【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ハプテン抗原及びその製造法、ハイブリドーマ及び抗フモニシンモノクローナル抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】フモニシン類は、真菌類のフザリウム(F
usarium)属の微生物により産生され、その内フザリウム・モニリホルメ(Fusarium・moniliforme)が主となり産生する有毒二次代謝産物である。 フモニシンは、近年海外で問題になっており、幾つかの同属体が知られている全く新しいタイプのカビ毒である。 これまでに知られているフモニシンの毒性は、Leukoencephalomalocia(馬の白脳炎)、更にラットに対する発癌性や人に対する食道癌
(南アフリカ））の発生も報告されている。 当初、フモニシンの汚染は、トウモロコシそのものについて注目されたが、それらを原料とした食品の汚染も報告され、米国ＵＳＤＡも本格的な調査を開始している。 また、日本国内においてもフモニシンの認識はまだ低く、公の規制もまだない。 しかし、トウモロコシの輸入量増加に伴い汚染が問題化すると考えられる。 フモニシンを穀物、特にトウモロコシ、あるいはその加工品から検出するには、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等が用いられているが、まだ、公定法に至っていない。 また、近年では免疫測定法も試みられている。 免疫測定法においては、フモニシンを選択的に検出するために、フモニシンに対して特異性の高い抗体を得ることが最も重要なポイントとなる。

【０００３】フモニシンＢ ₁のような低分子化合物は、
それ自体免疫原性を有しないので、蛋白質等の高分子物質との結合体、すなわちハプテン抗原を合成し動物に免疫を施すのが常法となっている。 フモニシンＢ ₁に対するポリクローナル抗体の作製は、従来法では結合蛋白質にコレラトキシンを用い、グルタルアルデヒドを架僑剤としてこのコレラトキシンをフモニシンＢ ₁と結合させたハプテン抗原で動物を免疫して作製されていた。 しかし、従来、牛血清アルブミンを結合蛋白質として使用したハプテン抗原については充分な抗体の産生が不可能であつた〔JIAzcona-Olivra,et al.,Applied and Envir
onmental Microbiology,58,169(1992)〕。 また、抗体のモノクローナル抗体の作製については、同じく、結合蛋白質にコレラトキシンを用いたハプテン抗原により動物を免疫し、ＩｇＧ ₁型の抗体が作製されていた。 投与方法も静脈内投与という高度な方法に依存している〔JI
Azcona-Olivera et al.,J.Agric.Food Chem.,40,531(19
92)〕。 このため、コレラトキシンのような特殊 で高価な蛋白質を使用せず、牛血清アルブミン等の入手が容易な蛋白質を結合蛋白質に用いたハプテン抗原の開発、及び免疫法も腹腔内投与のような一般的で容易な方法が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、牛血清アルブミンを結合蛋白質としたフモニシンＢ ₁のハプテン抗原を開発し、腹腔内投与のような一般的で容易な方法で免疫を施して、ＩｇＧ _2b型のモノクローナル抗体を提供すること等を目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、上記実情に鑑み種々検討した結果、フモニシンＢ ₁に、マレイミドベンゾイルオキシサクシイミド、グルタルアルデヒド等の架橋剤を結合させ、次いで、これに、必要により還元された牛血清アルブミン、ヘモシアニン等の蛋白質を架橋化させれば、容易にハプテン抗原フモニシンＢ ₁蛋白質結合体を効率よく作製できること、また、このハプテン抗原により免疫を施した動物より得た抗体産生細胞と増殖性の高い細胞との融合細胞より、目的とする抗原に対して特異的に反応する抗体を産生するクローンが得られ、これをモノクローン化すれば、特異性の高い抗体が創製できること等の知見を得、これらの知見に基づいて本発明を完成した。 すなわち、本発明は、以下の構成を含むものである。 （１） フモニシンＢ ₁と必要により還元された牛血清アルブミン又はヘモシアニン等の蛋白質とをマレイミドベンゾイルオキシサクシイミド、グルタルアルデヒド等の架橋剤を介して結合させたハプテン抗原フモニシンＢ
₁蛋白質結合体。 （２） フモニシンＢ ₁に、マレイミドベンゾイルオキシサクシイミド、グルタルアルデヒド等の架橋剤を結合させ、次いで、これに、必要により還元された牛血清アルブミン又はヘモシアニン等の蛋白質を結合させることを特徴とするハプテン抗原フモニシンＢ ₁蛋白質結合体の製造法。 （３） 動物を、上記（１）記載のハプテン抗原フモニシンＢ ₁蛋白質結合体で免疫し、該動物からの抗体産生細胞と増殖性の高い細胞との細胞融合によって形成されたＩｇＧ _2b型抗フモニシンモノクローナル抗体産生能を有するハイブリドーマ。 （４） 上記（３）記載のハイブリドーマから産生されたＩｇＧ _2b型抗フモニシンモノクローナル抗体。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。 フモニシンＢ ₁は、フザリウム(Fusarium)属の微生物により産生される低分子化合物（WCAGelderblom, et. al.,Appl
ied and Environment Microbiology,54, 1806 (1988)）
であり、単独では抗原とはなり得ないため、フモニシンＢ ₁を蛋白質と結合させてハプテン抗原に供する。 該蛋白質としては、如何なるものでもよく、例えば、通常入手が容易で安価な牛血清アルブミン、ヘモシアニン等が挙げられる。 そして、フモニシンＢ ₁と蛋白質とを結合させる架橋剤としては、例えば、マレイミドベンゾイルオキシサクシイミド、グルタルアルデヒド等が挙げられ、とりわけマレイミドベンゾイルオキシサクシイミドは好適である。 先ずフモニシシンＢ ₁に、上記架橋剤を結合させるには、例えば、pH6-8、好ましくは、pH7程度、温度20-40℃、好ましくは、30℃前後で20分以上好ましくは、30分程度必要により攪拌しつつ行なうことができる。 上記 pH条件に保つには、適宜適当な緩衝液を選択すればよい。 次いで、このようにして得られたフモニシンＢ ₁ - 架橋剤に、必要により還元された蛋白質を架橋化させてハプテン抗原を得るには、上記結合条件と同様に行なうことができる。 なお、架橋剤として、マレイミドベンゾイルオキシサクシイミドを用いる場合には、還元された蛋白質を使用する必要がある。 そして、
この還元された蛋白質は、例えば、蛋白質核酸酵素 別冊 No.31 酵素免疫測定法 第27−33頁(1987) 特に第
30−31頁『ｂ.MBS型の異反応性2価試薬を使用する方法』記載の方法等により得ることができる。 抗体産生細胞としては、例えば脾細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等が例示される。 免疫動物は、細胞融合に使用する増殖性の高い細胞によって決定され、例えば、マウス、ラット等が用いられ、マウスの種類の内でも免疫グロブリンを産生しない腫瘍細胞株の確立されているBALB/c系統が好ましい。

【０００７】増殖性の高い細胞としては、例えば、P3X6
3Ag8U.1(U1)(ATCC CRL 1597)、P3X63-Ag8.653(653)(ATC
C CRL 1580)、P3/NS1/1-Ag4-1(NS-1)(ATCC TIB 18)、SP
2/0-Ag14(SP2)(ATCC CRL 1581)等が挙げられる。 このようにして得られたハプテン抗原を、例えば、等張緩衝液、生理食塩水等に溶解して、マウスの場合１匹当たり１回に10〜300μｇを投与する。 通常免疫は、数回に分けて行ない、初回免疫は、アジュバンドと共に投与する。 アジュバンドとしては、ミョウバン、結核死菌体、
核酸等を常用する。 免疫は、2〜4週間隔で行ない、最終免疫は、使用せず行なう。 投与方法は、マウスの場合、
腹腔、皮下等が一般的であり、静脈内投与等も行なうことができる。 最終免疫2〜4日後にリンパ節又は脾臓を摘出し、得られたリンパ球を増殖性の高い細胞との細胞融合に供する。 細胞融合は、例えば、〔G.Galfre.Nature,
266,550(1977)〕に記載の方法又はこれに準ずる方法によって行なうことができる。 この際30〜50ポリエチレングリコール（平均分子量）を用いて30〜40℃の温度下に約1〜3分間程度反応させると好適である。 なお、胸腺細胞（フィーダ細胞）としては、BALB/cマウスの胸腺細胞、インターロイキン6等の細胞増殖促進成分等を用いることができる。

【０００８】細胞融合によって得られた融合細胞は、常法に従い、目的とするモノクローナル抗体を産生するクローンのスクリーニングに供する。 即ち、当該細胞を、
例えばマイクロプレート（96穴培養プレート等）中で培養し、増殖の見られた穴の培養上清中の抗体価を、例えば酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）等によって測定し、適切な抗体を産生している穴を得る。 このような穴から更に例えばＦＡＣＳ(Fluoresent Activated Cell Sorter)、So
ft Agarを用いてコロニーを拾い上げる方法、一般によく用いられる限外稀釈法等によってクローニングを行なってクローンを得る。 このクローンは、例えば、予めプリスタンを投与したBALB/cマウスあるいはヌードマウスの腹腔内へ移植し、７〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、検定する。 または、牛血清アルブミン（0.1〜１％）含有無血清培地中でも増殖させることができる。 即ち、0.5％牛血清アルブミン含有無血清培地（例えばＲＩＴＣ55-9培地）中で増殖させ、
培養上清を採取する。 選ばれたクローンの産生するモノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体、或いはイムノグロブリン・アフィニティーカラム等を応用することで容易に行うことができる。 かくして本発明は、フモニシンＢ ₁蛋白質結合体をハプテン抗原としてマウス腹腔内投与により得られた抗体を提供する。 即ち、フモニシンＢ ₁に特異的な抗原を認識し、フモニシンＢ ₁への結合がフモニシンＢ ₁により阻害され、コントロール（ミルク蛋白によるブロックのみを行なったＥＬＩＳＡプレート）に反応しないＩｇＧ _2b型の抗フモニシンＢ ₁モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローン４株、
FB-1(6B10;5;6;5),FB-1(6B10;5;6;6),FB-1(6B10;7;10;
2)及びFB-1(6B10;7;10;23)を提供する。

【０００９】

【発明の効果】本発明により、コレラトキシンのような高価な蛋白質を使用せず、牛血清アルブミン等の入手が容易な蛋白質を結合蛋白質に用いたハプテン抗原を得ることができた。 そして、このハプテン抗原を用いて抗体産生ハイブリドーマを得、このハイブリドーマを用いてＩｇＧ _2b型抗フモニシンモノクローナル抗体を得ることができた。 一般に抗血清の製造を目的としてウサギなどの動物に免疫を施す場合、免疫する度に新たなハプテン抗原を投与することが行われているが、この方法ではハプテン抗原の調製や、動物の個体差、免疫の仕方によってその都度、抗体価、特異性、抗体の型の異なった物が得られる。 そのためこの抗体を測定試薬に供した場合、
測定結果に悪影響を与える等の欠点があるが、本発明の抗体産生ハイブリドーマを用いて抗体を製造すれば、抗原を調製する必要がなく又、動物の個体差、免疫法の差に煩わされず常に安定した品質の抗体を得ることができる。

【００１０】以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。 ただし、これら実施例は本発明を限定するものではない。

【実施例】 抗フモニシンＢ ₁モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び抗体の作成 １． フモニシンＢ ₁牛血清アルブミン結合体の作製 フモニシンＢ ₁ （以下、ＦＢ ₁という）7.2mgを0.05M リン酸ナトリウム緩衝液1ml中に溶解したものに、攪拌しながら、500μlのテトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦという）に溶解した3.14mgのマレイミドベンゾイルオキシサクシイミド（以下、ＭＢＳという）を添加し、30℃で
30分間反応させた。 反応終了後、窒素ガスにより溶剤を除去し、メチレンクロライドで３回抽出を行ない、未反応のＭＢＳを除去し、フモニシンＢ ₁とＭＢＳの反応物を含む水層を得た。 牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）10mgをリン酸緩衝溶液（以下、ＰＢＳという）1m
lに溶解したものに、水素化ホウ素ナトリウム20mgを10
分間かけて添加し、消泡剤としてブタノールを0.2ml添加した。 合計30分間反応させ、0.1Mリン酸１ナトリウム
1mlとアセトン0.4mlを添加し、ジスルフィド結合の還元された牛血清アルブミンを得た。 この反応液に、フモニシンＢ ₁及びＭＢＳの反応物を含む水層を、攪拌しながら滴下し、室温にて時々攪拌しながら２時間反応させた。 得られた反応液を3M尿素に対して透析し、フモニシンＢ ₁牛血清アルブミン結合体約8.4mg を得た。 免疫抗原分析用抗原にはグルタルアルデヒドを用い、フモニシンＢ ₁卵白アルブミン（以下、ＯＶＡという）結合体及びフモニシンＢ ₁貝由来ヘモシアニン（以下、ＫＬＨという）結合体を作製し分析に供した。

【００１１】２． 免疫 フモニシンＢ ₁牛血清アルブミン結合体をＰＢＳにて1,0
00μg/mlとなるように稀釈し、この稀釈液1mlと、フロイントの完全アジュバント1mlを混合してエマルジョンとし、その200,50μlをＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、８週齢）に腹腔内投与した。 １４日後に同量の抗原をフロイントの不完全アジュバントと共に腹腔内投与を行ない追加免疫を施した。 更に、２８日目、融合３日前に同量の抗原をアジュバント無で腹腔内に投与し、最終免疫を行なった。 ３． 胸腺細胞浮遊液の作製 ハイブリドーマ形成率を高めるフィーダー細胞として使用する胸腺細胞浮遊液を作製した。 ddYマウス、４〜６
週齢、雌を頚椎脱臼法により斃死させ、胸腺を摘出し、
10mlの生細胞洗浄液（ＭＥＭ培地）を入れたプラスチック・シャーレ中で胸腺細胞を注意深くほぐし出した（マウス３〜４匹分）。 ほぐされた胸腺細胞は、メッシュ濾過後遠心管に移し、2,000回転、5分間遠心し、上清を吸引後30mlの生細胞洗浄液を加え洗浄、遠心し、これをＨ
ＡＴ培地〔ヒポキサンチン13.6mg/l、アミノプテリン0.
176mg/l、チミジン3.8mg/l（以下、HAT溶液という）を含むハイブリドーマ増殖培地〕に添加し、5×10 ⁸個の胸腺細胞を含む浮遊液100mlを得た。 本細胞浮遊液を、200
cm2フラスコに移し、炭酸ガス培養装置内で１日間培養した。 なお、ハイブリドーマ増殖培地は、抗生物質を含む20%ＦＣＳ−ＩＭＤＭ培地にＬ−グルタミン酸、２−
メルカプト・エタノール、トランスフェリン及びインスリンを添加した培地である。

【００１２】４． 細胞融合 最終免疫より３日後、マウスの脾臓を摘出し、10mlの生細胞洗浄液（以下、ＭＥＭ培地という）を入れたプラスチック・シャーレ中で脾臓リンパ球を注意深く押し出した（マウス３〜４匹分）。 ほぐされた脾臓リンパ球を、
メッシュ濾過後遠心管に移して、更に生細胞洗浄液を添加し全量50mlとし、遠心操作（1,600回転、5分）を繰り返し２回洗浄し、1〜2×10 ⁸個の脾臓リンパ球を含む浮遊液50mlを得た。 ６−チオグアニン耐性ミエローマ Sp-
2/O-Ag14細胞の浮遊液（2×107個の細胞を含む）及び1
×10 ⁸個の脾臓リンパ球を含む浮遊液を混合し1,600回転、5分間遠心してべレット化した。 上清の培地を吸引除去し、ペレットを丁寧にほぐした。 ＰＥＧ溶液（PEG#
4,000+DMSO他）1mlを1分間かけてゆっくりと加え、用いたピペットで攪拌しながら37℃、1分間融合させた。 続けて基本培地（IMDM培地）1mlを37℃で１分間かけて加えた。 更にもう一度同様の操作を繰り返した後、基本培地8mlを37℃で3分間かけて添加した。 得られた融合細胞浮遊液を実施例項目３で調製した胸腺細胞（フィーダー細胞）ＨＡＴ培地浮遊液に添加し充分懸濁させ、96穴培養プレート10〜14枚にこの細胞懸濁液を1穴当り0.1ml分注し、炭酸ガス培養装置内で37℃で10日間培養を行なった。 ５． ＨＡＴ選択 培養後1日目に、更にＨＡＴ培地を1穴当り0.15m添加し、第３、６及び10日目に培地の半分を吸引除去し、Ｈ
ＡＴ培地を1穴当り0.1〜0.15ml添加した。 10日目でハイブリドーマの増殖を確認したところ、ほぼ全穴での増殖が観察された。

【００１３】６． ハイブリドーマの選択 融合して12〜13日後に培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法にて抗体陽性穴の選択を行なった。 ＥＬＩＳＡ用96穴プレートに、フモニシンＢ ₁卵白アルブミン又はフモニシンＢ ₁貝由来ヘモシアニンを100μl分注し、４℃で一晩または、室温で１時間放置して抗原をプレートに固定した。 液を良く取り除き、培養上清中の蛋白質の非特異的吸着を避けるために、２％スキムミルクブロッキング液を100μl各穴に分注し、室温で５分間放置した。 液を良く取り除いた後、上記の各細胞培養上清を100μl分注し、室温で１時間静置した。 なお、陰性対照としては20
%FCS-IMDM培地を100μl分注した。 次に、0.02%のTween2
0を含むバッファー液（洗浄液）で3〜5回洗浄し、マウス免疫グロブリン抗体−西洋ワサビパーオキシダーゼ複合体溶液100μlをプレートに分注し室温で１時間放置した。 同上洗浄液で3〜5回洗浄後、ＡＢＴＳ(2,2'-Azido-
bis(3-etylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid)溶液(0.6
mg/ml)を100μlずつ添加し、室温で１時間反応後、酵素反応停止液（Sodium dodecyl sulfate 5%溶液）を100μ
l加え反応を停止し、OD405nmを測定して、パーオキシダーゼ活性を定量した。 まき込み細胞７００穴中の９穴に抗フモニシンＢ ₁抗体産生が認められた。 ７． 培養のスケール拡大 どの穴で抗モニシンＢ ₁抗体を産生しているかが判明したら、ＨＴ培地〔ヒポキサンチン13.6mg/l、チミジン3.
8mg/l（以下、HT溶液）を含むハイブリドーマ増殖培地〕を分注した２４穴培養プレートへ移植しスケールの拡大を行なった。 即ち、予めＨＴ培地500μlを２４穴培養プレート分注し、夫々の穴に９６穴培養プレートにおける抗体産生穴の細胞懸濁液を２４穴培養プレートへ移植し、炭酸ガス培養装置内で37℃で4日間培養を行なった。 培養2-3日後に各穴に、更に、１mlのＨＴ培地を添加し、各穴の上清をＥＬＩＳＡ法により抗体活性の再テストを行ない、クローニングを行なう細胞穴を再選択した。

【００１４】８． モノクローン化 クローニング培地としては、ヒトIL-6(1U/ml)を含むハイブリドーマ増殖培地を用いた。 抗フモニシンＢ ₁抗体産生ハイブリドーマを計数し、クローニング培地１ml当りに5個の細胞が含まれるように稀釈した。 この懸濁液を200μlずつ、９６穴培養プレートにまき込み炭酸ガス培養装置内で37℃で10日間培養を行なった。 約10日目に増殖をチェックしながら、ＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を測定し、コロニーが大きく抗体活性の高い細胞穴を１〜２穴選択、培養し、同じ方法で再クローニングを行ない、抗フモニシンＢ ₁抗体産生ハイブリドーマのクローン４株、即ち、FB-1(6B10;5;6;5),FB-1(6B10;5;6;
6),FB-1(6B10;7;10;2)及びFB-1(6B10;7;10;23)を得た。
なお、上記抗フモニシンＢ ₁抗体産生ハイブリドーマのクローン４株のうち、FB-1(6B10;7;10;23)は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-13615として寄託している。 ９． モノクローナル抗体の生産 各抗体産生株の培養細胞を、夫々１×10 ⁷個でハイブリドーマ増殖培地１mlに浮遊させ、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（８週齢、雌）の腹腔内に投与し、約１週後、腹水を回収した。 １０． モノクローナル抗体のクラスの決定 夫々のハイブリドーマクローンの産生する免疫グロブリンのクラスは、マウスモノクローナル抗体のアイソタイプ決定用キット（アマシャム・ジャパン製、ＲＰＮ２９
／ウエスタン・ブロット法）を用いて行なった。 その結果、４株ともＩｇＧ _2bで共にＬ鎖がκであった。 １１． モノクローナル抗体の精製 回収した腹水は、血清分離剤入り凝固促進型遠心管を用いて分離し、抗体精製用プロテインＧカラムを用いたクロマトグラフィーにより精製してモノクローナル抗体のマウス１固体当たり５mgを得た。

【００１５】１２． モノクローナル抗体交差性 抗フモニシンＢ ₁モノクローナル抗体の交差性を調べるため、フモニシンＢ ₁の類似化合物である１，２，３，
−トリカルボキシルプロパンとの交差反応性を、ＥＬＩ
ＳＡにて検討した。 測定方法は、実施例項目６に記載されているハイブリドーマ選択法に準じて行ない、項目６
での培養細胞上清の代りに、濃度を調整したフモニシンＢ ₁あるいは１，２，３，−トリカルボキシルプロパンの溶液50μlと同時に夫々のモノクローナル抗体を使用し交差性の検討を行なった。 その結果、図１より明らかな如く、抗フモニシンＢ ₁モノクローナル抗体の全ての株が、フモニシンＢ ₁の類似化合物である１，２，３，
−トリカルボキシルプロパンとの交差反応性を示さなかった。 １３． 抗フモニシンＢ ₁モノクローナル抗体の特異性試験 抗フモニシンＢ ₁モノクローナル抗体の特異性を調べるため、フモニシンＢ ₁の標準物質による抗原抗体反応に対する阻害率を検討した。 この方法はＣＩ−ＥＬＩＳＡ
（コンペティティブ・インダイレクト・エライザ）法と呼ばれる競合法の一つである。 測定方法は、実施例項目６に記載されているハイブリドーマ選択法に準じているが、項目６での培養細胞上清の代りに、各濃度に稀釈したフモニシンＢ ₁の純粋な溶液（フリーなフモニシンＢ ₁ ）50μlと夫々のモノクローナル抗体を同時に添加し、フリーなフモニシンＢ ₁による阻害を、パーオキシダーゼ活性の定量により測定した。 その結果、図２より明らかな如く、フモニシンＢ ₁濃度に依存した阻害傾向が観察され、フモニシンＢ ₁濃度10,000ng/ml以上では１
００％の阻害性を示し、高い特異性が認められた。

【００１６】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のモノクローナル抗体、即ち、FB-1(6
B10;5;6;6)及びFB-1(6B10;7;10;23)についてのフモニシンＢ ₁類似物質であるトリカルボキシプロパンとの交差性を示す図である。

【図２】 本発明のモノクローナル抗体、即ち、FB-1(6
B10;5;6;6)及びFB-1(6B10;7;10;23)についてのフモニシンＢ ₁に対する特異的結合性を示す図である。

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