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球毛壳菌素A作为酪酸酶抑制剂上的应用

阅读:585发布:2020-05-17

专利汇可以提供球毛壳菌素A作为酪酸酶抑制剂上的应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了球毛壳菌(Chaetomium)QY-1对酪 氨 酸酶的抑制作用研究。该球毛壳菌QY-1菌株,分离自三峡河岸带疏花 水 柏枝。本发明以球毛壳菌QY-1为原料,通过 发酵 培养, 真空 抽滤,乙酸乙酯萃取,经 硅 胶柱层析丙 酮 —石油醚梯度洗脱,液相分析及制备,结晶、重结晶得到 次级代谢产物 球毛壳菌素A。通过测定球毛壳菌QY-1的粗提物和其次级代谢产物球毛壳菌素A对酪氨酸酶的抑制效果,发现QY-1的粗提物及球毛壳菌素A对酪氨酸酶均具有很好的抑制效果,同时通过计算机辅助药物设计分析,发现球毛壳菌素A对酪氨酸酶具有一定的结合能 力 。因此可用于制备酪氨酸酶 抑制剂 ,也可以应用于 化妆品 ,医药等领域,具有很高的研究价值以及良好的经济和社会效益。,下面是球毛壳菌素A作为酪酸酶抑制剂上的应用专利的具体信息内容。

1.球毛壳菌素A作为酪酸酶抑制剂上的应用,所述的球毛壳菌素A分离自球毛壳菌QY-1中,所述的球毛壳菌素A的结构如下:
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,球毛壳菌(Chaetomium globosum)QY-1,于
2016年4月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为,CCTCC NO:M 2016178。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的球毛壳菌(Chaetomium globosum)QY-1,在制备酪氨酸酶抑制剂上的应用。
4.一种酪氨酸酶抑制剂,其含有权利要求1-3任一项所述的球毛壳菌素A的菌株或其发酵液或含所述菌株的生物菌剂。
5.一种酪氨酸酶抑制剂,其含有权利要求1所述的球毛壳菌(Chaetomium globosum)QY-1的菌株或其发酵液或含所述菌株的微生物菌剂。

说明书全文

球毛壳菌素A作为酪酸酶抑制剂上的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及球毛壳菌A对酪氨酸酶的抑制作用研究,主要应用于酪氨酸酶抑制剂的研究以及开发利用。

背景技术

[0002] 酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr,EC.1.14.18.1)又称酚化酶、多酚氧化酶(PPO)、儿茶酚氧化酶,是一种含的金属氧化还原酶,活性中心是由两个含铜离子位点构成,广泛存在于动植物生物及人体中。在生物体内,酪氨酸酶对酪氨酸和其它酚类化合物的代谢及黑色素的合成起重要的催化作用,其活性与黑色素的合成量成正相关,同时也是果蔬褐变的关键酶,研究表明酶的活性越高,果蔬褐变(氧化)的速度越快,保藏期越短。
[0003] 为了 抑 制黑色 素的 形成以 及 果蔬 褐变 ,对于 酪氨 酸酶 抑制 剂(tyrosinaseinhibitor,TI)的研究有很多,因TI在美容保健、色素型皮肤病的治疗病虫害防治以及食品保鲜等方面有着广泛的应用。有研究表明TI可直接抑制酪氨酸酶活性以及调控细胞中酪氨酸酶的表达量可有效调控黑色素的生成,从而达到美白及治疗色素紊乱症的作用;同时还可以抑制果蔬褐变,延长货架期
[0004] 本发明以内生真菌QY-1为原材料,从其次级代谢产物中分离得到一纯物质球毛壳菌素A,已知其具有广谱拮抗性和抗逆性,对多种杭物病害具有良好的防治效果,对肿瘤细胞强烈的细胞毒性、抗细菌和真菌活性(稻瘟病,立枯丝核菌和腐霉菌等植物病原菌)。

发明内容

[0005] 本发明提供一种球毛壳菌素A对酪氨酸酶的抑制活性,可用于制备、研发酪氨酸酶抑制剂,为开发新型高效的酪氨酸酶抑制剂提供选择,其不仅对提高蔬菜、果等食品的质量和营养价值有重要意义,而且防治人类的许多色素沉着疾病以及其它与黑色素有关的健康问题等方面有着重要的应用价值。
[0006] 一株球毛壳菌(Chaetomium globosum)QY-1菌株,该菌株具有对酪氨酸酶的抑制作用,可用于制备酪氨酸酶抑制剂,为开发新型的酪氨酸酶抑制剂提供了新选择。
[0007] 所述球毛壳菌(Chaetomium globosum)QY-1菌株是从疏花水柏枝(Myricaria Laxiflora)的叶中获得的内生真菌,于2016年4月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为,CCTCC NO:M 2016178。保藏地址为中国,武汉,武汉大学。
[0008] 本发明球毛壳菌(Chaetomium globosum)QY-1在铃薯葡萄糖培养基上具有以下微生物学特性:菌落生长缓慢,初期菌落为白色,渐变成暗青色,里层颜色较深,呈黄褐色,背面为米黄色,菌丝分支有隔。
[0009] 本发明另一目的是提供一种活性成分为球毛壳菌QY-1的次级代谢产物用于酪氨酸酶抑制剂,具体为球毛壳菌素A。对酪氨酸酶的酶活测定实验表明,当对酪氨酸酶活的抑制率达到50%左右时,球毛壳菌粗提物的浓度为1mg/mL,即球毛壳菌素A的浓度为1mg/mL,正对照Vc的浓度为0.2mg/mL,正对照熊果苷的浓度为5mg/mL。因而,本发明还包括含有所述菌株或者其发酵液的生物制剂,以及含有所述菌株的微生物菌剂。同时使用薛定谔软件进行分子对接分析,发现球毛壳菌素A对酪氨酸酶(PDB编号:5CE9)具有强烈的结合能力,说明球毛壳菌素A是通过与酪氨酸酶结合从而抑制黑色素的产生。
[0010] 附图/表说明
[0011] 图1为本发明的QY-1的次级代谢产物球毛壳菌素A与酪氨酸酶结合的分子对接结果。

具体实施方式

[0012] 实施例1:球毛壳菌(Chaetomium globosum)QY-1的次级代谢产物的分离提取、鉴定
[0013] 菌种的活化与培养
[0014] 挑取保存的QY-1菌种于PDA固体培养基中,培养3-7d,接种菌丝于发酵培养基(PDA液体培养基),500mL三瓶装液量为200mL,28℃、140r/min培养7d。
[0015] 样品提取
[0016] 发酵好的菌悬液经真空抽滤除去菌丝得发酵液水相,发酵液水相用等体积的乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,得该菌株次级代谢产物的发酵液的乙酸乙相,然后减压浓缩,冷冻干燥备用,即为QY-1发酵液乙酸乙酯相粗提物。
[0017] 物质的分离鉴定
[0018] 洗脱剂的确定:在进行胶柱层析之前,首先需要确定一种分离效果好的洗脱剂。在相同的条件下,硅胶柱层析与薄层层析在分离物质的原理上有着相同之处,故在选择硅胶柱层析的洗脱液时,先用简便的薄层层析做筛选,选几种常用展开剂进行试验,根据Rf(0.3酮/石油醚。
[0019] 硅胶层析:取发酵液乙酸乙酯相粗提物溶于甲醇中,加入适量的硅胶粉(200-300目)混匀,低温干燥后待上样。取柱层析用硅胶粉(200-300目)在105℃下活化30min,转移到干燥器中冷却。采用干法装柱和上样,即直接加活化好的硅胶粉于柱子中,保持上面平整,之后加入拌好样品的硅胶粉,最后用不同比例丙酮/石油醚的洗脱剂进行洗脱,收集馏分,减压蒸馏,吹干样品待分析。
[0020] 馏分的高效液相色谱:对粗提物的各馏分进行HPLC检测,通过样品中各洗脱峰的保留时间判断样品的纯度,收集单封化合物的馏分。本发明的次级代谢产物,液相制备的溶液吹干有机相会有黄色结晶,低温(4℃)重结晶,过滤分离结晶和母液,收集晶体。
[0021] 核磁分析:将收集得到晶体的化合物,进行核磁分析,确定其结构。
[0022] 通过结构鉴定分析,得到一种纯化合物为球毛壳菌素A,其结构如下:
[0023]
[0024] 实施例2:球毛壳菌(Chaetomium globosum)QY-1对酪氨酸酶抑制作用的研究[0025] 酪氨酸酶抑制率检测方法:
[0026] 多巴氧化法是基于L-多巴的酪氨酸酶催化氧化产物-多巴色素(dopachrome)在475nm波长处有最大吸收。在10mL试管中按下表依次加入反应液。
[0027]
[0028]
[0029] 立即充分混匀,测定OD475nm值。
[0030] 计算公式:
[0031] 实施例三:球毛壳菌素A对酪氨酸酶抑制的计算机药物辅助模拟分析[0032] 首先,在PDB数据库里查找已知的酪氨酸酶单体结构,通过对比选择编号为5CE9的酪氨酸酶结构,其是第一种关于植物酪氨酸酶晶体结构,来自于胡桃(Juglans regia)。其次使用薛定谔软件进行分析,确定本发明的球毛壳菌素A与5CE9是否有结合能力。
[0033] 结果显示,球毛壳菌素A与5CE9可以结合,模拟结果打分为-3.1(打分结果值越高表面结合能力越强),表现为中等活性,即具有一定的结合能力。说明本发明发的球毛壳菌素A抑制酪氨酸酶的活性是通过与其结合,从而可以抑制黑色素的产生。
[0034] 表1 Vc对酪氨酸酶活力的抑制结果
[0035]
[0036] 表2 QY-1粗提物对酪氨酸酶活力的抑制结果
[0037]
[0038] 表3 CheA(球毛壳菌素A)对酪氨酸酶活力的抑制结果
[0039]
[0040] 表4熊果苷对酪氨酸酶活力的抑制结果
[0041]
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