来自爪钩草属植物的细胞系培养物
阅读：964发布：2020-05-20
专利汇可以提供来自爪钩草属植物的细胞系培养物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及爪钩草 植物 细胞培养物、细胞系和提取物，以及它们的制备方法和用途。，下面是来自爪钩草属植物的细胞系培养物专利的具体信息内容。
1.H.procumbens细胞系，由如下步骤产生：
a.将H.probumbens细胞接种到适合悬浮细胞生长的液体培养基中；
b.在适于悬浮细胞生长的条件下培养所得细胞；
并且可选地：
c.通过周期性地分割任何紧密的团块，将所述细胞重悬于新鲜培养基中或加入新鲜培养基，并维持适于悬浮细胞持续生长的条件，来维持悬浮培养所得细胞；或d.将所得细胞保存为细胞系，可选通过冷冻保存所述细胞的样品。
2.如权利要求1所述的细胞系，其中步骤a中使用的细胞作为来自愈伤组织的材料样品提供，所述愈伤组织由以下步骤产生：
i)以H.procumbens的灭菌种子体外产生秧苗；
ii)从所述秧苗中提取至少一个茎节间；
iii)通过在固体培养基上培养所述节间诱导愈伤组织形成，所述培养基和培养条件适合于愈伤组织产生；
iv)在固体培养基上培养由步骤c得到的愈伤组织，所述培养基和培养条件适合于愈伤组织生长；
并且可选地：
v)通过定期将愈伤组织的健康部分转移到新鲜的固体培养基中，并维持适合愈伤组织生长的条件，来维持培养步骤d得到的愈伤组织；或
vi)通过冷冻所述愈伤组织的健康部分的样品来储存所得的愈伤组织，
优选地，其中愈伤组织材料与培养基比例在1：2和1:10w/w之间。
3.如权利要求1和2中任一项所述的细胞系，其中步骤a和/或c的培养基是补充有至少一种细胞分裂素、至少一种生长素，和糖的MS或GB5培养基，所述生长素不是2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)，其中细胞分裂素优选为6-苄氨基嘌呤(BAP)，生长素优选为α-萘乙酸(NAA)，糖优选为蔗糖。
4.如权利要求3所述的细胞系，其中步骤a和/或c的培养基中细胞分裂素：生长素的比例各自独立地为2：1至20：1。
5.如权利要求3和4中任一项所述的细胞系，其中步骤a中的培养基补充有5mg/ml BAP，
1mg/ml NAA和30g/l蔗糖，并且/或步骤c中的培养基补充有2mg/ml BAP，0.1mg/ml NAA和
30g/l蔗糖。
6.如前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中步骤b和c中的条件包括在黑暗中，约
22至28℃，用轨道振荡或在波反应器上培养，并且/或其中步骤c中大约每2-3周进行一次周期性重悬或添加培养基。
7.如前述任一项权利要求所述的细胞系，其中所述培养基具有如下表所示的宏量和微量元素和维生素组合物：
表A：
或表B:
8.一种H.procumbens细胞系，保藏于NCIMB保藏机构，登录号为NCIMB 42467。
9.一种植物提取物，其根据从H.procumbens的细胞中提取一种或多种苯乙醇苷的方法制备，该方法包括在培养基中获得所述细胞的样品，从所述细胞产生包含一种或多种苯乙醇苷的植物提取物，并且可选地从所述植物提取物分离一种或多种苯乙醇苷，优选毛蕊花苷，可选地其中提取物中苯乙醇苷类的产量为至少5％w/w，毛蕊花苷的产量为至少3％w/w，并且2-O-乙酰基阿克替苷的产量为提取物的至少1.5％w/w。
10.如权利要求9所述的植物提取物，其中所述细胞样品是从在H.procumbens细胞中产生次级代谢产物的方法得到的培养基中获得的，该方法包括在适合于所述细胞生长的条件下，在培养基中首先悬浮培养H.procumbens细胞，随后改变培养条件和/或培养基，使得它们适于由所述细胞产生次级代谢产物。
11.如权利要求10所述的植物提取物，其中所述首先悬浮培养通过以下方式进行：
a.将H.probumbens细胞接种到适合悬浮细胞生长的液体培养基中；
b.在适于悬浮细胞生长的条件下培养所得细胞；
并且可选地：
c.通过周期性地分割任何紧密的团块，将所述细胞重悬于新鲜培养基中或加入新鲜培养基，并保持适于悬浮细胞持续生长的条件，来维持悬浮培养所得细胞；或d.将得到的细胞作为细胞系存储，可选地通过冷冻所述细胞的样品，
并且所述改变在步骤b或步骤c之后进行，并且/或其中所述首先悬浮培养的细胞是来自权利要求1至8中任一项的细胞系的样品。
12.权利要求9-11中任一项所述的植物提取物，其中所述植物提取物通过以下步骤生产：
a.从所述样品中过滤出细胞物质，用水漂洗，然后在约0℃至约30℃之间干燥；
b.将得到的干燥物质悬浮在水-醇溶液中；
c.在室温下将所得悬浮液暴露于超声波约1小时至约24小时，然后在室温下将所述悬浮液浸渍约1小时至约48小时；和
d.过滤所得悬浮液以除去固体；并且可选地
e.通过在约0℃至约30℃之间蒸发剩余溶剂来浓缩所得提取物。
13.权利要求9-12中任一项所述的植物提取物，其中步骤d或e得到的植物提取物中：
苯乙醇苷类的产量为提取物的至少1.5％、至少2％、至少3％、至少4％或优选至少5％w/w；和/或
毛蕊花苷的产量为提取物的至少1％、至少2％或优选至少3％w/w；和/或
2-O-乙酰基阿克替苷的产量为提取物的至少0.5％、至少1％或优选至少1.5％w/w。
14.一种组合物，其包含权利要求9-13中任一项所述的植物提取物，和可选的适用于化妆品、药物、营养品、食品和/或动物饲料用途的载体。
15.一种治疗、减少或预防个体皮肤老化的至少一种迹象或至少一种与老化相关的皮肤损伤迹象的方法，该方法包括给予所述个体有效量的权利要求9-13任一项所述的植物提取物或权利要求14所述的组合物。
16.权利要求9-13中任一项所述的植物提取物或权利要求14所述的组合物用于治疗、减轻或预防疾病或病症的用途。
17.权利要求9-13中任一项所述的植物提取物或权利要求14所述的组合物在治疗、减少或预防个体中至少一种皮肤老化或皮肤损伤的迹象的用途，所述皮肤老化或皮肤损伤的迹象与以下一种或多种相关：色素沉着、胶原蛋白表达、炎症、糖化、屏障功能破坏或其任何组合。
18.权利要求9-13中任一项所述的植物提取物或权利要求14所述的组合物在治疗UV和/或污染诱导的皮肤损伤如炎症、色素沉着、胶原表达、屏障功能破坏中的用途。
19.权利要求9至13中任一项所述的植物提取物或权利要求14所述的组合物在制备药物中的用途。
20.权利要求15所述的方法或权利要求16或17所述的用途，其中所述皮肤损伤是由于皮肤暴露于非生物氧化胁迫，其可选地由暴露于UV辐射或污染引起。
21.一种治疗、减少或预防个体至少一种皮肤老化迹象或至少一种与皮肤老化有关的皮肤损伤迹象的美容方法，该方法包括给予所述个体有效量的权利要求9-13中任一项所述的植物提取物或权利要求14所述的组合物。
22.一种治疗、减少或预防个体至少一种皮肤老化迹象或至少一种与皮肤老化有关的皮肤损伤迹象的美容方法，该方法包括给予所述个体有效量的权利要求9至13中任一项所述的植物提取物或权利要求14所述的组合物，其中所述皮肤损伤是由于皮肤暴露于非生物氧化胁迫，其可选地由暴露于UV辐射或污染引起。
来自爪钩草属植物的细胞系培养物
技术领域
[0001] 本发明涉及爪钩草(Harpagophytum procumbens)植物细胞培养物，细胞系和提取物，以及它们的制备方法和用途。
背景技术
[0002] 爪钩草是芝麻科或芝麻家族中的一个属的植物。最常见的叫做魔鬼爪或猫爪草，它是一种杂草，具有视觉上引人注目的果实的多年生的块茎植物(Mncwangi et al.,2012；Journal of Ethnopharmacology 143 p775-771)。Harpagophytum procumbens
(H.procumbens)(Burch.)DC.Ex Mesin原产于南非的喀拉哈里沙漠地区，被认为具有很高的药用价值(Gyurkovska et al.,2011 Food Chemistry 125 p171-178)，其植物的次生块茎因其药用特性而被收获。从H.procumbens中分离出多达36种化合物(Mncwangi,2012)；然而，没有报道化学物是从整个植物还是从次生块茎中分离出来的。数千年来，H.procumbens块茎已经被用作草药治疗超过30种医学疾病，并且已被证明具有强烈的抗炎特性
(Georgiev et al.,2010；Food Chemistry 121 p967-972)。
(H.procumbens)(Burch.)DC.Ex Mesin原产于南非的喀拉哈里沙漠地区，被认为具有很高的药用价值(Gyurkovska et al.,2011 Food Chemistry 125 p171-178)，其植物的次生块茎因其药用特性而被收获。从H.procumbens中分离出多达36种化合物(Mncwangi,2012)；然而，没有报道化学物是从整个植物还是从次生块茎中分离出来的。数千年来，H.procumbens块茎已经被用作草药治疗超过30种医学疾病，并且已被证明具有强烈的抗炎特性
(Georgiev et al.,2010；Food Chemistry 121 p967-972)。
[0003] 在纳米比亚，野生收获H.procumbens是许多农村社区的生计。对这种药用植物的需求增加为初级生产者带来了更多的机会，但也使自然资源紧张。根据1975年纳米比亚的“自然保护条例”，H.procumbens于1977年被列为受保护物种。就该条例而言，需要许可才能收获和出口H.procumbens。它也受到博茨瓦纳和南非的类似立法的保护。由知识渊博的收获者进行的野外收获往往能够保护物种，但随着需求的增加以及财务动机，导致了更多(且知识较少)的收获者的过度收获，这对H.procumbens的资源库产生了重大影响。在纳米比亚，据说每公顷只剩下一株植物，而以前在天然群体中有1000-2000株植物。因此，基于1975年“自然保护条例”进行更严格的规定和保护，前环境和旅游部于1977年将H.procumbens(当地称为gamagu)列为受保护物种。
[0004] 已经证明难以培养H.procumbens以取代野生收获的需要，并且无论如何不能保证来自野生和栽培植物的生物活性化合物的产量。产量完全取决于它们的植物类型和所经历的生长条件，并且即使当环境因素针对栽培植物进行优化时也不能消除波动。此外，尽管据报道通过细胞培养技术生产H.procumbens植物材料(Georgiev，2010)，但由于再现性和感染发生率的问题，所用的方法不适合用于生物活性化合物的工业生产。最后，不管植物材料的来源如何，以商业上可行的量和适合使用的形式从H.probumbens中提取生物活性化合物存在进一步的困难。
[0005] 因此，需要制备钩爪草植物材料的替代方法，和从所述材料中提取生物活性化合物的替代方法。
发明内容
[0006] 本发明人发现可以通过细胞培养技术生产H.procumbens，从而避免了收获野生或栽培植物的需要。本发明的方法提供愈伤组织和悬浮培养物，并且特别适合于按比例放大到工业生产水平。本发明人还制备了稳定的H.procumbens细胞系，其特别适用于这些方法。
[0007] 本发明人进一步开发了一种在H.procumbens培养细胞中生产次级代谢产物的方法，以及从所述细胞中获得植物提取物的方法，该提取物也由本发明提供。所述提取物可以是干细胞提取物。所述提取物包含商业上可行产量的特定类别的生物活性化合物，苯乙醇苷类(特别是包括毛蕊花苷)。该方法可任选地包括从提取物中分离一种或多种苯乙醇苷。提取物或包含所述提取物的组合物可用于治疗和美容(非治疗)目的。
[0008] 苯乙醇苷类是一类生物活性化合物，天然存在于植物中，并且在结构上表征为苯甲酸的衍生物，含有苯乙基环，通过酯或糖苷键向其中加入β-吡喃葡萄糖(芹菜糖、半乳糖、鼠李糖或木糖)。苯乙醇苷类可以细分为五种主要化合物：毛蕊花苷、异毛蕊花苷、连翘苷B、焦地黄苯乙醇甙D(jionoside D)和天人草甙B(leucosceptoside B)。其他苯乙醇苷包括2-O-乙酰基阿克替苷(2-O-AcetyleAcetoside)。
[0009] 体外和体内的药理学研究表明，这些化合物具有广泛的生物活性，包括抗细菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、神经保护、抗氧化、保肝、免疫调节和酪氨酸酶抑制作用。毛蕊花苷，也称为Kusaginin，是一种咖啡酸衍生物，最初于1963年以阿克替苷的名称阐明。毛蕊花苷涉及许多治疗和化妆品应用。已描述了它作为一种抗老化组分(WO2004069218)，和其皮肤色素沉着活性(JP2005082522和WO2001026670)。本发明的植物提取物(和包含它的组合物)适用于任何这些应用。
[0010] 本发明提供：
[0011] 一种培养H.procumbens的愈伤组织的方法，包括：
[0013] b.从所述秧苗中提取至少一个茎节间；
[0014] c.通过在固体培养基上培养所述节间诱导愈伤组织形成，所述培养基和培养条件适合于愈伤组织产生；
[0015] d.在固体培养基上培养由步骤c产生的愈伤组织，所述培养基和培养条件适合愈伤组织生长；
[0016] 并且可选地：
[0017] e.即通过定期将愈伤组织的健康部分转移到新鲜的固体培养基中，并保持适合愈伤组织生长的条件，来维持培养步骤d产生的愈伤组织；或
[0018] f.通过冷冻所述愈伤组织的健康部分的样品来储存所得的愈伤组织。
[0019] 根据本发明的方法产生的H.procumbens的愈伤组织。
[0020] 一种悬浮培养H.procumbens细胞的方法，包括：
[0021] a.将H.probumbens细胞接种到适合悬浮细胞生长的液体培养基中；
[0022] b.在适于悬浮细胞生长的条件下培养所得细胞；
[0023] 并且可选地：
[0024] c.通过周期性地分割任何紧密的团块，将所述细胞重悬于新鲜培养基中或加入新鲜培养基，并保持适于悬浮细胞持续生长的条件，以维持悬浮培养所得细胞；或
[0025] d.将得到的细胞保存为细胞系，可选地通过冷冻所述细胞的样品。
[0026] 一种H.procumbens细胞系，由以下步骤产生：
[0027] a.将H.probumbens细胞接种到适合悬浮细胞生长的液体培养基中；
[0028] b.在适于悬浮细胞生长的条件下培养所得细胞；
[0029] 并且可选地：
[0030] c.通过周期性地分割任何紧密的团块，将所述细胞重悬于新鲜培养基中或加入新鲜培养基，并保持适于悬浮细胞持续生长的条件，以维持悬浮培养所得细胞；或
[0031] d.将所得细胞保存为细胞系，可选地通过冷冻，优选冷冻保存所述细胞的样品。
[0032] 如上制备的H.probumbens的细胞系，其中步骤a中使用的细胞作为来自愈伤组织的材料的样品提供，所述愈伤组织由以下步骤产生：
[0033] i)以H.procumbens的灭菌种子体外产生秧苗；
[0034] ii)从所述秧苗中提取至少一个茎节间；
[0035] iii)通过在固体培养基上培养所述节间诱导愈伤组织形成，所述培养基和培养条件适合于愈伤组织产生；
[0036] iv)在固体培养基上培养由步骤c产生的愈伤组织，所述培养基和培养条件适合于愈伤组织生长；
[0037] 并且可选地：
[0038] v)通过定期将愈伤组织的健康部分转移到新鲜的固体培养基中，并维持适合愈伤组织生长的条件，来维持培养步骤d产生的愈伤组织；或
[0039] vi)通过冷冻所述愈伤组织的健康部分的样品来储存所得的愈伤组织，
[0040] 优选地，愈伤组织材料与培养基比例在1：2和1:10w/w之间。
[0041] 如上制备的H.procumbens细胞系，其中步骤a和/或c的培养基是补充有至少一种细胞分裂素、至少一种不是2,4-二氯苯氧基乙酸的生长素(2,4-D)，和糖的MS或GB5培养基，其中细胞分裂素优选为6-苄氨基嘌吟(BAP)，生长素优选为α-萘乙酸(NAA)，糖优选为蔗糖。
[0042] 如上制备的H.procumbens细胞系，其中步骤a和/或c的培养基中细胞分裂素：生长素的比例各自独立地为2：1至20：1。
[0043] 如上制备的H.procumbens细胞系，其中步骤a中的培养基补充有5mg/ml BAP、1mg/ml NAA和30g/l蔗糖，并且/或步骤c中的培养基补充有2mg/ml BAP、0.1mg/ml NAA和30g/l蔗糖。
[0044] 如上制备的H.procumbens细胞系，其中步骤b和c中的条件包括在约22至28℃的黑暗中，用轨道振荡或在波浪反应器上培养，并且/或其中步骤C约每2-3周进行一次周期性的重悬或培养基添加。
[0045] 如上制备的H.procumbens细胞系，其中培养基具有如下表A或B中所示的宏量和微量元素和维生素组合物。
[0046] 一种H.procumbens细胞系，保藏在NCIMB保藏机构，保藏号为NCIMB 42467。
[0047] 一种在H.procumbens细胞中产生次级代谢产物的方法，该方法包括在适合于所述细胞生长的条件下，在培养基中首先悬浮培养H.procumbens细胞，随后改变培养条件和/或培养基使得它们适合于由所述细胞产生次级代谢产物。
[0048] 从H.procumbens细胞中提取一种或多种苯乙醇苷的方法，该方法包括在培养基中获得所述细胞的样品，从所述细胞产生包含一种或多种苯乙醇苷的植物提取物，并可选地分离一种或多种来自所述植物提取物的苯乙醇苷，优选毛蕊花苷。
[0049] 根据从H.procumbens细胞中提取一种或多种苯乙醇苷的方法生产的植物提取物，该方法包括在培养基中获得所述细胞的样品，从所述细胞产生包含一种或多种苯乙醇苷的植物提取物，并且可选地从所述植物提取物分离一种或多种苯乙醇苷，优选毛蕊花苷，可选地其中提取物中苯乙醇苷的产量为至少5％w/w，毛蕊花苷的产量为至少3％w/w，而2-O-乙酰基阿克替苷的产量为提取物的至少1.5％w/w。
[0050] 如上产生的植物提取物，其中所述细胞样品是从在H.procumbens细胞中产生次级代谢产物的方法所得到的培养基中获得的，该方法包括在培养基中首先悬浮培养H.procumbens细胞(在适于所述细胞生长的条件下)，随后改变培养条件和/或培养基，使得它们适于由所述细胞产生次级代谢产物。例如，可以通过接近生长周期结束时和收获前至少4天，添加浓度为100μM的茉莉酸甲酯来实现次级代谢产物的产生。
[0051] 如上制备的植物提取物，其中所述首先悬浮培养通过以下步骤进行：
[0052] a.将H.probumbens细胞接种到适合悬浮细胞生长的液体培养基中；
[0053] b.在适于悬浮细胞生长的条件下培养所得细胞；
[0054] 并且可选地：
[0055] c.通过周期性地分割任何紧密的团块，将所述细胞重悬于新鲜培养基中或加入新鲜培养基，并维持适于悬浮细胞持续生长的条件，来维持悬浮培养所得细胞；或
[0056] d.将得到的细胞作为细胞系存储，可选地通过冷冻所述细胞的样品，
[0057] 并且所述改变在步骤b或步骤c之后进行，并且/或其中用于所述首先培养的所述细胞是来自如本文所述发明的细胞系的样品。
[0058] 如上制备的植物提取物，其中所述植物提取物通过以下步骤产生：
[0059] a.从所述样品中过滤出细胞物质，用水漂洗，然后在约0℃至约30℃之间干燥；
[0060] b.将得到的干燥物质悬浮在水-醇溶液中；
[0062] d.过滤所得悬浮液以除去固体；并且可选地
[0064] 如上制备的植物提取物，其中在步骤d或e得到的植物提取物中：
[0065] 苯乙醇苷的产量为提取物的至少1.5％、至少2％、至少3％、至少4％或优选至少5％w/w；和/或
[0066] 毛蕊花苷的产量为提取物的至少1％、至少2％或优选至少3％w/w；和/或
[0067] 2-O-乙酰基阿克替苷的产量为提取物的至少0.5％、至少1％或优选至少1.5％w/w。
[0069] 一种治疗、减少或预防个体皮肤老化的至少一种迹象或至少一种与老化相关的皮肤损伤迹象的方法，该方法包括给予所述个体有效量的本发明的植物提取物或包含所述提取物的组合物。
[0070] 用于治疗疾病或病症的方法的本发明的植物提取物或组合物。
[0071] 本发明的植物提取物或组合物在制备药物中的用途。
[0072] 本发明的植物提取物或组合物在治疗、减轻或预防疾病或病症中的用途。
[0073] 本发明的植物提取物或组合物的用途，所述植物提取物或组合物治疗、减少或预防个体中至少一种与以下一种或多种相关的皮肤老化或皮肤损伤的迹象：色素沉着、胶原蛋白表达、炎症、糖化、屏障功能破坏或其任何组合。
[0074] 本发明的植物提取物或组合物在治疗UV(紫外光)和/或污染诱导的皮肤损伤如炎症、色素沉着、胶原蛋白表达、屏障功能破坏中的用途。
[0075] 本发明的植物提取物或组合物在制备药物中的用途。
[0076] 优选地，本发明的植物提取物或组合物的用途是化妆品用途。
[0077] 一种治疗、减少或预防个体皮肤老化的至少一种迹象或至少一种与皮肤老化相关的皮肤损伤迹象的方法，该方法包括给予所述个体有效量的本发明植物提取物或组合物。
[0078] 一种治疗、减少或预防个体皮肤老化的至少一种迹象或至少一种与皮肤老化相关的皮肤损伤迹象的方法，该方法包括给予所述个体有效量的本发明植物提取物或组合物。其中所述皮肤损伤是由于皮肤暴露于非生物氧化胁迫，其可选地由暴露于UV辐射或污染引起。
[0079] 一种治疗、减少或预防个体皮肤老化的至少一种迹象或至少一种与皮肤老化相关的皮肤损伤迹象的美容方法，该方法包括给予所述个体有效量的本发明植物提取物或组合物。
[0080] 一种治疗、减少或预防个体皮肤老化的至少一种迹象或至少一种与皮肤老化相关的皮肤损伤迹象的美容方法，该方法包括给予所述个体有效量的本发明植物提取物或组合物。其中所述皮肤损伤是由于皮肤暴露于非生物氧化胁迫，其可选地由暴露于UV辐射或污染引起。附图说明
[0081] 图1：说明了毛蕊花苷的结构，毛蕊花苷是苯乙醇苷的一个例子。
[0082] 图2：Harpagophytum procumbes(H.procumbens)细胞系提取物(水/乙醇25％w/w)的代表性RP-HPLC色谱图。UV波长：330nm。在Zorbax Eclipse C18柱(4.6×250mm×5mm；Agilent Technology)上，于35℃用梯度浓度的水和乙腈进行分离。
[0083] 图3：对几种提取物的DPPH测定筛选。在该测定中测试了两批H.procumbens，ALD53和ALD64，其在所有测试浓度中显示相似的自由基清除结果。
[0085] 图5：对UV(50mJ/cm2UVB)诱导的原代成纤维细胞(紫外线辐射前1小时用活性物质预处理)中H2O2释放的归一化％抑制。
[0086] 图6：显示用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)或阳性对照(1mM)处理后，对胶原蛋白酶的％抑制的数据。
[0087] 图7A：显示用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)预处理后，UV诱导的炎症标志物的％抑制的数据。通过多重分析测量MMP1、MMP3、IL-6和GM-CSF蛋白水平。总结在不同捐赠者上进行n＝4次实验的数据。
[0088] 图7B：显示用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)或毛蕊花苷(30μM)预处理后，对UV诱导的MMP1产生的％抑制的数据。通过ELISA测量MMP1蛋白水平。总结在不同捐赠者上进行n＝5次实验的数据。
[0089] 图7C：显示用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)或毛蕊花苷(50μM)预处理后，对污染诱导(DPM2μg/ml)的MMP1产生的％抑制的数据。通过ELISA测量MMP1蛋白水平。总结n＝3个不同捐赠者的数据。
[0090] 图8：用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)预处理的UV-旁分泌刺激的成纤维细胞中的胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV和原纤维蛋白的基因表达分析。数据是不同捐赠者的n＝3的总结。与UVB处理相比的显著性：*p<0.05、**p<0.01、p***<001。未处理的＝未用活性剂预处理，然后加入未刺激的KC培养基。UVB＝没有用活性剂预处理，然后加入UV刺激的KC培养基。UVB+H procumbens＝用H procumbens提取物预处理1小时，然后加入UV刺激的KC培养基。
[0091] 图9A：通过用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)或毛蕊花苷(16μM)预处理48小时的UV-旁分泌刺激的成纤维细胞的细胞内胶原蛋白I蛋白的产生。通过免疫荧光进行分析，所示数据是对n＝2不同的捐赠者总结。仅与UVB相比的显著性：p<0.01**、p<0.001***。
[0092] 图9B和C：荧光图像显示胶原蛋白I染色的荧光图像，代表仅用或不用H.probumbens处理的一个捐赠者，并且在UV处理培养基存在下。
[0093] 图10：在非UV处理培养基中用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)或毛蕊花苷(16μM)刺激24小时后，成纤维细胞中的胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV和原纤维蛋白的基因表达分析。数据是对不同捐赠者的n＝3的总结(年龄代表54、56、74岁)。与未治疗相比的显著性p<0.05*、p<0.01**。
[0094] 图11A：在非UV处理培养基中，用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)或毛蕊花苷(16μM)处理48小时的成纤维细胞在细胞内产生的胶原蛋白I蛋白。通过免疫荧光进行分析，显示的数据是对不同捐赠者n＝2的总结。与未处理相比的显著性p<0.05*。
[0095] 图11B和C：荧光图像显示胶原蛋白I染色，代表仅用或不用H.procumbens处理的一个捐赠者(在非UV处理培养基存在下)。
[0096] 图12A：数据显示无细胞系统中糖化的％抑制。将蛋白质BSA、糖D-核糖(0.5M)和测定对照芦丁(1mM)混合，或与H.procumbens(0.2mg/ml)的提取物混合，用分光光度定量AGE产品(晚期糖化终产物)。总结n＝4的数据。与未处理样品(仅BSA和糖)相比的显著性。p<0.01**、p<0.001**。
[0097] 图12B：数据显示对人成纤维细胞的糖化％抑制。用糖0.5mM乙二醛处理细胞以诱导100％糖化。然后用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)或测定对照(1mM二甲双胍)处理糖化细胞，然后通过免疫荧光染色存在的糖化蛋白羧甲基溶素(CML)。总结来自不同捐赠者n＝4的数据。与乙二醛治疗相比的显著性：p<0.01**、p<0.001**。
[0098] 图13：用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)或毛蕊花苷(16μM)处理的UV刺激的角质形成细胞的基因表达分析。数据是对不同捐赠者n＝2的总结。与UVB相比的显著性：p<0.05*、p<0.01**、p<0.001**。
[0099] 图14：用H.probumbens提取物(0.2mg/ml)或毛蕊花苷(16μM)处理的角质形成细胞的基因表达分析。数据是对不同捐赠者n＝2的总结。与未治疗相比的显著性*p<0.05[0100] 图15A：定量用可溶性试剂提取的来自人色素沉着表皮的黑色素，所述人色素沉着表皮用H.probumbens、毛蕊花苷和曲酸处理了4天到10天，没有UV挑战。直方图表示从每种条件的3个组织(n＝3)获得的值。与溶剂对照相比的显著性*p<0.01。
[0101] 图15B：定量用可溶性试剂提取的来自人色素沉着表皮的黑色素，所述人色素沉着表皮用H.probumbens、毛蕊花苷和曲酸处理了4天到10天，并用UV挑战。直方图表示从每种条件的3个组织(n＝3)获得的值。与溶剂对照相比的显著性*p<0.01。
具体实施方式
[0103] 应理解，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的特定需要而定制。还应理解，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施例的目的，而不是限制性的。
[0104] 另外，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该”包括复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，提及“一个细胞”包括“细胞”等。本文提及的“植物提取物”是指从植物材料(通常为干燥的植物材料)获得的制剂，包括培养的植物细胞或愈伤组织，该制剂可以是液体、半固体或固体形式。
[0105] 本文提供了一种培养H.procumbens愈伤组织的方法。愈伤组织是无组织的薄壁细胞的无定形团块。当植物受伤时，在切割表面处形成愈伤组织，并且其被认为是为密封受损组织的保护性应答。在体外，通过在无菌条件下将植物组织片段(外植体)置于固体培养基上来产生愈伤组织。愈伤组织由外植体组织切割表面的增殖细胞诱导和形成。本发明还提供了通过本发明的方法产生和维持的愈伤组织。所述愈伤组织是稳定的，意味着植物细胞保持未分化。
[0106] 在本发明的方法中，待使用的植物组织是来自由H.procumbens的灭菌种子在体外产生的秧苗茎节间。这确保了原始植物材料不存在病毒或细菌感染，与许多细胞培养技术中使用的叶子或其他植物插条(包括Georgiev et al,2010中的所述)相比，基本上种子更容易灭菌。
[0107] 茎节间是茎的节点之间的组织，节点通常保持叶、芽或花序。种子的灭菌和来自灭菌种子的秧苗的产生可以通过本领域已知的任何合适的方法实现。合适的方法公开于《植物细胞培养中》，即埃文斯等人于Taylor&Francis 2003发表的ISBN 185996320X(特别参见协议6.1部分A和B)。
[0108] 本发明的方法包括从秧苗中提取至少一个茎节间，并铺在固体培养基上。可以使用任何合适的固体介质。合适的培养基包括但不限于Murashige and Skoog's培养基(MS)、Gamborg B5培养基(GB5)、McCowan's Woody Plant Medium(McC)、Andersons Rhododendrum培养基(AR)、Shenk and Hildebrandt培养基(SH)以及Litvay’s培养基，每种都可以用任何合适的固化剂固化。用于本发明方法的优选培养基包括用植物琼脂固化的Murashige and Skoog's培养基(MS)或Gamborg B5(GB5)培养基。用于本发明方法的培养基优选分别包括表A和B中列出的宏量和微量元素和维生素组合物。
[0109] 通过将培养基维持在适于愈伤组织诱导的条件下，和/或通过用适合愈伤组织诱导的特定组分补充培养基来诱导愈伤组织形成。“补充”是指特定组分可以在方法开始之前包含在培养基中，或者可以在方法的适当阶段加入培养基中。本领域技术人员可以容易地确定愈伤组织诱导和生长/维持的适当条件。典型条件是在低强度荧光灯下约22至约28℃的温度，暗/光循环在约8小时：约16小时。本发明的优选方法在黑暗中使用约23℃至约25℃的温度，优选约24℃。
[0110] 培养基的补充组分通常包括：
[0111] 至少一种细胞分裂素，通常选自玉米素(Z)、玉米素核苷(ZR)、异戊烯基腺嘌呤(IP)、6-苄氨基嘌呤(BAP)、6-糠基氨基嘌呤(激动素)、N6-(间-羟基苄基)腺嘌呤(topolin)、噻苯隆(TDZ)、氯吡脲(CPPU或4PU-30)；
[0112] 至少一种不是2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的生长素，其通常选自吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、苯乙酸(PAA)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸(2,4,5-T)，毒莠定、麦草畏、对氯苯氧乙酸(CPA)；和
[0113] 通常选自蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖的糖。
[0114] 在需要包含生长素的本发明的所有方法中，不使用2,4-D。尽管这种生长素通常用于植物细胞培养，但本发明人已经确定它是不适合用于本发明方法的组分，本发明方法旨在产生H.procumbens的植物细胞的稳定愈伤组织或悬浮细胞培养物。2,4-D是不合适的，因为它可能引起有丝分裂活性，以及染色体和染色质结构的变化，以及细胞周期中的变化，导致植物细胞的异常。
[0115] 本领域技术人员可以容易地确定每种组分的适当浓度。然而，培养开始时培养基中的细胞分裂素：生长素比率优选为约2：1至约20：1。该比例可以是，例如约2：1、约4：1、约5：1、约6：1、约10：1或约20：1，但优选该比例为约2：1或约5：1。在本发明的方法中，细胞分裂素优选为6-苄氨基嘌呤(BAP)，生长素优选为α-萘乙酸(NAA)，糖优选为蔗糖。BAP的量优选为约5mg/l。NAA的量优选为约1mg/l。蔗糖的量优选为约20g/l至约50g/l，优选约30g/l。
[0116] 一旦诱导，通过继续在固体培养基上培养愈伤组织来培养/维持愈伤组织。这通过将培养基维持在适合愈伤组织生长的条件下，和/或通过改变培养基组合物，使其适合于愈伤组织生长。本领域技术人员可以容易地确定愈伤组织生长的适当条件，并且可以与用于愈伤组织诱导的条件相同。在本发明的优选方法中，愈伤组织生长条件通常包括在黑暗中，在约22℃至约28℃、优选约23℃至约25℃、最优选约24℃下培养。改变培养基组成可以包括向现有培养基中添加不同水平的补充组分，或将健康愈伤组织材料转移到新鲜培养基中，其中各种组分的水平已经适合愈伤组织生长。
[0117] 对培养基组合物进行适当改变以使其适于生长，可包括改变相对于用于培养起始时的细胞分裂素：生长素比例。该比例通常维持在约2：1至约20：1之间，但优选相对于用于愈伤组织诱导的比例增加。该比例可以是，例如约2：1、约4：1、约5：1、约6：1、约10：1或约20：1，条件是它与愈伤组织诱导所用比例相同或优选高于所用比例。最优选的细胞分裂素：生长素比例为约20：1。糖的量通常维持在与愈伤组织诱导所需的水平相似的水平。在本发明的方法中，BAP的量优选降低至约2mg/l。NAA的量优选降低至约0.1mg/l。蔗糖的量优选为约
20g/l至约50g/l，优选约30g/l。
20g/l至约50g/l，优选约30g/l。
[0118] 通过周期性地将健康的愈伤组织材料转移到适合于愈伤组织生长的新鲜固体培养基中，并维持适于愈伤组织生长的条件，以可选地维持培养愈伤组织。技术人员能够容易地确定定期转移的适当间隔。然而，在本发明的方法中，所述转移通常大约每2-3周进行一次。
[0119] 可选地通过冷冻所述愈伤组织的健康部分的样品来储存愈伤组织，例如来自悬浮在培养基中的所述愈伤组织的细胞。可通过本领域已知的任何合适方法进行愈伤组织或其他植物材料的冷冻。
[0120] 本文还提供了用于悬浮培养H.procumbens细胞的方法。悬浮培养是指细胞在液体培养基中生长。可以使用任何合适的液体培养基。合适的培养基包括但不限于Murashige and Skoog’s培养基(MS)、Gamborg B5培养基(GB5)、McCowan's Woody Plant Medium(McC)、Andersons Rhododendrum培养基(AR)、Shenk and Hildebrandt培养基(SH)和Litvay’s培养基。用于本发明方法的优选培养基包括Murashige and Skoog’s(MS)或Gamborg B5(GB5)。用于本发明方法的培养基优选分别包括表A和B中列出的宏量和微量元素和维生素组合物。
[0121] 本发明还提供了通过本发明的悬浮培养方法生产和/或维持的细胞。所述细胞是稳定的，意味着它们保持未分化，并且可以作为细胞系保藏。“稳定细胞系”定义为随时间具有高且恒定增殖率的细胞培养系，在各种传代培养物中保持相同的表型特征(细胞颜色、团聚脆性，大小等)，并在各种传代培养步骤的过程中具有可再现的次级代谢物水平。由本发明提供的示例性细胞系已经保藏于以下保藏机构：
[0122] NCIMB Ltd
[0123] Ferguson Building
[0124] Craibstone Estate
[0125] Bucksburn
[0126] Aberdeen
[0127] AB21 9YA
[0128] Scotland.
[0129] 保藏日期：2015年9月18日；保藏登录号：NCIMB 42467。
[0130] 保藏方：Oriflame Cosmetics AG，c/o Global Management AG，Bleicheplatz 3，CH-8200 Schaffhausen，Switzerland。
[0131] 本发明的悬浮培养方法包括将H.probumbens细胞接种到适于悬浮细胞生长的液体培养基中，并在适于悬浮细胞生长的条件下培养所得细胞。接种的细胞可优选包含通过根据本发明的愈伤组织培养方法产生的愈伤组织材料样品，在这种情况下，愈伤组织材料与培养基的比例优选为约1：2至约1:10。或者，接种的细胞可以来自任何合适的来源，例如可以是预先根据本发明的方法培养的稳定的H.probumbens细胞系。这种细胞系的一个例子是保藏的细胞系NCIMB 42467。
[0132] 悬浮细胞生长的适当条件可以由技术人员容易地确定，并且可以与用于愈伤组织生长的条件相同。典型条件是在低强度荧光灯下，温度为约22℃至约28℃，暗/光循环为约8小时：约16小时。本发明的优选方法在黑暗中，约23℃至约25℃，优选约24℃的温度下使用。通常在整个过程中温和地搅拌悬浮细胞培养物，例如用轨道震荡或在波浪反应器上。
[0133] 如果液体培养基补充有适合于所述生长的组分，则液体培养基适于悬浮细胞的生长。“补充”是指特定组分可以在方法开始之前包含在培养基中，或者可以在方法的适当阶段加入培养基中。培养基的补充组分通常包括：
[0134] 至少一种细胞分裂素，通常选自玉米素(Z)、玉米素核苷(ZR)、异戊烯基腺嘌呤(IP)、6-苄氨基嘌呤(BAP)、6-糠基氨基嘌呤(激动素)、N6-(间-羟基苄基)腺嘌呤(topolin)、噻苯隆(TDZ)、氯吡脲(CPPU或4PU-30)；
[0135] 至少一种不是2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的生长素，其通常选自吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、苯乙酸(PAA)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸(2,4,5-T)、毒莠定、麦草畏、对氯苯氧乙酸(CPA)；和
[0136] 通常选自蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖的糖。
[0137] 本领域技术人员可以容易地确定每种组分的适当浓度。然而，培养开始时培养基中的细胞分裂素：生长素比例优选为约2：1至约20：1。该比例可以是例如约2：1、约4：1、约5：1、约6：1、约10：1或约20：1，但优选该比例为约2：1或约5：1。在本发明的方法中，细胞分裂素优选为6-苄氨基嘌呤(BAP)，生长素优选为α-萘乙酸(NAA)，糖优选为蔗糖。BAP的量优选为约5mg/l。NAA的量优选为约1mg/l。蔗糖的量优选为约20g/l至约50g/l，优选约30g/l。
[0138] 通过周期性地分割任何紧密的团块，将所述细胞重新悬浮在新鲜培养基中或加入新鲜培养基，并维持适于悬浮细胞持续生长的条件，以可选地维持悬浮细胞培养。该过程可以称为“传代培养”。技术人员能够基于细胞的生长速率，容易地确定这些周期性活动的适当间隔。然而，在本发明的方法中，间隔通常为约1-3周。
[0139] 细胞的维持还可包括改变培养基组成。改变培养基组合物可以包括向现有培养基中添加不同水平的补充组分，或将细胞转移到已经改变各种组分水平的新鲜培养基中。
[0140] 对培养基组合物的适当改变使其适于维持悬浮培养物中的细胞可包括，相对于用于培养开始时的，改变细胞分裂素：生长素比例。该比例通常保持在约2：1至约20：1之间，但优选相对于用于培养开始时的比例增加。该比例可以是例如约2：1、约4：1、约5：1、约6：1、约10：1或约20：1，条件是它与开始时所用比例相同或优选高于所用比例。最优选的细胞分裂素：生长素比例为约20：1。糖的量通常维持在与愈伤组织诱导所需的水平相似的水平。在本发明的方法中，BAP的量优选降低至约2mg/l。NAA的量优选降低至约0.1mg/l。蔗糖的量优选为约20g/l至约50g/l，优选约30g/l。
[0141] 可选地通过根据本领域已知的任何合适方法冷冻健康细胞样品，或通过在公认的保藏机构中作为细胞系来保藏。
[0142] 本发明还提供了一种在H.procumbens细胞中产生次级代谢产物的方法，该方法包括在适合于所述细胞生长的条件下，在培养基中首先悬浮培养H.procumbens细胞，然后改变培养条件和/或培养基，使得它们适合于由所述细胞产生次级代谢产物。所述首先悬浮培养可以按照上述的本发明方法进行。使用的细胞可以来自根据如上所述的本发明方法产生的细胞系，例如保藏的细胞系NCIMB 42467的细胞。所述改变通常在所述首先悬浮培养的生长期要结束时发生，其可由技术人员容易地确定。在本发明的方法中，所述改变通常在悬浮生长1-3周后发生，但可以发生得或迟或早，这取决于悬浮细胞的生长速率。
[0143] 所述改变可包括以下中的任何一个或多个：
[0144] 增加培养基中前体化合物浓度，例如加入蔗糖；
[0145] 减少培养基中次生代谢物的浓度，例如通过原位吸附代谢物；
[0147] 在培养基中加入非生物激发子，例如重金属盐、pH调节剂
[0148] 调节温度和/或光照条件
[0149] 通过任何合适的方法固定悬浮培养物，例如，在惰性基质中捕获。合适的固定剂包括海藻酸钙、聚苯醚、纤维状聚丙烯、海藻酸盐+尼龙、网状聚氨酯、琼脂糖、琼脂、卡拉胶、明胶、聚丙烯酰胺、海藻酸盐+明胶。
[0150] 当所述改变包括向培养基中添加物质时，技术人员能够容易地确定合适的浓度。在所述改变包括调节条件的情况下，技术人员能够容易地确定合适的调节。技术人员还知道用于吸附次级代谢物和固定悬浮培养物的合适方法。
[0151] 在本发明的优选方法中，所述改变包括向培养基中加入生物激发子。所述生物激发子优选为植物信号传导化合物，最优选为茉莉酸甲酯。生物激发子优选以约0.1μM至约500μM，最优选约100μM的浓度添加。
[0152] 通常所述改变之后，在黑暗中，在约22℃至约28℃、优选约23℃至约25℃、最优选约24℃，通过轨道振荡或在波浪反应器上培养至少4天。
[0153] 该方法可以是半连续或连续过程，任选地包括新鲜愈伤组织材料或细胞的周期性培养基交换和/或周期性添加，和/或周期性重悬新鲜培养基中一部分细胞，和/或周期性添加生物激发子。
[0154] 本发明还提供了从包含苯乙醇苷的H.procumbens细胞或其他植物细胞中提取一种或多种苯乙醇苷的方法，该方法包括在培养基中获得所述细胞的样品，从包含一种或多种苯乙醇苷的所述细胞产生植物提取物，其中所述苯乙醇苷优选为毛蕊花苷。提取物最优选包含毛蕊花苷和2-O-乙酰基阿克替苷。或者，该方法可以描述为从H.procumbens的细胞产生植物提取物，所述植物提取物包含一种或多种苯乙醇苷，优选毛蕊花苷，最优选其中所述提取物包含毛蕊花苷和2-O-乙酰基阿克替苷。该方法可任选地包括从所述植物提取物中分离一种或多种苯乙醇苷。
[0155] 该方法中使用的细胞样品可以从任何合适的来源获得，例如可以是预先根据本发明的方法培养的稳定的H.procumbens细胞系。这种细胞系的一个例子是保藏的细胞系NCIMB 42467。或者，可以通过进行本发明的悬浮细胞培养方法并取出所得细胞的样品，来获得细胞。
[0156] 本发明的提取方法是优化的冷提取方法，其使用温和的提取条件和可持续的溶剂。“可持续的”是指溶剂在低毒性、低价格、广泛可获得性和良好的可再生性(例如易于由生物质原料生产)方面是有利的。温和条件和可持续溶剂的选择，确保了高产量和最佳的次级代谢物谱，产生的产品不含有潜在的有害污染物。
[0157] 该方法包括首先收获细胞。收获可以通过任何合适的方法进行。在实例中描述了示例性方法。收获细胞的优选方法包括过滤。例如，可通过布氏漏斗烧瓶吸滤收获细胞，使用孔径为约22-25μm的合适过滤材料(例如MiraclothTM)。然后通常用水(优选蒸馏水)漂洗过滤的细胞材料，然后在温和的温度条件下干燥，通常在约0℃至约38℃之间，优选在约20℃至约30℃之间。
[0158] 然后将得到的干燥物质悬浮在合适的作为溶剂的水-醇溶液中，例如水/乙醇、水/丙醇、水/异丙醇、水/正丁醇、优选水/乙醇。水-醇溶液通常为10-95％v/v、优选约25％v/v。将所得悬浮液在约45-65Hz、优选约45Hz，室温下超声处理(暴露于超声波)约1小时至约24小时、优选约1至2小时。超声处理后，将悬浮液浸渍约0.5小时至约48小时、优选约0.5至1小时，然后再次过滤除去固体。可以使用本领域已知的任何合适方法进行过滤。这些方法包括使用孔径为约11μm的定量纸过滤器。示例性方法在实例中描述。
[0159] 过滤后，然后可选地通过在低温下蒸发剩余溶剂来浓缩植物提取物，通常在约0℃至约30℃之间使用旋转蒸发，直至达到共沸点。这通常需要约5至约20分钟。可以将浅棕色残余物的存在作为指示所需植物提取物已获得的指示剂。
[0160] 然后可以通过任何合适的方法将浓缩的提取物冷冻干燥或喷雾干燥。优选的冷冻干燥方案包括将浓缩的植物提取物在约-20℃至约-150℃、优选约-80℃下冷冻约1小时至约3小时，优选约1小时。然后将冷冻的溶液置于冷冻干燥器中以获得干燥的粗提取物。该过程的典型参数如下：
[0162] 压力范围：10毫巴至1微巴，优选约7微巴
[0163] 时间范围：1-72小时，优选约48小时
[0164] 植物提取物可以作为冷冻干燥或喷雾干燥方法的一部分掺入产品中，即通过与适合于化妆品、治疗剂、营养品、食品和/或动物饲料用途的载体一起冷冻干燥或喷雾干燥。在上下文中合适的载体包括麦芽糊精、淀粉、纤维素和环糊精。或者，植物提取物可以通过悬浮在适于化妆品、治疗剂、营养品、食品和/或动物饲料用途的载体中而掺入产品中。
[0165] 合适的载体包括甘油(glycerol)、甘油(glycerine)、丁二醇、丙二醇、山梨糖醇单独或任何上述的组合、变性醇、PEG-40、氢化蓖麻油和肉豆蔻酸异丙酯。
[0166] 在通过本发明的方法生产的植物提取物中，通常：
[0167] 苯乙醇苷的产量为提取物的生物量的至少1.5％、至少2％、至少3％、至少4％或优选至少5％w/w；和/或
[0168] 毛蕊花苷的产量为提取物的生物量的至少1％、至少2％或优选至少3％w/w；和/或[0169] 2-O-乙酰基阿克替苷的产量为提取物的生物量的至少0.5％、至少1％或优选至少1.5％w/w。
[0170] 本发明还提供了所述植物提取物和包含它的组合物。所述提取物和所述组合物可适用于任何化妆品、治疗剂、营养品、食品和/或动物饲料用途。所述产品可任选地掺入适合于所述用途的赋形剂或载体。
[0171] 本发明还提供了治疗、减少或预防个体皮肤老化的至少一种迹象或至少一种与老化相关的皮肤损伤迹象的方法，该方法包括给予所述个体有效量的本发明植物提取物或包含所述提取物的组合物。个体通常是人。皮肤可以在身体的任何部位，但优选是面部或头皮。提取物或组合物的给予通常直接施用于皮肤，即局部，并相应地配制提取物或组合物。
[0172] 人体皮肤由两个主要层组成，对维持皮肤整体健康起着重要作用。顶部外层，即表皮起到保护屏障的作用，是防止机械损伤、外来微生物和其他外部侵害物如UV和污染的第一道防线。真皮位于表皮下方，构成约90％的皮厚度。真皮含有密集的蛋白质网络，赋予皮肤强度和弹性。成纤维细胞是在真皮中发现的主要细胞类型，并且负责产生作为真皮中发现的最丰富蛋白质之一的胶原蛋白。
[0173] 皮肤老化是生物过程，其由内部(天然生物老化)和外部(导致皮肤结构变化的)因素的组合的影响产生，通常是通过降解皮肤的表皮层和真皮层中的各种蛋白质生物标志物。外部因素包括暴露于UV(光诱导或光化老化)、暴露于污染或其他刺激物以及压力。这些因素中的每一种都导致皮肤暴露于非生物氧化胁迫，这随即导致皮肤老化和与老化相关的皮肤损伤。因此，本发明的方法可替代地描述为治疗、减少或预防由非生物氧化胁迫引起的对皮肤的损害的方法。
[0174] 据信所述损伤部分是由于皮肤中自由基的形成而产生的。例如，反复暴露于UV导致形成过氧自由基，其分解形成丙二醛，随后交联并聚合胶原蛋白。据报道，自由基还可以激活金属蛋白酶，如胶原蛋白酶，它们可以分解皮肤胶原蛋白和弹性蛋白。自由基损伤也会导致真皮层厚度减少，随即导致皮肤松弛。自由基对皮肤的综合作用导致了老化迹象的第一个和最明显的迹象之一-皮肤弹性的有害丧失，然后形成未成熟皱纹。皮肤组织中抗氧化剂的存在，是一种有效的保护系统，可以抵抗这些反应性自由基的破坏作用。然而，随着年龄的增长，皮肤中的抗氧化防御能力降低，从而增强了自由基的破坏作用。其他机制也造成皮肤老化和与老化相关的皮肤损伤，并且这些机制可能包括使真皮和表皮，合成和/或修复蛋白质的能力受损。
[0175] 如实例中所证明的，本发明的植物提取物起到抗氧化剂(降低自由基效应)的作用，作为内源性抗氧化活性的增强剂，并且作为产生皮肤和表皮蛋白质的刺激物，因此本发明的方法直接基于与皮肤老化和与老化相关的皮肤损伤相关的多种因素而作用，从而治疗、减少或预防皮肤老化或与老化相关的皮肤损伤的迹象。
[0176] 本发明的方法可以治疗、减少或预防皮肤老化或与老化相关的皮肤损伤的至少一种迹象：皱纹、皮肤细纹、皮肤干燥、皮肤缺乏弹性、缺乏肤色、皮肤变薄、皮肤胶原蛋白纤维降解、皮肤松弛、皮肤下垂、皮肤内部退化、炎症、发红、斑点、眼睛浮肿或黑眼圈、毛细血管扩张、日光性弹力纤维增生、外观革质化和/或皮肤色素沉着症。
[0177] 该方法还可用于以下至少一种：改善皮肤伤口愈合；通过减少皮肤发红、斑点或炎症来促进肤色均匀；淡化(美白)皮肤的颜色和/或减少皮肤色素沉着的外观；促进皮肤再生，以产生更均匀、更紧致、更有肤色和更有弹性的皮肤；促进皮肤细胞长寿；促进皮肤亮度；促进皮肤纹理和肤色均匀；治疗或预防因暴露于UV或接触刺激物或污染而导致的溃疡区域或皮肤胁迫或损伤区域；并治疗痤疮或其他皮肤瑕疵。
[0178] 应当理解，上述与老化相关的皮肤老化和皮肤损伤的迹象可能不是由潜在的疾病病理状态造成的，因此治疗、减少或预防这些迹象的方法可以被认为是单一的化妆性的，即非治疗性的。因此，该方法可以描述为美容方法，或者换句话说，该方法不是通过疗法治疗的方法。类似地，本发明可以描述为本发明的植物提取物或组合物的化妆用途，用于治疗、减少或预防个体皮肤老化的至少一种迹象或至少一种与老化相关的皮肤损伤迹象。
[0179] 然而，还应当理解，某些疾病和病症可能在皮肤中产生与老化相同或相似的效果。因此，在某些实施例中，治疗、减轻或预防这些迹象的方法可以被认为是治疗、减轻或预防这些潜在疾病或病症的症状的方法。因此，本发明还提供了本发明的植物提取物或组合物，其用于治疗、减轻或预防这种疾病或病症的症状的方法中。本发明还提供了本发明的植物提取物或组合物在制备用于治疗、减轻或预防这种疾病或病症的症状的药物中的用途。所述疾病或病症可以是引起皮肤老化的一种或多种迹象，与老化相关的皮肤损伤迹象或由上述非生物氧化胁迫引起的皮肤损伤的任何疾病或病症。这些疾病和病症包括日光斑、黄褐斑、白癜风和脂溢性角化病。
[0180] 本发明的植物提取物和组合物还适用于治疗或预防炎症，以及相关的疾病和病症，例如类风湿性关节炎。因此，本发明提供治疗炎症的方法，该方法包括给予所述个体有效量的本发明的植物提取物或包含所述提取物的组合物。本发明提供了本发明的植物提取物或包含所述提取物的组合物，其用于治疗炎症的方法。本发明提供了本发明的植物提取物或组合物在制备用于治疗炎症的药物中的用途。所述炎症可以是由于疾病或病症，包括酒渣鼻、痤疮、特应性皮炎和牛皮癣。
[0181] 表A.
[0182] 用于本发明方法的MS培养基的优选的宏量和微量元素和维生素组合物。
[0183]
[0184]
[0185] 表B.
[0186] 用于本发明方法的GB5培养基的优选宏量和微量元素和维生素组合物。
[0187]
[0188]
[0189] 通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为进一步的限制。
[0190] 实例
[0191] 本文所述的所有细胞培养均在无菌条件下在层流气流柜中进行。
[0192] 实例1：静态培养物(愈伤组织)的产生
[0193] 通过将组织铺到培养皿上而从植物组织产生愈伤组织，所述培养皿包含：
[0194] A)4.4g/l如表A中所定义的Murashige&Skoog(MS)培养基，用6.5g/l的植物琼脂固化，补充有5mg/l的6-苄氨基嘌呤(BAP)和1mg/l的α-萘乙酸(NAA)、30g/l的蔗糖。
[0195] 或
[0196] B)4.4g/l如表B中所定义的Gamborg B5培养基(GB5)培养基，用6.5g/l的植物琼脂固化，补充有5mg/l的6-苄氨基嘌呤(BAP)和1mg/l的α-萘乙酸(NAA)、30g/l的蔗糖。
[0197] 将培养皿密封并在黑暗中于24℃孵育。
[0198] 用于产生每个愈伤组织的植物组织是从根据标准方案，从于体外源自灭菌种子的无菌H.procumbens秧苗切下的茎节间。参见，例如埃文斯等人在Taylor&Francis 2003出版的《植物细胞培养》ISBN 185996320X(特别是协议6.1部分A和B)。
[0199] 实例2：静态培养物(愈伤组织)的持续生长
[0200] 将与实施例1中相同的培养基用于愈伤组织的初始生长周期。然后使愈伤组织在含有具有降低的细胞分裂素和生长素水平的培养基的培养皿上生长。特别：
[0201] A)4.4g/l如表A中所定义的Murashige&Skoog(MS)培养基，用6.5g/l的植物琼脂固化，补充有2mg/l的6-苄氨基嘌呤(BAP)和0.1mg/l的α-萘乙酸(NAA)、30g/l的蔗糖。
[0202] 或
[0203] B)4.4g/l如表B中定义的Gamborg B5培养基(GB5)培养基，用6.5g/l的植物琼脂固化，补充2mg/l的6-苄氨基嘌呤(BAP)和0.1mg/l的α-萘乙酸(NAA)、30g/l的蔗糖。
[0204] 将培养皿密封并在黑暗中于24℃孵育。
[0205] 通常每三周对愈伤组织进行传代培养(对于生长较快的培养物，可能需要的培养时间较短)。传代培养涉及将愈伤组织材料转移至新鲜培养基，并去除已开始分化的任何异常细胞或细胞。如果愈伤组织易碎，则将材料样品简单地铺在含有新培养基的新鲜培养皿上。如果愈伤组织是紧凑的，则首先将其分成直径约5mm的块并转移到具有新培养基的新鲜培养皿中。重复该过程直至获得易碎的愈伤组织。当寻求产生悬浮培养物时，易碎的愈伤组织是合乎需要的，因为该愈伤组织在液体培养基中搅拌时容易碎裂。
[0206] 实施例3：在静态培养基上从愈伤组织产生悬浮培养物
[0207] 用根据实施例1和2获得的愈伤组织材料接种液体培养基，愈伤组织(g)与培养基(ml)之比为1：2至1:10。使用的液体介质组成如下：
[0208] A)4.4g/l如表A中所定义的Murashige&Skoog(MS)培养基，补充有5mg/l的6-苄氨基嘌呤(BAP)和1mg/l的α-萘乙酸(NAA)、30g/l的蔗糖。
[0209] 或
[0210] B)4.4g/l如表B中定义的Gamborg B5培养基(GB5)培养基，补充有5mg/l的6-苄氨基嘌呤(BAP)和1mg/l的α-萘乙酸(NAA)、30g/l的蔗糖。
[0211] 通过从培养皿中刮取然后称重来获得愈伤组织材料，然后转移至无菌250-1000ml锥形瓶。加入培养基以达到合适的比例。然后用气体可渗透的密封将烧瓶密封，并在24℃黑暗中，用70-90rpm(实验室规模)的轨道振荡旋转或在波浪反应器(大规模)上孵育。
[0212] 实例4：悬浮培养物的持续生长
[0213] 通过定期分离紧密团块，并适当地添加新鲜的MS或GB5培养基(修改了的，具有30g/l蔗糖、2mg/l BAP和0.1mg/l NAA的补剂谱)，继续培养根据实例3制备的悬浮培养物。
这通常每2-3周完成一次(当生长进入停滞期时)，同时将细胞维持在无菌的250-1000ml锥形瓶中，在黑暗中于24℃，用70-90rpm轨道振荡旋转(实验室规模)或在波浪反应器上(大规模)。
这通常每2-3周完成一次(当生长进入停滞期时)，同时将细胞维持在无菌的250-1000ml锥形瓶中，在黑暗中于24℃，用70-90rpm轨道振荡旋转(实验室规模)或在波浪反应器上(大规模)。
[0214] 实例5：诱导次级代谢产物的产生
[0215] 通过在生长周期要结束时(即停滞期)和收获前至少4天加入100μM茉莉酸甲酯，在根据实施例3和4制备的悬浮培养物中诱导次级代谢物产生。将细胞在24℃的黑暗中维持在250-100ml烧瓶中，以70-90rpm轨道振荡旋转(实验室规模)或在波浪反应器(大规模)上。
[0216] 实例6：产物的提取
[0217] 将实施例5得到的细胞材料通过带有 过滤器(典型孔径：22-25μm)的布氏漏斗烧瓶抽滤，在蒸馏水中漂洗并在约30℃下干燥，直至重量稳定。
[0218] 然后将干燥的细胞材料悬浮在水-醇溶液(EtOH/H2O；10至95％v/v)中，并将混合物在室温下以45Hz超声处理1小时至24小时。超声处理后，将悬浮液在室温下浸渍1至48小时，然后进行进一步的过滤步骤以除去固体。
[0219] 通过在低温(0至30℃)下旋转蒸发溶剂来浓缩所得植物提取物，直至达到最小共沸点，通常在5至20分钟之后。所得植物提取物的存在用浅棕色残余物指示。然后通常将浓缩的提取物在约-80℃下冷冻约1小时。然后将冷冻的溶液置于冷冻干燥器中以获得干燥的粗提取物。该过程的典型参数如下：
[0220] 冷凝器温度范围：-50至-120℃，优选约-110℃
[0221] 压力范围：10毫巴至1微克，优选约7微巴
[0222] 时间范围：1-72小时，优选约48小时
[0223] 随后分析并阐明干燥提取物的次级代谢物谱
[0224] 实施例7：次级代谢物谱分析
[0225] 在配备有Agilent 6520 Q-TOF质量检测器的Agilent 1200系列HPLC系统上，使用反相HPLC-ESI-Q-TOF阐明根据实施例6获得的植物提取物的次级代谢物谱。使用反相柱(Agilent，Zorbax C-18,5μm×4.6mm×250mm)。
[0226] HPLC条件如下：流速0.218ml/min；烘箱温度，35℃；溶剂A，0.1％甲酸水溶液；溶剂B，乙腈；梯度：0.00min，5％(B)，60.00min，40％(B)，70.00min，5％(B)，75.00min，5％(B)；注射量，10μl(10mg/ml)。质谱数据在m/z 100-1000范围内获得，采集速率为1.35spectra/sec，平均10.000次瞬变。源参数调整如下：干燥气体温度，250℃；干燥流速5L/min，雾化器压力45psi，破碎器电压150V。数据采集和处理由Agilent Mass Hunter完成。
[0227] 示例性产量如下表所示：
[0228]
[0229] “％w/w”＝所示化合物的重量占提取的植物材料的百分比。
[0230] “g/Kg”是每千克提取的植物材料中所示化合物的重量克数。
[0231] 提取物的代表性RP-HPLC色谱图显示在图2中。
[0232] 实例8：提取物的抗氧化能力-体外生物化学测定
[0233] 如上所述制备的两个不同批次(ALD53和ALD64)取得的H.procumbens提取物样品的抗氧化活性用标准DPPH测定法测定(参见，例如Brand-Williams W et al Lebenson Wiss Technol 1995；28:25-30)。该测定通过加入试验物质后，测量DPPH的紫色自由基状态(在516nm处吸收)变为还原黄色产物DPPHH的颜色变化，来确定试验物质的抗氧化作用水平。维生素C和绿茶提取物用作阳性对照。为了比较的目的还测试了单独的毛蕊花苷，和用于比较目的的绿茶提取物。该测定包括将DPPH溶液(Sigma)与各种不同浓度的测试物质混合，然后孵育30分钟，再然后测量516nm处的吸光度。结果如图3所示。两种H.procumbens提取物(ALD53和ALD64)在所有测试浓度下均达到相似，良好水平的抗氧化活性(在0.2nM时达到50-60％)。发现单独的毛蕊花苷达到与阳性对照相当的结果。
[0234] 实例9：H.procumbens提取物改变人细胞基因表达的能力
[0235] 这些实验的目的是通过定量聚合酶链反应(qPCR)测定用测试物质和对照物处理的细胞的基因表达，所述qPCR测量样品中特定RNA的量。该方法包括从所有样品制备RNA和cDNA的方法。将人原代细胞培养物(包括成纤维细胞或角质形成细胞)在48孔细胞培养板中培养至约80％汇合。随后用测试物质(H.procumbens提取物或毛蕊花苷)或对照物(载体或TGFb)处理细胞12-48小时，然后进行RNA提取和cDNA合成以及qPCR。引物和其他材料的详细信息见附录1。
[0236] 该实验特异性地测量HMOX1的表达，所述HMOX1编码蛋白质HO-1或血红素加氧酶，其属于Vitagenes家族，所述Vitagenes进一步包括热休克蛋白和硫氧还蛋白系统。这些基因在胁迫应答中上调，在保护和维持细胞稳态中起着至关重要的作用。HO-1蛋白与血红素(具有促氧化特性)降解为一氧化碳、亚铁和胆绿素相关。最后两种成分是称为胆红素和铁蛋白的抗氧化剂化合物的前体。HMOX1因其对抗氧化胁迫的保护作用而闻名(Vile，Basu-Modak，Waltner，&Tyrrell，1994)。
[0237] RNA提取
[0238] 用H.procumbens提取物或毛蕊花苷进行细胞处理后，通过加入RTL裂解缓冲液(RNeasy Mini试剂盒，Qiagen)将细胞直接在细胞培养板上裂解。然后根据制造商的方案处理细胞裂解物用于RNA提取。通过用Nanodrop读取260nm/280nm的吸光度比例来测量RNA含量的最终浓度和纯度。
[0239] cDNA合成
[0240] 根据制造商的方案，使用iScript Advanced(BioRad)从RNA合成cDNA。将RNA在42℃下孵育30分钟，然后在热循环仪(BioRad)中将酶在85℃下灭活5分钟。根据靶转录物的丰度，每个20μl的反应物中使用5-15ml RNA样品。然后通过加入80ml无RNase水将20ml cDNA样品直接在PCR板中以1：5稀释，并在qPCR分析前储存于-80℃。
[0241] qPCR
[0242] 在qPCR之前，用水将cDNA样品1：5稀释。用5μl cDNA、10μl SsoAdvanced SYBR green+1μl特异性引物+4μl无RNase水制备qPCR反应物。用GAPDH作为内部参比基因。PCR循环参数；95℃热启动3分钟，40个循环(95℃持续10秒，60℃持续30秒)。根据归一化为参比基因的ΔΔCt方法分析结果。
[0243] 结果-HMOX1
[0244] H.procumbens提取物和纯毛蕊花苷显著增加人成纤维细胞中HMOX1的表达。两个独立实验的结果总结在下表和图4A中。
[0245]
[0246] H.procumbens提取物和毛蕊花苷上调HMOX1，表明两者都通过上调内源性抗氧化应答而具有抗自由基的保护性质。
[0247] 实例10-H.procumbens提取物调节UV诱导的人体细胞中活性氧物质产生的能力[0248] 这些实验测试了H.procumbens提取物或毛蕊花苷抑制人皮肤成纤维细胞中UV诱导的过氧化氢产生的能力。根据标准细胞培养程序，将成纤维细胞在DMEM/10％FBS培养基中培养。将实验设置在48孔板中，细胞汇合度为80-90％。用H.procumbens提取物、毛蕊花苷或对照物(维生素E(vit E)和白藜芦醇)预处理细胞1小时，然后UVB处理(50mJ/cm2)，在37℃孵育2小时。然后使用来自Promega的ROS-Glo试剂盒，根据制造商的说明分析H2O2水平。结果显示在图5中。发现单独的H.procumbens提取物和毛蕊花苷具有比用作阳性对照的其他众所周知的抗氧化剂(维生素E(vit E)和白藜芦醇)，更高的抑制UV诱导的过氧化氢产生的能力。
[0249] 实例11-H.procumbens提取物调节胶原蛋白酶活性的能力
[0250] 皮肤中的胶原蛋白量通过胶原蛋白合成和胶原蛋白分解之间的平衡来维持，所述分解是由胶原蛋白酶，即基质金属蛋白酶(MMP)家族中的酶介导的。该研究的目的是确定H.procumbens提取物或毛蕊花苷在无细胞系统中抑制来自溶组织梭菌的代表性胶原蛋白酶NB4的能力。
[0251] 简而言之，将胶原蛋白酶(0.3U/ml)与活性物质(1mM)在25℃孵育15分钟。加入3mM序列FALGPA的合成肽(模拟胶原蛋白的结构)作为底物，并通过分光光度法在345nm处测量所得量。结果如图6所示。H.procumbens提取物抑制胶原蛋白酶20％。
[0252] 材料
[0253] 来自溶组织梭菌的胶原蛋白酶NB 4 SERVA17454.02 500mg
[0254] 2-呋喃丙烯酰基-Leu-Gly-Pro-Ala(FALGPA)Sigma,Cat.F513 5-25mg
[0255]
[0256] 实例12-提取物调节人细胞炎性标志物的能力
[0257] 这些测定的目的是确定H.procumbens提取物或毛蕊花苷，对人皮肤成纤维细胞中紫外线或污染介导的炎症标志物产生的抑制效果。
[0258] 该测定法测量IL-6、GM-CSF、MMP1和MMP3的水平。IL-6和GM-CSF是炎症的标准标志物。MMP1和MMP3也是炎症的标志物，但是它们与本发明特别相关，因为它们也直接参与调节皮肤损伤。每种都是基质金属蛋白酶(MMP)，它是一种负责分解皮肤中胶原蛋白的酶。MMP-1(胶原蛋白酶)和MMP-3(溶基质素)在真皮结构的降解中起主要作用，并且已知受到诸如UV和污染的环境胁迫的刺激。这些研究中使用的污染物包括柴油颗粒物(DPM)。
[0259] 角质形成细胞条件(KC)培养基
[0260] 根据标准细胞培养程序，在EpiLife/HKGS培养基中培养角质形成细胞。当达到80-90％汇合时，用UVB(50mJ/cm 2)或DPM(2μg/ml)刺激细胞，或不刺激细胞，再培养24小时。然后收集细胞培养基并用于随后刺激成纤维细胞。据信UV或污染处理的角质形成细胞通过旁分泌信号传导引发成纤维细胞的应答，这提供皮肤外部胁迫损伤的模型。
[0261] 成纤维细胞刺激和用活性物质治疗
[0262] 根据标准细胞培养程序，将成纤维细胞在DMEM/10％FBS培养基中培养。将实验设置在48孔板中，细胞汇合度为80-90％。用H.procumbens提取物或毛蕊花苷预处理细胞1小时，然后加入来自UV或污染处理的角质形成细胞的KC条件培养基。
[0263] 用IL-1β(100ng/ml)处理细胞作为阳性对照。处理成纤维细胞24小时，然后根据制造商的说明，通过ELISA或Luminex确定成纤维细胞培养基中炎性标记物(MMP1、MMP3、IL-6和GM-SCF)的水平。
[0264] 结果
[0265] H.procumbens提取物抑制成纤维细胞中每种UV刺激的炎性标记物MMP-1、MMP-3、IL-6和GM-CSF的产生(参见图7A)。H.procumbens提取物在UV胁迫下完全抑制MMP-1的产生(参见图7B)，并且抑制污染诱导的MMP-1产生75％(参见图7C)。
[0266] 材料
[0267] EpiLife角质形成细胞培养基
[0268]
[0269] 实例13-H.probumbens提取物在UV刺激后调节人细胞基因表达的能力
[0270] 这些测定的目的是确定H.probumbens提取物或毛蕊花苷对暴露于UV胁迫的皮肤模型中基因表达的影响。用H.probumbens提取物预处理成纤维细胞，然后如实施例11中那样暴露于UV刺激的(或未刺激的)细胞培养基。如实施例9中进行RNA提取和cDNA合成，然后进行qPCR以确定基因表达水平。测定胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV和原纤维蛋白的表达。
[0271] 胶原蛋白是胞外基质的组成蛋白，由29种不同类型组成，胶原蛋白I是真皮中存在的最主要的蛋白质，约为85-90％。胶原蛋白III约占胞外基质的10-15％。这两种蛋白质在赋予皮肤结构完整性方面发挥重要作用，在光老化/UV损伤的皮肤中，胶原蛋白I和III水平都显著降低(Talwar HS 1995)。胶原蛋白IV存在于真皮-表皮连接处(DEJ)中，其有助于形成真皮和表皮之间的内聚力。据描述，这种蛋白质的减少会导致更深的皱纹，并导致皮肤弹性的丧失。光老化的皮肤的特征在于原弹性蛋白及其相关的微原纤维组分原纤维蛋白的解体。此外，在光老化vs非光老化皮肤中观察到真皮-表皮连接处的原纤维蛋白消耗。导致胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV和原纤维蛋白分解的变化是老化皮肤的最终迹象的主要原因。因此，这些蛋白质的新产生对于帮助修复由于持续的外部胁迫导致的皮肤损伤是重要的。
[0272] 如图8所示，用H.procumbens提取物预处理成纤维细胞，随后暴露于UV-培养基条件，能够相对于对照显著增加胶原蛋白I、III、IV和原纤维蛋白的基因表达。H.procumbens提取物对这些基因的上调，表明它将有助于修复皮肤免受在持续的环境胁迫存在下可能发生的损伤。
[0273] 实例14-H.procumbens提取物在UV刺激后调节人细胞中蛋白质产生的能力
[0274] 进一步探索了H.procumbens提取物在UV胁迫后刺激胶原蛋白I的基因表达的发现(参见图8)，以确定胶原蛋白I基因表达是否转化为生物学相关的蛋白质产物。如实例13，用活性物质预处理人成纤维细胞，并用UV刺激。然后使用抗胶原蛋白抗体以免疫荧光(见下文详述)观察细胞中胶原蛋白I蛋白的存在。如图9所示，在UV胁迫下，H.procumbens提取物和毛蕊花苷均显著增加胶原蛋白I的产生。
[0275] 免疫荧光染色
[0276] 处理细胞后，然后在免疫染色前用100％甲醇将它们固定5分钟。通过用PBS中的10％山羊血清封闭1小时来抑制非特异性染色。胶原蛋白I的测量是通过与一抗，即大鼠抗人前胶原蛋白I(1：100稀释)在PBS和1％山羊血清中孵育1小时，然后是与二抗，即山羊抗大鼠Alex 488(1：100稀释)在PBS和1％山羊血清中孵育1小时。使用10ng/ml的DAPI进行复染以使细胞核可视化。通过使用Cytation 3软件(Biotek)中的细胞成像/图像统计工具进行图像分析，得到标记强度/细胞的比例。
[0277] 材料
[0278]
[0279] 实施例15-H.procumbens提取物调节老年人细胞基因表达的能力
[0280] 这些测定的目的是确定H.procumbens提取物或毛蕊花苷对来自老年捐赠者的成纤维细胞中基因表达的影响(测试的三个捐赠者：54、56和74岁)。用H.procumbens提取物(或未处理的)处理成纤维细胞，并在正常成纤维细胞培养基(DMEM+10％FBS)中培养。因此，这是H.procumbens提取物的能力模型，其影响细胞由于时间老化而不是外部胁迫例如UV而引起的变化。如实施例9进行RNA提取和cDNA合成，然后进行qPCR以确定基因表达水平。测定胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV和原纤维蛋白的表达水平。
[0281] 如图10所示，用H.probumbens提取物预处理的细胞比毛蕊花苷处理的细胞表达更高水平的所有四种基因。H.profumbens处理的细胞也比未处理的对照表达更高水平的胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV，尽管仅胶原蛋白I和胶原蛋白IV显著增加。由于这些生物标志物在时间老化过程中减少，从老年人获得的细胞上的这些发现表明，H.profumbens提取物可以起到帮助重建/加强真皮皮肤层的作用，这随即有助于减轻可见的老化迹象。
[0282] 实施例16-H.profumbens提取物调节老年人细胞中蛋白质产生的能力
[0283] 进一步探索了H.profumbens提取物刺激老年细胞中胶原蛋白I的基因表达的发现(参见图10)，以确定胶原蛋白I基因表达是否转化为此类细胞中的生物学相关蛋白质产物。并如实施例15那样，用活性物预处理来自两个老年捐赠者(49和54岁)的成纤维细胞，并暴露于未刺激的KC培养基(参见实施例11)。如实施例14中通过免疫荧光测定胶原蛋白I水平。
结果如图11所示。清楚地证明了，只有H.procumbens提取物显著增加了胶原蛋白I蛋白的产生。这证实了实施例15的结果，即H.procumbens提取物能够刺激皮肤成纤维细胞在老化的皮肤细胞中产生生物学相关的胶原蛋白I蛋白。
结果如图11所示。清楚地证明了，只有H.procumbens提取物显著增加了胶原蛋白I蛋白的产生。这证实了实施例15的结果，即H.procumbens提取物能够刺激皮肤成纤维细胞在老化的皮肤细胞中产生生物学相关的胶原蛋白I蛋白。
[0284] 实施例17-H.procumbens提取物预防糖化的能力
[0285] 糖化是糖分子对蛋白质的损害。它是一种在皮肤老化中起重要作用的过程，其中糖分子与结合脂肪和蛋白质的细胞结合。随即，蛋白质被破坏并改变细胞的形状，最终导致细胞代谢的破坏。胶原蛋白是一种特别容易受到糖化作用的蛋白质，如果受损则表现为皱纹和面纹。进行实验以测试H.procumbens提取物在无细胞系统和人成纤维细胞中抑制糖化的能力。结果表明，H.procumbens提取物能够抑制无细胞系统中的糖化56％(图12A)和细胞中的糖化35％(图12B)。这表明H.procumbens提取物可用于预防或逆转与老化相关的皮肤损伤。
[0286] 无细胞测定
[0287] 在涉及蛋白质(例如胶原蛋白)和糖的非酶促反应，即Maillard反应期间，形成晚期糖化终产物(AGE)。可以通过测量由模型蛋白质和糖的糖化形成的AGE的荧光来监测抗糖化活性。该测定法测量了糖D-核糖对牛血清白蛋白(BSA)的糖化作用。在pH7.4的磷酸钠缓冲液中的BSA(10mg/mL)和D-核糖(0.5M)用H.probumbens提取物或芦丁(阳性对照)处理或不处理(阴性对照)，然后在37℃孵育24小时。然后用分光光度计微盘读数器在λexc 370nm和λem 440nm测量荧光AGE。
[0288] 材料
[0289]
[0290] 细胞测定(免疫荧光)
[0291] 根据标准细胞培养程序，将成纤维细胞在DMEM/10％FBS培养基中培养。将培养到50-70％汇合的成纤维细胞用0.5mM乙二醛处理48小时以诱导糖化。对照细胞未用乙二醛处理。在暴露于乙二醛后，用含有H.procumbens提取物或毛蕊花苷的新鲜培养基替换培养基并再培养72小时。用二甲双胍(1mM)处理细胞72小时，作为该测定的阳性对照。
[0292] 处理细胞后，然后在免疫染色前用100％甲醇将它们固定5分钟。通过用PBS中的10％山羊血清封闭1小时来抑制非特异性染色。测量羧甲基溶素(CML)，其是由于糖化而在蛋白质上形成的加合物，测量是通过与一抗即小鼠抗人CML(3μg/ml)在PBS和1％山羊血清中孵育1小时，然后与二抗即山羊抗小鼠Alex 488(1：100稀释)在PBS和1％山羊血清中1孵育小时。使用10ng/ml的DAPI进行复染以使细胞核可视化。通过使用Cytation 3软件(Biotek)中的细胞成像/图像统计工具进行图像分析，得到标记强度/细胞的比例。
[0293] 材料
[0294]
[0295]
[0296] 实施例18-H.procumbens提取物在UV刺激后调节人细胞表皮基因表达的能力[0297] 这些测定的目的是确定H.procumbens提取物或毛蕊花苷对随后暴露于UV的角质形成细胞中的基因表达的影响。根据标准细胞培养程序，在EpiLife/HKGS培养基中培养角质形成细胞，并用H.probumbens提取物或verbasocoside处理(或不处理)。当达到80-90％2
汇合时，用UVB(50mJ/cm)刺激细胞并再培养24小时。如实施例9进行RNA提取和cDNA合成，然后进行qPCR以确定基因表达水平。确定层粘连蛋白V、水通道蛋白3、外皮蛋白和角蛋白的表达水平。
汇合时，用UVB(50mJ/cm)刺激细胞并再培养24小时。如实施例9进行RNA提取和cDNA合成，然后进行qPCR以确定基因表达水平。确定层粘连蛋白V、水通道蛋白3、外皮蛋白和角蛋白的表达水平。
[0298] 老年人皮肤表现出表皮和真皮的形态差异。表皮中发生的一些变化包括：表皮厚度减小，真皮-表皮连接变平和角质形成细胞增殖减少。层粘连蛋白是一类糖蛋白，在维持皮肤结构中起着不可或缺的作用。它们在皮肤的基底膜中大量存在，并且对于维持真皮-表皮连接非常重要。层粘连蛋白的生物活性有助于影响各种细胞功能，如细胞分化、迁移、粘附和皮肤再生-维持和治愈皮肤所必需的机制。在这项研究中，我们试图测量H.procumbens或毛蕊花苷对层粘连蛋白V亚基γ(基因编码LAMC2)的影响。在UV的存在下，H.procumbens显著刺激了层粘连蛋白的产生，这表明其可能对皮肤-表皮连接处发挥潜在的强化作用，增强皮肤的紧致度和光滑度。
[0299] 水通道蛋白是促进水跨膜运输的蛋白质。水通道蛋白3(AQP3)水通道受到时间老化和慢性UV照射的强烈影响。在老年人中观察到AQP3水平的降低，这可以解释随着年龄增长而发生的皮肤干燥。因此，AQP是改善UV诱导的干燥的关键蛋白质靶标。在我们的研究中，我们观察到H.procumbens刺激紫外线刺激的表皮角质形成细胞中AQP3的产生。
[0300] 角蛋白是一种蛋白质，其构成表皮角质化的包膜。它具有与前胶原蛋白相似的结构组织-是角质层的重要组成部分。特应性皮炎患者表皮中角蛋白的表达减少被认为是导致这些个体中出现的表皮屏障缺陷的原因(Wu Z et al.2009)。最近的一项研究还表明，在患有慢性手部湿疹的患者中，角蛋白显著下调，这肯定了角蛋白在皮肤屏障功能中起重要作用的假设(Molin S et al.2015)。在我们的研究中，我们观察到H.procumbens提取物处理的角质形成细胞显著刺激角蛋白基因表达。这一发现表明，H.procumbens提取物可能有助于在UV胁迫条件下维持皮肤屏障功能。
[0301] 外皮蛋白是角质形成细胞分化和成熟的标志物。UV照射后外皮蛋白表达的报道相互矛盾，一些作者报道UV照射后外皮蛋白表达增加(Bertrand-Vallery 2010)，其他作者则认为外皮蛋白表达减少(Mammone et al.2000)。这些结果的差异似乎取决于UVB来源和生物模型。尽管如此，在我们的研究中，我们观察到，与单独用紫外线刺激的细胞相比，H.procumbens提取物刺激紫外线照射的角质形成细胞中的外皮蛋白的产生。该发现与上述其他表皮生物标志物上看到的效果一起，进一步支持论点-H.prromumbens提取物具有调节重要表皮标志物的强大能力，其可以帮助改善UV胁迫下皮肤屏障的状况、水合作用和功能。
[0302] 如图13所示，相对于未处理的细胞，用H.probumbens提取物处理导致层粘连蛋白V、水通道蛋白3、外皮蛋白和角蛋白中的每一种的基因表达显著升高。这表明该提取物可用于预防或逆转与老化相关的皮肤损伤，例如由外部胁迫引起的损伤。
[0303] 实例19-H.probumbens提取物在没有UV刺激的情况下调节人细胞表皮基因表达的能力
[0304] 这些测定的目的是确定H.probumbens提取物或毛蕊花苷对角质形成细胞中基因表达的影响，所述角质形成细胞未暴露于UV或其他外部胁迫。因此，这是提取物的能力模型，其影响由于时间老化而不是外部胁迫(例如UV)造成的细胞变化。根据标准细胞培养程序在EpiLife/HKGS培养基中培养角质形成细胞，并用H.probumbens提取物或verbasocoside处理(或不处理)。如实施例9进行RNA提取和cDNA合成，然后进行qPCR以确定基因表达水平。确定水通道蛋白3的表达水平。如图14所示，相对于未处理的细胞，H.procumbens提取物和毛蕊花苷处理均导致AQP3表达显著增加。
[0305] 这表明该提取物可用于预防或逆转与老化相关的皮肤损伤。
[0306] 实施例20-H.procumbens提取物的亮肤特性
[0307] 在研究中使用含有NHEM-黑色素化的黑色素细胞的重建表皮来确定H.procumbens提取物或毛蕊花苷是否能够抑制黑色素生成。基因分析显示，在没有UV照射的情况下，H.procumbens提取物和毛蕊花苷降低WNT16(Wingless型MMTV整合位点家族，成员16)的表达(参见下表中的结果)。
[0308]基因名称 H.procumbens 毛蕊花苷
WNT16 -6.49(p＝0.002) -3.72(p＝0.019)
WNT16 -6.49(p＝0.002) -3.72(p＝0.019)
[0309] MITF，参与黑色素细胞的分化、生长和存活的关键转录因子，调节超过25个色素沉着基因，包括黑色素合成关键酶(即酪氨酸酶、酪氨酸相关蛋白-1、多巴色素互变异构酶)、黑素体结构组分，和与其成熟和沿黑素细胞树突运输相关的蛋白质。
[0310] MITF受主要黑色素生成途径的控制，包括刺激激素/黑皮质素-1受体的α-黑色素细胞、干细胞因子/c-Kit、内皮素/蛋白激酶C和Wnt/β-连环蛋白途径。它本身受转录水平和特定磷酸化的调节(Levy,Khaled,&Fisher,2006；Shibahara et al.,2001)。
[0311] 在Wnt/β连环蛋白途径中，关键对照是细胞内β-连环蛋白的水平。在不存在Wnt信号的情况下，β连环蛋白依次由糖原合酶激酶3β(GSK-3β)磷酸化，然后磷酸化的β连环蛋白被泛素连接酶复合物识别，通过泛素依赖性机制而降解。相反，Wnt途径的激活负调节GSK-3β，导致胞质β连环蛋白的积累，所述β连环蛋白转位到细胞核，并与T细胞因子(TCF)和淋巴细胞增强因子-1(LEF)形成复合物，上调MITF的表达。因此，所述Wnt/β连环蛋白的途径的激活通过MITF活性的上调，刺激黑色素生成(Bellei,Pitisci,Catricalà,Larue,&Picardo,2011；Cadigan,2008；Yaar&Park,2012)。
[0312] 用H.procumbens提取物处理的细胞中的WNT配体表达的显著降低，可以表明通过减慢Wnt/β连环蛋白黑色素生成途径可能具有增白效果。
[0313] 实验方法如下：
[0314] 将含有正常人表皮黑色素细胞-黑色素化(NHEMs-DP；感光型V-VI)的重组人表皮在无血清培养基的气-液界面，于37℃的潮湿气氛，CO2 5％培养14天(完全分化)。在用H.probumbens提取物处理之前，将表皮转移到12孔板中，一式三份培养物(n＝3)。
[0315] 对于UV照射的实验，将H.prompumbens提取物在分化表皮的培养基中施用18小时。然后将组织置于PBS中，用4J/cm2的UVA和200mJ/cm2的UVB(±15分钟)照射，用发光器Biosun(Vilbert Lourmat,FR)照射。照射后，将表皮与提取物一起再孵育6小时。
[0316]
[0317] 在处理结束时，提取总RNA并通过分光光度法和毛细管电泳分析样品完整性。然后通过逆转录从mRNA合成cDNA。通过qPCR得到基因表达变化。
[0318] 总RNA提取和cDNA合成
[0319] 使用Qiagen RNeasy试剂盒提取总RNA。处理后，用PBS漂洗细胞并在缓冲液中裂解，同时将表皮直接浸入裂解缓冲液中(对于每种条件进行三个重复培养)。根据供应商的建议从细胞和组织中提取RNA。将收集的RNA储存在-80℃。根据制造商的说明，用高容量RNA-to-cDNA试剂盒(Applied Biosystems)从2μg总RNA进行逆转录。然后将cDNA储存在-20℃。
[0320] 定量PCR
[0321] 不同的探针由Applied Biosystems(MITF-Hs01117294_m1、WNT16-Hs00365138_m1)制造。使用7900HT快速实时系统(Applied Biosystems)，实时qPCR来定量特定靶标的表达。简言之，将4μl ADNc(4ng)与10μl TaqManFast Universal Master Mix(Applied Biosystems)、1μl TaqManGene Expression Assay和5μl无RNAse水混合。为了使结果归一化，将基因表达归一化为管家基因β2-微球蛋白B2M。热循环程序为用一个孵育步骤(在50℃下2分钟)，然后进行第一次变性步骤(在95℃下10分钟)。然后扩增方案再进行40个循环(95℃下15秒和60℃下1分钟)。
[0322] 获得每个基因的阈值循环数(Ct)。使用SDS RQ Manager软件(v1.2.1，Applied Biosystems)从实时qPCR设备导出结果文件，并使用设计用于执行基因表达的相对定量的DataAssist软件(v3.0，Applied Biosystems)分析数据，所述软件使用比较Ct(Ct)方法(Pfaffl,2001&Livak and Schmittgen,2001)并组合统计分析。对于表皮，将数据与作为管家基因的β2-微球蛋白(B2M)的参比条件(EtOH 1％)进行比较。用作检测阈值或Ct截止值的最大允许Ct值固定为36个循环。
[0323] 实施例21-H.procumbens提取物的进一步亮肤特性
[0324] 在存在和不存在UV挑战的情况下，使用重建的人表皮与感光型III-IV黑色素细胞进行研究，以测试H.procumbens提取物和毛蕊花苷的增白性质。作为阳性对照的曲酸降低了表皮中的黑色素含量(存在和不存在UV都)，验证了测试和分析方法。与EtOH阴性对照相比，在不存在UV挑战(图15A)和存在UV挑战(图15B)两者中，用H.probumbens提取物或毛蕊花苷处理的表皮都观察到黑色素沉积的显著降低。该发现支持实例19的结论，并且表明H.procumbens提取物和毛蕊花苷具有可直接导致皮肤增白效果的性质。
[0325] 实验方法如下：
[0326] 第0天至第4天，从含有BPE 100％(牛垂体提取物)的生长培养基的气-液界面重构人表皮。然后继续培养过程，从第4天至第7天生长培养基含有50％BPE，从第7天至第14天培养基不含BPE。
[0327] 从第4天到第14天(n＝3)，将H.procumbens提取物在培养基中施用总共10天，在第7天至第11天更新培养基，并且如下所示存在α-MSH(1μM)和UVA/B挑战(UVA 1J/cm2，UVB
2
50mJ/cm)。通过MTS测定(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基-甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四氮唑)检查到不存在细胞毒性。
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50mJ/cm)。通过MTS测定(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基-甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四氮唑)检查到不存在细胞毒性。
[0328] 将曲酸(250μM)的作用平行分析为增白参比化合物以验证分析。用作制备培养基中的H.procumbens提取物的溶剂为相应浓度为0.1％的乙醇，平行测试。在第14天，将组织从其插入物中取出并浸入可溶解的提取溶液(Perkin Elmer)中并在80℃下加热1小时。在490nm处测量上清液的光密度，并通过与合成黑色素(Sigma Aldrich M8631)的标准曲线比较来确定黑色素含量。
[0329] 附录1
[0330] 用于qPCR的具体引物和其它材料(实例9、13、15、18、19)
[0331]
[0332]
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