乙烯基异构酶-脱水酶、烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和/或巴豆醇脱水酶以及制备和使用其的方法
阅读：202发布：2020-06-07
专利汇可以提供乙烯基异构酶-脱水酶、烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和/或巴豆醇脱水酶以及制备和使用其的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在一些替代实施方案中，提供了非天然或经遗传改造的乙烯基异构酶‑脱 水 酶，包括烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和巴豆醇脱水酶。在一些替代实施方案中，提供了非天然或经遗传改造的多肽，其具有包含例如乙烯基异构酶‑脱水酶、烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和/或巴豆醇脱水酶活性，或者其组合的活性。在一些替代实施方案中，还提供了编码本文所述多肽的非天然或经遗传改造核酸(多核苷酸)、其中包含或已包含本文所述核酸的表达或克隆载体，以及其中包含或已包含本文所述核酸的非天然或经遗传改造细胞。在一些替代实施方案中，还提供了制备不同有机化合物(包括甲基乙烯基甲醇和丁二烯)的方法。，下面是乙烯基异构酶-脱水酶、烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和/或巴豆醇脱水酶以及制备和使用其的方法专利的具体信息内容。
1.一种分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)，其包含：
(a)(i)与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101组成的核酸序列具有至少
50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列，
或者其互补序列，
条件是所述核酸序列不编码含或不含信号肽的“LDRV”或“cdLD-Botes”蛋白或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的多肽，或者(ii)与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101组成的核酸序列具有至少95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列，
或者其互补序列；
(b)在严格条件下与包括SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、
85、91或97或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101的核酸杂交的核酸(多核苷酸)序列，
并且所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC中洗涤约15分钟，
或者其互补序列，
条件是所述核酸序列不编码含或不含信号肽的“LDRV”或“cdLD-Botes”蛋白或多肽或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的蛋白质；
(c)编码具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段的核酸，或者该编码核酸的互补序列；
(d)编码具有至少一个保守氨基酸替换的多肽的(a)至(c)的核酸，或者该编码核酸的互补序列；
(e)编码具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段的核酸，所述多肽或其酶活性片段具有选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替换：V19A、L21L、Y71F、G74S、G133M、R171K、I182L、V196F、D200N、F325S、G365S和L368F(参照SEQ ID NO:12编号)或在通过与SEQ ID NO:12比对鉴定的对应位置的相同替换；
(f)编码具有至少一个保守氨基酸替换的多肽的(e)的核酸，或者该编码核酸的互补序列；
(g)编码具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段的核酸，所述多肽或其酶活性片段具有选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替换：如见于“LDRV”中相对于SEQ ID NO:2作出的氨基酸替换(参照SEQ ID NO:2编号)或在通过与SEQ ID NO:2比对鉴定的对应位置的相同替换；
(h)编码具有至少一个保守氨基酸替换的多肽的(g)的核酸，或者该编码核酸的互补序列；或者
(i)以下核酸：
(1)其编码能够产生与具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、
86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102的序列的多肽特异性结合的抗体的多肽，或者
(2)(1)中核酸的互补序列；
其中(a)至(i)中任一个的核酸编码的多肽：
(1)具有芳樟醇脱水酶-异构酶(LinD)活性，
(2)具有乙烯基异构酶活性，
(3)具有脱水酶活性，任选地烯醇脱水酶活性，
(4)能够酶促催化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为3-丁烯-2-醇，
(5)能够酶促催化3-丁烯-2-醇转化为丁二烯或1,3丁二烯，
(6)能够酶促催化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为丁二烯或1,3丁二烯，
(7)能够酶促催化2,3-二甲基-丁-2-烯-1-醇转化为二甲基-丁二烯，
(8)催化对应于通式CnH2nO的化合物转化为CnH2n-2+H2O，其中3
2.根据权利要求1所述的分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸：
(a)还包含编码含有(或具有)以下或由以下组成的多肽或肽的核酸序列：信号序列、周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽；或者真核信号序列，
其中任选地所述核酸编码：SEQ ID NO:25(肽异源信号序列(ss)LamBss(或LamB ss))；
SEQ ID NO:26(肽：异源信号序列MalE ss)；SEQ ID NO:27(肽：异源信号序列MglBss)；SEQ ID NO:28(肽-异源信号序列OmpAss)；SEQ ID NO:29(肽：异源信号序列PelBss)、SEQ ID NO:30(肽：异源信号序列PhoAss)、SEQ ID NO:31(肽-异源信号序列DsbAss)、SEQ ID NO:32(肽：异源信号序列SfmCss)、SEQ ID NO:33(肽：异源信号序列TolBss)；SEQ ID NO:34(肽：
异源信号序列TorTss)、SEQ ID NO:35(肽：异源信号序列FhuD ss)；或者
(b)包含核酸序列SEQ ID NO:7，或者SEQ ID NO:19、38、44、50、56、67、75、81、87、93或
99，或者
编码SEQ ID NO:8，或者SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100的核酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸还包含编码N端甲硫氨酸的编码序列(或密码子)。
4.根据权利要求1或2所述的分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)，其中：
(a)所述核酸序列与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、
85、91或97组成的核酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或者其互补序列，
条件是所述核酸序列不编码含或不含信号肽的“LDRV”蛋白或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的多肽，或者
与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97组成的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列，或者其互补序列；
(b)在严格条件下与包括SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、
85、91或97的核酸杂交的核酸(多核苷酸)序列，并且所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC中洗涤约15分钟，
或者其互补序列，
条件是所述核酸序列不编码含或不含信号肽的“LDRV”蛋白或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的多肽。
5.根据权利要求2所述的分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)，其中周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)是：翻译后SecB靶向途径PTS或PSS；共翻译信号识别颗粒(SRP)-靶向途径PTS或PSS；或者双精氨酸转位(TAT)Sec独立系统PTS或PSS。
6.根据权利要求5所述的分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)，其中所述周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)包含以下或由以下组成：
(a)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌(C.defragrans)
65Phen的LinD PSS)，
(b)与SEQ ID NO:8、或者SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100具有约
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的肽；
(c)SEQ ID NO:25[Lam B信号序列或LamBss]，并且任选地所述编码的多肽包含SEQ ID NO:24；
(d)SEQ ID NO:26[MalE信号序列或MalEss]；
(e)SEQ ID NO:36[FhuD信号序列或FhuDss]；
(f)由与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、38、44、50、56、67、75、81、87、93或99具有约90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸编码的肽；
或者
(g)LamB ss、MalE ss、MglB ss、OmpA ss、PelB ss、PhoA ss、DsbA ss、SfmC ss、TolB ss、TorT ss、FhuD ss、PelB ss、YcdO ss、MdoD ss、Tor Ass或YcdO ss；
并且任选地包含或具有所述周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽操作性连接在由权利要求1所述的分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)编码的多肽的氨基端，并且任选地氨基端甲硫氨酸放置在包含或具有所述周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的所述多肽或肽的氨基端。
7.根据权利要求1所述的分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)，其中真核信号序列是酵母或真菌信号序列。
8.根据权利要求1所述的分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸还包含：编码含有异源氨基酸序列的多肽的核酸，或异源核苷酸序列，
并且任选地所述异源氨基酸序列包含或用作标签或表位，
并且任选地所述异源氨基酸序列包含或用作N端和/或C端延伸，用于靶向内质网(ER)或内膜，或者充当周质靶向序列周质信号序列或者具有PTS或PSS活性。
9.一种表达盒、载体或克隆载体，其包含或在其中已含有：(a)权利要求1至8中任一项所述的核酸序列；(b)(a)的表达盒、载体或克隆载体，含有或插入到病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、福斯质粒、细菌噬菌体或人工染色体中；(c)(b)的表达盒、载体或克隆载体，其中所述病毒载体包含或是腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体；或者(d)(a)、(b)或(c)的表达盒、载体或克隆载体，其包含或插入到细菌人工染色体(BAC)、质粒、细菌噬菌体P1衍生载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。
10.一种转化细胞或转导细胞，其：
(a)包含含有权利要求1至8中一项所述的序列的核酸；
(b)包含权利要求9所述的表达盒、载体或克隆载体；
(c)(a)或(b)的转化细胞或转导细胞，其中所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞；
(d)(c)的转化细胞或转导细胞，其中所述细胞是甲基营养型或甲烷营养型的，并且任选地是属于以下属的任何种：芽孢杆菌属(Bacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、Methyloversatilis、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)或生丝微菌属(Hyphomicrobium)，任选地甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)或荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatis)；
(e)(c)的转化细胞或转导细胞，其中所述细菌细胞或真菌细胞是属于以下属的任何种：曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Castellaniella、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Cornyebacteria)或葡萄球菌属(Staphylococcus)；
(f)(c)的转化细胞或转导细胞，其中所述细菌细胞或真菌细胞是大肠杆菌
(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、克劳氏芽孢杆(Bacillus clausii)、解芳烃卡斯特兰尼氏菌(Castellaniella
Defragrans)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌
(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌
(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、黑曲霉
(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；
(g)(c)的转化细胞或转导细胞，其中所述酵母细胞或真菌细胞是选自以下或属于以下的任何种：
酵母目(Saccharomycetales)、酵母科(Saccaromycetaceae)、或酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、红酵母属(Rhodotorula)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、曲霉属、克鲁维酵母属、伊萨酵母属(Issatchenkia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、Ogataea、Kuraishia、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、Ogataea,Kuraishia或Komagataella，酵母目、或Dipodascaceae科、或耶氏酵母属，
裂殖酵母目(Schizosaccharomycetales)、或裂殖酵母科、或裂殖酵母属，
散囊菌目(Eurotiales)、或发菌科(Trichocomaceae)、或曲霉属，
毛霉菌目(Mucorales)、或毛霉菌科(Mucoraceae)、或根霉属(Rhizopus)；
(h)(c)的转化细胞或转导细胞，其中所述所述酵母细胞或真菌细胞是选自以下的任何种：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母
(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia
lipolytica)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)或甲醇毕赤酵母(Pichia
methanolica)；或者
(i)(c)的转化细胞或转导细胞，其中所述细菌细胞或真菌细胞是选自以下或属于以下的任何种：
肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、或埃希氏菌属和克雷伯菌属(Klebsiella)，
气单胞菌目(Aeromonadales)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、或厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)，
巴斯德氏菌目(Pasteurellales)、或巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)、或放线杆菌属(Actinobacillus)和曼氏杆菌属(Mannheimia)，
根瘤菌目(Rhizobiales)、或慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、或根瘤菌属
(Rhizobium)，
芽孢杆菌目(Bacillales)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、或芽孢杆菌属，
放线菌目(Actinomycetales)、或棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)和链霉菌科
(Streptomycetaceae)、或分别地，棒状杆菌属和链霉菌属，
红螺菌目(Rhodospirillales)、或醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)、或葡糖杆菌属(Gluconobacter)，
鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、或鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、或酵单胞菌属(Zymomonas)，
乳杆菌目(Lactobacillales)、或乳杆菌科(Lactobacillaceae)和链球菌科
(Streptococcaceae)、或分别地，乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)，梭菌目(Clostridiales)、或梭菌科(Clostridiaceae)、或梭菌属(Clostridium)，或者假单胞菌目(Pseudomonadales)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、或假单胞菌属(Pseudomonas)。
11.根据权利要求10所述的转化细胞或转导细胞，其中：
(a)所述细胞包含同源的或还包含异源的巴豆醇脱水酶(CAD)；
(b)所述细胞包含同源的或还包含异源的CAD和巴豆醛还原酶(CAR)和/或巴豆酰CoA还原酶-醇形成(CCR-OH)；
(c)所述细胞包含同源的或还包含异源的CAD、CAR和/或巴豆酰CoA还原酶-醛形成
(CCR-ALD)和/或巴豆酸还原酶(CTR)；
(d)所述细胞包含同源的或还包含异源的CAD、CAR、CCR和/或CTR和巴豆酰CoA水解酶(CCH)、巴豆酰CoA转移酶(CCT)或巴豆酰CoA合成酶(CCS)；
(e)所述细胞包含同源的或还包含异源的CCR-OH和CAD；
(f)所述细胞包含同源的或还包含异源的3-羟基丁酰CoA脱水酶(HCD)或烯酰-CoA水合酶(ECH)和(a)至(e)的任意组合；
(g)所述细胞包含同源的或还包含异源的乙酰乙酰CoA还原酶-酮还原(ACR-KET)和(a)至(f)的任意组合；
(h)所述细胞包含同源的或还包含异源的乙酰CoA羧化酶(AC-CAR)、乙酰乙酰CoA合酶(ACS)(任选地ACS FhsA)和/或乙酰CoA:乙酰CoA乙酰转移酶(ACAC-AT)(或乙酰乙酰CoA硫解酶或乙酰CoA乙酰转移酶)和(a)至(g)的任意组合；
(i)所述细胞包含同源的或还包含异源的3-氧代酰基-CoA合酶(OCS)和(a)至(h)的任意组合；
(j)所述细胞包含同源的或还包含用于催化3-羟基丁酰CoA转化为巴豆酰CoA的酶、或
3-羟基丁酰CoA脱水酶、水解酶或烯酰CoA水合酶；
(k)所述细胞包含同源的或还包含异源的氧化还原酶、酰基-CoA还原酶或酰化醛脱氢酶以将酰基-CoA还原成其对应的醛，或脂肪酰CoA还原酶、琥珀酰CoA还原酶、丁酰CoA 还原酶或丙酰CoA还原酶；或者
(l)所述细胞包含或还包含图1或图6中的一种或更多种酶；
并且任选地产生二烯烃，其中任选地所述二烯烃是丁二烯。
12.一种转基因植物、植物细胞或种子：其(a)包含权利要求1至8中任一项所述的序列，或者权利要求9所述的表达盒、载体或克隆载体，或者权利要求10所述的转化细胞，其中任选地所述植物是玉米植物、高粱植物、马铃薯植物、番茄植物、小麦植物、油籽植物、菜籽植物、大豆植物、稻植物、大麦植物、草、烟草植物；或者用于动物或反刍动物的草料和/或饲料植物，并且任选地所述草料或饲料植物是干草、玉米、粟、大豆、小麦、荞麦、大麦、苜蓿、黑麦、一年生草、高粱、苏丹草、韦尔德草或纤毛狼尾草，
其中任选地所述植物细胞或种子是玉米种子、小麦粒、油籽、菜籽、大豆种子、棕仁、向日葵种子、芝麻种子、稻、大麦、花生或烟草植物种子；或者来自用于动物或反刍动物的任何草料和/或饲料植物的种子，并且任选地所述草料或饲料植物是干草、玉米、粟、大豆、小麦、荞麦、大麦、苜蓿、黑麦、一年生草、高粱、苏丹草、韦尔德草或纤毛狼尾草。
13.一种分离的、合成的、或重组的多肽，其由权利要求1至8中任一项所述的核酸编码。
14.一种分离的、合成的、或重组的多肽，其：
(a)具有与SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102具有至少50％、55％、60％、65％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，
条件是所述多肽不是含或不含信号肽的“LDRV”或“cdLD-Botes”蛋白或多肽或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的蛋白质，或者具有与由SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102组成的多肽具有至少95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
(b)具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段；
(c)具有至少一个保守氨基酸替换的(b)的多肽；
(d)具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段，该多肽或其酶活性片段具有选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替换：V19A、L21L、Y71F、G74S、G133M、R171K、I182L、V196F、D200N、F325S、G365S和L368F(参照SEQ ID NO:12编号)或在通过与SEQ ID NO:12比对鉴定的对应位置的相同替换；
(e)具有至少一个保守氨基酸替换的(d)的多肽；或者
(f)具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段，该多肽或其酶活性片段具有选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替换：如见于“LDRV”中相对于SEQ ID NO:2作出的氨基酸替换(参照SEQ ID NO:2编号)或在通过与SEQ ID NO:2比对鉴定的对应位置的相同替换；
(g)编码具有至少一个保守氨基酸替换的(f)的多肽；
(h)能够产生与具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或
98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102的序列的多肽特异性结合的抗体的多肽；
其中(a)至(h)中任一个的多肽包含以下活性：
(1)具有芳樟醇脱水酶-异构酶(LinD)活性，
(2)具有乙烯基异构酶活性，
(3)具有脱水酶活性，任选地烯醇脱水酶活性，
(4)能够酶促催化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为3-丁烯-2-醇，
(5)能够酶促催化3-丁烯-2-醇转化为丁二烯或1,3丁二烯，
(6)能够酶促活化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为丁二烯或1,3丁二烯，
(7)能够酶促催化2,3-二甲基-丁-2-烯-1-醇转化为二甲基-丁二烯，
(8)催化对应于通式CnH2nO的化合物转化为CnH2n-2+H2O，其中3
15.根据权利要求13或权利要求14所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中所述多肽：
(a)还包含以下或由以下组成：信号序列、周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽，或者真核信号序列；或者
(b)包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、
88、94或100。
16.根据权利要求13或权利要求14所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中所述多肽还包含N端甲硫氨酸或由N端甲硫氨酸组成。
17.根据权利要求13或权利要求14所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中：
(a)所述多肽与具有由EQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98组成的序列的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽不是含或不含信号肽的“LDRV”蛋白或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的多肽，或者
与具有由SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98组成的序列的多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
18.根据权利要求15所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中所述周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)是：翻译后SecB靶向途径PTS或PSS；共翻译信号识别颗粒(SRP)-靶向途径PTS或PSS；或者双精氨酸转位(TAT)Sec独立系统PTS或PSS。
19.根据权利要求18所述的分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)，其中所述周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)包含以下或由以下组成：
(a)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌65Phen的LinD PSS)，(b)与SEQ ID NO:8、或者SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100具有约
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的肽；
(c)SEQ ID NO:25[Lam B信号序列或LamBss]，并且任选地所述编码的多肽包含SEQ ID NO:24；
(d)SEQ ID NO:26[MalE信号序列或MalEss]；
(e)SEQ ID NO:36[FhuD信号序列或FhuDss]；
(f)由与SEQ ID NO:7、或者SEQ ID NO:19、44、38、50、56、67、75、81、87、93或99具有约
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸编码的肽；或者
(g)LamB ss、MalE ss、MglB ss、OmpA ss、PelB ss、PhoA ss、DsbA ss、SfmC ss、TolB ss、TorT ss、FhuD ss、PelB ss、YcdO ss、MdoD ss、Tor Ass或YcdO ss；
并且任选地包含或具有所述周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽操作性连接在权利要求13或权利要求14所述多肽的氨基端，并且任选地氨基端甲硫氨酸放置在包含或具有所述周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽的氨基端。
20.根据权利要求15所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中所述真核信号序列是酵母或真菌信号序列。
21.根据权利要求13或权利要求14所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中所述多肽还包含：异源氨基酸序列，
并且任选地所述异源氨基酸序列包含或用作标签或表位，
并且任选地所述异源氨基酸序列包含或用作N端和/或C端延伸，用于靶向内质网(ER)或内膜，或者用作周质靶向序列或周质信号序列或者具有PTS或PSS活性。
22.根据权利要求14所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中：
(a)所述保守氨基酸替换包括将一个脂族氨基酸用另一个脂族氨基酸替代；用苏氨酸替代丝氨酸，或反之亦然；将一个酸性残基用另一个酸性残基替代；将一个携带酰胺基团的残基用另一个携带酰胺基团的残基替代；使碱性残基与另一碱性残基交换；或将一个芳族残基用另一个芳族残基替代，或者其组合；或者
(b)(a)的所述分离的、合成的、或重组的多肽，其中脂族残基包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成等同物，或者所述酸性残基包含天冬氨酸、谷氨酸或其合成等同物，或者包含酰胺基的所述残基包含天冬氨酸、谷氨酸或其合成等同物，或者所述碱性残基包含赖氨酸、精氨酸或其合成等同物，或者所述芳族残基包含苯丙氨酸、酪氨酸或其合成等同物。
23.包含根据权利要求13至22中任一项所述的多肽的组合物，
其中任选地所述组合物还包含所述多肽的底物，并且任选地所述底物包含烯醇、巴豆醇、丁-3-烯-2-醇或丁-3-烯-1-醇、对应于其中3
25.一种分离的、合成的、或重组的抗体：(a)其与权利要求13至22中任一项所述的多肽特异性结合；(b)(a)的所述抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
26.包含与权利要求8至12中任一项所述的多肽特异性结合的抗体的杂交瘤，或产生权利要求17所述的抗体的杂交瘤。
27.一种分离或鉴定具有酶活性的多肽的方法，其包括以下步骤：
(a)提供权利要求25所述的抗体；
(b)提供包含一种或多种多肽的样品；以及
(c)使步骤(b)的所述样品与步骤(a)的所述抗体在其中所述抗体能够与所述多肽特异性结合的条件下接触，
其中任选地所述酶活性包含芳樟醇脱水酶-异构酶(LinD)活性、乙烯基异构酶活性或脱水酶活性，
从而分离或鉴定具有所述酶活性的多肽。
28.一种产生重组多肽的方法，其包括：
(i)(a)提供与启动子操作性连接的核酸，其中所述核酸包含权利要求1至8中任一项所述的核酸；以及(b)在允许表达所述多肽的条件下表达(a)的所述核酸，从而产生重组多肽；
或者
(ii)(i)的所述方法，其还包括用步骤(i)(a)的所述核酸转化宿主细胞，之后表达步骤(a)的所述核酸，从而在转化细胞中产生重组多肽。
29.用于由对应于或包含其中3
(b)在其中产生权利要求13至22中任一项所述多肽的条件下表达权利要求1至8中任一项所述的核酸，以及在适于产生包含所述化合物的酶产物的条件下使所述多肽与权利要求
13至22中任一项所述多肽的底物接触，
其中任选地所述方法还包括回收产生的对应于其中3
30.一种酶促催化巴豆醇转化为3-丁烯-2-醇的方法，其包括在其中所述巴豆醇被酶促转化为所述3-丁烯-2-醇的条件下使权利要求13至22中任一项所述的多肽与所述巴豆醇接触。
31.一种酶促催化3-丁烯-2-醇转化为丁二烯的方法，其包括在其中所述3-丁烯-2-醇被酶促转化为所述丁二烯的条件下使权利要求13至22中任一项所述的多肽与所述3-丁烯-
2-醇接触。
32.一种酶促催化巴豆醇转化为丁二烯的方法，其包括在其中所述巴豆醇被酶促转化为所述丁二烯的条件下使权利要求13至22中任一项所述的多肽与所述巴豆醇接触。
33.一种具有细菌周质靶向活性的肽或多肽，其包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100所示、并且具有至少一个保守氨基酸替换或具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸替换的序列。
34.一种分离的、合成的、或重组的多肽，其：
(a)与(i)SEQ ID NO:2、(ii)SEQ ID NO:6或(iii)SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者
(b)包含(a)的酶活性片段，
并且还包含以下或由以下组成：周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽；或者真核信号序列。
35.根据权利要求34所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中所述多肽还包含N端甲硫氨酸。
36.根据权利要求34所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中所述周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)是：翻译后SecB靶向途径PTS或PSS；共翻译信号识别颗粒(SRP)-靶向途径PTS或PSS；或者双精氨酸转位(TAT)Sec独立系统PTS或PSS。
37.根据权利要求36所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中所述周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)包含以下或由以下组成：
(a)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO 20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100；
(c)SEQ ID NO:25[Lam B信号序列或LamBss]，并且任选地所述编码的多肽包含SEQ ID NO:24；
(d)SEQ ID NO:26[MalE信号序列或MalEss]；
(e)SEQ ID NO:36[FhuD信号序列或FhuDss]；
(f)SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34；或者
(g)LamB ss、MalE ss、MglB ss、OmpA ss、PelB ss、PhoA ss、DsbA ss、SfmC ss、TolB ss、TorT ss、FhuD ss、PelB ss、YcdO ss、MdoD ss、Tor Ass或YcdO ss；
并且任选地包含或具有所述周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(SS)或者具有PTS活性的多肽或肽操作性连接在权利要求34所述多肽的氨基端，并且任选地氨基端甲硫氨酸放置在包含或具有所述周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽的氨基端。
38.根据权利要求34所述的分离的、合成的、或重组的多肽，其中所述真核信号序列是酵母或真菌信号序列。
39.由权利要求1至8中任一项所述核酸编码的多肽、或者权利要求13至22或34至38中任一项所述多肽、或者权利要求10或权利要求11所述转化细胞或转导细胞、或权利要求12所述植物细胞用于将对应于通式CnH2nO的化合物转化为CnH2n-2+H2O的用途或使用由权利要求1至8中任一项所述核酸编码的多肽、或者权利要求13至22或34至38中任一项所述多肽、或者权利要求10或权利要求11所述转化细胞或转导细胞、或权利要求12所述植物细胞将对应于通式CnH2nO的化合物转化为CnH2n-2+H2O的方法，其中3
(a)对应于其中3
其中任选地(a)或(b)的所述底物包含：变成CnH2n-2+H2O的对应于通式CnH2nO的化合物，其中3
和/或任选地对应于其中3
43.根据权利要求42所述的方法，其还包括一个、数个或全部以下步骤：
(a)获得包含共轭二烯烃如丁二烯、挥发性杂质、生物副产物杂质和水蒸气的发酵罐尾气；
(b)在多级压缩系统中压缩所述发酵罐尾气以产生压缩流；
(c)将所述压缩流进料到第一蒸馏区以去除生物副产物杂质和水蒸气，所述第一蒸馏区具有上部回流段、中间蒸馏段和下部再沸器段；
(d)使从生物副产物杂质和水去除蒸馏区产生的塔顶蒸气流与吸附剂接触以产生经干燥的塔顶流；
(e)将所述经干燥的塔顶流进料到第二蒸馏区以通过顶部去除挥发性杂质，其中所述第二蒸馏区具有上部回流段、中间蒸馏段和下部再沸器段；以及
(f)在用于去除挥发性杂质的所述蒸馏区的底部收集得到的经纯化液体共轭二烯烃如丁二烯。
44.用于产生聚合物、树脂或制品的方法，其包括使二烯烃、任选地丁二烯反应以产生聚合物或树脂，以及还任选地使所述聚合物或树脂形成为所述制品，其中所述二烯烃、任选地丁二烯通过权利要求29至32或权利要求42至43中任一项所述方法、或者权利要求40至41中任一项所述用途产生，或者任选地使用权利要求1至26或33至38中任一项所述组合物产生。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述聚合物、树脂或制品包含或是含丁二烯聚合物、聚丁二烯、己二腈、共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、丙烯腈-丁二烯橡胶(ABR)、苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)共聚物、苯乙烯-1,3-丁二烯胶乳，或者所述制品是轮胎、管、车辆部件、船部件、食品容器或地毯背衬。
46.一种具有周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)活性的分离的、合成的、或重组的多肽或肽，其包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:20、39、45、
51、57、68、76、82、88、94或100具有约90％至100％、或者约90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
乙烯基异构酶-脱水酶、烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和/或巴豆
醇脱水酶以及制备和使用其的方法
[0001] 相关申请
[0002] 本发明要求于2015年5月30日提交的美国临时专利申请序列号(USSN)62/168,787、于2015年10月2日提交的USSN 62/236,662和于2016年3月29日提交的USSN 62/314,
531的优先权权益。前述申请出于所有目的而明确地通过引用整体并入本文。
531的优先权权益。前述申请出于所有目的而明确地通过引用整体并入本文。
[0004] 根据37C.F.R.§1.821至1.825的序列表的电子形式(计算机可读形式)在此根据MPEP§502.05(IX)通过EFS-Web以ASCII形式提交，其内容处于所有目的而通过引用整体并入说明书中。该电子文件创建于2016-05-26，大小为205千字节，并且标题为RP8685.txt。
技术领域
[0005] 本发明总体上涉及用于生产有机化学品的酶学和生物合成方法。提供了非天然或经遗传改造的乙烯基异构酶-脱水酶，包括烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和巴豆醇脱水酶，其可以是双功能的，因为本文提供的酶具有异构酶和脱水酶两种活性，但不一定处于相同水平。还提供了包含这样的酶的经遗传改造微生物及其在可持续生产烯醇和烯烃中的应用。
背景技术
[0006] 每年生产超过250亿磅的丁二烯(BD、BDE)，包括1,3-丁二烯，并且其应用于制造例如合成橡胶和ABS树脂的聚合物，以及例如六亚甲基二胺和1,4-丁二醇的化学品。丁二烯通常作为用于将诸如石脑油、液化石油气、乙烷或天然气的石油原料转化为乙烯和其他烯烃的蒸汽裂化过程的副产物生产。从替代和/或可再生原料生产丁二烯的能力代表寻求更加可持续化学生产方法的重大进步。丁二烯可如下可再生地生产：发酵糖或其他原料以产生二醇，例如1,4-丁二醇或1,3-丁二醇，将其分离，纯化，并随后在涉及基于金属的催化的第二步骤中脱水成丁二烯。
[0007] 然而，由可再生原料直接发酵生产丁二烯(或其他二烯烃)消除了化学脱水步骤的需求，因为丁二烯气体(沸点或bp为-4.4℃)可连续地从发酵罐中排放出并容易例如通过冷凝收集。直接发酵生产方法消除了对基于化石的丁二烯(或其他二烯烃)的需求，并且相对于通过石油化学获得的丁二烯将显著节省成本、能量以及有害废物和排放物。
[0008] 需要用于由便宜的可再生原料有效地生产丁二烯或二烯烃的经改进的酶、微生物生物和方法，所述原料例如右旋糖、糖蜜、甘蔗汁和从生物质来源(包括农业和木材废料)获得的糖，以及C1原料，例如合成气、甲醇和二氧化碳。
发明内容
[0009] 在一些替代实施方案中，提供了分离的合成核酸(多核苷酸)或分离的重组核酸(多核苷酸)，其包含：
[0010] (a)与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97(编码全长酶)或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101(编码经加工的成熟酶)组成的核酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列，[0011] 或者其互补序列，
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列，[0011] 或者其互补序列，
[0012] 条件是所述核酸序列不编码具有或不具有信号肽或任何周质序列的“LDRV”或“cdLD-Botes”蛋白，或者含或不含其信号肽的的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的多肽，或者
[0013] 与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97(编码全长酶)或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101(编码经加工的成熟酶)组成的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列，
[0014] 或者其互补序列；
[0015] (b)在严格条件下与包含SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97(编码全长酶)或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101)(编码经加工的成熟酶)的核酸杂交的核酸(多核苷酸)序列，并且所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC中洗涤约15分钟，
[0016] 或者其互补序列
[0017] 条件是所述核酸序列不编码含或不含信号肽的“LDRV”或“cdLD-Botes”蛋白，或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的多肽；
[0018] (c)编码具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98(全长酶)或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102(经加工成熟酶)所示序列的多肽或其酶活性片段的核酸，或者所述编码核酸的互补序列；
[0019] (d)编码具有至少一个保守氨基酸替换的多肽的(c)的核酸，或者所述编码核酸的互补序列；
[0020] (e)编码具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段的核酸，所述多肽或其酶活性片段具有选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替换：V19A、L21L、Y71F、G74S、G133M、R171K、I182L、V196F、D200N、F325S、G365S和L368F(参照SEQ ID NO:12编号)或在通过与SEQ ID NO:12比对鉴定的对应位置的相同替换；
[0021] (f)编码具有至少一个保守氨基酸替换的多肽的(e)的核酸，或所述编码核酸的互补序列；
[0022] (g)编码具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段的核酸，所述多肽或其酶活性片段具有选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替换：如见于“LDRV”蛋白中相对于SEQ ID NO:2作出的氨基酸替换(参照SEQ ID NO:2编号)或在通过与SEQ ID NO:2比对鉴定的对应位置的相同替换；
[0023] (h)编码具有至少一个保守氨基酸替换的多肽的(g)的核酸，或编码所述核酸的互补序列；
[0024] 或者
[0025] (i)以下核酸：其编码能够产生与具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102的序列的多肽特异性结合的抗体的多肽，或其互补序列；
[0026] 其中(a)至(i)中任一个的核酸编码以下多肽，所述多肽：
[0027] (1)具有芳樟醇脱水酶-异构酶(LinD)活性，
[0028] (2)具有乙烯基异构酶活性，
[0029] (3)具有脱水酶活性，任选地烯醇脱水酶活性，
[0030] (4)能够酶促催化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为3-丁烯-2-醇，
[0031] (5)能够酶促催化3-丁烯-2-醇转化为丁二烯或1,3丁二烯，
[0032] (6)能够酶促活化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为丁二烯或1,3丁二烯，
[0033] (7)能够酶促催化2,3-二甲基-丁-2-烯-1-醇转化为二甲基-丁二烯，
[0034] (8)催化对应于通式CnH2nO的化合物转化为CnH2n-2+H2O，其中3
[0035] 其中任选地对应于通式CnH2nO其中3
[0036] 并且任选地对应于通式CnH2nO其中37的化合物是二甲基丁二烯，或者
[0037] (9)(1)至(8)的任意组合。
[0038] 在一些替代实施方案中，本文中提供的核酸(a)还包含编码以下多肽或肽的核酸序列：所述多肽或肽含有(或具有)信号序列、周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)或者由所述信号序列、PTS或PSS组成的多肽或肽，或者所述多肽或肽具有PTS或PSS活性，或者所述多肽或肽含有(或具有)真核信号序列或由真核信号序列组成；或者(b)包含核酸序列SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97或者SEQ ID NO:
15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101。
15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101。
[0039] 在一些替代实施方案中，本文中体用的核酸还包含编码N端甲硫氨酸的编码序列(或密码子)。
[0040] 在一些替代实施方案中，对于本文中提供的核酸：
[0041] (a)所述核酸序列与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97组成的核酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，[0042] 或者其互补序列，
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，[0042] 或者其互补序列，
[0043] 条件是所述核酸序列不编码含或不含信号肽的“LDRV”或“cdLD-Botes”蛋白或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的“LDRV”蛋白或多肽，或者
[0044] 所述核酸序列与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97组成的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，[0045] 或其互补序列；
[0046] (b)在严格条件下与包含SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97的核酸杂交的核酸(多核苷酸)序列，并且所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC中洗涤约15分钟，
[0047] 或者其互补序列，
[0048] 条件是所述核酸序列不编码含或不含信号肽的“LDRV”或“cdLD-Botes”蛋白或多肽，包括含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的蛋白质。
[0049] 在一些替代实施方案中，周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)是：翻译后SecB靶向途径PTS或PSS；共翻译信号识别颗粒(SRP)-靶向途径PTS或PSS；或者双精氨酸转位(TAT)Sec独立系统PTS或PSS。在一些替代实施方案中，周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)包含以下或由以下组成：
[0050] (a)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
[0051] (b)SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100所示的氨基酸序列；
[0052] (c)SEQ ID NO:25[Lam B信号序列或LamBss]，并且任选地编码的多肽包含SEQ ID NO:24；
[0053] (d)SEQ ID NO:26[MalE信号序列或MalEss]；
[0054] (e)SEQ ID NO:36[FhuD信号序列或FhuDss]；
[0055] (f)SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34；
[0056] (g)LamB ss、MalE ss、MglB ss、OmpA ss、PelB ss、PhoA ss、DsbA ss、SfmC ss、TolB ss、TorT ss、FhuD ss、PelB ss、YcdO ss、MdoD ss、Tor Ass或YcdO ss；或者
[0057] (h)由与SEQ ID NO:7或者SEQ ID NO:19、38、44、50、56、67、75、81、87、93或99具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸编码的肽；
[0058] 并且任选地包含或具有周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽操作性连接在由权利要求1所述分离的、合成的、或重组核酸(多核苷酸)编码的多肽的氨基端，并且任选地氨基端甲硫氨酸放置在包含或具有周质靶向序列
(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽的氨基端。真核信号序列可以是酵母或真菌信号序列。
(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽的氨基端。真核信号序列可以是酵母或真菌信号序列。
[0059] 在一些替代实施方案中，本文中提供的核酸还包含：编码含有异源氨基酸序列的多肽的核酸，或异源核苷酸序列，并且任选地所述异源氨基酸序列包含或用作标签或表位，并且任选地所述异源氨基酸序列包含或用作用于靶向内质网(ER)或内膜的N端和/或C端延伸，或者用作周质靶向序列、周质信号序列或者具有PTS或PSS活性。
[0060] 在一些替代实施方案中，本文中提供了表达盒、载体或克隆载体，在其包含或在其中已含有(a)本文中提供的核酸序列；(b)含有或被插入到病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、福斯质粒、细菌噬菌体或人工染色体中的(a)的表达盒、载体或克隆载体；(c)(b)的表达盒、载体或克隆载体，其中所述病毒载体包含或是腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体；或者(d)(a)、(b)或(c)的表达盒、载体或克隆载体，其包含或被插入到细菌人工染色体(BAC)、质粒、细菌噬菌体P1衍生载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)中。
[0061] 在一些替代实施方案中，本文中提供了转化或转导细胞(例如，非天然或经改造的细胞)，
[0062] (a)其包含本文中提供的核酸；
[0063] (b)其包含本文中提供的表达盒、载体或克隆载体；
[0064] (c)(a)或(b)的转化或转导细胞，其中所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞；
[0065] (d)(c)的转化或转导细胞，其中所述细胞是甲基营养型或甲烷营养型的，并且任选地是属于以下属：芽孢杆菌属(Bacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、Methyloversatilis、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)或生丝微菌属(Hyphomicrobium)的任何物种，任选地甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)或荚膜甲基球菌(Methylococcus
capsulatis)；
capsulatis)；
[0066] (e)(c)的转化或转导细胞，其中所述细菌细胞或真菌细胞是属于以下属的任何物种：曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Castellaniella(卡斯特兰尼氏菌属)、芽孢杆菌属、棒状杆菌属(Cornyebacteria)或葡萄球菌属(Staphylococcus)；
[0067] (f)(c)的转化或转导细胞，其中所述细菌细胞或真菌细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus
subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、克劳氏芽孢杆(Bacillus clausii)、解芳烃卡斯特兰尼氏菌(Castellaniella
Defragrans)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌
(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus
succinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、埃特里根瘤菌
(Rhizobium etli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡糖杆菌
(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌
(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌
(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(丙酮丁醇梭菌)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；
subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、克劳氏芽孢杆(Bacillus clausii)、解芳烃卡斯特兰尼氏菌(Castellaniella
Defragrans)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌
(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus
succinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、埃特里根瘤菌
(Rhizobium etli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡糖杆菌
(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌
(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌
(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(丙酮丁醇梭菌)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；
[0068] (g)(c)的转化或转导细胞，其中所述酵母细胞或真菌细胞是选自以下或属于以下的任何物种：
[0069] 酵母目(Saccharomycetales)、或酵母科(Saccaromycetaceae)、或酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、红酵母属(Rhodotorula)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、曲霉属、克鲁维酵母属、伊萨酵母属(Issatchenkia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、Ogataea、Kuraishia、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、Ogataea、Kuraishia或Komagataella，
[0070] 酵母目、或Dipodascaceae科、或耶氏酵母属，
[0071] 裂殖酵母目 (Schizosaccharomycetales)、或裂殖酵母科(Schizosaccharomycetaceae)、或裂殖酵母属，
[0072] 散囊菌目(Eurotiales)、或发菌科(Trichocomaceae)、或曲霉属，
[0073] 毛霉菌目(Mucorales)、或毛霉菌科(Mucoraceae)、或根霉属(Rhizopus)；
[0074] (h)(c)的转化或转导细胞，其中所述酵母细胞或真菌细胞是选自以下的任何物种：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母
(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus)、土曲霉
(Aspergillus terreus)、黑曲霉、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、少根根霉
(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia
lipolytica)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、多形汉逊酵母(Hansenula
polymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)或甲醇毕赤酵母(Pichia
methanolica)；或者
(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus)、土曲霉
(Aspergillus terreus)、黑曲霉、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、少根根霉
(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia
lipolytica)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、多形汉逊酵母(Hansenula
polymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)或甲醇毕赤酵母(Pichia
methanolica)；或者
[0075] (i)(c)的转化或转导细胞，其中所述细菌细胞或真菌细胞是选自以下或属于以下的任何物种：
[0076] 肠杆菌目(Enterobacteriales)、或肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、或埃希氏菌属和克雷伯菌属(Klebsiella)，
[0077] 气单胞菌目(Aeromonadales)、或琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、或厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)，
[0078] 巴斯德氏菌目(Pasteurellales)、或巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)、或放线杆菌属(Actinobacillus)和曼氏杆菌属(Mannheimia)，
[0079] 根瘤菌目(Rhizobiales)、或慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、或根瘤菌属(Rhizobium)，
[0080] 芽孢杆菌目(Bacillales)、或芽孢杆菌科(Bacillaceae)、或芽孢杆菌属，
[0081] 放线菌目(Actinomycetales)、或棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)和链霉菌科(Streptomycetaceae)、或分别地，棒状杆菌属和链霉菌属，
[0082] 红螺菌目(Rhodospirillales)、或醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)、或葡糖杆菌属(Gluconobacter)，
[0083] 鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、或鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、或酵单胞菌属(Zymomonas)，
[0084] 乳杆菌目(Lactobacillales)、或乳杆菌科(Lactobacillaceae)和链球菌科(Streptococcaceae)、或分别地，乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)，[0085] 梭菌目(Clostridiales)、或梭菌科(Clostridiaceae)、或梭菌属(Clostridium)，或者
[0086] 假单胞菌目(Pseudomonadales)、或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、或假单胞菌属(Pseudomonas)。
[0087] 在本文中提供的非天然的、经改造的转化或转导细胞的一些替代实施方案中：
[0088] (a)所述细胞包含同源的或还包含异源的巴豆醇脱水酶(CAD)；
[0089] (b)所述细胞包含同源的或还包含异源的CAD和巴豆醛还原酶(CAR)和/或巴豆酰CoA还原酶-醇形成(CCR-OH)；
[0090] (c)所述细胞包含同源的或还包含异源的CAD、CAR和/或巴豆酰CoA还原酶-醛形成(CCR-ALD)和/或巴豆酸还原酶(CTR)；
[0092] (e)所述细胞包含同源的或还包含异源的CCR-OH和CAD；
[0093] (f)所述细胞包含同源的或还包含异源的3-羟基丁酰CoA脱水酶(HCD)或烯酰CoA水合酶(ECH)，和(a)至(e)的任意组合；
[0094] (g)所述细胞包含同源的或还包含异源的乙酰乙酰CoA还原酶-酮还原(ACR-KET)，和(a)至(f)的任意组合；
[0095] (h)所述细胞包含同源的或还包含异源的乙酰CoA羧化酶(AC-CAR)、乙酰乙酰CoA合酶(ACS)(任选地ACS FhsA)和/或乙酰CoA:乙酰CoA乙酰转移酶(ACAC-AT)(或乙酰乙酰
CoA硫解酶或乙酰CoA乙酰转移酶)，和(a)至(g)的任意组合；
CoA硫解酶或乙酰CoA乙酰转移酶)，和(a)至(g)的任意组合；
[0096] (i)所述细胞包含同源的或还包含异源的3-氧代酰基-CoA合酶(OCS)，和(a)至(h)的任意组合；
[0097] (j)所述细胞包含同源的或还包含催化3-羟基丁酰CoA转化为巴豆酰CoA的酶、或3-羟基丁酰CoA脱水酶、水解酶或烯酰CoA水合酶；
[0098] (k)所述细胞包含同源的或还包含异源的氧化还原酶、酰基-CoA还原酶或将酰基-CoA还原成其对应醛的酰化醛脱氢酶，或脂肪酰CoA还原酶、琥珀酰CoA还原酶、丁酰CoA还原酶或丙酰CoA还原酶；或者
[0099] (l)所述细胞包含或还包含图1或图6中的一种或更多种酶；
[0100] 并且任选地产生二烯烃，其中任选地所述二烯烃是丁二烯。
[0101] 在一些替代实施方案中，提供了转基因植物、植物细胞或种子：(a)其包含本文中提供的序列，或者本文中提供的表达盒、载体或克隆载体，或者本文中提供的转化细胞，[0102] 其中任选地所述植物是玉米植物、高粱植物、马铃薯植物、番茄植物、小麦植物、油籽植物、菜籽植物、大豆植物、稻植物、大麦植物、草、烟草植物；或者用于动物或反刍动物的草料和/或饲料植物，并且任选地所述草料或饲料植物是干草、玉米、粟、大豆、小麦、荞麦、大麦、苜蓿、黑麦、一年生草、高粱、苏丹草、韦尔德草或纤毛狼尾草(buffel grass)，[0103] 其中任选地所述植物细胞或种子是玉米种子、小麦粒、油籽、菜籽、大豆种子、棕仁、向日葵种子、芝麻种子、稻、大麦、花生或烟草植物种子；或者来自用于动物或反刍动物的任何草料和/或饲料植物的种子，并且任选地所述草料或饲料植物是干草、玉米、粟、大豆、小麦、荞麦、大麦、苜蓿、黑麦、一年生草、高粱、苏丹草、韦尔德草或纤毛狼尾草。
[0104] 在一些替代实施方案中，提供了由本文中提供的核酸编码的分离的、合成的、或重组多肽。
[0105] 在一些替代实施方案中，提供了以下分离的、合成的、或重组：
[0106] (a)其具有与SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102具有至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列，
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列，
[0107] 条件是所述多肽不是含或不含信号肽的“LDRV”或“cdLD-Botes”蛋白或多肽或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的蛋白质，或者
[0108] 具有与由SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102组成的多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
[0109] (b)具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段；
[0110] (c)具有至少一个保守氨基酸替换的(b)的多肽；
[0111] (d)具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段，其具有选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替换：V19A、L21L、Y71F、G74S、G133M、R171K、I182L、V196F、D200N、F325S、G365S和L368F(参照SEQ ID NO:12编号)或在通过与SEQ ID NO:12比对而鉴定的对应位置的相同替换；
[0112] (e)具有至少一个保守氨基酸替换的(d)的多肽；或者
[0113] (f)具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段，其具有选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替换：如见于“LDRV”中相对于SEQ ID NO:2作出的氨基酸替换(参照SEQ ID NO:2编号)或在通过与SEQ ID NO:2比对而鉴定的对应位置的相同替换；
[0114] (g)具有至少一个保守氨基酸替换的(f)的多肽；
[0115] (h)能够产生与具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102的序列的多肽特异性结合的抗体的多肽；
[0116] 其中(a)至(h)中任一个的多肽包含以下活性：
[0117] (1)具有芳樟醇脱水酶-异构酶(LinD)活性，
[0118] (2)具有乙烯基异构酶活性，
[0119] (3)具有脱水酶活性，任选地烯醇脱水酶活性，
[0120] (4)能够酶促催化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为3-丁烯-2-醇，
[0121] (5)能够酶促催化3-丁烯-2-醇转化为丁二烯或1,3丁二烯，
[0122] (6)能够酶促活化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为丁二烯或1,3丁二烯，
[0123] (7)能够酶促催化2,3-二甲基-丁-2-烯-1-醇转化为二甲基-丁二烯，
[0124] (8)催化对应于通式CnH2nO的化合物转化为CnH2n-2+H2O，其中3
[0125] 其中任选地对应于通式CnH2nO其中3
[0126] 并且任选地对应于通式CnH2nO其中37的化合物是二甲基丁二烯，或者
[0127] (9)(1)至(8)的任意组合。
[0128] 在一些替代实施方案中，本文中提供的多肽：(a)还包含以下或由以下组成：信号肽、周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽，或者真核信号序列；或者(b)包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102。
[0129] 在一些替代实施方案中，本文中提供的多肽还包含N端甲硫氨酸或由其组成。
[0130] 在一些替代实施方案中，对于本文中提供的多肽：
[0131] (a)所述多肽与具有由SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98组成的序列的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，[0132] 条件是所述多肽不是含或不含信号肽的“LDRV”或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的多肽，或者
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，[0132] 条件是所述多肽不是含或不含信号肽的“LDRV”或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的多肽，或者
[0133] 与具有由SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98组成的序列的多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
[0134] 在一些替代实施方案中，所述周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)是：翻译后SecB靶向途径PTS或PSS；共翻译信号识别颗粒(SRP)-靶向途径PTS或PSS；或者双精氨酸转位(TAT)Sec独立系统PTS或PSS。在一些替代实施中，所述周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)包含以下或由以下组成：
[0135] (a)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，
[0136] (b)SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100；
[0137] (c)SEQ ID NO:25[Lam B信号序列或LamBss]，并且任选地编码的多肽包含SEQ ID NO:24；
[0138] (d)SEQ ID NO:26[MalE信号序列或MalEss]；
[0139] (e)SEQ ID NO:36[FhuD信号序列或FhuDss]；
[0140] (f)SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34；
[0141] (g)LamB ss、MalE ss、MglB ss、OmpA ss、PelB ss、PhoA ss、DsbA ss、SfmC ss、TolB ss、TorT ss、FhuD ss、PelB ss、YcdO ss、MdoD ss、Tor Ass或YcdO ss；或者
[0142] (h)由与SEQ ID NO:7或者SEQ ID NO:19、44、38、50、56、67、75、81、87、93或99具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸编码的肽；
[0143] 并且任选地包含或具有周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽操作性连接在权利要求13或权利要求14所述多肽的氨基端，并且任选地氨基端甲硫氨酸放置在包含或具有周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有
PTS或PSS活性的多肽或肽的氨基端。在一些替代实施方案中，真核信号序列是酵母或真菌信号序列。
PTS或PSS活性的多肽或肽的氨基端。在一些替代实施方案中，真核信号序列是酵母或真菌信号序列。
[0144] 在一些替代实施方案中，对于本文中提供的多肽：所述多肽还包含：异源氨基酸序列，并且任选地所述异源氨基酸序列包含或用作标签或表位，并且任选地所述异源氨基酸序列包含或用作用于靶向内质网(ER)或内膜的N端和/或C端延伸，或者用作周质靶向序列或周质信号序列或者具有PTS或PSS活性。
[0145] 在一些替代实施方案中，对于本文中提供的多肽：(a)保守氨基酸替换包括将一个脂族氨基酸用另一个脂族氨基酸替代；用苏氨酸替代丝氨酸，或反之亦然；将一个酸性残基用另一个酸性残基替代；将一个携带酰胺基团的残基用另一个携带酰胺基团的残基替代；使碱性残基与另一碱性残基交换；或将一个芳族残基用另一个芳族残基替代，或者其组合；
或者(b)(a)的分离的、合成的或重组多肽，其中脂族残基包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成等同物，或者所述酸性残基包含天冬氨酸、谷氨酸或其合成等同物，或者包含酰胺基团的残基包含天冬氨酸、谷氨酸或其合成等同物，或者所述碱性残基包含赖氨酸、精氨酸或其合成等同物，或者芳族残基包含苯丙氨酸、酪氨酸或其合成等同物。
或者(b)(a)的分离的、合成的或重组多肽，其中脂族残基包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成等同物，或者所述酸性残基包含天冬氨酸、谷氨酸或其合成等同物，或者包含酰胺基团的残基包含天冬氨酸、谷氨酸或其合成等同物，或者所述碱性残基包含赖氨酸、精氨酸或其合成等同物，或者芳族残基包含苯丙氨酸、酪氨酸或其合成等同物。
[0146] 在一些替代实施方案中，提供了包含本文提供的多肽的组合物，其中任选地所述组合物还包含所述多肽的底物，并且任选地所述底物包含烯醇、巴豆醇、丁-3-烯-2-醇或丁-3-烯-1-醇、对应于通式CnH2nO其中3
[0147] 在一些替代实施方案中，本文中提供的多肽还包含表位或标签，并且任选地所述标签是亲和标签。
[0148] 在一些替代实施方案中，提供了分离的、合成的或重组抗体：a)其与权利要求13至22中任一项所述的多肽特异性结合；(b)(a)的所述抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0149] 在一些实施方案中，提供了包含与本文中提供的多肽特异性结合的抗体的杂交瘤，或产生本文中提供的抗体的杂交瘤。
[0150] 在一些替代实施方案中，提供了分离或鉴定具有酶活性的多肽的方法，其包括以下步骤：
[0151] (a)提供本文中提供的抗体；
[0152] (b)提供包含一种或多种多肽的样品；以及
[0153] (c)使步骤(b)的样品与步骤(a)的抗体在其中所述抗体可与所述多肽特异性结合的条件下接触，
[0154] 其中任选地所述酶活性包含芳樟醇脱水酶-异构酶(LinD)活性、乙烯基异构酶活性或脱水酶活性，
[0155] 从而分离或鉴定具有所述酶活性的多肽。
[0156] 在一些替代实施方案中，提供了产生重组多肽的方法，其包括：
[0157] (i)(a)提供与启动子操作性连接的核酸，其中所述核酸包含本文中提供的核酸；以及(b)在允许表达多肽的条件下表达(a)的所述核酸，从而产生重组多肽；或者
[0158] (ii)(i)的所述方法，其还包括用步骤(i)(a)的核酸转化宿主细胞，之后表达步骤(a)的核酸，从而在转化细胞中产生重组多肽。
[0159] 在一些替代实施方案中，提供了用于由对应于或包含通式CnH2nO其中3
[0160] (a)在包含碳源和本文中提供多肽的底物的合适培养基中培养本文中提供的非天然的经改造转化或转导细胞或者本文中提供的植物细胞，以及在适于产生包含所述化合物的酶产物的条件下培养所述细胞；或者
[0161] (b)在其中产生本文中提供的多肽的条件下表达本文中提供的核酸，以及在适于产生包含所述化合物的酶产物的条件下使所述多肽与本文中提供的多肽的底物接触，
[0162] 其中任选地所述方法还包括回收产生的对应于通式CnH2n-2其中3
[0164] 和/或任选地对应于通式CnH2nO其中3
[0165] 和/或任选地对应于通式CnH2nO其中3
[0166] 任选地所述条件包括核酸的体外表达。
[0167] 在一些替代实施方案中，提供了酶促催化巴豆醇转化为3-丁烯-2-醇的方法，其包括在其中巴豆醇被酶促转化为3-丁烯-2-醇的条件下使本文中提供的多肽与所述巴豆醇接触。
[0168] 在一些替代实施方案中，提供了酶促催化3-丁烯-2-醇转化为丁二烯的方法，其包括在其中3-丁烯-2-醇被酶促转化为丁二烯的条件下使本文中提供的多肽与3-丁烯-2-醇接触。
[0169] 在一些替代实施方案中，提供了酶促催化巴豆醇转化为丁二烯的方法，其包括在其中巴豆醇被酶促转化为丁二烯的条件下使本文中提供的多肽与巴豆醇接触。
[0170] 在一些替代实施方案中，提供了一种具有细菌周质靶向活性的肽或多肽，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100所示的序列；并且具有至少一个保守氨基酸替换或具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸替换。
[0171] 在一些替代实施方案中，提供分离的、合成的或重组多肽，其：
[0172] (a)与(i)SEQ ID NO:2、(ii)SEQ ID NO:6或(iii)SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者
[0173] (b)包含(a)的酶活性片段，并且其还包含以下或由以下组成：周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽；或者真核信号序列。所述多肽还可包含N端甲硫氨酸。所述多肽还可包含周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)，其可以是：翻译后SecB靶向途径PTS或PSS；共翻译信号识别颗粒(SRP)-靶向途径PTS或PSS；或者双精氨酸转位(TAT)Sec独立系统PTS或PSS。在一些替代实施方案中，所述周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)包含以下或由以下组成：
[0174] (a)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
[0175] (b)SEQ ID NO 20、39、45、51、57、68、76、82、88、94或100；
[0176] (c)SEQ ID NO:25[Lam B信号序列或LamBss]，并且任选地编码的多肽包含SEQ ID NO:24；
[0177] (d)SEQ ID NO:26[MalE信号序列或MalEss]；
[0178] (e)SEQ ID NO:36[FhuD信号序列或FhuDss]；
[0179] (f)SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34；
[0180] (g)LamB ss、MalE ss、MglB ss、OmpA ss、PelB ss、PhoA ss、DsbAss、SfmC ss、TolB ss、TorT ss、FhuD ss、PelB ss、YcdO ss、MdoD ss、Tor Ass或YcdO ss；或者
[0181] (h)由与SEQ ID NO:7或者SEQ ID NO:19、44、38、50、56、67、75、81、87、93或99具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸编码的肽；
[0182] 并且任选地包含或具有周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(ss)或者具有PTS活性的多肽或肽操作性连接在由权利要求34所述多肽的氨基端，并且任选地氨基端甲硫氨酸放置在包含或具有周质靶向序列(PTS)、周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽的氨基端。在一些替代实方案中，真核信号序列是酵母或真菌信号序列。
[0183] 在一些替代实施方案中，提供了使用由本文中提供的核酸编码的多肽、或者本文中提供的多肽、或者本文中提供的转化或转导细胞、或者本文中提供的植物细胞用于将对应于通式CnH2nO的化合物转化为CnH2n-2+H2O的用途或方法，其中3
[0184] (a)对应于通式CnH2nO其中3
[0185] (b)对应于通式CnH2nO其中3
[0186] 在一些替代实施方案中，CnH2n-2其中3
[0187] 在一些替代实施方案中，提供了由对应于或包含通式CnH2nO其中3
[0188] (a)在包含碳源和本文中提供的多肽的底物的合适培养基中培养本文中提供的转化或转导细胞或者本文中提供的植物细胞，以及在适于产生(或催化产生)包含所述化合物的酶产物的条件下培养所述细胞；或者
[0189] (b)在其中产生本文中提供的多肽的条件下表达本文中提供的核酸，或者由本文中提供的表达构建体或载体表达核酸，以及在适于产生包含所述化合物的酶产物的条件下使所述多肽与所述多肽的底物接触，
[0190] 其中任选地(a)或(b)的底物包含：变成CnH2n-2+H2O的对应于通式CnH2nO的化合物，其中3
[0191] 其中任选地所述方法还包括回收或分离产生的化合物，所述化合物任选地包含或对应于通式CnH2n-2其中3
[0192] 和/或任选地产生的化合物包含或是：3-丁烯-2-醇、二甲基-丁二烯、丁二烯(BD)或1,3-丁二烯；
[0193] 和/或任选地对应于通式CnH2nO其中3
[0194] 和/或任选地对应于通式CnH2nO其中3CnH2n-2其中3
[0195] 任选地所述条件包括核酸的体外表达。
[0196] 在一些替代实施方案中，所述方法还包括以下步骤的一个、数个或全部步骤：
[0197] (a)获得包含共轭二烯烃如丁二烯、挥发性杂质、生物副产物杂质和水蒸气的发酵罐尾气；
[0198] (b)在多级压缩系统中压缩发酵罐尾气以产生压缩流；
[0199] (c)将所述压缩流进料到第一蒸馏区以去除生物副产物杂质和水蒸气，所述第一蒸馏区具有上部回流段、中间蒸馏段和下部再沸器段；
[0200] (d)使从生物副产物杂质和水去除蒸馏区产生的塔顶蒸气流与吸附剂接触以产生经干燥的塔顶流；
[0201] (e)将经干燥的塔顶流进料到第二蒸馏区以通过顶部去除挥发性杂质，其中所述第二蒸馏区具有上部回流段、中间蒸馏段和下部再沸器段；以及
[0202] (f)在用于去除挥发性杂质的蒸馏区的底部收集得到的经纯化液体共轭二烯烃如丁二烯。
[0203] 在一些替代实施方案中，提供产生聚合物、树脂或制品的方法，其包括使二烯烃，任选地丁二烯反应以产生聚合物或树脂，以及还任选地使所述聚合物或树脂形成为所述制品，其中所述二烯烃，任选地丁二烯通过本文中提供的方法、或者本文中提供的用途产生，或者任选地使用本文中提供的组合物产生。在一些替代实施方案中，所述聚合物、树脂或制品包含或是含丁二烯聚合物、聚丁二烯、己二腈、共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、丙烯腈-丁二烯橡胶(ABR)、苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)共聚物、苯乙烯-1,3-丁二烯胶乳，或者所述制品是轮胎、管、车辆部件、船部件、食品容器或地毯背衬。
[0204] 在一些替代实施方案中，提供了示例性SEQ ID NO:12的变化形式，其基于SEQ ID NO:2中的特定对应氨基酸残基差异；其中在一些替代实施方案中，来自SEQ ID NO:2(全长多肽野生解芳烃卡斯特兰尼氏菌65PhenlinD)的一个或更多个氨基酸被导入示例性SEQ ID NO:12的对应位置，如以下比较表中所示。在一些替代实施方案中，位置变化可改变SEQ IDNO:12或其本文中提供的变体用于巴豆醇向丁二烯或丁-3-烯-2-醇向丁二烯的催化转化的活性，如下文所述。
[0205]
[0206]
[0207]
[0208] 在一些替代实施方案中，本发明提供了基本上如上文所述或本文中参照任一个实例描述的根据本发明任一实施方案的组合物或方法。
[0210] 本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的而在此通过引用明确地并入。
[0211] 本文中描述的说明书的实施方案并不旨在是详尽性的或将本公开内局限于在以下附图或详细描述中公开的精确形式。相反，选择和描述实施方案是为了使本领域技术人员能够理解和了解说明书的原理和实践。
附图说明
[0212] 本文中所示的附图是对本发明实施方案进行举例说明，并不意味着限制权利要求所涵盖的本发明范围。
[0213] 图1示意性地示出了用于产生巴豆醇和丁二烯的替代示例性代谢途径，如下面详细讨论的。
[0214] 图2示出了可用于实施本发明的周质靶向序列(PTS)，如下所述；也如Steiner等(2006)Nature Biotechnology 24:823-831所述。
[0215] 图3A和图3B示出了与来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌65Phen的成熟LinD(SEQ ID NO:6)融合的异源信号肽的作用。来自于解芳烃卡斯特兰尼氏菌65Phen的野生型(wild-type，WT)LinD(SEQ ID NO:2)的WT PTS(SEQ ID NO:8)如所示被来自大肠杆菌周质蛋白的PTS替
代，在大肠杆菌中表达并如下所述测定丁二烯活性。
代，在大肠杆菌中表达并如下所述测定丁二烯活性。
[0216] 图4示出了序列比对：SEQ ID NO:2(野生型)与SEQ ID NO:12(野生型)；差异突出显示。
[0217] 图5示出了序列比对：比对SEQ ID NO:12(野生型)与SEQ ID NO:22(具有11个替换的变体)。SEQ ID NO:12中下替换：V19A、Y71F、G74S、G133M、R171K、I182L、V196F、D200N、F325S、G365S、L368F。SEQ ID NO:12对巴豆醇不具有可检测的活性。
[0218] 图6示意性地示出了用于产生巴豆醇(本文提供的示例性酶活性多肽的底物)的替代途径；并且还示出了用于由乙酰CoA、戊烯二酰CoA、戊二酰CoA、3-氨基丁酰CoA或4-羟基丁酰CoA通过巴豆醇产生丁二烯的示例性途径(其中在一些替代实施方案中，这些化合物中的一种、几种或全部可以添加到本文提供的细胞、细胞培养系统或生物反应器中)；还示出了用于将鉴定的底物转化为产物的示例性酶，并且所述酶包括：A.乙酰CoA:乙酰CoA酰基转移酶；B.乙酰乙酰CoA还原酶；C.3-羟基丁酰CoA脱水酶；D.巴豆酰CoA还原酶(醛形成)；E.巴豆醛还原酶(醇形成)；I.巴豆酰CoA水解酶、合成酶、转移酶；J.巴豆酸还原酶；K.巴豆酰CoA还原酶(醇形成)；L.戊烯二酰CoA脱羧酶；M.戊二酰CoA脱氢酶；N.3-氨基丁酰CoA脱氨酶；
O.4-羟基丁酰CoA脱水酶；以及VD)巴豆醇脱水酶(CAD)(其中在一些替代实施方案中，A至O中的一种、数种或全有酶被表达，例如在本文提供的经改造细胞中重组表达)。巴豆醇脱水酶(CAD)是本发明中识别巴豆醇作为转化为丁二烯的底物的酶的替代名称。
O.4-羟基丁酰CoA脱水酶；以及VD)巴豆醇脱水酶(CAD)(其中在一些替代实施方案中，A至O中的一种、数种或全有酶被表达，例如在本文提供的经改造细胞中重组表达)。巴豆醇脱水酶(CAD)是本发明中识别巴豆醇作为转化为丁二烯的底物的酶的替代名称。
[0219] 图7示出了用于例如如本文所述在高通量筛选(high through-put screening，HTS)中检测丁二烯的示例性反应。
[0220] 图8A、8B和8C示出了用于例如如本文所述检测丁二烯的示例性反应。
[0221] 图9示出了例如如本文所述用于检测丁二烯的示例性反应。
[0222] 图10示出了用于例如如本文所述检测丁二烯的示例性酶途径。示出了用于将丁二烯转化为3-丁烯-1,2-二醇或1-羟基-2-丁酮的示例性酶反应。酶是：A.丁二烯单加氧酶，B.丁二烯一氧化物水解酶，C.3-丁烯-1,2-二醇脱氢酶，D.丁二烯一氧化物单加氧酶。
[0223] 图11示出了已知野生型蛋白质(2753)和本文中首先鉴定的多肽(9819)的全长氨基酸序列的比对以显示对应的位置；信号肽加下划线。
[0224] 图12示出了已知野生型蛋白质(2753)和本文中首先鉴定的多肽(9873)的全长氨基酸序列的比对以显示对应的位置；信号肽加下划线。
[0225] 图13示出了已知野生型蛋白质(2753)和本文中首先鉴定的多肽(9874)的全长氨基酸序列的比对以显示对应的位置；信号肽加下划线。
[0226] 图14示出了已知野生型蛋白质(2753)和本文中首先鉴定的多肽(9875)的全长氨基酸序列的比对以显示对应的位置；信号肽加下划线。
[0227] 图15示出了已知野生型蛋白质(2753)和本文中首先鉴定的多肽(9894)的全长氨基酸序列的比对以显示对应的位置；信号肽加下划线。
[0228] 图16示出了已知野生型蛋白质(2753)和本文中首先鉴定的多肽(9895)的全长氨基酸序列的比对以显示对应的位置；信号肽加下划线。
[0229] 图17提供了本发明的示例性酶的酶活性。“CrOH”是巴豆醇；“MVC”是甲基乙烯基甲醇或3-丁烯-2-醇；“Prenol”是异戊烯醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇。
[0230] 图18A和18B提供了本文提供的新多肽与已知野生型酶之间以及本文提供的新多肽之间的配对同一性百分比(“ID％”)。图18A提供了全长(未经加工)蛋白质的氨基酸序列配对同一性百分比，18B为“成熟”或经加工蛋白质氨基酸序列配对同一性百分比。
[0231] 除非另外说明，否则各附图中相似的附图标记表示相同的元件。
[0232] 现在将详细参考本发明的各个示例性实施方案，其实例在附图中示出。提供以下详细描述以使读者更好地理解本发明各个方面和实施方案的某些细节，而不应被解释为对本发明范围的限制。
具体实施方式
[0233] 在一些替代实施方案中，提供了非天然或经遗传改造的乙烯基异构酶-脱水酶，包括烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和巴豆醇脱水酶。在一些替代实施方案中，提供了具有包含例如乙烯基异构酶-脱水酶、烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和/或巴豆醇脱水酶活性或其组合的活性的多肽。在一些替代实施方案中，提供了可以催化巴豆醇异构化为甲基乙烯基甲醇并且任选地还能够使甲基乙烯基甲醇脱水成丁二烯(例如1,3-丁二烯)的非天然或经遗传改造的酶。在一些替代实施方案中，提供了能够催化甲基乙烯基甲醇脱水成丁二烯(例如1,3-丁二烯)的非天然或经遗传改造酶。
[0234] 在一些替代实施方案中，提供了具有信号序列(SS)活性、周质靶向序列(PTS)活性和/或周质信号序列(PSS)活性的非天然或经遗传改造肽。在一个实施方案中，具有SS、PTS或PSS活性的肽与本文提供的多肽或任何多肽(例如酶)操作性连接用于多肽在细菌周质或周质间隙中的适当折叠和/或插入、或指导多肽进入周质、或使多肽穿过细菌内膜移位到周质中。
[0235] 在一些替代实施方案中，还提供了编码如本文所述的多肽(例如酶)或肽(例如具有SS、PTS或PSS活性)的非天然或经遗传改造核酸。在一些替代实施方案中，提供了包含或其中已包含如本文所述的核酸的表达系统或载体，例如重组载体或病毒、克隆载体等。
[0236] 在一些替代实施方案中，还提供了非天然或经遗传改造的细胞，例如转染或转导细胞，其包含或其中已包含如本文所述的核酸和/或如本文提供的表达系统或载体，例如重组载体或病毒、克隆载体等。在一些替代实施方案中，细胞是细菌、古细菌(Archaeal)、酵母、真菌、真核生物或植物细胞。
[0237] 在一些替代实施方案中，提供了非天然或经遗传改造的非人生物或植物，其包含或其中已包含如本文所述的核酸和/或如本文提供的表达系统或载体，例如重组载体或病毒、克隆载体等。
[0238] 在一些替代实施方案中，本文提供的非天然或经遗传改造细胞或生物还包含代谢途径中的另外的酶以产生期望的产物，例如丁二烯或1,3-丁二烯。在一些替代实施方案中，所述另外的酶可以参与产生本文提供的酶的底物(例如巴豆醇、丁-3-烯-2-醇或丁-3-烯-1-醇、2-甲基-丁-3-烯-1-醇、2-甲基-丁-2-烯-1-醇、3-甲基-丁-3-烯-2-醇或2-甲基-丁-
3-烯-2-醇)，或者另外的酶可以参与将本文提供的酶的产物修饰成另外的产物。
3-烯-2-醇)，或者另外的酶可以参与将本文提供的酶的产物修饰成另外的产物。
[0239] 在一些替代实施方案中，提供了用于产生期望产物(例如甲基乙烯基甲醇和/或丁二烯)的细胞培养系统，其包括生物反应器，所述生物反应器包含如本文提供的非天然或经遗传改造细胞或生物。
[0240] LDRV蛋白序列
[0241] 在一些替代实施方案中，提供了与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或
101组成的核酸序列具有至少50％至99％或100％序列同一性的核酸属，条件是该属中的核酸均不编码所谓的“LDRV”蛋白。在一些替代实施方案中，提供了与由SEQ ID NO:12、22、37、
43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、
90、96或102组成的核酸序列具有至少50％至99％或100％序列同一性的多肽属，条件是该属中的多肽均不是所谓的“LDRV”蛋白质。
101组成的核酸序列具有至少50％至99％或100％序列同一性的核酸属，条件是该属中的核酸均不编码所谓的“LDRV”蛋白。在一些替代实施方案中，提供了与由SEQ ID NO:12、22、37、
43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、
90、96或102组成的核酸序列具有至少50％至99％或100％序列同一性的多肽属，条件是该属中的多肽均不是所谓的“LDRV”蛋白质。
[0242] 排除或不包括：“LDRV”蛋白包含野生型芳樟醇脱水酶SEQ ID NO:2的特定已报道变体，例如如公开为WO2014184345A1的国际专利申请中明确列出的，包括下文总结的那些序列。其中描述的每个特定变体都全体地和独立地称为“LDRV”蛋白(或序列)。
[0243] 例如，排除或不包括：LDRV蛋白包括在WO2014184345A1的第17至45页明确列出的每种变体，例如第17页变体的“V195F A18I F20L G73S G132M R170K I181L D199N W269A L367F”至第45页的变体“V195F G73S Y70F E77I G132A”，并且还包括(WO2014184345A1的)第82页的序列，例如变体“V195F T84I G132R”至第99页，例如变体“V195F G132A W269A”。
[0244] 排除或不包括：LDRV蛋白还包括WO2014184345A1的图2至图28中明确列出的每种变体。LDRV蛋白还包括其中表格中明确列出的每个变体，这包括从WO2014184345A1中摘录的下表中的那些变体。示例性变体包括“V195F G73S R170K I181L F324S”和“V195F G132A G73S E77I”，其分别是野生型芳樟醇脱水酶SEQ ID NO:2序列中5个和4个氨基酸替换的变体。
[0245] 由于野生型芳樟醇脱水酶SEQ ID NO:2具有确保转运到周质空间中的信号肽(在周质空间中移除信号肽)，因此排除或不包括：LDRV蛋白还包括WO2014184345A1中明确列出的序列的每个成熟蛋白质序列。
[0246] 排除或不包括：LDRV蛋白还包括国际专利公开WO2014033129A1中描述的变体，其中信号肽通过在起始甲硫氨酸之后插入his标签(6个组氨酸)而被破坏。
[0247] 还排除或不包括LDRV核酸序列，其涵盖编码排除或不包括的LDRV蛋白的那些核酸序列并且包括其简并核酸序列变体。
[0248] 例如，从WO2014184345A1中摘录的下表指示作为本文提供的蛋白质和核酸而被排除或不包括的特定替换变体。表达的酶活性是在WO2014184345A1中报道的那些，使用其中报道的特定测定和底物。
[0249] 还排除或不包括WO2014184345A1的表1中列出的序列，其列出了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的单氨基酸变化变体。例如，下表中的V195F意指其中在第195位的V被替换成F的特定序列的变体。
[0250]
[0251]
[0252] 还排除或不包括WO2014184345A1的表2中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的两个氨基酸变化的变体。例如，下表中的G132R V195F意指特定序列的其中第
132位的G被替换成R且第195位的V被替换成F的变体。
132位的G被替换成R且第195位的V被替换成F的变体。
[0253]
[0254]
[0255] 还排除或不包括WO2014184345A1的表3中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，V195F意指WO2014184345A1的野生型序列1中第195位的V被替换成F。
[0256]
[0257]
[0258] 还排除或不包括WO2014184345A1的表4中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，下表中的G132R V195F意指该特定序列中其中第132位的G被替换成R且第195位的V被替换成F的变体。
[0259]
[0260]
[0261] 还排除或不包括WO2014184345A1的表5中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，下表中的G132R V195F意指该特定序列中其中第132位的G被替换成R且第195位的V被替换成F的变体。
[0262]
[0263]
[0264]
[0265]
[0266]
[0267]
[0268] 还排除或不包括WO2014184345A1的表10中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，在野生型序列的第18位，A被替换成I或V，产生两种变体。
[0269]
[0270] 还排除或不包括WO2014184345A1的表13中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，下表中的G132R V195F意指该特定序列中其中第132位的G被替换成R且第195位的V被替换成F的变体。
[0271]
[0272]
[0273] 还排除或不包括WO2014184345A1的表14中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，下表中的G132R V195F意指该特定序列中其中第132位的G被替换成R且第195位的V被替换成F的变体。
[0274]
[0275]
[0276]
[0277] 还排除或不包括WO2014184345A1的表16中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，下表中的G132R V195F意指该特定序列中其中第132位的G被替换成R且第195位的V被替换成F的变体。
[0278]
[0279] 还排除或不包括WO2014184345A1的表17中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，下表中的G132A V195F意指该特定序列中其中第132位的G被替换成A且第195位的V被替换成F的变体。
[0280]
[0281] 还排除或不包括WO2014184345A1的表19中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，下表中的F20T意指该特定序列中其中第20位的F被替换成T的变体。
[0282]
[0283]
[0284]
[0285] 还排除或不包括WO2014184345A1的表20中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，下表中的S75V意指该特定序列中其中第75位的S被替换成V的变体。
[0286]
[0287]
[0288] 还排除或不包括WO2014184345A1的表21中列出的序列，其列举了来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌的野生型芳樟醇脱水酶(在WO2014184345A1中称为序列1而在本文中表示为SEQ ID NO:2)的氨基酸变化变体。例如，下表中的A18I意指该特定序列中其中第18位的A被替换成I的变体。
[0289]
[0290] “cdLD-Botes”蛋白序列
[0291] 在一些替代实施方案中，提供了与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或
101组成的核酸序列具有至少50％至99％或100％序列同一性的核酸属，条件是该属中核酸均不编码所谓的“cdLD-Botes”蛋白。在一些替代实施方案中，提供了与由SEQ ID NO:12、
22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、
78、84、90、96或102组成的核酸序列具有至少50％至99％或100％序列同一性的多肽属，条件是该属中的多肽均不是所谓的“cdLD-Botes”蛋白。
101组成的核酸序列具有至少50％至99％或100％序列同一性的核酸属，条件是该属中核酸均不编码所谓的“cdLD-Botes”蛋白。在一些替代实施方案中，提供了与由SEQ ID NO:12、
22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、
78、84、90、96或102组成的核酸序列具有至少50％至99％或100％序列同一性的多肽属，条件是该属中的多肽均不是所谓的“cdLD-Botes”蛋白。
[0292] 排除或不包括：“cdLD-Botes”蛋白包括芳樟醇脱水酶SEQ ID NO:103的特定已报道变体，例如USPN 9,220,742中明确列出的，包括下文概述的那些序列。其中描述的每种特定变体都集体地和独立地称为“cdLD-Botes”蛋白(或序列)。
[0293] 在一些替代实施方案中，排除或不包括的序列包括涵盖编码“cdLD-Botes”蛋白的核酸序列的所谓“cdLD-Botes”核酸序列，并且包括其简并核酸序列变体。
[0294] 不包括或排除：“cdLD-Botes”蛋白包含含有与SEQ ID NO:103具有至少90％，或90％至100％氨基酸序列同源性的氨基酸序列的多肽(或编码其的多核苷酸)，其中所述氨基酸序列在SEQ ID NO:103的下列X位置包含至少1、2、3、4或5个突变(其中每个R与SEQ ID NO:103中对应的氨基酸相同)：
[0295] R1-95X96R97-98X99R100-122X123R124-185X187R188-203X204R205-211X212R213-272X273X274X275R276-323X324R325-327X328R329-R359X360R361-365X366R367-381X382R383-398，
[0296] 其中：
[0297] X96被突变成选自L和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0298] X99被突变成选自L和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0299] X123被突变成选自M和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0300] X187被突变成选自M和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0301] X204被突变成选自I和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0302] X212被突变成选自F、Y和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0303] X273被突变成选自C和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0304] X274被突变成选自F和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0305] X275被突变成选自I和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0306] X324被突变成选自L、E和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0307] X328被突变成选自V和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0308] X360被突变成选自Y和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0309] X356被突变成选自V、C、G和等同氨基酸的不同氨基酸；
[0310] X382被突变成选自W和等同氨基酸的不同氨基酸。
[0311] 排除或不包括：“cdLD-Botes”蛋白包含含有SEQ ID NO:103的以下突变(变化)组合或(仅具有)由以下突变(变化)组合组成的多肽(或编码其的多核苷酸)：
[0312] V204I、M274F、V275I；V123I、M274F、V275I；V123I、V204I、V275I；V123I、V204I、M274F；M274F、V275I；M274F、A324L；M274F、R360Y；M274F、V275I、A324L；M274F、V275I、F382W；M274F、A324L、F382W；M274F、V275I、R360Y；F382W；V275I、A324L；V275I、F382W；V275I、A324L、R360Y；V275I、A324、F382W；R360Y、F382W；M274F；V275I；A324L；R360Y；F382W；
V123I和/或V204I，及其任意组合；
V123I和/或V204I，及其任意组合；
[0313] V123I/V204I/M274F；M274F/V275I/F382W；V275I/A324L；V275I；V123I；和V204I；
[0314] A324L、M274F.S366V、V275I和/或F382W，及其任意组合；
[0315] V123I、V204I、M274F、V275I和F382W；
[0316] V275I和F382W；
[0317] A324L、V275I、V123I和V204I；
[0318] A324L和S366G；
[0319] M274F和F96L；
[0320] M274F和Y99L；
[0321] F382W和L212Y；
[0322] F382W和A273C；
[0323] F382W和L328V；
[0324] F382W、L328V和1187M；
[0325] V204I、M274F和V275I；
[0326] V123I、M274F和V275I；
[0327] V123I、V204I和V275I；V123I、V204I和M274F；
[0328] M274F、V275I和A324L；
[0329] M274F、V275I；
[0330] M274F、V275I、R360Y和F382W；
[0331] V275I和A324L；
[0332] R360Y和F382W。
[0333] 另外地，“cdLD-Botes”蛋白(及编码其的核酸)还包括，即还排除或不包括的“cdLD-Botes”蛋白(及编码其的核酸)还包括：包含SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:10或由其组成。
[0334] 还排除或不包括的“cdLD-Botes”蛋白(及编码其的核酸)具有或不具有：一个或更多个N端甲硫氨酸、周质标签、C端标签(例如C端His-标签)或其任意组合。
[0335] 序列比对和序列同一性生成的计算方法
[0336] 在一些替代实施方案中，可以使用序列比对和序列同一性生成的任何计算方法，例如包括全局比对和局部比对。全局比对使用全局优化来强制比对跨越所有查询序列的整个长度。相比之下，局部比对确定通常整体差异很大的长序列内的相似性区域。为了了解靶序列与模板的同一性，可以使用全局比对。任选地，与模板序列具有很低同一性或不具有同一性的靶序列的氨基末端和/或羧基末端序列可被排除用于全局比对和同一性评分生成。
[0337] 在一些替代实施方案中，可以使用本领域技术人员公知的任何算法(例如Align、BLAST、Clustal W等)来比较和确定原始序列相似性或同一性，并且还确定可以分配权重或评分的序列中空位的存在或显著性。这样的算法也是本领域已知的，并且同样适用于确定核苷酸序列相似性或同一性。基于用于计算统计学相似性的公知方法或者在随机多肽中发现相似匹配的机会以及所确定匹配的显著性来计算用于确定相关性的足够相似性的参数。如果需要的话，两个或更多个序列的计算机比较也可以由本领域技术人员在视觉上进行优化。预期相关基因产物或蛋白质具有高度相似性，例如45％至100％的序列同一性。如果扫描了足够大小的数据库(约5％)，那么不相关的蛋白质可具有与偶然发生所预期的基本上相同的同一性。
[0338] 例如，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman,S.&Wunsch,C)进行比对。或者，可以使用应用于通过BALIG工具实施的两种蛋白质的氨基酸序列的相似性检索的一般方法(J.Mol.Biol,1970,48,443-453)。可以使用默认参数进行比对并且可以使用BLOSUM62作为评分矩阵。
[0339] 在一些替代实施方案中，使用基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)算法来确定多肽序列之间或模板序列中的氨基酸基序与靶序列之间的序列同一性。在一些替代实施方案中，使用BLAST来鉴定或了解模板和靶蛋白之间的较短段氨基酸(例如序列基序)的同一性。在一些替代实施方案中，BLAST使用近似于Smith-
Waterman算法的启发式方法通过定位两个序列之间的短匹配寻找相似的序列。(BLAST)算法可以鉴定在特定阈值以上与查询序列相似的文库序列。用于使用BLAST算法确定两个或更多个序列的相关性的示例性参数例如可以如下所述。在一些替代实施方案中，可以使用BLASTP 2.0.8版(1999年1月5日)和以下参数进行氨基酸序列比对：矩阵：0BLOSUM62；空位开放：11；空位延伸：1；x_dropoff:50：预期：10.0；字长：3；过滤器：开。可以使用BLASTN
2.0.6版(1998年9月16日)和以下参数进行核酸序列比对：匹配：1；错误匹配：-2；空位开放：
5；空位延伸：2；x_dropoff:50；预期：10.0；字长：11；过滤器：关。本领域的技术人员将知晓可以对上述参数进行哪些修改例如提高或降低比较的严格性，并确定两个或更多个序列的相关性。
Waterman算法的启发式方法通过定位两个序列之间的短匹配寻找相似的序列。(BLAST)算法可以鉴定在特定阈值以上与查询序列相似的文库序列。用于使用BLAST算法确定两个或更多个序列的相关性的示例性参数例如可以如下所述。在一些替代实施方案中，可以使用BLASTP 2.0.8版(1999年1月5日)和以下参数进行氨基酸序列比对：矩阵：0BLOSUM62；空位开放：11；空位延伸：1；x_dropoff:50：预期：10.0；字长：3；过滤器：开。可以使用BLASTN
2.0.6版(1998年9月16日)和以下参数进行核酸序列比对：匹配：1；错误匹配：-2；空位开放：
5；空位延伸：2；x_dropoff:50；预期：10.0；字长：11；过滤器：关。本领域的技术人员将知晓可以对上述参数进行哪些修改例如提高或降低比较的严格性，并确定两个或更多个序列的相关性。
[0340] 表达系统、经改造细胞
[0341] 在一些替代实施方案中，提供了表达构建体、载剂或载体以在其中包括或包含如本文所例示的一种或更多种核酸，所述核酸任选地与在宿主生物体中起作用的表达控制序列如启动子连接。在一些替代实施方案中，适于在所提供的微生物宿主生物体中使用的表达构建体、载剂或载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载体或重组病毒、附加体和人工染色体，包括有效用于稳定整合到宿主染色体中的载体和选择序列或标记。在一些替代实施方案中，表达载体还包括一个或更多个选择标记基因和合适的表达控制序列。还可以包括以下选择标记基因，例如其提供针对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷或供应不在培养基中的关键营养物。表达控制序列可以包括本领域公知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两种或更多种外源编码核酸共表达时，两种核酸都可以插入例如单个表达载体或分开的表达载体中。对于单载体表达，编码核酸可以可操作地与一个共同表达控制序列连接，或者与不同表达控制序列连接，例如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。
[0342] 在一些替代实施方案中，本文提供的核酸向细胞中的转化或转导(包括参与代谢或合成途径的外源核酸序列的转化或转导)可以使用本领域公知的方法来确认。这样的方法包括例如核酸分析，例如mRNA的Northern印迹或聚合酶链反应(PCR)扩增、或者用于基因产物表达的免疫印迹、或者测试所导入核酸序列的表达或其对应基因产物的其他合适分析方法。本领域技术人员理解的是，外源核酸以足以产生期望产物的量表达，并且应进一步理解，可使用本领域公知和本文公开的方法优化表达水平以获得足够的表达。
[0343] 在一些替代实施方案中，术语“外源的”旨在意指所提及的分子(例如本文提供的多肽或核酸)或所提及的(例如酶)活性被导入到宿主微生物生物体中。可以例如附加地或如下导入分子：将核酸(例如本文提供的多肽或核酸)导入宿主遗传物质中，例如通过整合到宿主染色体中或作为非染色体遗传物质，例如质粒。在一些替代实施方案中，术语“外源的”用于指可表达形式的编码核酸在细胞(例如微生物生物体)中的表达。当涉及生物合成活性使用时，术语“外源的”可以指被导入到宿主参考生物体中的活性。来源可以是例如同源或异源(例如本文提供的多肽或核酸)编码核酸，其在导入宿主微生物生物体中后表达所提及的活性。在一些替代实施方案中，术语“内源的”是指存在于宿主中的参考分子或活性。在一些替代实施方案中，该术语在用于指编码核酸的表达时可以指微生物生物体中所包含编码核酸的表达。在一些替代实施方案中，术语“异源的”可以指来源于除所提及物种之外的来源的分子或活性，而“同源的”是指来源于宿主微生物生物体的分子或活性。在一些替代实施方案中，编码核酸的外源表达可以利用异源或同源编码核酸中任一种或二者。
[0344] 在一些替代实施方案中，可以将一种以上异源的外源核酸(例如本文提供的一种或更多种核酸)导入宿主微生物生物中的单独核酸分子上、多顺反子核酸分子上、或其组合。在一些替代实施方案中，可以将微生物生物体改造成表达两种或更多种编码期望途径酶或蛋白质的外源核酸。在将两种编码期望活性的外源核酸(例如，其中至少一种是如本文所提供的核酸)导入宿主微生物生物体中的情况下，在一些替代实施方案中，两种外源核酸可作为单个核酸例如在单个质粒上导入，在分开的质粒上导入，或者可以整合到宿主染色体中的单个位点或多个位点。在一些替代实施方案中，两种以上外源核酸(例如，其中至少一种是本文提供的核酸)可以以任何期望的组合导入宿主生物体中，例如在单个质粒上、在分开的质粒上、可以整合到宿主生物体中的单个位点或多个位点。
[0345] 在一些替代实施方案中，可以使用本领域公知的技术将本文提供的核酸稳定或瞬时导入宿主细胞中，所述技术包括但不限于缀合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化。任选地，对于在大肠杆菌(E.coli)或其他原核细胞中进行外源表达，真核核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码靶向信号，例如N端线粒体或其他靶向信号，其可以在转化到原核宿主细胞中之前去除，如果需要的话。在一些替代实施方案中，为了在大肠杆菌中提高表达而去除线粒体前导序列(Hoffmeister等,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。在用于在酵母或其他真核细胞中进行外源表达的一些替代实施方案中，基因可以在胞液中表达而不添加前导序列，或者通过添加合适的靶向序列如适于宿主细胞的线粒体靶向或分泌信号可以靶向线粒体或其他细胞器，或者靶向分泌。在一些替代实施方案中，对本文提供的核酸进行合适修饰例如以去除或包含靶向序列或赋予任何期望的特性。在一些替代实施方案中，用本领域公知的技术对基因进行密码子优化以实现蛋白质的优化表达。
[0346] 在本文提供的一些替代实施方案中，“微生物细胞”、“微生物生物体”或“微生物”(例如，其中包含如本文所提供的核酸以表达本文提供的多肽)包括古细菌、细菌或真核生物的域中包括的作为微观单元存在的任何生物体。在本文提供的一些替代实施方案中，原核或真核细胞或生物体具有微观尺寸并且包括所有物种的细菌、古细菌和真细菌，以及真核微生物如酵母和真菌。在一些替代实施方案中，本文提供了可以培养用于生产生物化学物质的任何物种的细胞培养物。
[0347] 在一些替代实施方案中，本文提供了其中包含本文提供的核酸或多肽的微生物，包括原核生物和真核生物，包括但不限于：细菌，包括古细菌和真细菌；以及真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括体外人细胞。用于实施本发明的示例性物种包括例如大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克氏酵母(Saccharomyces kluyveri)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、克氏梭菌
(Clostridium kluyveri)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌
(Clostridi um beijerinckii)、糖丁酸梭菌(Clostrid ium
saccharoperbutylacetonicum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌
(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、酪丁酸梭菌
(Clostridium tyrobutyricum)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、氨基丁酸梭菌
(Clostridium aminobutyricum)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、斯氏梭菌
(Clostridium sticklandii)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、牛分枝杆菌
(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)；假单胞菌属物种(Pseudomonas species)，包括绿脓假单胞菌
(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌
(Pseudomonas stutzeri)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；智人(Homo
sapiens)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、类球红细菌(Rhodobacter spaeroides)、布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus
aurantiacus)、光合玫瑰菌(Roseiflexus castenholzii)、红色杆菌属(Erythrobacter)、西蒙得木(Simmondsia chinensis)；不动杆菌属(Acinetobacter)物种，包括乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)和贝利不动杆菌(Acinetobacter baylyi)；牙龈卟啉单胞菌、Sulfolobus tokodaii、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短芽孢杆菌(Bacillus
brevis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、小眼虫(Euglena
gracilis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、热醋穆尔氏菌(Moorella
thermoacetica)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、盐沼盐杆菌(Halobacterium
salinarum)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、敏捷气热菌
(Aeropyrum pernix)、野猪(Sus scrofa)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus
fermentans)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus
plantarum)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter
aerogenes)、念珠菌属(Candida)、土曲霉(Aspergillus terreus)、戊糖片球菌
(Pedicoccus pentosaceus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilus)、巴氏醋杆菌
(Acetobacter pasteurians)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴氏真细菌
(Eubacterium barkeri)、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、Anaerotruncus
colihominis、Natranaerobius thermophilusm、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、具核梭杆菌(Fusobacterium nuleatum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、海洋γ-变形菌(marine gamma proteobacterium)、丁酸产生菌(butyrate-producing bacterium)、艾阿华诺卡菌(Nocardia iowensis)、皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)、灰色链霉菌
(Streptomyces griseus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、热葡糖苷酶地芽胞杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella
typhimurium)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、烟草
(Nicotiana tabacum)、稻(Oryza sativa)、极端嗜盐古菌(Haloferax mediterranei)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、脱氮无色杆菌(Achromobacter
denitrificans)、具核梭杆菌、棒状链霉菌(Streptomyces clavuligenus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、小鼠(Mus musculus)、Lachancea kluyveri、阴道毛滴虫
(Trichomonas vaginalis)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、百脉根根瘤菌
(Mesorhizobium loti)、牛(Bos taurus)、粘毛烟草(Nicotiana glutinosa)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、死海盐盒菌
(Haloarcula marismortui)、耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、耻垢分枝杆菌MC2 155(Mycobacterium smegmatis MC2 155)、鸟分枝杆菌副结核亚种K-10
(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis K-10)、海分枝杆菌M(Mycobacterium marinum M)、微变冢村氏菌DSM 20162(Tsukamurella paurometabola DSM 20162)、
Cyanobium PCC7001、盘基网柄菌AX4(Dictyostelium discoideum AX4)，以及本文中公开的或可用作对应基因的来源生物的其他示例性物种。
(Clostridium kluyveri)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌
(Clostridi um beijerinckii)、糖丁酸梭菌(Clostrid ium
saccharoperbutylacetonicum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌
(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、酪丁酸梭菌
(Clostridium tyrobutyricum)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、氨基丁酸梭菌
(Clostridium aminobutyricum)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、斯氏梭菌
(Clostridium sticklandii)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、牛分枝杆菌
(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)；假单胞菌属物种(Pseudomonas species)，包括绿脓假单胞菌
(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌
(Pseudomonas stutzeri)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；智人(Homo
sapiens)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、类球红细菌(Rhodobacter spaeroides)、布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus
aurantiacus)、光合玫瑰菌(Roseiflexus castenholzii)、红色杆菌属(Erythrobacter)、西蒙得木(Simmondsia chinensis)；不动杆菌属(Acinetobacter)物种，包括乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)和贝利不动杆菌(Acinetobacter baylyi)；牙龈卟啉单胞菌、Sulfolobus tokodaii、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短芽孢杆菌(Bacillus
brevis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、小眼虫(Euglena
gracilis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、热醋穆尔氏菌(Moorella
thermoacetica)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、盐沼盐杆菌(Halobacterium
salinarum)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、敏捷气热菌
(Aeropyrum pernix)、野猪(Sus scrofa)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus
fermentans)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus
plantarum)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter
aerogenes)、念珠菌属(Candida)、土曲霉(Aspergillus terreus)、戊糖片球菌
(Pedicoccus pentosaceus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilus)、巴氏醋杆菌
(Acetobacter pasteurians)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴氏真细菌
(Eubacterium barkeri)、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、Anaerotruncus
colihominis、Natranaerobius thermophilusm、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、具核梭杆菌(Fusobacterium nuleatum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、海洋γ-变形菌(marine gamma proteobacterium)、丁酸产生菌(butyrate-producing bacterium)、艾阿华诺卡菌(Nocardia iowensis)、皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)、灰色链霉菌
(Streptomyces griseus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、热葡糖苷酶地芽胞杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella
typhimurium)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、烟草
(Nicotiana tabacum)、稻(Oryza sativa)、极端嗜盐古菌(Haloferax mediterranei)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、脱氮无色杆菌(Achromobacter
denitrificans)、具核梭杆菌、棒状链霉菌(Streptomyces clavuligenus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、小鼠(Mus musculus)、Lachancea kluyveri、阴道毛滴虫
(Trichomonas vaginalis)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、百脉根根瘤菌
(Mesorhizobium loti)、牛(Bos taurus)、粘毛烟草(Nicotiana glutinosa)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、死海盐盒菌
(Haloarcula marismortui)、耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、耻垢分枝杆菌MC2 155(Mycobacterium smegmatis MC2 155)、鸟分枝杆菌副结核亚种K-10
(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis K-10)、海分枝杆菌M(Mycobacterium marinum M)、微变冢村氏菌DSM 20162(Tsukamurella paurometabola DSM 20162)、
Cyanobium PCC7001、盘基网柄菌AX4(Dictyostelium discoideum AX4)，以及本文中公开的或可用作对应基因的来源生物的其他示例性物种。
[0348] 用于实施本发明的示例性物种包括例如鲍氏不动杆菌Naval-82(Acinetobacter baumannii Naval-82)不动杆菌属亚种ADP1(Acinetobacter sp.ADP1)、不动杆菌属菌株M-
1(Acinetobacter sp.strain M-1)、琥珀酸放线杆菌130Z(Actinobacillus succinogenes
130Z)、Allochromatium vinosum DSM 180、嗜甲基拟无枝酸菌(Amycolatopsis
methanolica)、拟南芥、极小阿托波氏菌DSM 20469(Atopobium parvulum DSM 20469)、棕色固氮菌DJ(Azotobacter vinelandii DJ)、嗜碱芽孢杆菌ATCC 27647(Bacillus
alcalophilus ATCC 27647)、产氮芽胞杆菌LMG 9581(Bacillus azotoformans LMG
9581)、凝固芽胞杆菌36D1(Bacillus coagulans 36D1)、巨大芽孢杆菌、甲醇芽孢杆菌MGA3(Bacillus methanolicus MGA3)、甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus PB1)、甲醇芽孢杆菌PB-1(Bacillus methanolicus PB-1)、砷还原芽孢杆菌MLS10(Bacillus
selenitireducens MLS10)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)、枯草芽孢杆菌、新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia
cepacia)、多噬伯克霍尔德菌(Burkholderia multivorans)、吡咯伯克霍尔德菌
(Burkholderia pyrrocinia)、稳定伯克霍尔德菌(Burkholderia stabilis)、泰国伯克霍尔德菌E264(Burkholderia thailandensis E264)、伯克霍尔德目细菌Joshi_001
(Burkholderiales bacterium Joshi_001)、丁酸产生菌L2-50(Butyrate-producing
bacterium L2-50)、空肠弯曲杆菌、白色念珠菌(Candida albicans)、博伊丁假丝酵母、Candida methylica、Carboxydothermus hydrogenoformans、Carboxydothermus
hydrogenoformans Z-2901、柄杆菌属物种AP07(Caulobacter sp.AP07)、Chloroflexus aggregans DSM 9485、嗜热光全绿丝菌J-10-fl(Chloroflexus aurantiacus J-10-fl)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、柯氏柠檬酸杆菌ATCC BAA-895(Citrobacter
koseri ATCC BAA-895)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)、梭状芽孢杆菌
(Clostridium)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌ATCC 824(Clostridium acetobutylicum ATCC 824)、梭菌属(Clostridium acidurici)、氨基丁酸梭菌、Clostridium asparagiforme DSM 15981、拜氏梭菌、拜氏梭菌NCIMB 8052
(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)、鲍氏梭菌(ATCC BAA-613(Clostridium
bolteae ATCC BAA-613)、Clostridium carboxidivorans P7、食纤维梭菌743B
(Clostridium cellulovorans 743B)、艰难梭菌、Clostridium hiranonis DSM 13275、Clostridium hylemonae DSM 15053、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、克氏梭菌DSM
555(Clostridium kluyveri DSM 555)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahli)、扬氏梭菌DSM 13528(Clostridium ljungdahlii DSM 13528)、甲基戊糖梭菌DSM 5476(Clostridium methylpentosum DSM 5476)、巴氏梭菌、巴氏梭菌DSM 525(Clostridium pasteurianum DSM 525)、产气荚膜梭菌、产气荚膜梭菌ATCC 13124(Clostridium perfringens ATCC
13124)、产气荚膜梭菌菌株13(Clostridium perfringens str.13)、Clostridium
phytofermentans ISDg、糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、糖丁酸梭菌
(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖丁酸梭菌N1-4(Clostridium
saccharoperbutylacetonicum N1-4)、破伤风梭菌、谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067
(Corynebacterium glutamicum ATCC 14067)、谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacterium
glutamicum R)、棒状杆菌属物种U-96(Corynebacterium sp.U-96)、可变棒状杆菌
(Corynebacterium variabile)、钩虫贪铜菌N-1(Cupriavidus necator N-1)、Cyanobium PCC7001、Desulfatibacillum alkenivorans AK-01、Desulfitobacterium hafniense、Desulfitobacterium metallireducens DSM 15288、Desulfotomaculum reducens MI-1、非洲脱硫弧菌菌株Walvis Bay(Desulfovibrio africanus str.Walvis Bay)、食果糖脱硫弧菌JJ(Desulfovibrio fructosovorans JJ)、普通脱硫弧菌菌株Hildenborough
(Desulfovibrio vulgaris str.Hildenborough)、普通脱硫弧菌菌株'Miyazaki F'
(Desulfovibrio vulgaris str.'Miyazaki F')、盘基网柄菌AX4(Dictyostelium
discoideum AX4)、大肠杆菌、大肠杆菌K-12(Escherichia coli K-12)、大肠杆菌K-
12MG1655(Escherichia coli K-12MG1655)、霍氏真细菌DSM 3353(Eubacterium hallii DSM 3353)、Flavobacterium frigoris、具核梭杆菌多形亚种ATCC 10953(Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum ATCC 10953)、地芽孢杆菌属物种Y4.1MC1(Geobacillus sp.Y4.1MC1)、Geobacillus themodenitrificans NG80-2、Geobacter bemidjiensis Bem、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、硫还原地杆菌PCA(Geobacter
sulfurreducens PCA)、嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM 2334(Geobacillus stearothermophilus DSM 2334)、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、智人、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter
thermophilus)、嗜热氢杆菌TK-6(Hydrogenobacter thermophilus TK-6)、脱氮生丝微菌ATCC 51888(Hyphomicrobium denitrificans ATCC 51888)、札氏生丝微菌
(Hyphomicrobium zavarzinii)、肺炎克雷伯菌、肺炎克雷伯菌肺炎亚种MGH 78578
(Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae MGH 78578)、短乳杆菌ATCC 367
(Lactobacillus brevis ATCC 367)、肠系膜明串珠菌、纺锤形梭形芽孢杆菌
(Lysinibacillus fusiformis)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、百脉根根瘤菌MAFF303099(Mesorhizobium loti MAFF303099)、勤奋生金球菌、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、噬乙酸甲烷八叠球菌C2A(Methanosarcina
acetivorans C2A)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌
Tuc01(Methanosarcina mazei Tuc01)、海洋甲基细菌(Methylobacter marinus)、外链甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、外链甲基杆菌AM1(Methylobacterium
extorquens AM1)、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatas)、Methylomonas
aminofaciens、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、分枝杆菌属物种菌株JC1DSM
3803(Mycobacter sp.strain JC1 DSM 3803)、鸟分枝杆菌副结核亚种K-10
(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis K-10)、牛分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)、胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)、海分枝杆菌M(Mycobacterium marinum M)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、耻垢分枝杆菌MC2 155(Mycobacterium smegmatis MC2 155)、结核分枝杆菌、Nitrosopumilus salaria BD31、Nitrososphaera gargensis Ga9.2、皮疽诺卡菌IFM 10152(Nocardia farcinica IFM 10152)、艾阿华诺卡菌物种NRRL 5646(Nocardia iowensis sp.NRRL 5646)、念珠藻属物种PCC 7120(Nostoc sp.PCC 7120)、Ogataea angusta、Ogataea parapolymorpha DL-1(多形汉逊酵母DL-1)、Paenibacillus peoriae KCTC 3763、脱氮副球菌(脱氮副球菌)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、深海发光菌3TCK(Photobacterium profundum 3TCK)、Phytofermentans ISDg、巴斯德毕赤酵母、Picrophilus torridus DSM9790、牙龈卟啉单胞菌、牙龈卟啉单胞菌W83(Porphyromonas gingivalis W83)、绿浓假单胞菌PA01(Pseudomonas aeruginosa PA01)、脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、Pseudomonas knackmussii、恶臭假单胞菌、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp)、丁香假单胞菌丁香致病变种B728a
(Pseudomonas syringae pv.syringae B728a)、冰岛火棒菌DSM 4184(Pyrobaculum
islandicum DSM 4184)、阿氏火球菌(Pyrococcus abyssi)、激烈火球菌(Pyrococcus
furiosus)、掘越氏热球菌OT3(Pyrococcus horikoshii OT3)、富养罗尔斯通氏菌
(Ralstonia eutropha)、富养罗尔斯通氏菌H16(Ralstonia eutropha H16)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌、类球红细菌ATCC 17025(Rhodobacter
sphaeroides ATCC 17025)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、沼泽红假单胞菌CGA009(Rhodopseudomonas palustris CGA009)、沼泽红假单胞菌DX-1
(Rhodopseudomonas palustris DX-1)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、深红红螺菌ATCC 11170(Rhodospirillum rubrum ATCC 11170)、卵瘤胃球菌ATCC 29174
(Ruminococcus obeum ATCC 29174)、酿酒酵母、酿酒酵母S288c(Saccharomyces
cerevisiae S288c)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清变型菌株LT2(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium
str.LT2)、鼠伤寒肠道沙门氏菌(Salmonella enterica typhimurium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粟酒裂殖酵、白蚁塞巴鲁德菌ATCC 3338(Sebaldella
termitidis ATCC 33386)、Shewanella oneidensis MR-1、苜蓿中华根瘤菌1021
(Sinorhizobium meliloti 1021)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌灰色亚种NBRC 13350(Streptomyces griseus subsp.griseus NBRC 13350)、嗜酸热硫化叶菌、硫磺矿硫化叶菌P-2(Sulfolobus solfataricus P-2)、集胞藻属菌株PCC 6803
(Synechocystis str.PCC 6803)、Syntrophobacter fumaroxidans、芳香索氏菌(Thauera aromatica)、热厌氧杆菌属亚种X514(Thermoanaerobacter sp.X514)、Thermococcus
kodakaraensis、Thermococcus litoralis、嗜酸热原体、嗜中性热变形菌(Thermoproteus neutrophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、桃红荚硫菌(Thiocapsa
roseopersicina)、Tolumonas auensis DSM 9187、阴道毛滴虫G3(Trichomonas vaginalis G3)、布氏锥虫、微变冢村氏菌DSM 20162、霍乱弧菌、哈维氏弧菌ATCC BAA-1116(Vibrio harveyi ATCC BAA-1116)、自养黄色杆菌Py2(Xanthobacter autotrophicus Py2)、中间耶尔森菌(Yersinia intermedia)或玉米。
1(Acinetobacter sp.strain M-1)、琥珀酸放线杆菌130Z(Actinobacillus succinogenes
130Z)、Allochromatium vinosum DSM 180、嗜甲基拟无枝酸菌(Amycolatopsis
methanolica)、拟南芥、极小阿托波氏菌DSM 20469(Atopobium parvulum DSM 20469)、棕色固氮菌DJ(Azotobacter vinelandii DJ)、嗜碱芽孢杆菌ATCC 27647(Bacillus
alcalophilus ATCC 27647)、产氮芽胞杆菌LMG 9581(Bacillus azotoformans LMG
9581)、凝固芽胞杆菌36D1(Bacillus coagulans 36D1)、巨大芽孢杆菌、甲醇芽孢杆菌MGA3(Bacillus methanolicus MGA3)、甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus PB1)、甲醇芽孢杆菌PB-1(Bacillus methanolicus PB-1)、砷还原芽孢杆菌MLS10(Bacillus
selenitireducens MLS10)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)、枯草芽孢杆菌、新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia
cepacia)、多噬伯克霍尔德菌(Burkholderia multivorans)、吡咯伯克霍尔德菌
(Burkholderia pyrrocinia)、稳定伯克霍尔德菌(Burkholderia stabilis)、泰国伯克霍尔德菌E264(Burkholderia thailandensis E264)、伯克霍尔德目细菌Joshi_001
(Burkholderiales bacterium Joshi_001)、丁酸产生菌L2-50(Butyrate-producing
bacterium L2-50)、空肠弯曲杆菌、白色念珠菌(Candida albicans)、博伊丁假丝酵母、Candida methylica、Carboxydothermus hydrogenoformans、Carboxydothermus
hydrogenoformans Z-2901、柄杆菌属物种AP07(Caulobacter sp.AP07)、Chloroflexus aggregans DSM 9485、嗜热光全绿丝菌J-10-fl(Chloroflexus aurantiacus J-10-fl)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、柯氏柠檬酸杆菌ATCC BAA-895(Citrobacter
koseri ATCC BAA-895)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)、梭状芽孢杆菌
(Clostridium)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌ATCC 824(Clostridium acetobutylicum ATCC 824)、梭菌属(Clostridium acidurici)、氨基丁酸梭菌、Clostridium asparagiforme DSM 15981、拜氏梭菌、拜氏梭菌NCIMB 8052
(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)、鲍氏梭菌(ATCC BAA-613(Clostridium
bolteae ATCC BAA-613)、Clostridium carboxidivorans P7、食纤维梭菌743B
(Clostridium cellulovorans 743B)、艰难梭菌、Clostridium hiranonis DSM 13275、Clostridium hylemonae DSM 15053、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、克氏梭菌DSM
555(Clostridium kluyveri DSM 555)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahli)、扬氏梭菌DSM 13528(Clostridium ljungdahlii DSM 13528)、甲基戊糖梭菌DSM 5476(Clostridium methylpentosum DSM 5476)、巴氏梭菌、巴氏梭菌DSM 525(Clostridium pasteurianum DSM 525)、产气荚膜梭菌、产气荚膜梭菌ATCC 13124(Clostridium perfringens ATCC
13124)、产气荚膜梭菌菌株13(Clostridium perfringens str.13)、Clostridium
phytofermentans ISDg、糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、糖丁酸梭菌
(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖丁酸梭菌N1-4(Clostridium
saccharoperbutylacetonicum N1-4)、破伤风梭菌、谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067
(Corynebacterium glutamicum ATCC 14067)、谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacterium
glutamicum R)、棒状杆菌属物种U-96(Corynebacterium sp.U-96)、可变棒状杆菌
(Corynebacterium variabile)、钩虫贪铜菌N-1(Cupriavidus necator N-1)、Cyanobium PCC7001、Desulfatibacillum alkenivorans AK-01、Desulfitobacterium hafniense、Desulfitobacterium metallireducens DSM 15288、Desulfotomaculum reducens MI-1、非洲脱硫弧菌菌株Walvis Bay(Desulfovibrio africanus str.Walvis Bay)、食果糖脱硫弧菌JJ(Desulfovibrio fructosovorans JJ)、普通脱硫弧菌菌株Hildenborough
(Desulfovibrio vulgaris str.Hildenborough)、普通脱硫弧菌菌株'Miyazaki F'
(Desulfovibrio vulgaris str.'Miyazaki F')、盘基网柄菌AX4(Dictyostelium
discoideum AX4)、大肠杆菌、大肠杆菌K-12(Escherichia coli K-12)、大肠杆菌K-
12MG1655(Escherichia coli K-12MG1655)、霍氏真细菌DSM 3353(Eubacterium hallii DSM 3353)、Flavobacterium frigoris、具核梭杆菌多形亚种ATCC 10953(Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum ATCC 10953)、地芽孢杆菌属物种Y4.1MC1(Geobacillus sp.Y4.1MC1)、Geobacillus themodenitrificans NG80-2、Geobacter bemidjiensis Bem、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、硫还原地杆菌PCA(Geobacter
sulfurreducens PCA)、嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM 2334(Geobacillus stearothermophilus DSM 2334)、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、智人、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter
thermophilus)、嗜热氢杆菌TK-6(Hydrogenobacter thermophilus TK-6)、脱氮生丝微菌ATCC 51888(Hyphomicrobium denitrificans ATCC 51888)、札氏生丝微菌
(Hyphomicrobium zavarzinii)、肺炎克雷伯菌、肺炎克雷伯菌肺炎亚种MGH 78578
(Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae MGH 78578)、短乳杆菌ATCC 367
(Lactobacillus brevis ATCC 367)、肠系膜明串珠菌、纺锤形梭形芽孢杆菌
(Lysinibacillus fusiformis)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、百脉根根瘤菌MAFF303099(Mesorhizobium loti MAFF303099)、勤奋生金球菌、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、噬乙酸甲烷八叠球菌C2A(Methanosarcina
acetivorans C2A)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌
Tuc01(Methanosarcina mazei Tuc01)、海洋甲基细菌(Methylobacter marinus)、外链甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、外链甲基杆菌AM1(Methylobacterium
extorquens AM1)、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatas)、Methylomonas
aminofaciens、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、分枝杆菌属物种菌株JC1DSM
3803(Mycobacter sp.strain JC1 DSM 3803)、鸟分枝杆菌副结核亚种K-10
(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis K-10)、牛分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)、胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)、海分枝杆菌M(Mycobacterium marinum M)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、耻垢分枝杆菌MC2 155(Mycobacterium smegmatis MC2 155)、结核分枝杆菌、Nitrosopumilus salaria BD31、Nitrososphaera gargensis Ga9.2、皮疽诺卡菌IFM 10152(Nocardia farcinica IFM 10152)、艾阿华诺卡菌物种NRRL 5646(Nocardia iowensis sp.NRRL 5646)、念珠藻属物种PCC 7120(Nostoc sp.PCC 7120)、Ogataea angusta、Ogataea parapolymorpha DL-1(多形汉逊酵母DL-1)、Paenibacillus peoriae KCTC 3763、脱氮副球菌(脱氮副球菌)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、深海发光菌3TCK(Photobacterium profundum 3TCK)、Phytofermentans ISDg、巴斯德毕赤酵母、Picrophilus torridus DSM9790、牙龈卟啉单胞菌、牙龈卟啉单胞菌W83(Porphyromonas gingivalis W83)、绿浓假单胞菌PA01(Pseudomonas aeruginosa PA01)、脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、Pseudomonas knackmussii、恶臭假单胞菌、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp)、丁香假单胞菌丁香致病变种B728a
(Pseudomonas syringae pv.syringae B728a)、冰岛火棒菌DSM 4184(Pyrobaculum
islandicum DSM 4184)、阿氏火球菌(Pyrococcus abyssi)、激烈火球菌(Pyrococcus
furiosus)、掘越氏热球菌OT3(Pyrococcus horikoshii OT3)、富养罗尔斯通氏菌
(Ralstonia eutropha)、富养罗尔斯通氏菌H16(Ralstonia eutropha H16)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌、类球红细菌ATCC 17025(Rhodobacter
sphaeroides ATCC 17025)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、沼泽红假单胞菌CGA009(Rhodopseudomonas palustris CGA009)、沼泽红假单胞菌DX-1
(Rhodopseudomonas palustris DX-1)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、深红红螺菌ATCC 11170(Rhodospirillum rubrum ATCC 11170)、卵瘤胃球菌ATCC 29174
(Ruminococcus obeum ATCC 29174)、酿酒酵母、酿酒酵母S288c(Saccharomyces
cerevisiae S288c)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清变型菌株LT2(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium
str.LT2)、鼠伤寒肠道沙门氏菌(Salmonella enterica typhimurium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粟酒裂殖酵、白蚁塞巴鲁德菌ATCC 3338(Sebaldella
termitidis ATCC 33386)、Shewanella oneidensis MR-1、苜蓿中华根瘤菌1021
(Sinorhizobium meliloti 1021)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌灰色亚种NBRC 13350(Streptomyces griseus subsp.griseus NBRC 13350)、嗜酸热硫化叶菌、硫磺矿硫化叶菌P-2(Sulfolobus solfataricus P-2)、集胞藻属菌株PCC 6803
(Synechocystis str.PCC 6803)、Syntrophobacter fumaroxidans、芳香索氏菌(Thauera aromatica)、热厌氧杆菌属亚种X514(Thermoanaerobacter sp.X514)、Thermococcus
kodakaraensis、Thermococcus litoralis、嗜酸热原体、嗜中性热变形菌(Thermoproteus neutrophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、桃红荚硫菌(Thiocapsa
roseopersicina)、Tolumonas auensis DSM 9187、阴道毛滴虫G3(Trichomonas vaginalis G3)、布氏锥虫、微变冢村氏菌DSM 20162、霍乱弧菌、哈维氏弧菌ATCC BAA-1116(Vibrio harveyi ATCC BAA-1116)、自养黄色杆菌Py2(Xanthobacter autotrophicus Py2)、中间耶尔森菌(Yersinia intermedia)或玉米。
[0349] 细胞培养系统、生物反应器
[0350] 在一些替代实施方案中，提供了包括生物反应器的细胞培养系统，所述生物反应器包含本文提供的非天然或经遗传改造细胞或生物体用于产生期望的产物，例如甲基乙烯基甲醇、丁二烯。使用本文提供的经改造细胞产生期望产物的方法包括厌氧或需氧发酵、连续或分批方法，等等。本领域已知的任何培养系统、反应器、生物反应器等均可以用于实施这些方法，或使用本文提供的非天然或经遗传改造细胞或生物来产生期望产物，例如如US专利或专利申请号.9,023,642、9,012,205、9,005,550；8,980,624、8,980,623、8,778,647、8,709,793、8,518,691、8,835,159、5,954,858、20150104835、20140377822、20140187826、
20150017683、20130005011、20120070888中所述的。
20150017683、20130005011、20120070888中所述的。
[0351] 在一些替代实施方案中，对于使用细胞培养系统，可以使用任何合适的碳源。例如，在一个实施方案中，碳源是甲醇或甲酸盐，并且任一种或两种可以单独地或与本文提供的产物途径组合地用作本文提供的生物中的碳源。
[0352] 在一些替代实施方案中，碳源包含糖(例如葡萄糖)或含糖生物质。例如，碳源可以包含甲醇和/或甲酸盐和糖(例如葡萄糖)或含糖生物质。在一些具体实施方案中，发酵进料中的甲醇或甲酸盐或者二者作为与糖(例如葡萄糖)或含糖生物质的混合物提供。在某些实施方案中，提供糖以获得足够的菌株生长。
[0353] 在一些替代实施方案中，本文提供的非天然或经遗传改造细胞(例如，当用于产生丁二烯时)在具有碳源和其他必需营养物的培养基中培养。在一些替代实施方案中，可需要在发酵罐中维持厌氧条件以降低整个过程的成本。这样的条件可以例如通过首先用氮气鼓泡培养基然后密封孔或发酵罐来获得。对于没有在厌氧下没有观察到生长的菌株，则可以应用微氧或基本上厌氧的条件。示例性的厌氧条件先前已经描述并且是本领域公知的。示例性的需氧和厌氧条件描述于例如2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。在一些替代实施方案中，发酵可以以分批、补料分批或连续方式进行。
[0354] 如果需要的话，可以例如根据使培养基维持在期望pH的需要通过添加碱(例如NaOH或其他碱)或酸来使培养系统培养基的pH维持在期望的pH，特别是中性pH，例如约7的pH。生长速率可以通过使用分光光度计(600nm)测量光密度来确定，并且葡萄糖摄取速率可以通过随时间监测碳源消耗来确定。
[0355] 生长培养基可以包括例如可以向非天然存在微生物供应碳源的任何碳水化合物来源。这样的来源包括例如糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉。碳水化合物的其他来源包括例如可再生原料和生物质。可以在筛选方法中用作原料的生物质的示例性类型包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料或者原料中的部分。这样的生物质原料包含例如可用作碳源的碳水化合物底物，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将会理解，可以使用不同于以上例示的那些的可再生原料和生物质来培养本文提供的微生物，例如用于产生期望的化合物，例如丁二烯。
[0356] 除可再生原料如上文例示的那些之外，还可以修饰本文提供的非天然或经遗传改造细胞用于利用合成气作为其碳源生长。在该具体实施方案中，在生物体中表达一种或更多种蛋白质或酶以提供利用合成气或其他气态碳源的代谢途径。合成气体(也称为合成气或发生气气体)是煤和含碳材料如生物质材料(包括农作物和残渣)的气化的主要产物。合成气主要是H2和CO的混合物，并且可以从任何有机原料的气化获得，所述有机原料包括但不限于煤、煤油、天然气、生物质和废有机物质。气化一般在高燃料与氧的比率下进行。尽管主要是H2和CO，合成气也可以包含少量的CO2和其他气体。因此，合成气体提供了有成本效益的气态碳源，例如CO和另外地CO2。
[0357] 在一些替代实施方案中，本文提供的非天然或经遗传改造细胞可以使用与一氧化碳脱氢酶和/或氢化酶活性偶联的还原性(反向)三羧酸循环，所述氢化酶活性用于将CO、CO2和/或H2转化为乙酰CoA和其他产物如乙酸。能够通过还原性TCA途径固定碳的生物体可以利用以下一种或更多种酶：ATP柠檬酸裂解酶、柠檬酸裂解酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰CoA合成酶、琥珀酰CoA转移酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、NAD(P)H：铁氧还蛋白氧化还原酶、一氧化碳脱氢酶、和氢化酶。特别地，利用通过一氧化碳脱氢酶和氢化酶从CO和/或H2提取的还原等同物通过还原性TCA循环将CO2固定为乙酰CoA或乙酸。乙酸盐可通过例如乙酰CoA转移酶、乙酸激酶/磷酸转乙酰酶和乙酰CoA合成酶的酶转化为乙酰CoA。乙酰CoA可通过丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和用于糖质异生的酶转化为丁二烯、3-磷酸甘油醛、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸。根据本文提供的用于导入足够数量编码核酸以产生期望代谢途径的教导和指导，本领域技术人员将理解，还可以在以下方面进行相同的改造设计：至少导入编码宿主生物中不存在的编码还原性TCA途径酶或蛋白质的核酸。因此，将一种或更多种编码核酸导入微生物生物体中使得经修饰的生物体包含完整的还原性TCA途径将赋予合成气利用能力，并且可以使用本文所述的装置和方法筛选这样的经修饰微生物的文库。
[0358] 在一些替代实施方案中，本文提供的非天然或经遗传改造细胞可以从中间体开始合成期望的产物如丁二烯，并且可以将该中间体添加到培养基(或生物反应器)中，或者可以将酶添加到细胞中以补充以下物质的量或增加(从头)细胞中以下物质的产生：例如乙酰乙酰CoA、3-羟基丁酰CoA、巴豆酰CoA、巴豆醛、巴豆醇、2-丁烯基磷酸、2-丁烯基-4-二磷酸酯、赤藓醇-4-磷酸、4-(胞苷5'-二磷酸)-赤藓醇、2-磷酸-4-(胞苷5'-二磷酸)-赤藓醇、赤藓醇-2,4-环二磷酸、1-羟基-2-丁烯基4-二磷酸、丁烯基4-二磷酸、2-丁烯基4-二磷酸、3-氧代戊二酰CoA、3-羟基戊二酰CoA、3-羟基-5-氧代戊酸、3,5-二羟基戊酸、3-羟基-5-膦酸根合氧基戊酸酯、3-羟基-5-[羟基(膦酰氧基)磷酰基]氧基戊酸、巴豆酸、赤藓糖、赤藓醇、3,5-二氧代戊酸酯或5-羟基-3-氧代戊酸。
[0359] 在一些替代实施方案中，本文提供的非天然或经遗传改造细胞在可以扩大规模的条件下培养和/或连续生长以制备期望的产物如丁二烯。示例性的生长过程包括例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或连续发酵和连续分离。所有这些过程都是本领域中公知的。发酵过程可用于生物合成生产商业量的期望产物(例如丁二烯)。
[0360] 在一些替代实施方案中，与非连续培养过程一样，期望产物(例如丁二烯)的连续和/或接近连续生产可以包括在足够的营养物和培养基中培养本文提供的非天然或经遗传改造细胞以维持和/或接近维持在指数阶段的生长。在这样的条件下的连续培养可以包括例如生长1天、2、3、4、5、6或7天或更久。在一些替代实施方案中，连续培养可以包括1周、2、3、4或5周或更多周且多至数月的更长时间段。或者，如果适用于特定应用，则可以将微生物体培养数小时。应理解的是，连续和/或接近连续的培养条件还可以包括这些示例性时间段之间的所有时间间隔。在一些替代实施方案中，培养微生物生物体的时间是以产生足够量产物用于期望的目的的足够时间段。
[0361] 因此，本文提供了由对应于或包括通式CnH2nO其中3
[0362] (a)在包含的碳源或本文所述本发明多肽的底物的合适培养基中培养本文所述的本发明转化或转导细胞或植物细胞，并在适于产生包含所述化合物的酶产物的条件下培养细胞包含该化合物；或者
[0363] (b)在其中产生本发明多肽的条件下表达本发明的核酸，并在适于产生包含所述化合物的酶产物的条件下使所述多肽与所述多肽的底物接触，
[0364] 其中任选地所述方法还包括回收产生的对应于通式CnH2n-2其中3
[0366] 和/或任选地，对应于通式CnH2nO其中3
[0367] 和/或任选地对应于通式CnH2nO其中37的化合物是二甲基丁二烯，和/或
[0368] 任选地，所述条件包括核酸的体外表达。
[0369] 发酵可以在需氧、微氧或厌氧条件下进行，，优选地在厌氧下进行，，其中化合物如丁二烯与氧是反应的。还提供了产生聚合物、树脂或制品的方法，其包括使化合物、二烯烃、任选地丁二烯反应以产生聚合物或树脂，以及还任选地使所述聚合物或树脂形成为所述制品，其中所述化合物、二烯烃、任选地丁二烯通过本发明的方法或用途产生，或者使用本发明的组合物，例如多核苷酸、酶、经改造微生物、烯烃产物组合物产生。此外，所述聚合物、树脂或制品可以包含或是含丁二烯聚合物、聚丁二烯、己二腈、共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、丙烯腈-丁二烯橡胶(ABR)、苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)共聚物、苯乙烯-1,3-丁二烯胶乳，或者所述制品是轮胎、管、车辆部件、船部件、食品容器或地毯背衬。
[0370] 用于筛选酶活性和回收产物的方法
[0371] 在一些替代实施方案中，可以使用用于筛选酶活性(例如期望产物如丁二烯的产生)的任何方法和用于分离酶产物或最终产物的任何方法，例如如以下中所述的：2011年6月11日公开的标题为Methods and Organisms for Converting Synthesis Gas or Other Gaseous Carbon Sources and Methanol to 1,3-Butanediol的WO2011071682A1；2011年3月17日公开的标题为Microorganisms and Methods for the Co-Production of
Isopropanol with Primary Alcohols,Diols and Acids的WO2011031897A；2010年11月4日公开的标题为Organisms for the Production of 1,3-Butanediol的WO2010127319A2；
2013年5月16日公开的标题为Eukaryotic Organisms and Methods for Increasing the Availability of Cytosolic Acetyl-CoA,and for Producing 1,3-Butanediol的
WO2013071226A1；2013年2月28日公开的标题为Microorganisms and Methods for
Producing 2,4-Pentadienoate,Butadiene,Propylene,1,3-Butanediol and Related
Alcohols的WO2013028519A1；2013年3月14日公开的标题为Eukaryotic Organisms and
Methods for Producing1,3-Butanediol的WO2013036764A1；2013年1月24日公开的标题为Methods for Increasing Product Yields的WO2013012975A1；2012年12月27日公开的标题为Microorganisms for Producing 1,3-Butanediol and Methods Related Thereto的WO2012177619A2；以及2014年7月3日公开的标题为Compositions and Methods for Bio-Butadience Production Screening的WO/2014/106122。
Isopropanol with Primary Alcohols,Diols and Acids的WO2011031897A；2010年11月4日公开的标题为Organisms for the Production of 1,3-Butanediol的WO2010127319A2；
2013年5月16日公开的标题为Eukaryotic Organisms and Methods for Increasing the Availability of Cytosolic Acetyl-CoA,and for Producing 1,3-Butanediol的
WO2013071226A1；2013年2月28日公开的标题为Microorganisms and Methods for
Producing 2,4-Pentadienoate,Butadiene,Propylene,1,3-Butanediol and Related
Alcohols的WO2013028519A1；2013年3月14日公开的标题为Eukaryotic Organisms and
Methods for Producing1,3-Butanediol的WO2013036764A1；2013年1月24日公开的标题为Methods for Increasing Product Yields的WO2013012975A1；2012年12月27日公开的标题为Microorganisms for Producing 1,3-Butanediol and Methods Related Thereto的WO2012177619A2；以及2014年7月3日公开的标题为Compositions and Methods for Bio-Butadience Production Screening的WO/2014/106122。
[0372] 丁二烯中间体如1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基醇)和3-丁烯-1-醇可以通过将本文醇脱氢酶与本领域已知的产物途径共表达来制备，如本文所述的。合适的产物途径和酶、筛选方法以及分离方法见于：2011年11月10公开的标题为Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene的WO2011140171A2；2012年2月9日公开的标题为Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of
Aromatics,2,4-Pentadienoate and 1,3-Butadiene的WO2012018624A2；2011年11月10日公开的标题为Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene的
O2011140171A2；2013年3月21日公开的标题为Microorganisms and Methods for
Producing Alkenes的WO2013040383A1；2012年12月27日公开的标题为Microorganisms
for Producing Butadiene and Methods Related thereto的WO2012177710A1；2012年8月
9日公开的标题为Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene的WO2012106516A1；2013年2月28日公开的标题为Microorganisms and Methods for
Producing 2,4-Pentadienoate,Butadiene,Propylene,1,3-Butanediol and Related
Alcohols的WO2013028519A1；以及提交于2013年3月15日的美国序列No.61/799255。
Aromatics,2,4-Pentadienoate and 1,3-Butadiene的WO2012018624A2；2011年11月10日公开的标题为Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene的
O2011140171A2；2013年3月21日公开的标题为Microorganisms and Methods for
Producing Alkenes的WO2013040383A1；2012年12月27日公开的标题为Microorganisms
for Producing Butadiene and Methods Related thereto的WO2012177710A1；2012年8月
9日公开的标题为Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene的WO2012106516A1；2013年2月28日公开的标题为Microorganisms and Methods for
Producing 2,4-Pentadienoate,Butadiene,Propylene,1,3-Butanediol and Related
Alcohols的WO2013028519A1；以及提交于2013年3月15日的美国序列No.61/799255。
[0373] 使用本文所述的酶制备的丁二烯和其他二烯烃可以使用本领域公知的多种方法与培养物中的其他组分分开和/或分离。在挥发性二烯烃如丁二烯的情况下，可以在发酵尾气中获得并从其分离。这样的分离方法包括例如萃取操作以及包括以下的方法：连续液-液萃取、渗透蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取性过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱、超滤、气体压缩、使用溶剂的萃取性蒸馏、通过蒸馏和最终蒸馏去除溶剂。此外，如果二烯烃如丁二烯在充足的氧存在下是危险的，可以使用厌氧发酵。所有上述方法都是本领域公知的。
[0374] 例如，标题为“Method Of Separating and Purifying a Conjugated Diolefin Produced by Fermentation under Anaerobic Conditions”的国际专利申请公开WO2014121357提供了用于在厌氧条件下从发酵罐尾气中分离和纯化发酵物的方法，其包
括：a)获得包含共轭二烯烃如丁二烯、挥发性杂质、生物副产物杂质和水蒸气的发酵罐尾气；b)在多级压缩系统中压缩发酵罐尾气以产生压缩流；c)将压缩流进料到第一蒸馏区以去除生物副产物杂质和水蒸气，第一蒸馏区具有上部回流段、中间蒸馏段和下部再沸器段；
d)使由生物副产物杂质和水去除蒸馏区产生的塔顶蒸气流与吸附剂接触以产生经干燥的
塔顶流；e)将经干燥的塔顶流进料到第二蒸馏区以通过顶部去除挥发性杂质，其中第二蒸馏区具有上部回流段、中间蒸馏段和下部再沸器段；以及f)在用于去除挥发性杂质的蒸馏区的底部收集得到的经纯化液体共轭二烯如丁二烯。
括：a)获得包含共轭二烯烃如丁二烯、挥发性杂质、生物副产物杂质和水蒸气的发酵罐尾气；b)在多级压缩系统中压缩发酵罐尾气以产生压缩流；c)将压缩流进料到第一蒸馏区以去除生物副产物杂质和水蒸气，第一蒸馏区具有上部回流段、中间蒸馏段和下部再沸器段；
d)使由生物副产物杂质和水去除蒸馏区产生的塔顶蒸气流与吸附剂接触以产生经干燥的
塔顶流；e)将经干燥的塔顶流进料到第二蒸馏区以通过顶部去除挥发性杂质，其中第二蒸馏区具有上部回流段、中间蒸馏段和下部再沸器段；以及f)在用于去除挥发性杂质的蒸馏区的底部收集得到的经纯化液体共轭二烯如丁二烯。
[0375] 产生的化合物可以通过使其与培养物中的其他组分分离并使用本领域公知的多种方法对其进行纯化来回收。在挥发性二烯烃如丁二烯的情况下，可以在发酵尾气中获得并从其分离。这样的分离方法包括例如萃取操作以及包括以下的方法：连续液-液萃取、渗透蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取性过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱、超滤、气体压缩、使用溶剂的萃取性蒸馏、通过蒸馏去除溶剂和最终蒸馏。回收可以包括使化合物与培养物中的其他组分分离并纯化该化合物；分离或纯化进一步可以包括收集含有该化合物的发酵尾气，并且分离和纯化进一步可以包括尾气压缩、使用溶剂进行萃取性蒸馏、通过蒸馏去除溶剂和蒸馏中的一种或更多种。在一个实施方案中，用于产生所述化合物如丁二烯的方法还包括：a)获得包含共轭二烯烃如丁二烯、挥发性杂质、生物副产物杂质和水蒸气的发酵罐尾气；b)在多级压缩系统中压缩发酵罐尾气以产生压缩流；c)将压缩流进料到第一蒸馏区以去除生物副产物杂质和水蒸气，第一蒸馏区具有上部回流段、中间蒸馏段和下部再沸器段；d)使由生物副产物杂质和水去除蒸馏区产生的塔顶蒸气流与吸附剂接触以产生经干燥的塔顶流；e)将经干燥的塔顶流进料到第二蒸馏区以通过顶部去除挥发性杂质，其中第二蒸馏区具有上部回流段、中间蒸馏段和下部再沸器段；以及f)在用于去除挥发性杂质的蒸馏区的底部收集得到的经纯化液体共轭二烯如丁二烯。
[0376] 在一些替代实施方案中，提供了用于产生有机化合物(例如丁二烯)的微生物生物体(例如细菌)，包括由可再生原料产生期望的化合物，所述可再生原料例如便宜的可再生原料例如糖蜜、甘蔗汁、源自生物质来源(包括农业和木材废弃物)的糖，以及C1(一碳化合物)原料，例如合成气和二氧化碳。在一些替代实施方案中，本文提供的多肽催化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为丁二烯或1,3丁二烯，并且为了筛选具有该活性的多肽，可以使用用于筛选酶活性的任何方法，包括利用丁二烯高反应性的用于丁二烯产生的大细胞群的高通量筛选(HTS)。
[0377] 在一些替代实施方案中，提供了用于检测和/或分离使用本文提供的酶作为生物合成过程的产物(例如作为微生物生物体生物合成过程的产物)在细胞中产生的丁二烯(例如，1,3-丁二烯)(包括丁二烯气体)的任何方法。在一些替代实施方案中，提供了用于制备和检测丁二烯(包括丁二烯气体)的组合物和方法。
[0378] 在一些替代实施方案中，本发明的组合物和方法包括使用任何方法或装置检测有机挥发物(例如BD或BD气体)或微生物产生的有机挥发物(例如BD气体)，例如采用发酵培养基或顶部空间的侵入性取样，之后对样品进行通常与质谱偶联的气相色谱或液相色谱。在一些替代实施方案中，可以使用任何“现有技术”装置，例如用于高通量筛选，例如可以使用具有111-小瓶容量(10mL、20mL或22mL小瓶)和三个36-小瓶架子的Agilent 7697A HEADSPACE SAMPLERTM(Agilent Technologies,Santa Clara CA,USA)，所述架子在操作顶部空间采样器或等同操作时可交换。除有限的样品配置和数量外，装置在与GC或GC/MS偶联时通常需要10至30分钟来分析每个样品。
[0379] 在一些替代实施方案中，装置被设计或配置成通过直接或间接地检测和/或测量以下形式的BDE，例如通过化学或酶促反应，对细胞，例如微生物，例如细菌的丁二烯产生进行HTS：在细胞培养基中的可溶性形式、在细胞培养物顶部空间中的气体形式、在捕获由细胞培养物产生的BDE气体的液体中的可溶性形式和/或在该液体的顶部空间中的气态形式。
[0380] 在一些替代实施例中，方法是可自动化的并且适用于实验室机器人系统，从而消除或减少操作者参与，同时提供高通量筛选。在一些实施方案中，装置通过其在细胞培养物顶部空间中的直接检测或通过捕获尾气BD接着在捕获状态下进行其检测而利用BDE的挥发性质。
[0381] 这些所述方法中的任一种或本领域已知用于检测本文所述提供酶的产物产生的任何方法均可用于确定多肽是否具有在本要求保护发明的范围内的必要活性。
[0382] 经改造代谢途径
[0383] 在一些替代实施方案中，使用另外的酶或编码其的核酸(作为使用本文提供的酶的补充)(例如插入在同一细胞中)以产生本文所提供酶的底物或使得产生本文所提供酶的底物的代谢途径的底物或者增加其量；例如，如图1中所述，其示出了能够由乙酰CoA(使得产生本文所提供酶的底物的代谢途径的底物)产生巴豆醇(本文提供的酶的底物)和丁二烯(本文提供的酶的产物)的示例性途径。如图1所示，巴豆醇和丁二烯的产生可以通过以下酶进行：A)乙酰CoA羧化酶；B)乙酰乙酰CoA合酶；C)乙酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶；D)乙酰乙酰CoA还原酶(酮还原)；J)3-羟基丁酰CoA脱水酶(HCD)；K)巴豆酰CoA还原酶(醛形成)(CCR-ALD)；L)巴豆酰-CoA水解酶(CCH)、转移酶)或合成酶(CCS)；M)巴豆酸还原酶(CTR)；N)巴豆醛还原酶(CAR)；U)巴豆酰CoA还原酶(形成醇)(CCR-OH)；和S)化学脱水或VD)巴豆醇脱水酶(CAD)，如本文所述的。
[0384] 产生本文所述酶的底物或被改造以产生本文所述酶的底物的任何微生物都是合适的宿主，并且可用于实施本发明。例如，可以将示例性微生物改造以产生巴豆醇，例如如国际专利申请公开WO2011140171、WO2012106516和WO2013090915A1中所述的，后者也公开了使用芳樟醇脱水酶将巴豆醇酶促转化为丁二烯。图1还示出了从乙酰CoA到巴豆醇(如例如WO2011140171和WO2012106516中所述)及其通过乙烯基异构酶-脱水酶(其为本文提供的酶)(图1，步骤VD)转化为丁二烯的示例性酶促步骤。图6提供了用于产生巴豆醇的示例性替代途径，并且在一些替代实施方案中，本文提供的酶可以：酶促催化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为3-丁烯-2-醇；酶催化3-丁烯-2-醇转化为丁二烯或1,3丁二烯；和/或酶促催化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为丁二烯或1,3丁二烯；并且可以将产生它们的任意一种、几种或全部中间体或前体化合物和/或酶添加到经改造细胞中。以下提供了用于与本文所述的酶一起使用的用于产生巴豆醇的示例性宿主微生物和有用酶的细节。
[0385] 示例性的巴豆醇和丁二烯合成酶
[0386] 提供了可用于将乙酰CoA转化为巴豆醇并转化为丁二烯的示例性基因和酶，如图1和图6的途径中所示；例如，在一些替代实施方案中，本文提供的经改造细胞除本文所提供核酸或酶之外还包含这些示例性基因和/或酶中的一种或数种。
[0387] 图1步骤A.乙酰CoA羧化酶
[0388] 乙酰CoA羧化酶(EC 6.4.1.2)催化乙酰CoA到丙二酰CoA的ATP依赖性羧化。这种酶是生物素依赖性的，并且是数种生物体中脂肪酸生物合成起始的第一反应。示例性酶由以下编码：大肠杆菌的accABCD(Davis等,J Biol Chem 275:28593-8(2000))、酿酒酵母的ACC1和同源物(Sumper等,Methods Enzym 71:34-7(1981))。
[0389]
[0390]
[0391] 图1：步骤B：乙酰乙酰CoA合酶
[0392] 丙二酰CoA和乙酰CoA底物向乙酰乙酰CoA的转化可以由2.3.1家族酶中的CoA合成酶催化。已经在文献中描述了几种催化CoA合成酶活性的酶并且代表合适的候选物。
[0393] 3-氧代酰基-CoA产物如乙酰乙酰CoA、3-氧代戊酰CoA、3-氧代-5-羟基戊酰CoA可以由酰基-CoA和丙二酰CoA底物通过3-氧代酰基CoA合酶而合成。由于这一类别的酶催化基本上不可逆的反应，因此其特别地可用于过量产生由3-氧代酰基-CoA中间体如乙酰乙酰CoA获得的代谢物、燃料或化学物质的代谢改造应用。乙酰乙酰CoA合酶例如已经在生物合成丁醇(Lan等,PNAS USA(2012))和聚-(3-羟基丁酸酯)(Matsumoto等,Biosci Biotech
Biochem,75:364-366(2011))的生物体中异源表达。已经在土壤细菌链霉菌属物种CL190
(Streptomyces sp.CL190)中表征了乙酰乙酰CoA合酶(EC 2.3.1.194)酶(FhsA)，其中其参与甲羟戊酸生物合成(Okamura等,PNAS USA 107:11265-70(2010))。另一些乙酰乙酰CoA合酶基因可以通过与fhsA的序列同源性来鉴定。
Biochem,75:364-366(2011))的生物体中异源表达。已经在土壤细菌链霉菌属物种CL190
(Streptomyces sp.CL190)中表征了乙酰乙酰CoA合酶(EC 2.3.1.194)酶(FhsA)，其中其参与甲羟戊酸生物合成(Okamura等,PNAS USA 107:11265-70(2010))。另一些乙酰乙酰CoA合酶基因可以通过与fhsA的序列同源性来鉴定。
[0394]
[0395] 图1：步骤C：乙酰CoA:乙酰CoA酰基转移酶(乙酰乙酰CoA硫解酶)
[0396] 乙酰乙酰CoA硫解酶(也称为乙酰CoA乙酰转移酶)将两分子的乙酰CoA转化为各一分子的乙酰乙酰CoA和CoA。示例性的乙酰乙酰CoA硫解酶包括以下的基因产物：来自大肠杆菌的atoB(Martin et al.,Nat.Biotechnol 21:796-802(2003))、来自丙酮丁醇梭菌
(C.acetobutylicum)的thlA和thlB(Hanai等,Appl Environ Microbiol 73:7814-7818
(2007)；Winzer等,J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531-541(2000)，以及来自酿酒酵母ERG10(Hiser等,J.Biol.Chem.269:31383-31389(1994))。来自生枝动胶菌(zoogloea
ramigera)的乙酰乙酰CoA硫解酶在生物合成方向上是不可逆的，并且晶体结构是可获得的(Merilainen等,Biochem 48:11011-25(2009))。这些基因/蛋白质在下表中表示。
(C.acetobutylicum)的thlA和thlB(Hanai等,Appl Environ Microbiol 73:7814-7818
(2007)；Winzer等,J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531-541(2000)，以及来自酿酒酵母ERG10(Hiser等,J.Biol.Chem.269:31383-31389(1994))。来自生枝动胶菌(zoogloea
ramigera)的乙酰乙酰CoA硫解酶在生物合成方向上是不可逆的，并且晶体结构是可获得的(Merilainen等,Biochem 48:11011-25(2009))。这些基因/蛋白质在下表中表示。
[0397]基因 GenBank ID GI号 生物体
AtoB NP_416728 16130161 大肠杆菌
ThlA NP_349476.1 15896127 丙酮丁醇梭菌
ThlB NP_149242.1 15004782 丙酮丁醇梭菌
ERG10 NP_015297 6325229 酿酒酵母
phbA P07097.4 135759 生枝动胶菌
AtoB NP_416728 16130161 大肠杆菌
ThlA NP_349476.1 15896127 丙酮丁醇梭菌
ThlB NP_149242.1 15004782 丙酮丁醇梭菌
ERG10 NP_015297 6325229 酿酒酵母
phbA P07097.4 135759 生枝动胶菌
[0398] 图1：步骤D：乙酰乙酰CoA还原酶
[0399] 合适的酶活性是1.1.1.a氧化还原酶(氧到醇)。参见本文。另外，乙酰乙酰CoA还原酶(EC 1.1.1.36)催化乙酰乙酰CoA还原成3-羟基丁酰CoA。该酶在梭菌纲(Clostridia)的数个物种中参与到丁酸酯的乙酰CoA发酵途径，并且已被详细研究(Jones等,Microbiol Rev.50:484-524(1986))。乙酰乙酰CoA还原酶还参与许多生物体中的聚羟基丁酸酯生物合成，并且也已经用于过量产生PHB和3-羟基异丁酸酯的代谢改造应用(Liu等,
Appl .Microbiol .Biotechnol .76:811-818(2007) ；Qui等 ,
Appl.Microbiol.Biotechnol.69:537-542(2006))。由hbd编码的来自丙酮丁醇梭菌的酶已被克隆并在大肠杆菌中功能性表达(Youngleson等,J Bacteriol.171:6800-6807(1989))。
另外的基因候选物包括来自生枝动胶菌的phbB(Ploux等,Eur.J Biochem.174:177-182
(1988))和来自类球红细菌的phaB(Alber等,Mol.Microbiol61:297-309(2006))。生枝动胶菌(Z.ramigera)基因是NADPH依赖性的，并且该基因已经在大肠杆菌中表达(Peoples等,
Mol.Microbiol 3:349-357(1989))。对基因的底物特异性研究得出以下结论：除乙酰乙酰CoA之外，其还可接受3-氧代丙酰CoA作为底物(Ploux等,Eur.J Biochem.174:177-182
(1988))。另外的基因：包括在脱氮硝副球菌(Paracoccus denitrificans)中的phaB、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)中的Hbd1(C端结构域)和Hbd2(N端结构域)(Hillmer和
Gottschalk,Biochim.Biophys.Acta 3334:12-23(1974))，以及牛中的HSD17B10(Wakil等,J Biol.Chem.207:631-638(1954))。来自脱氮副球菌的酶已在大肠杆菌中功能性表达和表征(Yabutani等,FEMS Microbiol Lett.133:85-90(1995))。已在梭菌属的另一些物种中和勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)中发现了许多类似的酶(Berg等,Science.318:
1782-1786(2007))。来自热带念珠菌(Candida tropicalis)的酶是过氧化物酶体脂肪酸β-氧化多功能酶2型(MFE-2)的组分。该蛋白质的脱氢酶B结构域对乙酰乙酰CoA具有催化活
性。该结构域已经在大肠杆菌中功能性表达，晶体结构是可获得的，并且催化机理是充分已知的(Ylianttila等,Biochem Biophys Res Commun 324:25-30(2004)；Ylianttila等,J Mol Biol 358:1286-1295(2006))。
Appl .Microbiol .Biotechnol .76:811-818(2007) ；Qui等 ,
Appl.Microbiol.Biotechnol.69:537-542(2006))。由hbd编码的来自丙酮丁醇梭菌的酶已被克隆并在大肠杆菌中功能性表达(Youngleson等,J Bacteriol.171:6800-6807(1989))。
另外的基因候选物包括来自生枝动胶菌的phbB(Ploux等,Eur.J Biochem.174:177-182
(1988))和来自类球红细菌的phaB(Alber等,Mol.Microbiol61:297-309(2006))。生枝动胶菌(Z.ramigera)基因是NADPH依赖性的，并且该基因已经在大肠杆菌中表达(Peoples等,
Mol.Microbiol 3:349-357(1989))。对基因的底物特异性研究得出以下结论：除乙酰乙酰CoA之外，其还可接受3-氧代丙酰CoA作为底物(Ploux等,Eur.J Biochem.174:177-182
(1988))。另外的基因：包括在脱氮硝副球菌(Paracoccus denitrificans)中的phaB、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)中的Hbd1(C端结构域)和Hbd2(N端结构域)(Hillmer和
Gottschalk,Biochim.Biophys.Acta 3334:12-23(1974))，以及牛中的HSD17B10(Wakil等,J Biol.Chem.207:631-638(1954))。来自脱氮副球菌的酶已在大肠杆菌中功能性表达和表征(Yabutani等,FEMS Microbiol Lett.133:85-90(1995))。已在梭菌属的另一些物种中和勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)中发现了许多类似的酶(Berg等,Science.318:
1782-1786(2007))。来自热带念珠菌(Candida tropicalis)的酶是过氧化物酶体脂肪酸β-氧化多功能酶2型(MFE-2)的组分。该蛋白质的脱氢酶B结构域对乙酰乙酰CoA具有催化活
性。该结构域已经在大肠杆菌中功能性表达，晶体结构是可获得的，并且催化机理是充分已知的(Ylianttila等,Biochem Biophys Res Commun 324:25-30(2004)；Ylianttila等,J Mol Biol 358:1286-1295(2006))。
[0400]
[0401]
[0402] 图1：步骤J：3-羟基丁酰CoA脱水酶
[0403] EC 4.2.1水裂解酶提供合适的酶活性，并在下文和本文中进行描述。由ech编码的来自恶臭假单胞菌的烯酰CoA水合酶催化3-羟基丁酰CoA转化为巴豆酰CoA(Roberts等,Arch.Microbiol 117:99-108(1978))。这种转化也由丙酮丁醇梭菌的crt基因产物、克氏梭菌的crt1基因产物和其他梭菌属生物催化(Atsumi等,Metab Eng 10:305-311(2008)；
Boynton等,J Bacteriol.178:3015-3024(1996)；Hillmer等,FEBS Lett.21:351-354
(1972)))。另外的烯酰CoA水合酶候选物是来自恶臭假单胞菌(P.putida)的phaA和phaB，以及来自荧光假单胞菌(P.fluorescens)的paaA和paaB(Olivera等,Proc.Natl.Acad.Sci
U.S.A 95:6419-6424(1998))。预测沼泽红假单胞菌中pimF的基因产物编码参与庚二酰CoA降解的烯酰CoA水合酶(Harrison等,Microbiology 151:727-736(2005))。最后，许多大肠杆菌基因已被证明显示烯酰CoA水合酶功能性，包括maoC(Park等,J Bacteriol.185:5391-
5397(2003))、paaF(Ismail等,Eur.J Biochem.270:3047-3054(2003)；Park等,
Appl.Biochem.Biotechnol 113-116:335-346(2004)；Park等,Biotechnol Bioeng 86:
681-686(2004))和paaG(Ismail等,Eur.J Biochem.270:3047-3054(2003)；Park和Lee,
Appl.Biochem.Biotechnol 113-116:335-346(2004)；Park和Yup,Biotechnol Bioeng 86:
681-686(2004))。
Boynton等,J Bacteriol.178:3015-3024(1996)；Hillmer等,FEBS Lett.21:351-354
(1972)))。另外的烯酰CoA水合酶候选物是来自恶臭假单胞菌(P.putida)的phaA和phaB，以及来自荧光假单胞菌(P.fluorescens)的paaA和paaB(Olivera等,Proc.Natl.Acad.Sci
U.S.A 95:6419-6424(1998))。预测沼泽红假单胞菌中pimF的基因产物编码参与庚二酰CoA降解的烯酰CoA水合酶(Harrison等,Microbiology 151:727-736(2005))。最后，许多大肠杆菌基因已被证明显示烯酰CoA水合酶功能性，包括maoC(Park等,J Bacteriol.185:5391-
5397(2003))、paaF(Ismail等,Eur.J Biochem.270:3047-3054(2003)；Park等,
Appl.Biochem.Biotechnol 113-116:335-346(2004)；Park等,Biotechnol Bioeng 86:
681-686(2004))和paaG(Ismail等,Eur.J Biochem.270:3047-3054(2003)；Park和Lee,
Appl.Biochem.Biotechnol 113-116:335-346(2004)；Park和Yup,Biotechnol Bioeng 86:
681-686(2004))。
[0404]
[0405]
[0406] 图1：步骤K：巴豆酰CoA还原酶(醛形成)
[0407] EC 1.2.1.b氧化还原酶(酰基CoA到醛)提供合适的酶活性。1.2.1家族中的酰基CoA还原酶将酰基CoA还原成其对应的醛。在公开文献中已经描述了几种酰基CoA还原酶，并且代表用于该步骤的合适候选物。酰基CoA还原酶或酰化醛脱氢酶将酰基CoA还原成其对应的醛。示例性的酶包括下表中所示的脂肪酰CoA还原酶、琥珀酰CoA还原酶(EC 1.2.1.76)、乙酰CoA还原酶、丁酰CoA还原酶、丙酰CoA还原酶(EC1.2.1.3)等等。
[0408]
[0409] 示例性的脂肪酰CoA还原酶由乙酸钙不动杆菌(Reiser,Journal of Bacteriology 179:2969-2975(1997))和不动杆菌属物种M-1(Acinetobacter sp.M-1)
(Ishige等,Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002))的acr1编码。具有琥珀酰CoA还原酶活性的酶由克氏梭菌的sucD(Sohling,J.Bacteriol.178:871-880(1996))和牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的sucD(Takahashi,J.Bacteriol 182:4704-4710(2000))编码。
另外的琥珀酰CoA还原酶参与嗜热古细菌的3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环，所述嗜热古细菌包括勤奋金属球菌(Berg等,Science 318:1782-1786(2007))和嗜中性热变形菌
(Thermoproteus neutrophilus)(Ramos-Vera等,J Bacteriol.,191:4286-4297(2009))。
由Msed_0709编码的勤奋金属球菌酶严格依赖于NADPH并且还具有丙二酰CoA还原酶活性。
嗜中性热变形菌(T.neutrophilus)酶对NADPH和NADH二者都有活性。由bphG编码的假单胞菌属中的乙酰化乙醛脱氢酶是另一种酶，因为已经证明其氧化和乙酰化乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛(Powlowski,J.Bacteriol.175:377-385(1993))。除将乙酰CoA还原成乙醇之外，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示还将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰CoA(Kazahaya,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972)；和Koo等,Biotechnol Lett.27:505-
510(2005))。丁醛脱氢酶在产溶剂生物如糖丁酸梭菌中催化类似反应：将丁酰CoA转化为丁醛(Kosaka等,Biosci Biotechnol Biochem.,71:58-68(2007))。示例性的丙酰CoA还原酶包括鼠伤寒沙门氏菌LT2的pduP(Leal,Arch.Microbiol.180:353-361(2003))和来自大肠
杆菌的eutE(Skraly,WO专利号2004/024876)。将丙酰CoA天然转化为丙醛的鼠伤寒沙门氏菌LT2的丙酰CoA还原酶也催化5-羟基戊酰CoA还原为5-羟基戊醛(WO 2010/068953A2)。
(Ishige等,Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002))的acr1编码。具有琥珀酰CoA还原酶活性的酶由克氏梭菌的sucD(Sohling,J.Bacteriol.178:871-880(1996))和牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的sucD(Takahashi,J.Bacteriol 182:4704-4710(2000))编码。
另外的琥珀酰CoA还原酶参与嗜热古细菌的3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环，所述嗜热古细菌包括勤奋金属球菌(Berg等,Science 318:1782-1786(2007))和嗜中性热变形菌
(Thermoproteus neutrophilus)(Ramos-Vera等,J Bacteriol.,191:4286-4297(2009))。
由Msed_0709编码的勤奋金属球菌酶严格依赖于NADPH并且还具有丙二酰CoA还原酶活性。
嗜中性热变形菌(T.neutrophilus)酶对NADPH和NADH二者都有活性。由bphG编码的假单胞菌属中的乙酰化乙醛脱氢酶是另一种酶，因为已经证明其氧化和乙酰化乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛(Powlowski,J.Bacteriol.175:377-385(1993))。除将乙酰CoA还原成乙醇之外，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示还将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰CoA(Kazahaya,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972)；和Koo等,Biotechnol Lett.27:505-
510(2005))。丁醛脱氢酶在产溶剂生物如糖丁酸梭菌中催化类似反应：将丁酰CoA转化为丁醛(Kosaka等,Biosci Biotechnol Biochem.,71:58-68(2007))。示例性的丙酰CoA还原酶包括鼠伤寒沙门氏菌LT2的pduP(Leal,Arch.Microbiol.180:353-361(2003))和来自大肠
杆菌的eutE(Skraly,WO专利号2004/024876)。将丙酰CoA天然转化为丙醛的鼠伤寒沙门氏菌LT2的丙酰CoA还原酶也催化5-羟基戊酰CoA还原为5-羟基戊醛(WO 2010/068953A2)。
[0410]蛋白质 GenBank ID GI号 生物体
acr1 YP_047869.1 50086359 乙酸钙不动杆菌
acr1 AAC45217 1684886 贝利不动杆菌
acr1 BAB85476.1 18857901 不动杆菌属菌株M-1
MSED_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋金属球菌
Tneu_0421 ACB39369.1 170934108 嗜中性热变形菌
sucD P38947.1 172046062 克氏梭菌
sucD NP_904963.1 34540484 牙龈卟啉单胞菌
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌属
adhE AAV66076.1 55818563 肠系膜明串珠菌
bld AAP42563.1 31075383 糖丁酸梭菌
pduP NP_460996 16765381 鼠伤寒沙门氏菌LT2
eutE NP_416950 16130380 大肠杆菌
acr1 YP_047869.1 50086359 乙酸钙不动杆菌
acr1 AAC45217 1684886 贝利不动杆菌
acr1 BAB85476.1 18857901 不动杆菌属菌株M-1
MSED_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋金属球菌
Tneu_0421 ACB39369.1 170934108 嗜中性热变形菌
sucD P38947.1 172046062 克氏梭菌
sucD NP_904963.1 34540484 牙龈卟啉单胞菌
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌属
adhE AAV66076.1 55818563 肠系膜明串珠菌
bld AAP42563.1 31075383 糖丁酸梭菌
pduP NP_460996 16765381 鼠伤寒沙门氏菌LT2
eutE NP_416950 16130380 大肠杆菌
[0411] 将酰基CoA转化为其对应醛的另外酶是丙二酰CoA还原酶，其将丙二酰CoA转化为丙二酸半醛。丙二酰CoA还原酶是在嗜热嗜酸古细菌中通过3-羟基丙酸循环进行自养碳固定中的关键酶(Berg,Science318:1782-1786(2007)；和Thauer,Science 318:1732-1733
(2007))。该酶利用NADPH作为辅因子，并已在金属球菌属(Metallosphaera)和硫化叶菌属(Sulfolobus sp.)中表征(Alber等,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Hugler,
J.Bacteriol.184:2404-2410(2002))。该酶由勤奋金属球菌中的Msed_0709编码(Alber等,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Berg,Science 318:1782-1786(2007))。已克隆来自Sulfolobus tokodaii的编码丙二酰CoA还原酶的基因并在大肠杆菌中异源表达(Alber
等,J.Bacteriol188:8551-8559(2006)。该酶还显示催化甲基丙二酰CoA转化为其对应醛
(WO2007141208(2007))。虽然这些酶的醛脱氢酶功能类似于来自嗜热光全绿丝菌的双功能脱氢酶，但几乎没有序列相似性。两种丙二酰CoA还原酶候选物均与天冬氨酸-半醛脱氢酶具有高序列相似性，天冬氨酸-半醛脱氢酶是催化天冬氨酰-4-磷酸还原并同时去磷酸化为天冬氨酸半醛的酶。另外的基因候选物可以通过与其他生物体(包括硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌)中的蛋白质的序列同源性而发现，并且已经在下面列出。用于CoA-酰化醛脱氢酶的另一种候选物是来自拜氏梭菌的ald基因(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:
4973-4980(1999)。已经报道这种酶将乙酰CoA和丁酰CoA还原成其对应的醛。该基因与编码鼠 伤寒沙门氏 菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶的eutE非常 相似 (To th ,
Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999))。
(2007))。该酶利用NADPH作为辅因子，并已在金属球菌属(Metallosphaera)和硫化叶菌属(Sulfolobus sp.)中表征(Alber等,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Hugler,
J.Bacteriol.184:2404-2410(2002))。该酶由勤奋金属球菌中的Msed_0709编码(Alber等,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Berg,Science 318:1782-1786(2007))。已克隆来自Sulfolobus tokodaii的编码丙二酰CoA还原酶的基因并在大肠杆菌中异源表达(Alber
等,J.Bacteriol188:8551-8559(2006)。该酶还显示催化甲基丙二酰CoA转化为其对应醛
(WO2007141208(2007))。虽然这些酶的醛脱氢酶功能类似于来自嗜热光全绿丝菌的双功能脱氢酶，但几乎没有序列相似性。两种丙二酰CoA还原酶候选物均与天冬氨酸-半醛脱氢酶具有高序列相似性，天冬氨酸-半醛脱氢酶是催化天冬氨酰-4-磷酸还原并同时去磷酸化为天冬氨酸半醛的酶。另外的基因候选物可以通过与其他生物体(包括硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌)中的蛋白质的序列同源性而发现，并且已经在下面列出。用于CoA-酰化醛脱氢酶的另一种候选物是来自拜氏梭菌的ald基因(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:
4973-4980(1999)。已经报道这种酶将乙酰CoA和丁酰CoA还原成其对应的醛。该基因与编码鼠 伤寒沙门氏 菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶的eutE非常 相似 (To th ,
Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999))。
[0412]蛋白质 GenBank ID GI号 生物体
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋金属球菌
Mcr NP_378167.1 15922498 Sulfolobus tokodaii
asd-2 NP_343563.1 15898958 硫磺矿硫化叶菌
Saci_2370 YP_256941.1 70608071 嗜酸热硫化叶菌
Ald AAT66436 49473535 拜氏梭菌
eutE AAA80209 687645 鼠伤寒沙门氏菌
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋金属球菌
Mcr NP_378167.1 15922498 Sulfolobus tokodaii
asd-2 NP_343563.1 15898958 硫磺矿硫化叶菌
Saci_2370 YP_256941.1 70608071 嗜酸热硫化叶菌
Ald AAT66436 49473535 拜氏梭菌
eutE AAA80209 687645 鼠伤寒沙门氏菌
[0413] 4-羟基丁酰CoA还原酶催化4-羟基丁酰CoA还原为其对应的醛。几种酰基CoA脱氢酶能够催化这种活性。克氏梭菌和牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的琥珀酸半醛脱氢酶
(SucD)在参考文献(WO/2008/115840)中显示将4-羟基丁酰CoA转化为4-羟基丁醛作为产生
1,4-丁二醇的途径的一部分。许多丁醛脱氢酶对4-羟基丁醛也具有活性，包括糖丁酸梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)的bld和假单胞菌属的bphG(Powlowski等,
J.Bacteriol.175:377-385(1993))。另一候选物是来自拜氏梭菌的ald基因(Toth,
Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。该基因与编码鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶的eutE非常相似(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。
下面鉴定了具有4-羟基丁酰CoA还原酶活性的这些和另外的蛋白质。
(SucD)在参考文献(WO/2008/115840)中显示将4-羟基丁酰CoA转化为4-羟基丁醛作为产生
1,4-丁二醇的途径的一部分。许多丁醛脱氢酶对4-羟基丁醛也具有活性，包括糖丁酸梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)的bld和假单胞菌属的bphG(Powlowski等,
J.Bacteriol.175:377-385(1993))。另一候选物是来自拜氏梭菌的ald基因(Toth,
Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。该基因与编码鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶的eutE非常相似(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。
下面鉴定了具有4-羟基丁酰CoA还原酶活性的这些和另外的蛋白质。
[0414]蛋白质 GenBank ID GI号 生物体
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌属
ald YP_001310903.1 150018649 拜氏梭菌NCIMB 8052
Ald ZP_03778292.1 225569267 Clostridium hylemonae DSM 15053
Ald ZP_03705305.1 225016072 甲基戊糖梭菌DSM 5476
Ald ZP_03715465.1 225026273 霍氏真细菌DSM 3353
Ald ZP_01962381.1 153809713 卵瘤胃球菌ATCC 29174
Ald YP_003701164.1 297585384 砷还原芽孢杆菌MLS10
Ald AAP42563.1 31075383 糖丁酸梭菌N1-4
Ald YP_795711.1 116334184 短乳杆菌ATCC 367
Ald YP_002434126.1 218782808 Desulfatibacillum alkenivorans AK-01
Ald YP_001558295.1 160879327 Clostridium phytofermentans ISDg
Ald ZP_02089671.1 160942363 鲍氏梭菌ATCC BAA-613
Ald ZP_01222600.1 90414628 深海发光菌3TCK
Ald YP_001452373.1 157145054 柯氏柠檬酸杆菌ATCC BAA-895
Ald NP_460996.1 16765381 鼠伤寒肠道沙门氏菌
Ald YP_003307836.1 269119659 白蚁塞巴鲁德菌ATCC 33386
Ald ZP_04969437.1 254302079 具核梭杆菌多形亚种ATCC 10953
Ald YP_002892893.1 237808453 Tolumonas auensis DSM 9187
Ald YP_426002.1 83592250 深红红螺菌ATCC 11170
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌属
ald YP_001310903.1 150018649 拜氏梭菌NCIMB 8052
Ald ZP_03778292.1 225569267 Clostridium hylemonae DSM 15053
Ald ZP_03705305.1 225016072 甲基戊糖梭菌DSM 5476
Ald ZP_03715465.1 225026273 霍氏真细菌DSM 3353
Ald ZP_01962381.1 153809713 卵瘤胃球菌ATCC 29174
Ald YP_003701164.1 297585384 砷还原芽孢杆菌MLS10
Ald AAP42563.1 31075383 糖丁酸梭菌N1-4
Ald YP_795711.1 116334184 短乳杆菌ATCC 367
Ald YP_002434126.1 218782808 Desulfatibacillum alkenivorans AK-01
Ald YP_001558295.1 160879327 Clostridium phytofermentans ISDg
Ald ZP_02089671.1 160942363 鲍氏梭菌ATCC BAA-613
Ald ZP_01222600.1 90414628 深海发光菌3TCK
Ald YP_001452373.1 157145054 柯氏柠檬酸杆菌ATCC BAA-895
Ald NP_460996.1 16765381 鼠伤寒肠道沙门氏菌
Ald YP_003307836.1 269119659 白蚁塞巴鲁德菌ATCC 33386
Ald ZP_04969437.1 254302079 具核梭杆菌多形亚种ATCC 10953
Ald YP_002892893.1 237808453 Tolumonas auensis DSM 9187
Ald YP_426002.1 83592250 深红红螺菌ATCC 11170
[0415] 图1：步骤L：巴豆酰CoA水解酶、转移酶或合成酶
[0416] EC 3.1.2.a辅酶A水解酶、EC 2.8.3.a CoA转移酶和/或EC 6.2.1.a CoA合成酶提供合适的酶活性，并且在本文和下面的部分中进行描述。
[0417] EC 3.1.2.a CoA水解酶。3.1.2家族中的酶将酰基CoA分子水解成其对应的酸。文献中已经描述了几种这样的酶并且代表用于这些步骤的合适候选物。
[0418] 例如，由来自褐鼠脑的acot12(Robinson等,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959-965(1976))编码的酶可以与丁酰CoA、己酰-CoA和丙二酰CoA反应。由acot8编码的人二羧酸硫酯酶对戊二酰CoA、己二酰CoA、辛二酰(suberyl)CoA、癸二酰(sebacyl)CoA和十二烷二酰CoA显示出活性(Westin等,J.Biol.Chem.280:38125-38132(2005))。与该酶最接近的大肠杆菌同源物tesB也可以水解一系列CoA硫酯(Naggert等,J Biol Chem 266:11044-
11050(1991))。在大鼠肝中也已经表征了类似的酶(Deana R.,Biochem Int 26:767-773
(1992))。在大肠杆菌中具有水解酶活性的另外酶包括ybgC、paaI和ybdB(Kuznetsova,等,FEMSMicrobiol Rev,2005,29(2):263-279；Song等,J Biol Chem,2006,281(16):11028-
38)。尽管序列尚未报道，但来自豌豆叶线粒体的酶具有广泛的底物特异性，其中对乙酰CoA、丙酰CoA、丁酰CoA、棕榈酰CoA、油酰CoA、琥珀酰CoA和巴豆酰CoA的活性已证明(Zeiher等,Plant.Physiol.94:20-27(1990))。来自酿酒酵母的乙酰CoA水解酶ACH1代表另一候选水解酶(Buu等,J.Biol.Chem.278:17203-17209(2003))。
11050(1991))。在大鼠肝中也已经表征了类似的酶(Deana R.,Biochem Int 26:767-773
(1992))。在大肠杆菌中具有水解酶活性的另外酶包括ybgC、paaI和ybdB(Kuznetsova,等,FEMSMicrobiol Rev,2005,29(2):263-279；Song等,J Biol Chem,2006,281(16):11028-
38)。尽管序列尚未报道，但来自豌豆叶线粒体的酶具有广泛的底物特异性，其中对乙酰CoA、丙酰CoA、丁酰CoA、棕榈酰CoA、油酰CoA、琥珀酰CoA和巴豆酰CoA的活性已证明(Zeiher等,Plant.Physiol.94:20-27(1990))。来自酿酒酵母的乙酰CoA水解酶ACH1代表另一候选水解酶(Buu等,J.Biol.Chem.278:17203-17209(2003))。
[0419]蛋白质 GenBank登录号 GI号 生物体
acot12 NP_570103.1 18543355 褐鼠
tesB NP_414986 16128437 大肠杆菌
acot8 CAA15502 3191970 智人
acot8 NP_570112 51036669 褐鼠
tesA NP_415027 16128478 大肠杆菌
ybgC NP_415264 16128711 大肠杆菌
paaI NP_415914 16129357 大肠杆菌
ybdB NP_415129 16128580 大肠杆菌
ACH1 NP_009538 6319456 酿酒酵母
acot12 NP_570103.1 18543355 褐鼠
tesB NP_414986 16128437 大肠杆菌
acot8 CAA15502 3191970 智人
acot8 NP_570112 51036669 褐鼠
tesA NP_415027 16128478 大肠杆菌
ybgC NP_415264 16128711 大肠杆菌
paaI NP_415914 16129357 大肠杆菌
ybdB NP_415129 16128580 大肠杆菌
ACH1 NP_009538 6319456 酿酒酵母
[0420] 另外的水解酶包括3-羟基异丁酰CoA水解酶，其已被描述为在缬氨酸降解期间有效地催化3-羟基异丁酰CoA转化为3-羟基异丁酸(Shimomura等,J Biol Chem.269:14248-
14253(1994))。编码该酶的基因包括褐鼠(Shimomura等,Methods Enzymol.324:229-240
(2000))和智人(Shimomura等,同上)的hibch。类似的基因候选物也可以通过序列同源性来鉴定，包括酿酒酵母的hibch和蜡状芽孢杆菌的BC_2292。
14253(1994))。编码该酶的基因包括褐鼠(Shimomura等,Methods Enzymol.324:229-240
(2000))和智人(Shimomura等,同上)的hibch。类似的基因候选物也可以通过序列同源性来鉴定，包括酿酒酵母的hibch和蜡状芽孢杆菌的BC_2292。
[0421]蛋白质 GenBank No. GI号 生物体
hibch Q5XIE6.2 146324906 褐鼠
hibch Q6NVY1.2 146324905 智人
hibch P28817.2 2506374 酿酒酵母
BC_2292 AP09256 29895975 蜡状芽孢杆菌
hibch Q5XIE6.2 146324906 褐鼠
hibch Q6NVY1.2 146324905 智人
hibch P28817.2 2506374 酿酒酵母
BC_2292 AP09256 29895975 蜡状芽孢杆菌
[0422] EC 2.8.3.a CoA转移酶。2.8.3家族中的酶催化CoA部分从一个分子到另一个分子的可逆转移。在公开文献中已经描述了几种CoA转移酶，并且代表用于这些步骤的合适的候选物。这些在下面描述。
[0423] 许多转移酶具有广泛的特异性，因此可以利用多样的CoA分子，如乙酸、琥珀酸、丙酸、丁酸、2-甲基乙酰乙酸、3-酮己酸、3-酮戊酸、戊酸、巴豆酸、3-巯基丙酸、丙酸、乙烯基乙酸、丁酸等。例如，来自罗氏菌属物种A2-183(Roseburia sp.A2-183)的酶显示具有丁酰CoA:乙酸：CoA转移酶和丙酰CoA:乙酸:CoA转移酶活性(Charrier等,Microbiology 152,179-185(2006))。在例如肠道罗斯氏菌L1-82(Roseburia intestinalis L1-82)、
Roseburia inulinivorans DSM 16841、直肠真细菌ATCC 33656(Eubacterium rectale
ATCC 33656)中可以发现密切同源物。具有丙酰CoA转移酶活性的另一种酶可以在丙酸梭菌(Clostridium propionicum)中发现(Selmer等,Eur J Biochem 269,372-380(2002))。该酶可以使用乙酸、(R)-乳酸、(S)-乳酸、丙烯酸和丁酸作为CoA受体(Selmer等,Eur J
Biochem 269,372-380(2002)；Schweiger和Buckel,FEBS Letters,171(1)79-84(1984))。
例如，可以在例如诺维氏梭菌NT(Clostridium novyi NT)、拜氏梭菌NCIMB 8052和肉毒梭菌C菌株Eklund中发现密切同源物。YgfH在大肠杆菌中编码丙酰CoA:琥珀酸CoA转移酶
(Haller等,Biochemistry,39(16)4622-4629)。在例如杨氏柠檬酸杆菌ATCC 29220、肠道沙门氏菌亚种arizonae血清变型(Salmonella enterica subsp.arizonae serovar)和中间
耶尔森菌ATCC 29909中发现亲近的同源物。
Roseburia inulinivorans DSM 16841、直肠真细菌ATCC 33656(Eubacterium rectale
ATCC 33656)中可以发现密切同源物。具有丙酰CoA转移酶活性的另一种酶可以在丙酸梭菌(Clostridium propionicum)中发现(Selmer等,Eur J Biochem 269,372-380(2002))。该酶可以使用乙酸、(R)-乳酸、(S)-乳酸、丙烯酸和丁酸作为CoA受体(Selmer等,Eur J
Biochem 269,372-380(2002)；Schweiger和Buckel,FEBS Letters,171(1)79-84(1984))。
例如，可以在例如诺维氏梭菌NT(Clostridium novyi NT)、拜氏梭菌NCIMB 8052和肉毒梭菌C菌株Eklund中发现密切同源物。YgfH在大肠杆菌中编码丙酰CoA:琥珀酸CoA转移酶
(Haller等,Biochemistry,39(16)4622-4629)。在例如杨氏柠檬酸杆菌ATCC 29220、肠道沙门氏菌亚种arizonae血清变型(Salmonella enterica subsp.arizonae serovar)和中间
耶尔森菌ATCC 29909中发现亲近的同源物。
[0424]
[0425] 另外的候选酶是已经显示具有3-氧代己二酰CoA/琥珀酸转移酶活性由假单胞菌属中的pcaI和pcaJ编码的双单元酶(Kaschabek等,同上)。不动杆菌属物种ADP1(Kowalchuk等,Gene 146:23-30(1994))和天蓝色链霉菌中存在基于同源性的类似酶。另外的示例性琥珀酰-CoA:3:氧代酸CoA转移酶存在于幽门螺杆菌(Corthesy-Theulaz等,
J.Biol .Chem.272:25659-25667(1997))和枯草芽孢杆菌(Stols等,
Protein.Expr.Purif.53:396-403(2007))中。这些蛋白质如下所示。
J.Biol .Chem.272:25659-25667(1997))和枯草芽孢杆菌(Stols等,
Protein.Expr.Purif.53:396-403(2007))中。这些蛋白质如下所示。
[0426]蛋白质 GenBank ID GI号 生物体
pcaI AAN69545.1 24985644 恶臭假单胞菌
pcaJ NP_746082.1 26990657 恶臭假单胞菌
pcaI YP_046368.1 50084858 ADP1
pcaJ AAC37147.1 141776 不动杆菌属物种ADP1
pcaI NP_630776.1 21224997 天蓝色链霉菌
pcaJ NP_630775.1 21224996 天蓝色链霉菌
HPAG1_0676 YP_627417 108563101 幽门螺杆菌
HPAG1_0677 YP_627418 108563102 幽门螺杆菌
ScoA NP_391778 16080950 枯草芽孢杆菌
ScoB NP_391777 16080949 枯草芽孢杆菌
pcaI AAN69545.1 24985644 恶臭假单胞菌
pcaJ NP_746082.1 26990657 恶臭假单胞菌
pcaI YP_046368.1 50084858 ADP1
pcaJ AAC37147.1 141776 不动杆菌属物种ADP1
pcaI NP_630776.1 21224997 天蓝色链霉菌
pcaJ NP_630775.1 21224996 天蓝色链霉菌
HPAG1_0676 YP_627417 108563101 幽门螺杆菌
HPAG1_0677 YP_627418 108563102 幽门螺杆菌
ScoA NP_391778 16080950 枯草芽孢杆菌
ScoB NP_391777 16080949 枯草芽孢杆菌
[0427] 可以利用乙酸作为CoA受体的CoA转移酶是由大肠杆菌atoA(α亚基)和atoD(β亚基)基因编码的乙酰乙酰CoA转移酶(Vanderwinkel等,Biochem.Biophys.Res Commun.33:
902-908(1968)；Korolev等,Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.58:2116-2121
(2002))。该酶还显示出将CoA部分从各种支链和线性酰基-CoA底物(包括异丁酸(Matthies等,Appl Environ Microbiol 58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等,同上)和丁酸(Vanderwinkel等，同上)转移到乙酸。类似的酶存在于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(Duncan等,Appl Environ Microbiol 68:5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等,Appl
Environ Microbiol 56:1576-1583(1990))和糖丁酸梭菌(Kosaka等,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))中。这些蛋白质如下所示。
902-908(1968)；Korolev等,Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.58:2116-2121
(2002))。该酶还显示出将CoA部分从各种支链和线性酰基-CoA底物(包括异丁酸(Matthies等,Appl Environ Microbiol 58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等,同上)和丁酸(Vanderwinkel等，同上)转移到乙酸。类似的酶存在于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(Duncan等,Appl Environ Microbiol 68:5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等,Appl
Environ Microbiol 56:1576-1583(1990))和糖丁酸梭菌(Kosaka等,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))中。这些蛋白质如下所示。
[0428]
[0429]
[0430] 另外的示例性转移酶候选物由已经显示分别展现出琥珀酰CoA、4-羟基丁酰CoA和丁酰CoA转移酶活性的克氏梭菌的cat1、cat2和cat3的基因产物催化(Seedorf等,同上；Sohling等,Eur.J Biochem.212:121-127(1993)；Sohling等,J Bacteriol.178:871-880
(1996))。类似的CoA转移酶活性也存在于阴道毛滴虫(van Grinsven等,J.Biol.Chem.283:
1411-1418(2008))和布氏锥虫(van Grinsven等,J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008))中。
这些蛋白质如下所示。
(1996))。类似的CoA转移酶活性也存在于阴道毛滴虫(van Grinsven等,J.Biol.Chem.283:
1411-1418(2008))和布氏锥虫(van Grinsven等,J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008))中。
这些蛋白质如下所示。
[0431]蛋白质 GenBank ID GI号 生物体
cat1 P38946.1 729048 克氏梭菌
cat2 P38942.2 172046066 克氏梭菌
cat3 EDK35586.1 146349050 克氏梭菌
TVAG_395550 XP_001330176 123975034 阴道毛滴虫G3
Tb11.02.0290 XP_828352 71754875 布氏锥虫
cat1 P38946.1 729048 克氏梭菌
cat2 P38942.2 172046066 克氏梭菌
cat3 EDK35586.1 146349050 克氏梭菌
TVAG_395550 XP_001330176 123975034 阴道毛滴虫G3
Tb11.02.0290 XP_828352 71754875 布氏锥虫
[0432] 来自厌氧细菌发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)的戊烯二酸-CoA-转移酶(EC 2.8.3.12)与二酸戊烯二酰CoA和3-丁烯酰CoA反应(Mack等,FEBS Lett.405:
209-212(1997))。编码这种酶的基因是gctA和gctB。该酶对包括戊二酰CoA、2-羟基戊二酰CoA、己二酰CoA和丙烯酰CoA的其他CoA衍生物具有降低但可检测的活性(Buckel等,
Eur.J.Biochem.118:315-321(1981))。该酶已被克隆并在大肠杆菌中表达(Mack等,
Eur.J.Biochem.226:41-51(1994))。这些蛋白质如下所示。
209-212(1997))。编码这种酶的基因是gctA和gctB。该酶对包括戊二酰CoA、2-羟基戊二酰CoA、己二酰CoA和丙烯酰CoA的其他CoA衍生物具有降低但可检测的活性(Buckel等,
Eur.J.Biochem.118:315-321(1981))。该酶已被克隆并在大肠杆菌中表达(Mack等,
Eur.J.Biochem.226:41-51(1994))。这些蛋白质如下所示。
[0433]
[0434] EC 6.2.1.a CoA合酶(酸-硫醇连接酶)。酰基-CoA底物向其酸产物的转化可以由6.2.1家族酶中的CoA酸-硫醇连接酶或CoA合成酶催化，其中几种酶是可逆的。已经在文献中描述了催化CoA酸-硫醇连接酶或CoA合成酶活性的几种酶，并且代表用于这些步骤的合适候选物。
[0435] 例如，ADP形成乙酰CoA合成酶(ACD，EC 6.2.1.13)是一种将酰基-CoA酯转化为其对应酸并伴随ATP合成的酶。已显示由AF1211编码的来自闪烁古生球菌的ACD I对包括异丁酸、异戊酸和富马酸在内的各种线性和支链底物起作用(Musfeldt等,J Bacteriol.184:636-644(2002))。由AF1983编码的闪烁古生球菌中的第二种可逆ACD也显示出具有宽的底物范围，对环状化合物苯乙酸酯和吲哚乙酸酯具有高活性(Musfeldt和Schonheit,J
Bacteriol.184:636-644(2002))。来自死海盐盒菌的酶(注释为琥珀酰CoA合成酶)接受丙酸、丁酸和支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物，并且显示其在正向和反向方向上都有作用(Brasen等,Arch Microbiol182:277-287(2004))。来自超嗜热泉古菌耐超高温热棒菌由
PAE3250编码的ACD显示在所述表征ACD中显示出最宽底物范围，与乙酰CoA、异丁酰CoA(优选底物)和苯乙酰CoA反应(Brasen等，同上)。定向进化或改造可用于修饰该酶以在宿主生物体的生理温度下作用。已经将来自闪烁古生球菌(A.fulgidus)、死海盐盒菌
(H.marismortui)和耐超高温热棒菌(P.aerophilum)的酶全部克隆，在大肠杆菌中功能性表达并表征(Brasen和Schonheit,同上；Musfeldt和Schonheit,J Bacteriol.184:636-644(2002))。另外的候选物是由大肠杆菌的sucCD以及酿酒酵母的LSC1和LSC2基因编码的琥珀酰CoA合成酶。这些酶催化在体内可逆的反应中由琥珀酸形成琥珀酰CoA，同时消耗一个ATP(Buck等,Biochemistry 24:6245-6252(1985))。已经证明来自恶臭假单胞菌的酰基CoA连接酶对几种脂族底物起作用，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和辛酸；以及对芳族化合物起作用 ，例如苯乙酸 和苯氧乙酸 (Fernand ez-Valverde等 ,
Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。来自豆科植物根瘤菌(Rhizobium
leguminosarum)的相关酶丙二酰辅酶A合成酶(6.3.4.9)可以将几种二酸，即乙基-丙二酸、丙基-丙二酸、烯丙基-丙二酸、异丙基-丙二酸、二甲基-丙二酸、环丙基-丙二酸、环丙基亚甲基-丙二酸、环丁基-丙二酸、和苄基-丙二酸转化为其对应的一硫代酯(Pohl等,
J.Am.Chem.Soc.123:5822-5823(2001))。
Bacteriol.184:636-644(2002))。来自死海盐盒菌的酶(注释为琥珀酰CoA合成酶)接受丙酸、丁酸和支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物，并且显示其在正向和反向方向上都有作用(Brasen等,Arch Microbiol182:277-287(2004))。来自超嗜热泉古菌耐超高温热棒菌由
PAE3250编码的ACD显示在所述表征ACD中显示出最宽底物范围，与乙酰CoA、异丁酰CoA(优选底物)和苯乙酰CoA反应(Brasen等，同上)。定向进化或改造可用于修饰该酶以在宿主生物体的生理温度下作用。已经将来自闪烁古生球菌(A.fulgidus)、死海盐盒菌
(H.marismortui)和耐超高温热棒菌(P.aerophilum)的酶全部克隆，在大肠杆菌中功能性表达并表征(Brasen和Schonheit,同上；Musfeldt和Schonheit,J Bacteriol.184:636-644(2002))。另外的候选物是由大肠杆菌的sucCD以及酿酒酵母的LSC1和LSC2基因编码的琥珀酰CoA合成酶。这些酶催化在体内可逆的反应中由琥珀酸形成琥珀酰CoA，同时消耗一个ATP(Buck等,Biochemistry 24:6245-6252(1985))。已经证明来自恶臭假单胞菌的酰基CoA连接酶对几种脂族底物起作用，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和辛酸；以及对芳族化合物起作用 ，例如苯乙酸 和苯氧乙酸 (Fernand ez-Valverde等 ,
Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。来自豆科植物根瘤菌(Rhizobium
leguminosarum)的相关酶丙二酰辅酶A合成酶(6.3.4.9)可以将几种二酸，即乙基-丙二酸、丙基-丙二酸、烯丙基-丙二酸、异丙基-丙二酸、二甲基-丙二酸、环丙基-丙二酸、环丙基亚甲基-丙二酸、环丁基-丙二酸、和苄基-丙二酸转化为其对应的一硫代酯(Pohl等,
J.Am.Chem.Soc.123:5822-5823(2001))。
[0436]蛋白质 GenBank ID GI号 生物体
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌
AF1983 NP_070807.1 11499565 闪烁古生球菌
Scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌
PAE3250 NP_560604.1 18313937 耐超高温热棒菌菌株IM2
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
LSC1 NP_014785 6324716 酿酒酵母
LSC2 NP_011760 6321683 酿酒酵母
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
matB AAC83455.1 3982573 豆科植物根瘤菌
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌
AF1983 NP_070807.1 11499565 闪烁古生球菌
Scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌
PAE3250 NP_560604.1 18313937 耐超高温热棒菌菌株IM2
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
LSC1 NP_014785 6324716 酿酒酵母
LSC2 NP_011760 6321683 酿酒酵母
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
matB AAC83455.1 3982573 豆科植物根瘤菌
[0437] 用于这些步骤的另一种候选酶是6-羧基己酸-CoA连接酶，也称为庚二酰CoA连接酶(EC 6.2.1.14)，其在革兰氏阳性细菌的生物素生物合成期间天然地将庚二酸酯活化为庚二酰CoA。显示克隆到大肠杆菌中的来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的所述酶接受替代的底物己二酸和壬二酸(Binieda等,Biochem.J 340(Pt 3):793-801
(1999))。在枯草芽孢杆菌(Bower等,J Bacteriol.178:4122-4130(1996)和球形赖氨酸芽孢杆菌(原名球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))(Ploux等,Biochem.J 287(Pt3):685-
690(1992))中发现另一些候选物
(1999))。在枯草芽孢杆菌(Bower等,J Bacteriol.178:4122-4130(1996)和球形赖氨酸芽孢杆菌(原名球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))(Ploux等,Biochem.J 287(Pt3):685-
690(1992))中发现另一些候选物
[0438]蛋白质 GenBank ID GI号 生物体
bioW NP_390902.2 50812281 枯草芽孢杆菌
bioW CAA10043.1 3850837 门多萨假单胞菌
bioW P22822.1 115012 球形芽孢杆菌
bioW NP_390902.2 50812281 枯草芽孢杆菌
bioW CAA10043.1 3850837 门多萨假单胞菌
bioW P22822.1 115012 球形芽孢杆菌
[0439] 另外的CoA连接酶包括序列尚未表征的大鼠二羧酸-CoA连接酶(Vamecq等,Biochem.J 230:683-693(1985))、两种表征的来自产黄青霉的苯乙酸-CoA连接酶中任一种(Lamas-Maceiras等,Biochem.J 395:147-155(2006)；Wang等,360:453-458(2007))、来自恶臭假单胞菌的苯乙酸-CoA连接酶(Martinez-Blanco等,J Biol Chem 265:7084-7090
(1990))和来自枯草芽孢杆菌的6-羧基己酸-CoA连接酶(Bower等J Bacteriol178(14):
4122-4130(1996))。来自小鼠(Hasegawa等,Biochim Biophys Acta1779:414-419(2008))和智人(Ohgami等,Biochem.Pharmacol.65:989-994(2003))的乙酰乙酰CoA合成酶天然催
化乙酰乙酸向乙酰乙酰CoA的ATP依赖性转化。
(1990))和来自枯草芽孢杆菌的6-羧基己酸-CoA连接酶(Bower等J Bacteriol178(14):
4122-4130(1996))。来自小鼠(Hasegawa等,Biochim Biophys Acta1779:414-419(2008))和智人(Ohgami等,Biochem.Pharmacol.65:989-994(2003))的乙酰乙酰CoA合成酶天然催
化乙酰乙酸向乙酰乙酰CoA的ATP依赖性转化。
[0440]蛋白质 登录号 GI号 生物体
phl CAJ15517.1 77019264 产黄青霉
phlB ABS19624.1 152002983 产黄青霉
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
bioW NP_390902.2 50812281 枯草芽孢杆菌
AACS NP_084486.1 21313520 小鼠
AACS NP_076417.2 31982927 智人
phl CAJ15517.1 77019264 产黄青霉
phlB ABS19624.1 152002983 产黄青霉
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
bioW NP_390902.2 50812281 枯草芽孢杆菌
AACS NP_084486.1 21313520 小鼠
AACS NP_076417.2 31982927 智人
[0441] 类似于他类别的酶，EC类6.2.1中的某些酶也已经被确定具有广泛的底物特异性。已经证明来自恶臭假单胞菌的酰基CoA连接酶对几种脂族底物起作用，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和辛酸；以及对芳族化合物起作用，例如苯乙酸和苯氧乙酸
(Fernandez-Valverde等,Applied and Environmental Microbiology 59:1149-1154
(1993))。来自三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)的相关酶丙二酰CoA合成酶(6.3.4.9)可以将几种二酸，即乙基丙二酸、丙基丙二酸、烯丙基丙二酸、异丙基丙二酸、二甲基丙二酸、环丙基丙二酸、环丙基亚甲基丙二酸、环丁基丙二酸、和苄基丙二酸转化为其对应的一硫代酯(Pohl等,J.Am.Chem.Soc.123:5822-5823(2001))。
(Fernandez-Valverde等,Applied and Environmental Microbiology 59:1149-1154
(1993))。来自三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)的相关酶丙二酰CoA合成酶(6.3.4.9)可以将几种二酸，即乙基丙二酸、丙基丙二酸、烯丙基丙二酸、异丙基丙二酸、二甲基丙二酸、环丙基丙二酸、环丙基亚甲基丙二酸、环丁基丙二酸、和苄基丙二酸转化为其对应的一硫代酯(Pohl等,J.Am.Chem.Soc.123:5822-5823(2001))。
[0442] 图1：步骤M：巴豆酸还原酶：
[0443] 合适的酶活性是1.2.1.e氧化还原酶(酸到醛)，其包括以下物质。
[0444] 酸向醛的转化是热力学不利的，并且通常需要富含能量的辅因子和多个酶促步骤。通过单一酶将酸直接转化为醛是由1.2.1家族中的酸还原酶催化。示例性的酸还原酶包括羧酸还原酶、α-氨基己二酸还原酶和视黄酸还原酶。在艾阿华诺卡菌中发现的羧酸还原酶(CAR)催化羧酸向其对应醛的镁、ATP和NADPH依赖性还原(Venkitasubramanian等,J
Biol.Chem.282:478-485(2007))。该酶的天然底物是苯甲酸，并且该酶显示广泛接受芳族底物，包括对甲苯甲酸(Venkitasubramanian等,Biocatalysis in Pharmaceutical and Biotechnology Industries.CRC press(2006))。克隆由car编码的来自艾阿华诺卡菌的酶并在大肠杆菌中功能性表达(Venkitasubramanian等,J Biol.Chem.282:478-485(2007))。
CAR需要通过磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)的翻译后活化，这将无活性的脱辅基酶转化为活性全酶(Hansen等,Appl.Environ.Microbiol 75:2765-2774(2009))。编码特定
PPTase产物的npt基因的表达改善酶的活性。在灰色链霉菌中发现的另外酶候选物由griC和griD基因编码。认为该酶将3-氨基-4-羟基苯甲酸转化为3-氨基-4-羟基苯甲醛，因为
griC或griD的缺失均导致细胞外3-乙酰基氨基-4-羟基苯甲酸(3-氨基-4-羟基苯甲酸的分路产物)累积(Suzuki,等,J.Antibiot.60(6):380-387(2007))。griC和griD与SGR_665(一种序列与艾阿华诺卡菌npt具有相似性的酶)的共表达可以是有益的。
Biol.Chem.282:478-485(2007))。该酶的天然底物是苯甲酸，并且该酶显示广泛接受芳族底物，包括对甲苯甲酸(Venkitasubramanian等,Biocatalysis in Pharmaceutical and Biotechnology Industries.CRC press(2006))。克隆由car编码的来自艾阿华诺卡菌的酶并在大肠杆菌中功能性表达(Venkitasubramanian等,J Biol.Chem.282:478-485(2007))。
CAR需要通过磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)的翻译后活化，这将无活性的脱辅基酶转化为活性全酶(Hansen等,Appl.Environ.Microbiol 75:2765-2774(2009))。编码特定
PPTase产物的npt基因的表达改善酶的活性。在灰色链霉菌中发现的另外酶候选物由griC和griD基因编码。认为该酶将3-氨基-4-羟基苯甲酸转化为3-氨基-4-羟基苯甲醛，因为
griC或griD的缺失均导致细胞外3-乙酰基氨基-4-羟基苯甲酸(3-氨基-4-羟基苯甲酸的分路产物)累积(Suzuki,等,J.Antibiot.60(6):380-387(2007))。griC和griD与SGR_665(一种序列与艾阿华诺卡菌npt具有相似性的酶)的共表达可以是有益的。
[0445]基因 GenBank登录号 GI号 生物体
car AAR91681.1 40796035 艾阿华诺卡菌
npt ABI83656.1 114848891 艾阿华诺卡菌
griC YP_001825755.1 182438036 灰色链霉菌
griD YP_001825756.1 182438037 灰色链霉菌
car AAR91681.1 40796035 艾阿华诺卡菌
npt ABI83656.1 114848891 艾阿华诺卡菌
griC YP_001825755.1 182438036 灰色链霉菌
griD YP_001825756.1 182438037 灰色链霉菌
[0446] 另外的car和npt基因可以基于序列同源性来鉴定。
[0447]
[0448]
[0449] 具有类似特征的酶α-氨基己二酸还原酶(AAR，EC 1.2.1.31)在一些真菌物种中参与赖氨酸生物合成途径。该酶天然地将α-氨基己二酸还原成α-氨基己二酸半醛。首先通过腺苷酸的ATP依赖性形成活化羧基，然后通过NAD(P)H还原生成醛和AMP。类似于CAR一样，这种酶利用镁，并且需要通过PPTase活化。在酿酒酵母(Morris等,Gene 98:141-145(1991))、白色念珠菌(Guo等,Mol.Genet.Genomics 269:271-279(2003))和粟酒裂殖酵母(Ford等,Curr.Genet.28:131-137(1995))中发现AAR及其相应PPTase的酶候选物。来自粟酒裂殖酵母(S.pombe)的AAR当在大肠杆菌中表达时显示出显著活性(Guo等,Yeast 21:1279-1288
(2004))。来自产黄青霉的AAR接受S-羧甲基-L-半胱氨酸作为替代底物，但不与己二酸、L-谷氨酸或二氨基庚二酸反应(Hijarrubia等,J Biol.Chem.278:8250-8256(2003))。编码产黄青霉PPTase的基因迄今为止还没有被鉴定，并且通过序列比较同源性检索未鉴定出高置信度命中物。
(2004))。来自产黄青霉的AAR接受S-羧甲基-L-半胱氨酸作为替代底物，但不与己二酸、L-谷氨酸或二氨基庚二酸反应(Hijarrubia等,J Biol.Chem.278:8250-8256(2003))。编码产黄青霉PPTase的基因迄今为止还没有被鉴定，并且通过序列比较同源性检索未鉴定出高置信度命中物。
[0450]基因 GenBank登录号 GI号 生物体
LYS2 AAA34747.1 171867 酿酒酵母
LYS5 P50113.1 1708896 酿酒酵母
LYS2 AAC02241.1 2853226 白色念珠菌
LYS5 AAO26020.1 28136195 白色念珠菌
Lys1p P40976.3 13124791 粟酒裂殖酵母
Lys7p Q10474.1 1723561 粟酒裂殖酵母
Lys2 CAA74300.1 3282044 产黄青霉
LYS2 AAA34747.1 171867 酿酒酵母
LYS5 P50113.1 1708896 酿酒酵母
LYS2 AAC02241.1 2853226 白色念珠菌
LYS5 AAO26020.1 28136195 白色念珠菌
Lys1p P40976.3 13124791 粟酒裂殖酵母
Lys7p Q10474.1 1723561 粟酒裂殖酵母
Lys2 CAA74300.1 3282044 产黄青霉
[0451] 图1：步骤N：巴豆醛还原酶。EC 1.1.1.a氧化还原酶(氧到醇)提供了合适的酶活性。EC 1.1.1.a氧化还原酶(氧到醇)包括以下：
[0452] 戊二酸半醛还原酶将戊二酸半醛还原为5-羟基戊酸需要将醛还原为其对应的醇。具有戊二酸半醛还原酶活性的酶包括土曲霉的ATEG_00539基因产物和由4hbd编码的拟南
芥的4-羟基丁酸脱氢酶(WO 2010/068953A2)。克隆拟南芥酶并在酵母中表征(Breitkreuz等,J.Biol.Chem.278:41552-41556(2003))。
芥的4-羟基丁酸脱氢酶(WO 2010/068953A2)。克隆拟南芥酶并在酵母中表征(Breitkreuz等,J.Biol.Chem.278:41552-41556(2003))。
[0453]蛋白质 GENBANK ID GI号 生物体
ATEG_00539 XP_001210625.1 115491995 土曲霉NIH2624
4hbd AAK94781.1 15375068 拟南芥
ATEG_00539 XP_001210625.1 115491995 土曲霉NIH2624
4hbd AAK94781.1 15375068 拟南芥
[0454] 编码催化醛还原成醇的酶(即醇脱氢酶或等同地醛还原酶)的另外基因包括编码C2-C14的中链醇脱氢酶的alrA(Tani et al.,Appl.Environ.Microbiol.66:5231-5235
(2000))、来自大肠杆菌的yqhD和fucO(Sulzenbacher等,342:489-502(2004)))以及来自丙酮丁醇梭菌的bdh I和bdh II，其将丁醛转化为丁醇(Walter等,174:7149-7158(1992))。
YqhD使用NADPH作为辅因子催化广泛范围的醛的还原，其中优选超过C(3)的链长度
(Sulzenbacher等,342:489-502(2004)；Perez等,J Biol.Chem.283:7346-7353(2008))。已经证明来自运动发酵单胞菌E(Zymomonas mobilisE)的adhA基因产物对许多醛(包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛和丙烯醛)具有活性(Kinoshita等,Appl Microbiol Biotechnol 22:249-
254(1985))。另外的醛还原酶候选物由糖丁酸梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)中的bdh以及拜氏梭菌(C.Beijerinckii)中的Cbei_1722、Cbei_2181和Cbei_2421编码。酿酒酵母中的另外醛还原酶基因候选物包括醛还原酶GRE3、ALD2-6和HFD1，乙醛酸还原酶GOR1和YPL113C，以及甘油脱氢酶GCY1(WO 2011/022651A1；Atsumi等等,Nature 451:86-89
(2008))。先前描述用于催化甲基乙二醛还原成丙酮醇或乳醛的酶候选物也是合适的乳醛还原酶候选物。
(2000))、来自大肠杆菌的yqhD和fucO(Sulzenbacher等,342:489-502(2004)))以及来自丙酮丁醇梭菌的bdh I和bdh II，其将丁醛转化为丁醇(Walter等,174:7149-7158(1992))。
YqhD使用NADPH作为辅因子催化广泛范围的醛的还原，其中优选超过C(3)的链长度
(Sulzenbacher等,342:489-502(2004)；Perez等,J Biol.Chem.283:7346-7353(2008))。已经证明来自运动发酵单胞菌E(Zymomonas mobilisE)的adhA基因产物对许多醛(包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛和丙烯醛)具有活性(Kinoshita等,Appl Microbiol Biotechnol 22:249-
254(1985))。另外的醛还原酶候选物由糖丁酸梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)中的bdh以及拜氏梭菌(C.Beijerinckii)中的Cbei_1722、Cbei_2181和Cbei_2421编码。酿酒酵母中的另外醛还原酶基因候选物包括醛还原酶GRE3、ALD2-6和HFD1，乙醛酸还原酶GOR1和YPL113C，以及甘油脱氢酶GCY1(WO 2011/022651A1；Atsumi等等,Nature 451:86-89
(2008))。先前描述用于催化甲基乙二醛还原成丙酮醇或乳醛的酶候选物也是合适的乳醛还原酶候选物。
[0455]
[0456]
[0457] 显示4-羟基丁酸脱氢酶活性的酶(EC 1.1.1.61)也属于这一类别。这样的酶已经在富养罗尔斯通氏菌(Bravo等,J Forens Sci,49:379-387(2004))和克氏梭菌(Wolff等,
Protein Expr.Purif.6:206-212(1995))中表征。另一种基因是来自热葡糖苷酶地芽胞杆菌的醇脱氢酶adhI(Jeon等,J Biotechnol 135:127-133(2008))。
Protein Expr.Purif.6:206-212(1995))中表征。另一种基因是来自热葡糖苷酶地芽胞杆菌的醇脱氢酶adhI(Jeon等,J Biotechnol 135:127-133(2008))。
[0458]蛋白质 GENBANK ID GI号 生物体
4hbd YP_726053.1 113867564 富养罗尔斯通氏菌H16
4hbd L21902.1 146348486 克氏梭菌DSM 555
adhI AAR91477.1 40795502 热葡糖苷酶地芽胞杆菌
4hbd YP_726053.1 113867564 富养罗尔斯通氏菌H16
4hbd L21902.1 146348486 克氏梭菌DSM 555
adhI AAR91477.1 40795502 热葡糖苷酶地芽胞杆菌
[0459] 另一种示例性醛还原酶是甲基丙二酸半醛还原酶，也称为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)。该酶参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，并已在细菌、真核生物和哺乳动物中鉴定到。由来自嗜热栖热菌HB8(Thermus thermophilus HB8)的P84067编码的酶已在结构上表征(Lokanath等,J Mol Biol,352:905-17(2005))。使用同位素标记的底物证明人
3-羟基异丁酸脱氢酶的可逆性(Manning等,Biochem J,231:481-4(1985))。编码这种酶的另外基因包括智人(Hawes等,Methods Enzymol,324:218-228(2000))和穴兔(Hawes等,同
上；Chowdhury等,Biosci.Biotechnol Biochem.60:2043-2047(1996))的3hidh、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和恶臭假单胞菌中的mmsB，以及恶臭假单胞菌中的dhat
(Aberhart等,J Chem.Soc.[Perkin 1]6:1404-1406(1979)；Chowdhury等,
Biosci.Biotechnol Biochem.60:2043-2047(1996)；Chowdhury等,Biosci.Biotechnol
Biochem.67:438-441(2003))。已经在还原方向表征了几种3-羟基异丁酸脱氢酶，包括来自铜绿假单胞菌的mmsB(Gokarn等,US专利739676,(2008))和来自恶臭假单胞菌的mmsB。
3-羟基异丁酸脱氢酶的可逆性(Manning等,Biochem J,231:481-4(1985))。编码这种酶的另外基因包括智人(Hawes等,Methods Enzymol,324:218-228(2000))和穴兔(Hawes等,同
上；Chowdhury等,Biosci.Biotechnol Biochem.60:2043-2047(1996))的3hidh、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和恶臭假单胞菌中的mmsB，以及恶臭假单胞菌中的dhat
(Aberhart等,J Chem.Soc.[Perkin 1]6:1404-1406(1979)；Chowdhury等,
Biosci.Biotechnol Biochem.60:2043-2047(1996)；Chowdhury等,Biosci.Biotechnol
Biochem.67:438-441(2003))。已经在还原方向表征了几种3-羟基异丁酸脱氢酶，包括来自铜绿假单胞菌的mmsB(Gokarn等,US专利739676,(2008))和来自恶臭假单胞菌的mmsB。
[0460]蛋白质 GENBANK ID GI号 生物体
P84067 P84067 75345323 嗜热栖热菌
3hidh P31937.2 12643395 智人
3hidh P32185.1 416872 穴兔
mmsB NP_746775.1 26991350 恶臭假单胞菌
mmsB P28811.1 127211 铜绿假单胞菌
dhat Q59477.1 2842618 恶臭假单胞菌
P84067 P84067 75345323 嗜热栖热菌
3hidh P31937.2 12643395 智人
3hidh P32185.1 416872 穴兔
mmsB NP_746775.1 26991350 恶臭假单胞菌
mmsB P28811.1 127211 铜绿假单胞菌
dhat Q59477.1 2842618 恶臭假单胞菌
[0461] 存在几种将酮转化为羟基官能团的示例性醇脱氢酶。来自大肠杆菌的两种这样的酶由苹果酸脱氢酶(mdh)和乳酸脱氢酶(ldhA)编码。此外，来自富养罗尔斯通氏菌的乳酸脱氢酶已表明显示出对各种链长度的2-酮酸(包括乳酸、2-氧代丁酸、2-氧代戊酸、和2-氧代戊二酸)具有高活性(Steinbuchel等,Eur.J.Biochem.130:329-334(1983))。将α-酮己二酸转化为α-羟基己二酸可以由2-酮己二酸还原酶催化，所述酶被报道在大鼠和人胎盘中发现(Suda等,Arch .Biochem .Biophys .176:610-620(1976)；Suda等,Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586-591(1977))。另外的氧化还原酶是已克隆并表征的来自人心脏的线粒体3-羟基丁酸脱氢酶(bdh)(Marks等,J.Biol.Chem.267:15459-15463
(1992))。拜氏梭菌(Ismaiel等,J.Bacteriol.175:5097-5105(1993))和布氏嗜热厌氧杆菌(T.brockii)(Lamed等,Biochem.J.195:183-190(1981)；Peretz等,Biochemistry.28:
6549-6555(1989))的醇脱氢酶将丙酮转化为异丙醇。甲基乙基酮还原酶催化MEK还原为2-丁醇。示例性的MEK还原酶可见于赤红球菌(Rhodococcus ruber)(Kosjek等,Biotechnol Bioeng.86:55-62(2004))和激烈火球菌(an der Oost等,Eur.J.Biochem.268:3062-3068
(2001))中。
(1992))。拜氏梭菌(Ismaiel等,J.Bacteriol.175:5097-5105(1993))和布氏嗜热厌氧杆菌(T.brockii)(Lamed等,Biochem.J.195:183-190(1981)；Peretz等,Biochemistry.28:
6549-6555(1989))的醇脱氢酶将丙酮转化为异丙醇。甲基乙基酮还原酶催化MEK还原为2-丁醇。示例性的MEK还原酶可见于赤红球菌(Rhodococcus ruber)(Kosjek等,Biotechnol Bioeng.86:55-62(2004))和激烈火球菌(an der Oost等,Eur.J.Biochem.268:3062-3068
(2001))中。
[0462]蛋白质 Genbank ID GI号 生物体
mdh AAC76268.1 1789632 大肠杆菌
ldhA NP_415898.1 16129341 大肠杆菌
ldh YP_725182.1 113866693 富养罗尔斯通氏菌
bdh AAA58352.1 177198 智人
adh AAA23199.2 60592974 拜氏梭菌NRRL B593
adh P14941.1 113443 布氏嗜热厌氧杆菌HTD4
sadh CAD36475 21615553 赤红球菌
adhA AAC25556 3288810 激烈火球菌
mdh AAC76268.1 1789632 大肠杆菌
ldhA NP_415898.1 16129341 大肠杆菌
ldh YP_725182.1 113866693 富养罗尔斯通氏菌
bdh AAA58352.1 177198 智人
adh AAA23199.2 60592974 拜氏梭菌NRRL B593
adh P14941.1 113443 布氏嗜热厌氧杆菌HTD4
sadh CAD36475 21615553 赤红球菌
adhA AAC25556 3288810 激烈火球菌
[0463] 许多生物体编码催化3-氧代丁醇还原为1,3-丁二醇的基因，包括属于芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、念珠菌属和克雷伯菌属(Klebsiella)等的那些，如Matsuyama等J Mol Cat B Enz,11:513-521(2001)所述的。这些酶中的一种，来自近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的SADH已克隆并在大肠杆菌中表征。还已经显示，突变的红球菌苯乙醛还原酶(Sar268)和Leifonia醇脱氢酶以高产率催化该转化(Itoh等,Appl.Microbiol Biotechnol.75:1249-1256(2007))。
[0464]蛋白质 Genbank ID GI号 生物体
sadh BAA24528.1 2815409 近平滑念珠菌
sadh BAA24528.1 2815409 近平滑念珠菌
[0465] 图1：步骤U：巴豆酰CoA还原酶(醇形成)：
[0466] 巴豆酰CoA底物直接转化为其对应醇由具有酰基CoA还原酶(醛形成)活性和醛还原酶或醇脱氢酶活性的双功能酶催化。本文描述了将酰基-CoA转化为醇的示例性双功能氧化还原酶。合适的是巴豆醛还原酶(醇形成)，其催化从巴豆酰CoA形成巴豆醇所需的2个还原步骤。下文提供了将酰基-CoA转化为醇的示例性的两步氧化还原酶。这样的酶可以天然地将巴豆酰CoA转化为巴豆醇，或者可以被改造成这样做。这些酶包括将底物如乙酰CoA转化为乙醇(例如，来自大肠杆菌的adhE(Kessler等,FEBS.Lett.281:59-63(1991)))和将丁酰CoA转化为丁醇(例如来自丙酮丁醇梭菌的adhE2(Fontaine等,J.Bacteriol.184:821-
830(2002)))的那些。来自丙酮丁醇梭菌的adhE2酶特别地在参考文献(Burk等,同上
(2008))中表明由4-羟基丁酰CoA生产BDO。除将乙酰-CoA还原成乙醇之外，肠系膜明串珠菌中由adhE编码的酶还已经显示出将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰CoA(Kazahaya等,
J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972)；Koo等,Biotechnol.Lett.27:505-510(2005))。
830(2002)))的那些。来自丙酮丁醇梭菌的adhE2酶特别地在参考文献(Burk等,同上
(2008))中表明由4-羟基丁酰CoA生产BDO。除将乙酰-CoA还原成乙醇之外，肠系膜明串珠菌中由adhE编码的酶还已经显示出将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰CoA(Kazahaya等,
J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972)；Koo等,Biotechnol.Lett.27:505-510(2005))。
[0467]蛋白质 GenBank ID GI号 生物体
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
adhE2 AAK09379.1 12958626 丙酮丁醇梭菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠系膜明串珠菌
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
adhE2 AAK09379.1 12958626 丙酮丁醇梭菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠系膜明串珠菌
[0468] 另一种示例性酶是将丙二酰CoA转化为3-HP的酶。具有这种活性的NADPH依赖性酶已在嗜热光全绿丝菌中表征，其中其参与3-羟基丙酸循环(Hugler等人,同上(2002)；Strauss等,215:633-643(1993))。质量为300kDa的该酶是高度底物特异性的，并且显示与其他已知氧化还原酶几乎没有序列相似性(Hugler等,同上(2002))。其他生物中没有酶显示催化这种特异性反应；然而有生物信息学证据表明其他生物体可以具有类似的途径
(Klatt等,Environ Microbiol.9:2067-2078(2007))。其他生物体(包括光合玫瑰菌、赤细菌属物种NAP1和海洋γ变形菌HTCC2080)中的候选酶可以通过序列相似性推断。
(Klatt等,Environ Microbiol.9:2067-2078(2007))。其他生物体(包括光合玫瑰菌、赤细菌属物种NAP1和海洋γ变形菌HTCC2080)中的候选酶可以通过序列相似性推断。
[0469]蛋白质 GenBank ID GI号 生物体
mcr AAS20429.1 42561982 嗜热光全绿丝菌
Rcus_2929 YP_001433009.1 156742880 光合玫瑰菌
NAP1_02720 ZP_01039179.1 85708113 赤细菌属物种NAP1
MGP2080_00535 ZP_01626393.1 119504313 海洋γ变形菌HTCC2080
mcr AAS20429.1 42561982 嗜热光全绿丝菌
Rcus_2929 YP_001433009.1 156742880 光合玫瑰菌
NAP1_02720 ZP_01039179.1 85708113 赤细菌属物种NAP1
MGP2080_00535 ZP_01626393.1 119504313 海洋γ变形菌HTCC2080
[0470] 图1：步骤VD：巴豆醇脱水酶：
[0471] 使用巴豆醇脱水酶将巴豆醇转化为丁二烯包括本文所述的芳樟醇脱水酶的酶变体。尽管不受理论的束缚，但是芳樟醇脱水酶具有两种活性：即巴豆醇到3-丁烯-2-醇的酶促异构化和3-丁烯-2-醇到丁二烯的脱水。关于野生型芳樟醇脱水酶的克隆、表达和研究，参见Brodkorb等,J Biol Chem285:30436-42(2010)。
[0472] 周质靶向序列、信号肽
[0473] 在一些替代实施方案中，本文提供的多肽进一步包含(或由其组成)同源或异源信号序列或信号肽(术语“信号肽”和“信号序列”可互换使用并且两者均包括各种类别的靶向和信号传导肽)，例如周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)或者具有PTS或PSS活性的多肽或肽；或者真核信号序列。在一些替代实施方案中，本文提供的多肽可进一步包含(替代其天然信号序列)任何周质靶向序列(PTS)或周质信号序列(PSS)，例如任何翻译后SecB靶向途径PTS或PSS；任何共翻译信号识别颗粒(SRP)-靶向途径PTS或PSS；或任何双精氨酸转位(TAT)Sec独立系统PTS或PSS。
[0474] 例如，图2举例说明了可以用于实施本发明例如在本文提供的成熟或经加工酶上(与其操作性连接)的示例性异源信号序列，例如示例性的LinD多肽SEQ ID NO:16，其为不具有其天然信号序列的(其为信号肽SEQ ID NO:20)全长多肽SEQ ID NO:12的成熟形式。例如，图2的任何信号序列或其他信号序列用于代替全长示例性LinD酶SEQ ID NO:12的天然信号序列。示例性LinD多肽SEQ ID NO:12含有本文所述的sec依赖性周质靶向序列(PTS)
(肽SEQ ID NO:20)。在一些替代实施方案中，示例性LinD多肽的PTS被所示sec依赖性和SRP依赖性PTS各自替代，如图2所示，以及被基于TAT的序列替代(未示出)。类似地，在一些替代实施方案中，本文提供了其天然信号序列(分别包括SEQ ID NO:20、20、39、45、51、57、20、
68、76、82、88、94或100)被图2的信号序列或另外信号序列替代的示例性全长LinD多肽SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、64、66、74、80、86、92或98。
(肽SEQ ID NO:20)。在一些替代实施方案中，示例性LinD多肽的PTS被所示sec依赖性和SRP依赖性PTS各自替代，如图2所示，以及被基于TAT的序列替代(未示出)。类似地，在一些替代实施方案中，本文提供了其天然信号序列(分别包括SEQ ID NO:20、20、39、45、51、57、20、
68、76、82、88、94或100)被图2的信号序列或另外信号序列替代的示例性全长LinD多肽SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、64、66、74、80、86、92或98。
[0475] 在一些替代实施方案中，本文提供了与另一种多肽(例如另一种LinD多肽，例如SEQ ID NO:2)操作性连接的新信号序列，包括SEQ ID NO:20、39、45、51、57、68、76、82、88、
94或100(其中本文提供的信号序列替换SEQ ID NO:2的天然信号序列或SEQ ID NO:8)。
94或100(其中本文提供的信号序列替换SEQ ID NO:2的天然信号序列或SEQ ID NO:8)。
[0476] 异源信号序列是功能性的，即当信号序列与其来源的多肽不同的多肽操作性连接时具有功能性。例如，如图3A和图3B所示，用来自大肠杆菌周质蛋白的PTS替代来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌65Phen的野生型(WT)LinD(SEQ ID NO:2)的WT PTS(SEQ ID NO:8)，在大肠杆菌中表达并测定丁二烯活性。图3A：Sec依赖性PTS和TAT-SEC PTS显示具有与野生型靶向序列相似的活性；图3B：与野生型PTS相当的信号肽以黄色突出显示(LamB ss、MalE ss、PelB ss、FhuD)并且显著降低活性的信号肽以红色突出显示(MalE和YcdO)。
[0477] 在Geneious中进行使用MUSCLE(MUSCLE：高精度和高通量的多序列比对)比对计算的％ID；Edgar(2004)Nucleic Acids Research32(5):1792-7。
[0478] 总结示例性序列：
[0479] 来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌65Phen的芳樟醇脱水酶(LinD)(表示为GMN2753)
[0480] SEQ ID NO:1编码野生型(WT)芳樟醇脱水酶多肽SEQ ID NO:2的天然核酸序列；包括信号肽编码序列
[0481] SEQ ID NO:2天然全长野生型芳樟醇脱水酶多肽
[0482] SEQ ID NO:3编码SEQ ID NO:2的经密码子优化核酸
[0483] SEQ ID NO:4编码SEQ ID NO:2的经密码子优化核酸
[0484] SEQ ID NO:5编码SEQ ID NO:6的经密码子优化核酸
[0485] SEQ ID NO:6SEQ ID NO:2野生型芳樟醇脱水酶的成熟(经加工)形式
[0486] SEQ ID NO:7编码信号序列SEQ ID NO:8的天然核酸
[0487] SEQ ID NO:8来自SEQ ID NO:2的信号序列肽
[0488] SEQ ID NO:9编码SEQ ID NO:10的核酸；通过具有12个密码子替代而不同于SEQ ID NO:4。
[0489] SEQ ID NO:10SEQ ID NO:2的全长多肽变体；具有12个替代
[0490] 来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌62Car的芳樟醇脱水酶(LinD)；表示为GNM9819
[0491] SEQ ID NO:11编码SEQ ID NO:12的天然核酸；包括信号肽
[0492] SEQ ID NO:12来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌62Car的具有信号肽的全长野生型LinD
[0493] SEQ ID NO:13(编码全长SEQ ID NO:12的第一经密码子优化核酸；表示为GNM9819A)
[0494] SEQ ID NO:14(编码全长SEQ ID NO:12的第二经密码子优化核酸；表示为GNM9819B)
[0495] SEQ ID NO:15(编码SEQ ID NO:16的天然核酸；SEQ ID NO:11核酸的经加工(成熟)形式，GNM 9819)
[0496] SEQ ID NO:16(LinD多肽SEQ ID NO:12的成熟形式(GNM 9819))
[0497] SEQ ID NO:17:(编码SEQ ID NO:16的经密码子优化核酸(由SEQ ID NO:13GNM 9819A缩短)
[0498] SEQ ID NO:18:(编码SEQ ID NO:16的经密码子优化核酸(由SEQ ID NO:14GNM 9819B缩短)
[0499] SEQ ID NO:19(编码信号序列SEQ ID NO:20的天然核酸；来自SEQ ID NO:11)
[0500] SEQ ID NO:20(来自SEQ ID NO:12的信号肽(GNM 9819))
[0501] SEQ ID NO:21(编码全长变体SEQ ID NO:22的核酸，表示为9819C；通过具有11个密码子替代而不同于野生型SEQ ID NO:13GNM9819A)
[0502] SEQ ID NO:22(具有11个氨基酸替换的V19I、Y71F、G74S、G133M、R171K、I182L、V196F、D200N、F325S、G365S、L368F的全长变体SEQ ID NO:12(GNM9819)；表示为9819C)[0503] SEQ ID NO:23(变体酶：与来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌65Phen的成熟形式野生型linD(SEQ ID NO:6)融合的SEQ ID NO:25(异源信号序列LamB ss)
[0504] SEQ ID NO:24(变体酶：与来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌62Car的成熟形式野生型酶(SEQ ID NO:16)融合的SEQ ID NO:25(异源信号序列LamBss)
[0505] SEQ ID NO:25(肽：异源信号序列(ss)LamBss(或LamB ss))
[0506] SEQ ID NO:26(肽：异源信号序列MalE ss)
[0507] SEQ ID NO:27(肽：异源信号序列MglBss)
[0508] SEQ ID NO:28(肽：异源信号序列OmpAss)
[0509] SEQ ID NO:29(肽：异源信号序列PelBss)
[0510] SEQ ID NO:30(肽：异源信号序列PhoAss)
[0511] SEQ ID NO:31(肽：异源信号序列DsbAss)
[0512] SEQ ID NO:32(肽：异源信号序列SfmCss)
[0513] SEQ ID NO:33(肽：异源信号序列TolBss)
[0514] SEQ ID NO:34(肽：异源信号序列TorTss)
[0515] SEQ ID NO:35(肽：异源信号序列FhuD ss)
[0517] SEQ ID NO:36编码SEQ ID NO:37的天然核酸，SEQ ID NO:37是未经加工的且包括其信号肽
[0518] SEQ ID NO:37：天然的或未加工的LinD酶，包括信号肽
[0519] SEQ ID NO:38：编码GNM 9874信号肽的核酸
[0520] SEQ ID NO:39：GNM 9874信号肽
[0521] SEQ ID NO:40：编码经加工的GNM 9874LinD酶的核酸，无信号肽
[0522] SEQ ID NO:41：经加工的GNM 9874LinD酶，无信号肽
[0523] (全长GNM 9874多肽与全长GNM 2753具有99％的序列同一性；成熟或经加工的GNM 9874多肽与经加工的GNM 2753具有99％序列同一性)
[0524] (全长GNM 9874多肽与全长GNM 9819具有94％序列同一性；成熟或经加工的GNM 9874多肽与经加工的GNM 9819具有96％序列同一性)
[0525] 来自富集月桂烯的Camp Pendleton的活化污泥的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)(二次富集)，表示为GNM 9873
[0526] SEQ ID NO:42编码SEQ ID NO:43的天然核酸，SEQ ID NO:43是未加工的且包括其信号肽
[0527] SEQ ID NO:43：天然或未经加工的LinD酶，包括信号肽
[0528] SEQ ID NO:44：编码GNM 9873信号肽的核酸
[0529] SEQ ID NO:45：GNM 9873信号肽
[0530] SEQ ID NO:46：编码经加工的GNM 9873LinD酶的核酸，无信号肽
[0531] SEQ ID NO:47：经加工的GNM 9873LinD酶，不含信号肽
[0532] (全长GNM 9873多肽与全长GNM 2753具有75％序列同一性；成熟或经加工的GNM 9873多肽与经加工的GNM 2753具有79％序列同一性)
[0533] (全长GNM 9873多肽与全长GNM 9819具有75％序列同一性；成熟或经加工的GNM 9873多肽与经加工的GNM 9819具有79％序列同一性)
[0534] 来自富集月桂烯的Camp Pendleton的活化污泥的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)(初级富集)，表示为GNM 9875
[0535] SEQ ID NO:48：编码SEQ ID NO:49的天然核酸，SEQ ID NO:49是未经加工的且包括其信号肽
[0536] SEQ ID NO:49：天然或未经加工的LinD酶，包括信号肽
[0537] SEQ ID NO:50：编码GNM 9875信号肽的核酸
[0538] SEQ ID NO:51：GNM 9875信号肽
[0539] SEQ ID NO:52：编码经加工的GNM 9875LinD酶的核酸，无信号肽
[0540] SEQ ID NO:53：经加工的GNM 9875LinD酶，无信号肽
[0541] (全长GNM 9875多肽与全长GNM 2753具有78％序列同一性；成熟或经加工的GNM 9875多肽与经加工的GNM 2753具有82％序列同一性)
[0542] (全长GNM 9875多肽与全长GNM 9819具有78％序列同一性；成熟或经加工的GNM 9875多肽与经加工的GNM 9819具有81％序列同一性)
[0543] 来自活化污泥(Camp Pendleton)的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)，表示为GNM 9894
[0544] SEQ ID NO:54：编码SEQ ID NO:55的天然核酸，其是未经加工的且包括其信号肽[0545] SEQ ID NO:55：天然或未经加工的LinD酶，包括信号肽
[0546] SEQ ID NO:56：编码GNM 9894信号肽的核酸
[0547] SEQ ID NO:57：GNM 9894信号肽
[0548] SEQ ID NO:58：编码经加工的GNM 9894LinD酶的核酸，无信号肽
[0549] SEQ ID NO:59：经加工的GNM 9894LinD酶，无信号肽
[0550] (全长GNM 9894多肽与全长GNM 2753具有78％序列同一性；成熟或经加工的GNM 9894多肽与经加工的GNM 2753具有81％序列同一性)
[0551] (全长GNM 9894多肽与全长GNM 9819具有78％序列同一性；成熟或经加工的GNM 9894多肽与经加工的GNM 9819具有81％序列同一性)
[0552] 来自活化污泥(Camp Pendleton)的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)，表示为GNM 9895
[0553] SEQ ID NO:60：编码SEQ ID NO:61的天然核酸，SEQ ID NO:61是未经加工的且包括其未鉴定到信号肽切割位点的信号肽
[0554] SEQ ID NO:61：天然或未经加工的LinD酶，包括未鉴定到信号肽切割位点的信号肽。
[0555] SEQ ID NO:62：具有A196F修饰的LinD酶SEQ ID NO:61；表示为9895B。
[0556] (全长GNM 9895多肽与全长GNM 2753具有66％序列同一性。
[0557] (全长GNM 9895多肽与全长GNM 9819具有65％序列同一性。
[0558] 芳樟醇脱水酶(LinD)(具有7个突变(氨基酸变化)的GNM 9819的经改造变体：G74S、G133Q、R171K、I182K、V196F、D200G、G365S)；表示为GNM9819T
[0559] SEQ ID NO:63：编码SEQ ID NO:64的天然核酸，SEQ ID NO:64是未经加工的且包括其信号肽
[0560] SEQ ID NO:64：天然或未经加工的改造LinD酶，包括信号肽。
[0561] 来自活化污泥(Camp Pendleton)的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)，表示为GNM 10038
[0562] SEQ ID NO:65：编码SEQ ID NO:66的天然核酸，SEQ ID NO:66是未经加工的且包括其信号肽
[0563] SEQ ID NO:66：天然或未经加工的LinD酶GNM 10038，包括信号肽
[0564] SEQ ID NO:67：编码GNM 10038信号肽的核酸
[0565] SEQ ID NO:68：GNM 10038信号肽
[0566] SEQ ID NO:69：编码经加工(成熟)GNM 10038LinD酶的核酸，无信号肽
[0567] SEQ ID NO:70：经加工(成熟)的GNM 10038 LinD酶，无信号肽
[0568] 来自活化污泥(Camp Pendleton)的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)，表示为GNM 10039
[0569] SEQ ID NO:71：编码SEQ ID NO:72的天然核酸，SEQ ID NO:72是未经加工的且包括其未鉴定到信号肽切割位点的信号肽。
[0570] SEQ ID NO:72：天然或未经加工的LinD酶GNM 10039，包括未鉴定到信号肽切割位点的信号肽。
[0571] 来自土壤样品(Cottonwood河)的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)，表示为GNM 10058
[0572] SEQ ID NO:73：编码SEQ ID NO:74的天然核酸，SEQ ID NO:74是未经加工的且包括其信号肽
[0573] SEQ ID NO:74：天然或未经加工的LinD酶GNM 10058，包括信号肽
[0574] SEQ ID NO:75：编码GNM 10058信号肽的核酸
[0575] SEQ ID NO:76：GNM 10058信号肽
[0576] SEQ ID NO:77：编码经加工(成熟)GNM 10058LinD酶的核酸，无信号肽
[0577] SEQ ID NO:78：经加工(成熟)的GNM 10058LinD酶，无信号肽
[0578] 来自土壤样品的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)，表示为GNM10092
[0579] SEQ ID NO:79：编码SEQ ID NO:80的天然核酸，SEQ ID NO:80是未经加工的且包括其信号肽
[0580] SEQ ID NO:80：天然或未经加工的LinD酶GNM 10092，包括信号肽
[0581] SEQ ID NO:81：编码GNM 10092信号肽的核酸
[0582] SEQ ID NO:82：GNM 10092信号肽
[0583] SEQ ID NO:83：编码经加工(成熟)的GNM 10092LinD酶的核酸，无信号肽
[0584] SEQ ID NO:84：经加工(成熟)的GNM 10092LinD酶，无信号肽
[0585] 来自土壤样品(Cottonwood河)的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)，表示为GNM 10093
[0586] SEQ ID NO:85：编码SEQ ID NO:86的天然核酸，SEQ ID NO:86是未经加工的且包括其信号肽
[0587] SEQ ID NO:86：天然或未经加工的LinD酶GNM 10093，包括信号肽
[0588] SEQ ID NO:87：编码GNM 10093信号肽的核酸
[0589] SEQ ID NO:88：GNM 10093信号肽
[0590] SEQ ID NO:89：编码经加工(成熟)GNM 10093LinD酶的核酸，无信号肽
[0591] SEQ ID NO:90：经加工(成熟)的GNM 10093LinD酶，无信号肽
[0592] 来自活化污泥(内华达山脉(Sierra Nevada))的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)，表示为GNM 10094
[0593] SEQ ID NO:91：编码SEQ ID NO:92的天然核酸，SEQ ID NO:92是未经加工的且包括其信号肽
[0594] SEQ ID NO:92：天然或未经加工的LinD酶GNM 10094，包括信号肽
[0595] SEQ ID NO:93：编码GNM 10094信号肽的核酸
[0596] SEQ ID NO:94：GNM 10094信号肽
[0597] SEQ ID NO:95：编码经加工(成熟)GNM 10094 LinD酶的核酸，无信号肽
[0598] SEQ ID NO:96：经加工(成熟)的GNM 10094 LinD酶，无信号肽
[0599] 来自土壤样品(Cottonwood河)的宏基因组学的芳樟醇脱水酶(LinD)，表示为GNM 10097
[0600] SEQ ID NO:97：编码SEQ ID NO:98的天然核酸，SEQ ID NO:98是未经加工的且包括其信号肽
[0601] SEQ ID NO:98：天然或未经加工的LinD酶GNM 10097，包括信号肽
[0602] SEQ ID NO:99：编码GNM 10097信号肽的核酸
[0603] SEQ ID NO:100：GNM 10097信号肽
[0604] SEQ ID NO:101：编码经加工(成熟)GNM 10097 LinD酶的核酸，无信号肽
[0605] SEQ ID NO:102：经加工(成熟)的GNM 10097LinD酶，无信号肽。
[0606] 本发明的另外示例性序列：
[0607] 本发明的另外示例性序列可以见于LinD氨基酸残基的序列比较中，包括图11至16的序列比较，如下所述：
[0608] 例如，本发明的另外示例性序列可以见于图12至16的序列比较中，其将本发明的新序列GNM 9873(SEQ ID NO:43)(图12)、GNM 9874(SEQ ID NO:37)(图13)、GNM 9875(SEQ ID NO:49)(图14)、GNM 9894(SEQ ID NO:55)(图15)和GNM 9895(SEQ ID NO:61)(图16)与已知的LinD 多肽GNM 2753(SEQ ID NO:2)进行比较。本发明的另外示例性序列可以见于图11的序列比较中，其将示例性LinD酶GNM 9819(SEQ ID NO:12)与已知GNM 2753(SEQ ID
NO:2)进行比较。
NO:2)进行比较。
[0609] 本发明的另外示例性序列由序列比较中不同的残基鉴定，其中每个氨基酸残基差异被转移或掺入本文所述LinD多肽的等同残基，包括本文所述的已知和新LinD序列。
[0610] 例如，图12的比对显示信号肽之后的第一个氨基酸(aa)残基的差异，其中全长GNM 9873(SEQ ID NO:43)的“成熟”形式中的第一个aa残基是“E”，全长GNM 2753(SEQ ID NO:2)的“成熟”形式中的第一个aa残基是“A”。因此，本发明的另外示例性序列包括其中第一个“成熟”aa残基是“A”或“E”的LinD多肽。本发明的其他另外示例性序列包括示例性LinD多肽(例如GNM 9819(SEQ ID NO:12)和已知GNM 2753(SEQ ID NO:2)的的变体，其中第一个“成熟”aa残基是“A”或“E”。
[0611] 来自图12的本发明另外示例性序列的另一个实例可以见于“成熟”LinD多肽的第四个aa残基中，其中全长GNM 9873(SEQ ID NO:43)的“成熟”形式中的第4个aa残基是“F”，全长GNM 2753(SEQ ID NO:2)的“成熟”形式中的第4个aa残基是“P”。因此，本发明的另外示例性序列包括其中第4个“成熟”aa残基(或等同残基)是“F”或“P”的LinD多肽。本发明的其他另外示例性序列包括示例性LinD多肽(例如，GNM9819(SEQ ID NO:12)和已知GNM 2753(SEQ ID NO:2)的的变体，其中第4个“成熟”aa残基是“F”或“P”。
[0612] 如图11，本发明的另外示例性序列可以见于在示例性LinD多肽GNM9819(SEQ ID NO:12)和已知GNM 2753(SEQ ID NO:2)的变体的比较中。并且将这些氨基酸(aa)残基差异并入本文提供的其他新型LinD多肽中。例如，全长GNM 9819(SEQ ID NO:12)的“成熟”形式中的第2个aa残基是“P”，全长GNM 2753(SEQ ID NO:2)“的成熟”形式中的第2个aa残基是“E”。因此，本发明的另外示例性序列包括其中第2个“成熟”aa残基(或等同残基)是“E”或“P”的LinD多肽；并且这包括将这些氨基酸(aa)残基差异并入本文提供的新型LinD多肽和其他已知LinD多肽中(由此产生新变体，即本文提供的新的新型示例性LinD序列)。
[0613] 本发明的另外示例性序列是通过序列比较发现的这些aa残基变化中2、3、4、5、6或更多个的组合，例如如本文提供的。例如，本文提供的一种示例性LinD多肽包含以下两种或更多种：其第一“成熟”aa残基改变为“A”或“E”；其第2个“成熟”aa残基(或等同残基)改变为“E”或“P”；其第4个“成熟”aa残基(或等同物)改变为“F”或“P”；等等
[0614] 在一些替代实施方案中，实施本发明包括使用本领域技术范围内的常用于分子生物学、微生物学和重组DNA的任何常规技术。这样的技术是本领域技术人员已知的，并且在许多文本和参考文献中有描述(参见例如Sambrook等,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual,"第二版,Cold Spring Harbor,1989；和Ausubel等,"Current Protocols in Molecular Biology,"1987)。除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，Singleton和
Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第2版,John Wiley
and Sons,NY(1994)；以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用字典。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实施本发明，但是优选的方法和材料在本文中描述。因此，下面直接定义的术语作为整体通过参考说明书而更全面地描述。
Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第2版,John Wiley
and Sons,NY(1994)；以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用字典。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实施本发明，但是优选的方法和材料在本文中描述。因此，下面直接定义的术语作为整体通过参考说明书而更全面地描述。
[0615] 除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实施本发明中，但是优选的方法和材料在本文中描述。因此，下面直接定义的术语作为整体通过参考说明书而更全面地描述。
[0616] 除非上下文另外清楚地指出，否则本文使用的没有数量词修饰的名词包括一个/种和/或更多个/种。除非另有说明，否则分别地，核酸以5'至3'的方向从左至右书写；氨基酸序列从氨基到羧基取向从左到右书写。应理解的是，本发明不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化，这取决于本领域技术人员使用的上下文。
[0617] 以下实施例和附图旨在阐明本发明，并且说明和进一步示出某些优选实施方案和方面，而不将本发明的主题限制于实施例和附图。
[0618] 实施例
[0619] 实施例1.证明芳樟醇脱水酶活性
[0620] 以下是在异源添加巴豆醇的大肠杆菌中表达的已知野生型芳樟醇脱水酶(由表示为2753I的核酸表达)及其12-氨基酸替换变体(表示为2753N)用于丁二烯产生(在顶部空间中)的活性的表格；48小时反应时间，如本文所述的。在酶反应中，巴豆醇被异构化为MVC，其被脱水为丁二烯。丁二烯具有足够的挥发性，使得在顶部空间收集其并对其进行测量。如文献中所报道和在此所示的，野生型和变体酶在体内对巴豆醇具有活性。
[0621]
[0622] 以下是在异源添加巴豆醇或其异构体甲基乙烯基甲醇(MVC)的大肠杆菌中表达的来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌62Car的本文所述提供新型烯醇脱水酶(SEQ ID NO:12)用于丁二烯产生(在顶部空间中)的活性的表格；48小时反应时间，如本文所述的。在酶反应中，巴豆醇被异构化为MVC，其被脱水为丁二烯。丁二烯具有足够的挥发性，使得在顶部空间收集其并对其进行测量。如文献中所报道和在此所示的，野生型和变体酶在体内对巴豆醇具有活性。新型酶的成熟形式由经改造的大肠杆菌制备，并且如下表所示对巴豆醇和MVC二者都具有体内活性。新型酶还对3
[0623]
[0624] 体内1,3-丁二烯产生分析
[0625] 用表达质粒转化大肠杆菌(ATCC 8739C变体)，并使用抗生素选择进行选择和维持。在实验前一天，将在LB-抗生素中的1mL过夜培养物接种并在37℃下在24孔板中用透气密封垫生长。将过夜培养物以OD600＝0.05接种到10ml螺帽瓶中的新鲜2mL M9+4％葡萄糖+抗生素+IPTG+10mM巴豆醇中。将瓶在37℃下孵育48小时，并通过GC-MS进行顶空分析来验证
1,3-丁二烯产生。
1,3-丁二烯产生。
[0626] 宏基因组测序
[0627] 活化的污水样品从加利福尼亚的当地废水处理获得，并用作富集培养物的接种物。使用Illumina MiSeq平台对从富集培养物提取的DNA样品进行宏基因组测序。使用
SPAdes组装器进行重新组装以产生代表宏基因组的重叠群。使用WT解芳烃卡斯特兰尼氏菌
65Phen全长多肽LinD对该重叠群数据库进行TBLASTN搜索以鉴定宏基因组组装中的同源
物；使用如例如在Bankevich,等,SPAdes:A New Genome Assembly Algorithm and Its
Applications to Single-Cell Sequencing.Journal of Computational Biology19(5)
(2012),455-477.doi:10.1089/cmb.2012.0021中所述的方案。
SPAdes组装器进行重新组装以产生代表宏基因组的重叠群。使用WT解芳烃卡斯特兰尼氏菌
65Phen全长多肽LinD对该重叠群数据库进行TBLASTN搜索以鉴定宏基因组组装中的同源
物；使用如例如在Bankevich,等,SPAdes:A New Genome Assembly Algorithm and Its
Applications to Single-Cell Sequencing.Journal of Computational Biology19(5)
(2012),455-477.doi:10.1089/cmb.2012.0021中所述的方案。
[0628] 图18所示的表格和下表报道了本文提供的新型多肽与本文所述的已知野生型酶(全长和成熟形式)之间成对百分比同一性，其中百分比同一性(％ID)使用Geneious软件使用MUSCLE比对算法计算(Edgar,MUSCLE:multiple sequence alignment with high
accuracy and high throughput,Nucleic acids research 32(5):1792-7(2004))。图18的表格描述了全长(未经加工)蛋白质的成对％ID(图18A)和“成熟”或经加工蛋白质的成对％ID(图18B)。这些表格表明本发明人已经鉴定具有相似酶功能的天然酶，其共有相同或几乎相同的氨基酸长度和低至至少约75％并且甚至低至约63％(在全长蛋白质氨基酸序列之间比较)和67％(在成熟蛋白质氨基酸序列之间比较)的氨基酸(并且由此结构)同一性。
accuracy and high throughput,Nucleic acids research 32(5):1792-7(2004))。图18的表格描述了全长(未经加工)蛋白质的成对％ID(图18A)和“成熟”或经加工蛋白质的成对％ID(图18B)。这些表格表明本发明人已经鉴定具有相似酶功能的天然酶，其共有相同或几乎相同的氨基酸长度和低至至少约75％并且甚至低至约63％(在全长蛋白质氨基酸序列之间比较)和67％(在成熟蛋白质氨基酸序列之间比较)的氨基酸(并且由此结构)同一性。
[0629]
[0630] 实施例2：证明芳樟醇脱水酶活性
[0631] 本实施例提供数据证明本文所提供的示例性酶的脱水酶酶活性和双功能异构酶-脱水酶酶活性。
[0632] 目标/假设和背景
[0633] 为了测试新LinD 9895A(SEQ ID NO:61，其为未经加工的且包括其信号肽)的RBS组对10mM CrOH、MVC和异戊烯醇的活性。实验还包括9895A(SEQ ID NO:61)和9895B(其是具有A196F修饰的SEQ ID NO:62)的原始构建体的重复测试。
[0634] (核糖体结合位点(RBS)是在启动蛋白质翻译时被核糖体结合的mRNA上的序列)
[0635] 实验设计
[0636] 宿主菌株8157
[0637] 质粒(rpt:pG_8227、pG_8228)、pG_8285,、pG_8286、pG_8287、pG_8288
[0638] 基因(rpt：9895A、9895B、典型RBS)、13k-9895A、34k-9895A、104k-9895A，290k-9895A
[0639] 可变的RBS强度
[0640] 实验方案在SMM5+10mM CrOH或10mM MVC或10mM异戊烯醇中的螺帽小瓶细胞培养物
[0641] 采样时间点BDE的72小时细胞培养物顶部空间测量
[0642] 收集的数据类型通过GCMS来自CrOH和MVC的BDE
[0643] 实验条件
[0644] 在24孔板中的2ml LB+葡萄糖+Kan预培养物，在加湿培养箱中培养过夜。生物重复中的样品。
[0645] 用于在10ml密封玻璃小瓶中接种2ml SMM5+Trace+Kan+IPTG+10mM CrOH或10mM MVC或10mM异戊烯醇。开始OD 0.1。在35℃下生长72小时。样品接受60℃，30分钟的热杀灭，然后通过GCMS提供对BDE进行顶部空间分析。
[0646] 对于SDS-PAGE，在摇瓶，SMM5+IPTG中生长24小时
[0647] 数据
[0648] (1)证明LinD多肽9895(SEQ ID NO:61)将10mM的甲基乙烯基甲醇(MVC)转化为BDE，用13、34和104K RBS序列检测分别高达0.27、0.25和0.17ppm。MVC转化为丁二烯(BD、BDE)证明脱水酶活性。
[0649] (2)证明LinD多肽9895(SEQ ID NO:61)将10nM异戊烯醇转化为异戊二烯，用13、34和104K RBS序列检测，分别高达6、4至8和3ppm。异戊烯醇向异戊二烯的转化显示异构酶和脱水酶活性二者(其中异构酶活性将异戊烯醇转化为异构体异戊二烯醇，并且脱水酶活性将异戊二烯醇转化为异戊二烯)。
[0650] (3)将突变A196F导入LinD多肽9895中(表示为GNM 9895B，SEQ ID NO:62)可使得MVC测定增强2倍(以产生BDE)。在一个测定中，使用“典型”RBS，LinD多肽9895(SEQ ID NO:
61)以0.13ppm的产率将异戊烯醇转化为异戊二烯，而9895B突变A196F LinD(SEQ ID NO:
62)以0.17ppm的产率将异戊烯醇转化为异戊二烯。
61)以0.13ppm的产率将异戊烯醇转化为异戊二烯，而9895B突变A196F LinD(SEQ ID NO:
62)以0.17ppm的产率将异戊烯醇转化为异戊二烯。
[0651] (4)在单独运行的该测定中证明LinD多肽9819T(SEQ ID NO:64，其是未经加工的改造变体且包括其信号肽；由SEQ ID NO:63编码)将10mM的甲基乙烯基甲醇(MVC)转化为
BDE：平均值为132μM，单独运行产生7.36ppm(或136μM)、7.32ppm(135μM)和6.68ppm(123μM)。
BDE：平均值为132μM，单独运行产生7.36ppm(或136μM)、7.32ppm(135μM)和6.68ppm(123μM)。
[0652] 图17以表格形式总结了本发明的示例性酶的显示酶活性。
[0653] 已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。相应地，其他实施方案也在以下权利要求书的范围内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 嵌合病毒样颗粒以及其作为免疫反应的抗原特异性重定向剂的用途 | 2020-05-11 | 777 |
| 可生物侵蚀的药物递送植入物 | 2020-05-08 | 91 |
| 用于引起细胞内化的CD20结合免疫毒素及其使用方法 | 2020-05-08 | 776 |
| 引发剂衍生肽及其用途 | 2020-05-11 | 728 |
| 晚疫病抗性基因及使用方法 | 2020-05-15 | 976 |
| 抗-CD40抗体及其用途 | 2020-05-12 | 394 |
| 工程化抗微生物两亲性肽及使用方法 | 2020-05-13 | 742 |
| 一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法 | 2020-05-13 | 403 |
| 用于提高免疫活性的TGFβ和ActRII拮抗剂 | 2020-05-14 | 234 |
| 用于治疗肺部炎症的组合物和方法 | 2020-05-14 | 552 |
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