一种基于ATP生物发光的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒
阅读：878发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种基于ATP生物发光的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种基于ATP 生物 发光的鸭致病菌药敏快速检测 试剂 盒 ，属于畜禽 疾病 体外诊断技术领域，包括增菌培养基、包被抗菌药物的无菌透明EP管和生物发光剂；将增菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管，所述抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。采用本发明提供的试剂盒能够根据 荧光 值大小判断鸭致病菌对药物是否敏感，所需时间不超过7h。，下面是一种基于ATP生物发光的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种基于ATP生物发光的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，其特征在于，包括增菌培养基、包被抗菌药物的无菌透明EP管和生物发光剂；
将增菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管后，所述抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物发光剂包括BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述增菌培养基包括胰蛋白胨大豆肉汤。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述增菌培养基罐装螺纹盖玻璃瓶中，灌装量为8～12mL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗菌药物的无菌透明EP管中的抗菌药物包括阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟、四环素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、红霉素、多粘菌素、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、壮观霉素、安普霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶或复方新诺明。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述抗菌药物的敏感性折点为：阿莫西林4μg/mL、氨苄西林4μg/mL、头孢噻呋2μg/mL、头孢喹肟2μg/mL、四环素4μg/mL、多西环素4μg/mL、土霉素4μg/mL、氟苯尼考2μg/mL、红霉素1μg/mL、多粘菌素2μg/mL、恩诺沙星1μg/mL、环丙沙星1μg/mL、二氟沙星1μg/mL、达氟沙星1μg/mL、大观霉素32μg/mL，安普霉素16μg/mL、庆大霉素2μg/mL、磺胺间甲氧嘧啶256μg/mL、磺胺二甲嘧啶256μg/mL和复方新诺明40μg/mL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述鸭致病菌包括鸭致病性大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述无菌透明EP管的容量为1.5mL。
一种基于ATP生物发光的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 鸭细菌性疾病一直是养鸭业面临的严重问题，给养鸭业造成了严重的经济损失，并随着集约化程度提高而危害逐渐加大。鸭致病性大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌感染是目前鸭养殖中常见的细菌性传染病，在实际生产中常以原发或继发于其他疾病出现，且往往存在两种甚至三种细菌的混合感染。且这些细菌的血清型均非常多，各血清型之间一般缺乏交叉保护作用，这给疫苗防控带来了困难，使用抗菌药物仍然是预防和治疗鸭细菌性疾病的主要手段。但由于鸭养殖中抗菌药物的滥用，细菌耐药性问题也越来越严重，细菌产生耐药的周期愈来愈短，耐药谱愈来愈宽，给养殖者合理选择药物造成了很大的障碍。
[0003] 体外抗菌药物敏感性试验(简称药敏试验)是指导临床合理选择药物不可缺少的试验手段。目前常规药敏试验方法是纸片扩散法和肉汤稀释法，虽然这些方法原理比较简单，其试验过程及结果判断也被标准化，但是其最大缺陷在于操作繁琐、耗时较长。常规的药敏试验方法从细菌分离到获得药敏试验结果一般需要2-3天。鸭细菌性疾病一般发病急，传染快，在等待药敏试验结果的过程中，鸭可能已发生大面积发病和死亡。此外，鸭细菌性疾病混合感染的情况非常普遍，分离细菌后再作常规药敏试验，可能会漏掉部分感染菌的药敏试验结果。在生产实际中，往往不需要作细菌分离鉴定，而只需要知道鸭感染的细菌对哪种药物敏感，然后选择敏感药物进行紧急治疗。然而目前很少见到直接使用病料进行药敏快速检测的方法，主要原因是无法克服病料组织对检测的干扰。
[0004] 过去，人们一直在探索建立快速药敏试验检测方法，这些方法主要包括基于细菌NADH还原刃天青显色方法、基于检测活体细菌活性氧含量的化学发光法、基于检测活体细菌ATP含量的生物发光法、基于检测耐药基因的 PCR检测方法、基于检测耐药基因的微阵列杂交成像方法、基于检测耐药相关酶的免疫层析方法、基于检测耐药相关酶的质谱法，流式细胞光度法等。但是这些方法或者需要配备专门的仪器，或者操作繁琐、耗时长，或者检测成本过高，不能满足兽医临床对药敏试验方法具有简便、快速、经济特性的需要。所以开发出一种无需进行细菌分离鉴定，直接进行药敏检测，且操作简便、快速的药敏检测试剂盒势在必行。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于ATP生物发光的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，采用本发明提供的试剂盒能够根据荧光值大小判断鸭致病菌对药物是否敏感，所需时间不超过7h。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种基于ATP生物发光的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，包括增菌培养基、包被抗菌药物的无菌透明EP管和生物发光剂；
[0008] 将增菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管后，所述抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。
[0009] 优选的，所述生物发光剂包括BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂。
[0010] 优选的，所述增菌培养基包括胰蛋白胨大豆肉汤。
[0012] 优选的，所述包被抗菌药物的无菌透明EP管中的抗菌药物包括阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟、四环素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、红霉素、多粘菌素、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、壮观霉素、安普霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶或复方新诺明。
[0013] 优选的，所述抗菌药物的敏感性折点为：阿莫西林4μg/mL、氨苄西林 4μg/mL、头孢噻呋2μg/mL、头孢喹肟2μg/mL、四环素4μg/mL、多西环素 4μg/mL、土霉素4μg/mL、氟苯尼考2μg/mL、红霉素1μg/mL、多粘菌素 2μg/mL、恩诺沙星1μg/mL、环丙沙星1μg/mL、二氟沙星1μg/mL、达氟沙星1μg/mL、大观霉素32μg/mL，安普霉素16μg/mL、庆大霉素2μg/mL、磺胺间甲氧嘧啶256μg/mL、磺胺二甲嘧啶256μg/mL和复方新诺明40μg/mL。
[0014] 优选的，所述鸭致病菌包括鸭致病性大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌中的一种或几种。
[0015] 优选的，所述无菌透明EP管的容量为1.5mL。
[0016] 本发明提供了一种基于ATP生物发光的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，包括增菌培养基、包被抗菌药物的无菌透明EP管和生物发光剂；
[0017] 将增菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管后，所述抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。
[0018] 本发明的试剂盒检测鸭致病菌对抗菌药物的敏感性的机理：
[0019] 本发明依据活体微生物细胞产生的ATP，在荧光素酶作用下与荧光素反应产生荧光的原理，通过荧光值的大小反映出微生物活体细胞数量，从而反映出抗菌药物对被检测微生物的敏感性。
[0020] 本发明的有益效果是：
[0021] (1)本发明的药敏快速检测试剂盒能够同时对临床上鸭常见致病菌的药物敏感性进行检测，无需繁琐的细菌分离鉴定步骤，简化了常规药敏试验的操作流程。
[0022] (2)本发明操作简便，使用方便，特别适合于基层兽医诊疗机构和养殖场使用。
[0023] (3)根据敏感折点设定预包被药物浓度，一方面可以直接筛选出敏感药物，另一方面较梯度浓度法节省了药敏检测板和试剂，节省了检测成本，也利于环境保护。
[0025] 图1为大肠杆菌ATCC25922菌株的菌液浓度-吸光度值标准曲线。
[0026] 生物保藏证明
[0027] 大肠杆菌EC-AE45，拉丁文为Escherichia coli EC-AE45，于2019年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，邮编430027，保藏编号为CCTCC No.M2019753。
[0028] 沙门氏菌S-CXW6，拉丁文为Salmonella sp. S-CXW6，于2019年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，邮编430027，保藏编号为CCTCC No.M2019752。
[0029] 鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4，拉丁文为Riemerella anatipestifer RA-WLJ4，于2019年9 月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，邮编430027，保藏编号为CCTCC No.M2019751。
具体实施方式
[0030] 本发明提供了一种基于ATP生物发光的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，包括增菌培养基、包被抗菌药物的无菌透明EP管和生物发光剂；
[0031] 将增菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管后，所述抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。
[0032] 在本发明中，所述增菌培养基优选包括胰蛋白胨大豆肉汤。在本发明中，所述增菌培养基优选罐装螺纹盖玻璃瓶中，灌装量优选为8～12mL，更优选为10mL，所述螺纹盖玻璃瓶的容量优选为20mL。在本发明中，所述增菌培养基利于适合多种微生物增殖。
[0033] 在本发明中，所述包被抗菌药物的无菌透明EP管中的抗菌药物优选包括阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟、四环素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、红霉素、多粘菌素、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、壮观霉素、安普霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶或复方新诺明。在本发明中，所述抗菌药物的敏感性折点优选为：阿莫西林 4μg/mL、氨苄西林4μg/mL、头孢噻呋2μg/mL、头孢喹肟2μg/mL、四环素 4μg/mL、多西环素4μg/mL、土霉素4μg/mL、氟苯尼考2μg/mL、红霉素 1μg/mL、多粘菌素2μg/mL、恩诺沙星1μg/mL、环丙沙星1μg/mL、二氟沙星1μg/mL、达氟沙星1μg/mL、大观霉素32μg/mL，安普霉素16μg/mL、庆大霉素2μg/mL、磺胺间甲氧嘧啶256μg/mL、磺胺二甲嘧啶256μg/mL和复方新诺明40μg/mL。
[0034] 在本发明中，所述包被抗菌药物的无菌透明EP管中优选含有抗菌药物溶液，将增菌培养基与抗菌药物溶液等体积混合后，即可达到美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。本发明对所述抗菌药物溶液使用的溶剂没有特殊限定，能够溶剂药物并不影响药物性质即可。在本发明中，所述无菌透明EP管的容量优选为1.5mL。
[0035] 在本发明中，所述所述生物发光剂优选包括BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂，所述BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂优选购买于美国，厂家是美国Promega公司，产品型号：G8231。本发明对所述 BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂在试剂盒中的放置量没有特殊限定，采用常规试剂盒中放置试剂的量即可。
[0036] 在本发明中，所述鸭致病菌包括鸭致病性大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌中的一种或几种，本发明对上述鸭致病菌的来源没有特殊限定，采用常规即可，在本发明具体实施方式中，所述鸭致病性大肠杆菌的保藏编号优选为CCTCC No. M2019753，所述鸭疫里默氏杆菌的保藏编号优选为CCTCC No. M2019751，所述沙门氏菌的沙门氏菌保藏编号优选为 CCTCC No.M2019752。
[0037] 在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括：将病死鸭肝组织 0.1mL～0.2mL接种于增菌培养基中，37℃振荡培养1h；静置5min后，取上清菌液加入到包被抗菌药物的无菌透明EP管中，使抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点，于37℃孵育过夜；孵育完毕后，取菌液置于荧光检测管中加入生物发光剂，混匀，以加入生物发光剂的时间作为起始时间，25～30℃放置5min，用CariScreenTMATP荧光检测仪测定荧光值。不含药物的阴性对照管(简称阴性对照)荧光值大于50RLU，试验成立；药物检测管的荧光值越小于阴性对照管，药物越敏感；荧光值越接近于阴性对照管，甚至大于阴性对照管，药物越不敏感。
[0038] 在本发明中，所述菌液培养基与生物发光剂的体积比优选为100:100。本发明优选使用无菌棉签拭子蘸取病死鸭肝组织，本发明优选避免采集使用过抗菌药物的病料，对检测可产生干扰。
[0039] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0040] 实施例1
[0041] 一种基于ATP生物发光的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，包括胰蛋白胨大豆肉汤、包被抗菌药物的无菌透明EP管和BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂。
[0042] 将胰蛋白胨大豆肉汤加入包被抗菌药物的无菌透明EP管后，抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点；包被抗菌药物的无菌透明EP管中的抗菌药物包括阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟、四环素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、红霉素、多粘菌素、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、壮观霉素、安普霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶或复方新诺明，抗菌药物的敏感性折点为：阿莫西林4μg/mL、氨苄西林4μg/mL、头孢噻呋2μg/mL、头孢喹肟2μg/mL、四环素4μg/mL、多西环素4μg/mL、土霉素4μg/mL、氟苯尼考2μg/mL、红霉素1μg/mL、多粘菌素2μg/mL、恩诺沙星1μg/mL、环丙沙星1μg/mL、二氟沙星1μg/mL、达氟沙星1μg/mL、大观霉素32μg/mL，安普霉素16μg/mL、庆大霉素2μg/mL、磺胺间甲氧嘧啶256μg/mL、磺胺二甲嘧啶256μg/mL和复方新诺明40μg/mL；
[0043] 胰蛋白胨大豆肉汤罐装螺纹盖玻璃瓶中，灌装量为10ml，螺纹盖玻璃瓶得容量为20mL。
[0044] 实施例2
[0045] 菌液浓度-吸光度值标准曲线绘制：
[0046] 以标准菌株大肠杆菌ATCC25922绘制菌液浓度-吸光度值标准曲线。将ATCC 25922-1 -1菌株接种于10mL TSB培养基，37℃，200r·min 振荡培养过夜。取1mL菌液，5000r·min 离心3min，弃上清，并加入等量的0.85％生理盐水重悬。然后用生理盐水稀释，用麦氏比浊法得浓度分别为9×108CFU/mL、 7×108CFU/mL、5×108CFU/mL、3×108CFU/mL、1.5×108CFU/mL、 0.75×108CFU/mL的菌悬液，每个菌液浓度重复3次。以生理盐水调零，于600nm波长测定各浓度菌悬液的吸光度值(OD值)，取平均值。以吸光度值为横坐标、以菌液浓度为纵坐标，绘制菌液浓度-吸光度值标准曲线，并进行线性回归得标准曲线方程，结果见图1。
[0047] 实施例3
[0048] 细菌世代时间测定
[0049] 将大肠杆菌ATCC 25922、鸭致病性大肠杆菌EC-AE45(CCTCC M2019753)、鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4(CCTCC M2019753)、沙门氏菌 ST-CXW6(CCTCC M2019752)、禽多杀性巴氏杆菌CVCC474接种于10mL TSB培养基，37℃，200r·min-1振荡培养过夜。取培养物接种到10mL TSB 培养基中，并用上述菌液浓度-吸光度值标准曲线调整起始菌液浓度为 5×105CFU/mL，37℃，200r·min-1振荡培养，每个培养物重复3次。至菌液略显浑浊时(相当于1号麦氏比浊管浓度)，取1mL菌液，5000r·min-1离心3min，弃上清，并加入等量的0.85％生理盐水重悬。以生理盐水调零，于 600nm波长测定菌悬液的OD值，并根据上述菌液浓度-吸光度值标准曲线换算成菌液浓度，取3次测定的平均值。培养物接种时间相当于细菌对数生长期起始时间T1，取样测定的时间相当于对数生长末期时间T2；起始菌液浓度计为X1，对数生长末期菌液浓度计为X2。细菌在对数生长期以二等分分裂方式繁殖，菌液浓度满足关系式：X2＝n2Xl，细菌繁殖代次 n＝3.31×(lgX2-lgX1)，世代时间G＝(T2-T1)/[3.31×(lgX2-lgX1)]。经测定，各菌株世代时间分别为：ATCC 25922，19.7min；EC-AE45，19.1min；RA-WLJ4，
50.1min；ST-CXW6，26.4min；CVCC474：28.1min。
50.1min；ST-CXW6，26.4min；CVCC474：28.1min。
[0050] 实施例4
[0051] 细菌最低检出浓度确定
[0052] 将大肠杆菌ATCC 25922、鸭致病性大肠杆菌EC-AE45、鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4、沙门氏菌ST-CXW6、禽多杀性巴氏杆菌CVCC474菌株接种于10mL TSB培养基，37℃，200r·min-1，培养过夜。取1mL菌液，3000r·min-1离心10min，弃上清，并加入等量的0.85％生理盐水重悬。以生理盐水调零，于600nm波长测定菌悬液的OD值，并根据上述菌液浓度-吸光度值标准曲线换算成菌液浓度。用TSB培养基稀释培养过夜的菌液，得浓度分别为 5×105CFU/mL、2.5×105CFU/mL、105CFU/mL、0.75×105CFU/mL、 0.5×105CFU/mL、0.25×105CFU/mL，并以无菌TSB培养基作为空白对照，每个菌液浓度重复5次。取各稀释度菌液100μL，加入100μL的生物发光剂，混匀；以加入生物发光剂的时间作为起始时间，室温放置5min后，用
CariScreenTMATP荧光检测仪测定荧光值(RLU)。以5次测定的平均荧光值大于空白对照平均荧光值加3倍标准差 对应的最低菌液浓度为该菌株的最低检出浓度。检测结果
为：空白对照的荧光值为4.4±1.14RLU， 最低检出浓度分别为：
ATCC25922，0.25×105CFU/mL； EC-AE45，105CFU/mL；RA-WLJ4，2.5×105CFU/mL；ST-CXW6，
2.5×105CFU/mL；CVCC474：105CFU/mL。
CariScreenTMATP荧光检测仪测定荧光值(RLU)。以5次测定的平均荧光值大于空白对照平均荧光值加3倍标准差 对应的最低菌液浓度为该菌株的最低检出浓度。检测结果
为：空白对照的荧光值为4.4±1.14RLU， 最低检出浓度分别为：
ATCC25922，0.25×105CFU/mL； EC-AE45，105CFU/mL；RA-WLJ4，2.5×105CFU/mL；ST-CXW6，
2.5×105CFU/mL；CVCC474：105CFU/mL。
[0053] 实施例4
[0054] 加药孵育时间确定
[0055] 细菌感染病死鸭组织中的细菌含量一般在105-107CFU/mL，接种到增菌培养基的初始菌液经过增菌培养后，菌液浓度一般高于104CFU/mL。本发明试验菌株中，鸭疫里默氏杆菌的世代时间最长。以世代时间50.1min计算， 37℃孵育5h，细菌以二分裂方式繁殖了6个世代，细菌增殖了26倍，菌液终浓度达到了6.4×105CFU/mL，超过了细菌的最低检出浓度，因此确定加药孵育时间为5h。其他细菌37℃孵育5h后，其世代数更多，菌液终浓度更大。
[0056] 实施例5
[0057] 试剂盒检测与微量肉汤稀释法检测结果比对
[0058] 以标准菌株大肠杆菌ATCC 25922、鸭致病性大肠杆菌EC-AE45、鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4、沙门氏菌ST-CXW6、禽多杀性巴氏杆菌CVCC474 菌株为对象，比较了本发明试剂盒与微量肉汤稀释法对抗菌药物敏感性检测的一致性，被测试的药物包括阿莫西林、头孢噻呋、多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星、大观霉素、庆大霉素。
[0059] 将大肠杆菌ATCC 25922、鸭致病性大肠杆菌EC-AE45、鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4、沙门氏菌ST-CXW6、禽多杀性巴氏杆菌CVCC474接种于10 mL TSB培养基，37℃，200r/min振荡培养过夜。采用麦氏比浊法调整菌液浓度为105CFU/mL，取400μL菌液加入到包被抗菌药物的无菌透明EP管中，并设置不加药物的空白对照，每个检测管重复一次，于37℃孵育5h；孵育完毕后，取100μL菌液置于荧光检测管中，并加入100μL BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂，混匀；以加入生物发光剂的时间作为起始时间，室温放置5min后，用CariScreenTMATP荧光检测仪测定荧光值(RLU)。结果判定：不含药物的阴性对照管(简称阴性对照)荧光值大于50RLU，试验成立；药物检测管的荧光值越小于阴性对照管，药物越敏感；荧光值越接近于阴性对照管，甚至大于阴性对照管，药物越不敏感。检测结果如表1。
[0060] 表1不同药物下各菌株的荧光值(RLU)
[0061]
[0062] 另采用微量肉汤稀释法测定各菌株的抗菌药物敏感性。按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)制订的指南进行药物原液制备和稀释，并设置空白对照组(不加药物组)。挑取培养好的受试菌制备成0.5麦氏单位菌悬液，按照最终菌液浓度为5×105CFU/mL进行接种。接种完毕后将培养基放入 37℃培养箱中培养16h-20h。检查空白对照组生长情况，以肉眼观察读取所需数据。微量肉汤稀释法检测结果如表2。
[0063] 表2抗菌药物的最低抑菌浓度(μg/mL)
[0064]
[0065] 比较本发明的快速药敏试剂盒与微量肉汤稀释法的敏感性结果，两者的符合率为100％。
[0066] 实施例6
[0067] 动物攻毒试验
[0068] 以鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4菌株为攻毒菌株，用生理盐水调整菌液浓度为5×108CFU/mL，选取15日龄健康樱桃谷鸭5只，按0.2mL/只肌肉注射菌液。攻毒后3d，鸭出现死亡。无菌棉签拭子蘸取病死鸭肝组织 0.1mL-0.2mL，接种于10mL无菌包装的增菌培养基，拧紧螺纹盖，充分振摇后，稍稍拧松螺纹盖，37℃振荡培养1h；静置5min后，取上清菌液加入到包被抗菌药物的无菌透明EP管中，每管加入400μL，每个检测管重复一次；37℃孵育5h；孵育完毕后，取100μL菌液置于荧光检测管中，并加入100μL BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂，混匀；以加入生物发光剂的时间作为起始时间，室温放置5min后，用
TM
CariScreen ATP荧光检测仪测定荧光值(RLU)，并判定药物敏感性，结果如表3。结果显示，本发明的药敏快速检测试剂盒能够快速地筛选敏感药物，且检测结果与体外药敏试验结果一致。
TM
CariScreen ATP荧光检测仪测定荧光值(RLU)，并判定药物敏感性，结果如表3。结果显示，本发明的药敏快速检测试剂盒能够快速地筛选敏感药物，且检测结果与体外药敏试验结果一致。
[0069] 表3快速药敏检测试剂盒检测结果
[0070]
[0071] 实施例7
[0072] 临床应用
[0073] 2019年8月，武汉市江夏区某肉鸭养殖场存栏肉鸭约1500羽，19日龄发病，发病率20％左右，已发病2天，每日病死十余只。发病鸭有明显的神经症状，剖检病理变化以心包炎、肝周炎、气囊炎为特征，初步诊断为鸭传染性浆膜炎。无菌棉签拭子蘸取病死鸭肝组织
0.1mL-0.2mL，接种于10mL 无菌包装的增菌培养基，拧紧螺纹盖，充分振摇后，稍稍拧松螺纹盖，37℃振荡培养1h；静置5min后，取上清菌液加入到包被抗菌药物的无菌透明EP 管中，每孔加入400μL；37℃孵育5h；孵育完毕后，取100μL菌液置于荧光检测管中，并加入100μL BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂，混匀；以加入生物发光剂的时间作为起始时间，TM
室温放置5min后，用CariScreen ATP荧光检测仪测定荧光值(RLU)，结果如表4。结果显示，强力霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、阿莫西林、头孢噻呋、壮观霉素为高度敏感药物。选用强力霉素和恩诺沙星拌料给药治疗，给药后5天，病情得到有效控制，全群鸭精神状况和采食恢复正常。
0.1mL-0.2mL，接种于10mL 无菌包装的增菌培养基，拧紧螺纹盖，充分振摇后，稍稍拧松螺纹盖，37℃振荡培养1h；静置5min后，取上清菌液加入到包被抗菌药物的无菌透明EP 管中，每孔加入400μL；37℃孵育5h；孵育完毕后，取100μL菌液置于荧光检测管中，并加入100μL BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂，混匀；以加入生物发光剂的时间作为起始时间，TM
室温放置5min后，用CariScreen ATP荧光检测仪测定荧光值(RLU)，结果如表4。结果显示，强力霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、阿莫西林、头孢噻呋、壮观霉素为高度敏感药物。选用强力霉素和恩诺沙星拌料给药治疗，给药后5天，病情得到有效控制，全群鸭精神状况和采食恢复正常。
[0074] 表4快速药敏检测试剂盒检测结果
[0075] 药物 阿莫西林 头孢噻呋 强力霉素 氟苯尼考 恩诺沙星 大观霉素 庆大霉素 阴性对照 荧光值(RLU) 35 38 26 59 38 42 1334 1463
[0076] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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