、抑郁症、结节病例如肺结节病、胰腺炎、特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、动脉粥样硬化、巨细胞动脉炎、抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)相关血管炎、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、移植物抗宿主病、2型糖尿病、痤疮、镰状细胞病、血管病变、缺血再灌注损伤、心血管疾病、外周动脉疾病(peripheral artery disease，PAD)、动脉粥样硬化、血管功能障碍、骨骼肌缺血、纤维化、疟疾、血液透析依赖性慢性肾病或克罗恩病。
[0503] 在一个实施例中，提供了通过向受试者施用有效量的本文披露的bbmAb(例如bbmAb1)来治疗以下疾病的方法，所述方法包括：镰状细胞病、血管病变、缺血再灌注损伤、心血管疾病、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、血管功能障碍、骨骼肌缺血、肺结节病、纤维化、疟疾、血液透析依赖性慢性肾病或克罗恩病。
[0504] 9.实例5：药物组合物
[0505] 本文提供了药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的bbmAb抗体，例如bbmAb1。所述组合物可另外含有适用于治疗医学病症的一种或多种其他治疗剂。药学上可接受的载体增强或稳定所述组合物，或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
[0506] 本文描述的药物组合物可通过本领域已知的各种方法施用。施用途径和/或方式根据所希望的结果而变化。优选地，施用可以是玻璃体内、静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下或在靶标部位附近施用。药学上可接受的载体应适合于玻璃体内、静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物(即bbmAb)可以包被在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。
[0507] 所述组合物应该是无菌和流动的。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)和氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝或明胶)来实现可注射组合物的长期吸收。
[0508] 本文描述的药物组合物可以按照本领域熟知和常规实施的方法制备。参见例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy[药学的科学与实践],Mack Publishing Co.[马克出版公司],第20版,2000；和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems[缓释和控释药物递送系统],J.R.Robinson编,Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔出版社公司],纽约,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。通常，治疗有效(effective或efficacious)剂量的bbmAb用于本文描述的药物组合物中。通过本领域技术人员已知的常规方法将bbmAb配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，如由治疗情况的紧急状态所指示的，可以施用单次推注，可以随着时间的推移施用若干个分次剂量，或可以按比例地减少或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便施用和剂量统一。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于要治疗的受试者的单元剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所要求的药物载体联合产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。
[0509] 可以改变本文描述的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，所述活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和施用方式的所期望的治疗反应，而对所述患者没有毒性。所选的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括本文描述的所用的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史。
[0510] 医生或兽医可以以低于达到期望治疗效果所需的水平开始药物组合物中使用的本文描述的抗体的剂量，并逐渐增加剂量直至达到期望效果。通常，用于治疗本文所述的排便障碍的本文所述的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是人动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。需要滴定治疗剂量以优化安全性和功效。对于用抗体全身施用，剂量范围为约0.0001至100mg/kg宿主体重，且更通常为0.01至15mg/kg宿主体重。对于用抗体的玻璃体内施用，剂量可以在0.1mg/眼至5mg/眼的范围内。示例性治疗方案需要每两周或每月一次或每3至6个月一次全身施用。示例性治疗方案需要每两周或每月一次或每3至6个月一次或按需要(PRN)全身施用。
[0511] 生物疗法(诸如bbmAb1)通常会在多种情况下施用。单次剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量患者中bbmAb1的血液水平所示，间隔也可以是无规律的。另外，可替代的给药间隔可以由医生确定并且每月或按有效性的需要施用。在一些全身施用方法中，调节剂量以达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中达到25-500μg/ml。可替代地，抗体可以作为持续释放配制品施用，在这种情况下需要不太频繁的施用。剂量和频率根据抗体在患者体内的半衰期而变。通常，人抗体示出比嵌合抗体和非人抗体更长的半衰期。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变。在预防性应用中，在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔给予相对较高的剂量直至疾病进展减少或终止，并且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施用预防性方案。
[0512] 序列表
[0513] 表15中披露了用于实施本发明的有用的氨基酸和核苷酸序列。
[0514] 表15.根据本发明的实施例的序列
[0515]
[0516]
[0517]
[0518]
[0519]
[0520]
[0521]
[0522]
[0523]
[0524]
[0525]
[0526]
[0527]
[0528] 在本申请的全文中，如果说明书文本(例如，表15)与序列表之间存在差异，则以说明书文本为准。
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