스트렙토마이세스 속 균주 유래의 아데노실메치요닌 생합성 효소, 이를 코딩하는 유전자 염기서열 및 항생제를 포함하는 유용한 이차대사산물의 대량 생산방법{Adenosylmethionine synthetase from Streptomyces sp., gene sequences coding the same and method for mass production of secondary metabolites including antibiotics thereof}

본 발명은 S-아데노실-L-메치요닌 생합성 효소와 이를 코딩하는 유전자 염기서열에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 아데노실트리포스페이트(adenosytri-phosphate)와 메치요닌(methionine)을 결합해서 SAM(S-adenosyl-L-methionine)을 생합성하는 생합성 효소(SAM-s)를 암호화하는 유전자의 염기서열 및 아미노산 염기서열에 관한 것이며 SAM을 이용하여 항생제를 포함하는 유용한 이차대사산물을 대량생산하는 방법에 관한 것이다.

SAM의 경우 살아있는 생명체에 있어서 생명현상에 관여하는 1, 2차 대사에 주요한 역할을 하는 분자이다. 이것은 메칠기의 공여자로 사용되며, 폴리아민(polyamine)의 생합성에 있어서 아미노프로필 그룹(aminopropyl group)의 전구체로 사용되는 물질이다. 메칠기 공여자나 폴리아민은 생명체의 대상에 커다란 영향을 주는데 특히 1, 2차 대사에 직접적으로 관여한다.

또한 대장균과 고초균에서는 세균의 생활상에 있어서, 형태분화에 영향을 주며, 이로 인하여 생활환의 변화에 따른 영향들이 보고된 바 있다. 이는 SAM의 메칠 공여체의 역할에 의한 것과 생활환의 직접적인 성장저해나 촉진에 의한 형태분화로 알려져 있다.

본 발명은 현재 널리 쓰여지고 있는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스( Streptomyces spectabilis )가 생산하는 스펙티노마이신(spectinomycin)의 연구에서 출발하였다. 스펙티노마이신(spectinomycin)은 아미노글라이코시드(aminoglycoside)계 항생물질로 한개의 당을 포함하고 있고, 메칠 공여체인 SAM에서 유래한 2개의 메칠기를 가지고 있는 것으로 조사되었다.

SAM은 현재까지의 연구 보고에 의하면 미생물 뿐만 아니라 동식물에서도 1,2차 대사에서 메칠 공여체로서 중요한 역할을 하고 있으며, 특히 형태분화에 영향이 있음이 이미 보고된 바 있다.

본 발명자들은 이러한 점에 착안하여 본 발명에서는 스펙티노마이신(spectinomycin)의 생합성에 SAM이 영향을 미칠 수 있으며, 항생제 생산 조절에도 관여할 수 있음을 생각하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 스트렙토마이세스 스펙타빌리스( Streptomyces spectabilis ATCC 27741)로부터 유래한 SAM 생합성 효소의 유전자 염기서열과 이로부터 번역되는 아미노산 서열을 제공함에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 아미노산 서열을 갖는 SAM 생합성 효소로 부터 생산되는 SAM이 항생제를 포함하는 유용한 이차대사산물의 생산을 촉진할 수있는 능력이 있음을 밝히는데 있다.

상기 본 발명의 첫째 목적은 PCR를 이용하여 스트렙토마이세스 스펙타빌리스( S. spectabilis )로부터 SAM 생합성 유전자를 분리하고 스트렙토마이세스 스펙타빌리스( S.spectabilis )로부터 제작한 유전자 도서관으로부터 4.0kb의 PCR 산물을 얻은 후, 시퀀싱을 통하여 약 1.2kb 정도의 SAM 생합성 유전자가 존재함을 확인함으로써 달성하였다.

또한 상기 본 발명의 둘째 목적은 유전자가 코딩하는 SAM 생합성 효소로부터 제조되는 SAM이 항생제를 포함하는 유용한 이차대사산물의 생산을 촉진할 수 있음을 확인함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 SAM 생합성에 관여하는 효소(SAM-s)를 코딩하는 유전자가 대장균 플라스미드에 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 pJWK0012의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 2는 SAM 생합성 유전자( SAM-s) 로부터 번역되는 아미노산 서열을 기초로 하여 미국 GeneBank 데이터와 비교한 상동성 검색 결과이다.

도 3은 HPLC를 사용하여 시판되고 있는 SAM과 비교함으로써, 본원발명인 SAM 생합성 효소(SAM-s)의 SAM 합성을 보여주는 그래프이다.

도 4는 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23에 도입된 SAM 생합성 유전자( SAM-s )에 의한 액티노로딘(actinorhodin)의 생산성 증대를 보여주는 그래프이다.

도 5는 SAM 생합성 유전자( SAM-s )를 이용하지 않고, 시판되고 있는 SAM을 항생제 생산 균주에 직접 처리해 줌으로써 항생제 생산 증가 여부를 확인한 사진도이다.

도 6은 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23에서 운데실프로디지오신(Undecylprodigiosin) 항생제 생산량의 증가를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 서열목록의 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스( Streptomyces spectabilis ) ATCC 27741 유래의 S-아데노실-L-메치요닌 생합성 효소를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 아미노산 서열을 코딩하는 서열목록의 서열 1에 기재된 유전자 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 방선균 유래 S-아데노실-L-메치요닌 생합성 효소를 코딩하는유전자가 도입된 형질전환체로부터 항생제를 포함하는 유용한 이차대사산물의 생산을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 S-아데노실-L-메치요닌(S-adenosyl-L-methionine)을 항생제 생산균의 배지에 직접 처리하여 항생제를 포함하는 유용한 이차대사산물을 생산하는 것을 특징으로 한다.

상기에 있어서, 상기 이차대사산물중에는 폴리케타이드(polyketide)계열의 항생제는 물론 항암제 및 기타 구충제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 스펙티노마이신 생산균주인 스트렙토마이세스 스펙타빌리스 ( S. spectabilis ATCC 27741)의 게놈을 이용하여 작성된 cDNA 라이브러리에서 분리한 스펙티노마이신 생합성 효소의 유전자가 들어있는 코스미드 클론에서 아데노실메치요닌 생합성 효소의 유전자로 아데노실트리포스페이트(ATP)와 메치요닌을 결합하여 SAM을 만들어내는 SAM 합성 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 3.9kb 클론의 염기서열과 아미노산 염기서열을 밝혔다. 이 유전자로 암호화되는 효소의 기능을 알기 위하여 실험관내(in vitro) 실험을 통하여 기질이 합쳐지는 것을 확인하였고 방선균의 대표적 연구 균주인 스트렙토마이세스 리비단스( Streptomyces lividans ) TK23에 형질전환하여 생산되는 항생제 액티노로딘(actinorhodin)을 측정함으로써 항생제 생산에 대한 영향을 확인하였고, SAM이라는 물질을 배지에서 처리하여 항생제의 대량 생산을 확인하였다.

본 발명의 하기 실시예에서는 용이하게 입수할 수 있는 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23 균주에 SAM 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여그 형질전환체에서 액티노로딘(actinorhodin)이라는 항생물질이 대량 생산됨을 확인함으로써 SAM이라는 물질에 의해 항생제 생산능이 증가됨을 확인하였으나 이는 상기 형질전환체나 상기 항생물질에 한정되는 것은 아니고 항생물질생산능이 있는 방선균주에 상기 유전자를 도입시켰을 경우에 전부 달성될 수 있는 효과이다.

또한 SAM이 생체내에서 과대 생합성됨으로써 항생제 액티노로딘 항생제 생산량을 증가시키는 것을 확인한 후, 하기 실시예 5~13에서와 같이 세포 외부에서 SAM을 처리해 줌으로써 항생제 생산에 미치는 영향을 확인하였다.

그 결과 외부에서 SAM을 처리한 경우에 있어, 항생제의 생산량이 5~10배 정도 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 특히 폴리케타이드(polyketide)계열의 항생제에 있어 주목할 만한 생산량 증가의 효과가 있었다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 스트렙토마이세스 스펙타빌리스 ( Streptomyces spectabilis ATCC 27741)의 코스미드 클론에서의 SAM 생합성 효소(SAM-s)의 유전자 클로닝

본 실시예에서는 항생물질의 생합성에 관여하는 효소들이 일반적으로 게놈의 일정지역에 모여서 존재하므로, 스펙티노마이신 생합성 유전자 집단이 존재하는 삽입단편 30-40kb에 상당하는 두 개의 코스미드 클론에도 아미노글라이코사이드계 항생물질인 스펙티노마이신 생합성에서 메칠기를 도입해주는 메칠트랜스퍼래이즈 유전자가 존재할 것이므로 상기의 두 개의 코스미드 클론를 여러 가지 제한효소로 절단한 후 스트렙토마이신 생합성 유전자중 메칠트랜스퍼래이즈 유전자와 염기서열 상동성이 높은 metK 유전자를 탐침으로 하여 서던 하이브리디제이션(Southern hybridization) 실험을 수행하였다.

이때, pHCG121 코스미드에서 Bam HI 3.9kb가 양성반응을 보였고 BamH I 3.9kb 단편을 대장균 플라스미드 pBluescript KS(+)의 Bam HI 자리에 서브클로닝하였다. 실험결과, 약 BamH I 3.9kb 단편이 삽입된 pHCG1647 재조합 플라스미드에 목표로 했던 SAM의 생합성에 관여하는 SAM 생합성 효소의 유전자가 존재함을 확인하였고 이를 다시 서브클로닝하여 NcoI/PstI 2.5kb 단편을 얻었고 이를 pJWK0012의 재조합 플라스미드로 재작하여 단편의 염기 서열을 결정하였다.

실시예 2: 효소 SAM-S의 유전자 염기서열 및 아미노산 서열 결정

본 실시예에서는 SAM-s의 유전자 염기서열 및 아미노산 서열 결정을 위하여, pJWK0012 재조합 플라스미드의 삽입단편을 제한효소인 Apa I, Sal I, Sac I로 처리하여 염기서열 결정이 용이한 서브클론을 제작한 후 염기서열을 결정하였다. 도 1에는 pBluescript KS(+)에 서브클로닝된 SAM-s 유전자를 포함하는 pJWK0012의 제한효소지도와 유전자 위치를 나타냈다. CODON PREFERENCE 프로그램(Bibb, MJ et al., Gene, 1984)을 이용하여, 일차적인 DNA 염기서열 결과를 기초로 단백질을 코딩하는 부분을 검색하였다.

실험 결과, 이 지역에 한 개의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 존재함을 확인하였다. SAM-s라 명명한 단백질은 염기순서가 835인 ATG를 개시코돈으로하여 염기서열이 2051인 TGA를 종결코돈으로 하는 464개의 아미노산으로 구성되어 있는 것이 확인되었다.

또한, 데이터베이스를 통하여 아미노산 상동성을 검색한 결과, 스트렙토마이세스 코에리코롤( Streptomyces coelicolor ), 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis ), 에스세리시아 콜라이( Escherichia coli )를 대상으로 수행된 GENOME Project의 결과로서 미국 GenBank에 보고되었던 많은 에스-아데노실-엘-메치요닌 합성 효소(S-adenosyl-L-methionine synthetase)와 상동성이 있었고, 여러 가지 메틸트랜스퍼래이즈(methyltransferase)와 상동성이 있는 것으로 확인되었다.(도 2)

실시예 3: SAM 생합성 효소의 유전자 기능분석

본 실시예에서는 분리한 SAM 생합성 효소의 유전자 기능을 분석하기 위하여 SAM 생합성 효소의 유전자를 에스세리시아 콜라이( E. coli )에서 발현시켜 SAM 생합성 효소를 분리하였다.

효소 분리 방법은 SAM 생합성 효소의 유전자를 pET-21a 벡터에 도입하여 에스세리시아 콜라이( E. coli ) BL21에서 발현한 후 His-Tag 정제 방법을 사용하여 원하는 효소만을 분리 정제하였다. 분리한 효소를 이용한 SAM 생합성 능력을 실험하기 위하여 실험관내( in vitro ) 반응 조건을 확립했는데 그 조건은 다음과 같다. Tris-HCl 100mM, KCl 200mM, MgCl ₂ 10mM, DTT 1mM, ATP 5mM, 메치요닌(methionine) 5mM과 분리한 효소용액 10-50ul를 첨가하여 섭시30도에서 120분 동안 반응시켰다.반응 후 반응 생성물은 리버스 C18 컬럼(Reverse C18 column)을 이용한 HPLC에서 NaH ₂ PO ₄ 0.1M과 아세토나이트라일(acetonitrile)을 98:2(V/V)으로 섞어 pH 2.65로 만든 후 분리를 시작하여 NaH ₂ PO ₄ 0.15M 용액과 아세토나이트라일(acetonitrile)을 74:26으로 섞은 용액으로 농도 구배를 주어 흘려주면서 HPLC를 실시하여 SAM을 검출하였다.

도 3은 본 발명에서 찾은 SAM 생합성 유전자의 기능을 확인하기 위하여 SAM 생합성에 기질로 사용되는 ATP와 메치요닌을 사용하여 에스세리시아 콜라이( E. coli )로부터 분리 정제한 SAM 생합성 효소를 반응시켜 SAM 생합성 능력을 확인한 것이다. 이의 확인은 HPLC를 사용하여 시판되고 있는 SAM과 비교함으로써 본원발명 SAM 생합성 효소의 SAM 생성 여부를 확인하였다.

실시예 4: 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23에서 액티노로딘(actinorhodin) 항생제 생산량 증가 확인

SAM에 의한 항생제 생산 증가를 하기와 같이 실험함으로써 입증하였다.

스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23에 SAM 생합성 효소의 유전자를 도입하기 위하여 에스세리시아 콜라이( E. coli ) · 방선균 셔틀벡터인 pWHM3에 클로닝한 후 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23에 형질전환하였다(2002년 7월 2일자로 한국종균협회에 기탁, 기탁균주명: Streptomyces lividans TK-23 harboring pSAM-s, 기탁번호 KCCM 10397). 그 후 스트렙토마이세스 리비단스( S.lividans ) TK23에서 생산되는 대표적인 항생물질인 액티노로딘(actinorhodin)의 생산량을 측정하였다. 액티노로딘(actinorhodin)의 생산 배지는 글리세롤(glycerol) 50g, 글루탐산(glutamic acid) 5g, 모포리노프로페인 설포닉 산(morpholinopropane sulfonic acid) 21g, MgSO ₄ ·7H ₂ O 200mg, CaCl ₂ ·2H ₂ O 100mg, NaCl 100mg, KH ₂ PO ₄ 82mg, FeSO ₄ ·7H ₂ O 9mg, 트레이스 엘리먼트 용액(trace element solution) 2 ml (per liter)와 pH 6.5로 맞추어 사용하였다. 그 후 28 ℃에서 진탕 배양하면서 7일 간 항생제 량을 측정하였다.

도 4는 SAM 생합성 효소의 유전자를 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23에서 과대 발현하여 SAM을 생체 내에서 과대 생산한 결과, 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23에서 생산하는 액티노로딘(actinorhodin)의 생산성 증대를 확인한 것이다. SAM의 과대 생산에 의하여 액티노로딘(actinorhodin)의 생산성은 야생종 보다 6배 이상 증가하였다.

실시예 5: 외부에서 처리한 SAM에 의한 항생제 생산 촉진 확인

SAM이 생체내에서 과대 생합성 됨으로써 항생제 액티노로딘(actinorhodin) 생산량을 증가시키는 것을 확인하고, 세포 외부에서 SAM을 처리해 줌으로써 항생제 생산에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 그 방법으로 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23 야생종을 항생제 생산 배지에 배양하면서 1 mM되도록 시판하는 SAM을 처리하였다. 그 결과 SAM을 처리한 배지에서는액티노로딘(actinorhodin)이 생산되는 것을 확인하였으나, 대조군으로 사용한 물처리 군에서는 항생제 생산량의 증가를 확인하지 못하였다.

도 5는 SAM의 생합성 유전자를 이용하지 않고, 시판되고 있는 SAM을 항생제 생산 균주에 직접 처리함으로써 항생제 생산 증가 여부를 확인한 것이다. SAM을 외부에서 처리한 결과, 대조군으로 물을 처리한 것에 비하여 많은 양의 항생제 생산되는 것을 확인할 수 있다. 도 5에서 푸른색은 항생제를 나타내고 있다.

실시예 6: 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23에서 운데실프로디지오신(Undecylprodigiosin) 항생제 생산량 증가 확인

스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK23에 pSAM-s를 도입하여 액티노로딘 생산조건과 동일하게 배양한 후 배양액내 pH를 12로 맞춘 후 468 nm에서 흡광도를 측정한 후 "농도=OD값 ×9.4673"을 이용하여 농도를 계산하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 항생제의 생산량이 증가되었다.

실시예 7~13: 각종 방선균에 있어 SAM의 처리에 의한 항생물질의 생산 검증

상기 실시예 7~13에 기재된 항생제 사용균주를 각각의 항생제 생산 배지에 배양하면서 1 mM되도록 시판하는 SAM(시그마사, 미국)을 처리(실험군)하였다. 그 결과 SAM을 처리한 배지에서는 실시예 7~13에 기재된 항생물질이 각각의 균주로 부터 대량 생산되는 것을 확인하였으나, 대조군으로 사용한 물처리 군에서는 그러하지 아니하였다(표 2).

상기 표 2에서 보는 바와 같이 항생제 생산량은 SAM을 처리한 사용군에 있어 대조군보다 5~10배에 해당하는 항생제 생산량의 증가를 확인할 수 있었다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 스트렙토마이세스 스펙타빌리스( Streptomyces spectabilis ATCC 27741)로부터 유래한 SAM 생합성에 관여하는 SAM-s(metK)의 유전자 염기서열과 아미노산 서열을 결정하여 제공하는 효과가 있으며, 아데노실메치요닌 생합성 유전자의 조작을 통하여 세포의 대사를 조절함으로써 항생물로 대변되는 2차대사 산물의 과다 생산을 유도할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.