基于转录组学链霉菌次级代谢强启动子挖掘方法及应用
阅读：626发布：2020-05-19
专利汇可以提供基于转录组学链霉菌次级代谢强启动子挖掘方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种基于转录组学链霉菌次级代谢强启动子挖掘方法及应用，是通过比较分析链霉菌转录组 基因芯片 数据，筛选次级代谢中表达 水 平相对提高明显的基因，并扩增这些基因的启动子区域，作备选启动子。以强启动子ermE*p作参照，利用egfp报告基因表征备选启动子活性，确证启动子在次级代谢中相对高活性。此外，与ermE*p相比，应用筛选得到的启动子高表达恰塔努加链霉菌纳他霉素途径特异性正调控因子，使纳他霉素产量提高30％。本发明方法可应用于链霉菌次级代谢基因表达调控。，下面是基于转录组学链霉菌次级代谢强启动子挖掘方法及应用专利的具体信息内容。
1.基于转录组学链霉菌次级代谢强启动子挖掘方法，其特征是，通过比较分析链霉菌转录组基因芯片数据，筛选出次级代谢中表达水平相对提高明显的基因，并扩增出这些基因的启动子区域，作为备选启动子，利用egfp报告基因次级代谢中表达水平进一步确认和表征备选启动子活性，同时以强启动子ermE*p作为参照，确证启动子在初级代谢中低活性但在次级代谢中高活性。
2.根据权利要求1所述的基于转录组学链霉菌次级代谢强启动子挖掘方法，其特征是，通过以下步骤实现：
（1）根据链霉菌转录组基因芯片数据，初步筛选出链霉菌次级代谢中表达水平相对提高明显的基因；
（2）根据步骤（1）中确定的基因，剔除其中基因间隔区过短或者没有基因间隔区的基因后得到若干个基因，取这些基因的启动子区域作为备选启动子；
（3）扩增出步骤（2）中的备选启动子，克隆插入pIJ8660载体中，使得备选启动子位于egfp基因的上游，测序检验序列正确性后，即得到若干分别依次带有一段备选启动子和egfp基因的pIJ8660重组质粒，同时扩增出ermE*p启动子，克隆插入pIJ8660载体的相同位点，得到依次带有ermE*p启动子和egfp基因的pIJ8660重组质粒；
（4）将步骤（3）中的所有重组质粒分别接合转导进入链霉菌中，得到突变株若干；
（5）将步骤（4）中的突变株进行发酵；
（6）取步骤（5）中24、48、72以及96小时的各突变株发酵液，离心收取菌体，超声破碎细胞获得菌体总蛋白；
（7）取步骤（6）中等量的各样品进行菌体总蛋白Western blot实验，检测eGFP在24、48、
72以及96小时的表达水平同时利用等量的各样品进行蛋白胶电泳后考马斯亮蓝染色，确定各样品总蛋白上样量一致；
（8）根据步骤（7）中Western blot实验相对定量检测eGFP的结果，进一步确认在链霉菌次级代谢高效调控强启动子，其特点为在初级代谢中低活性并且在次级代谢中高活性。
3.权利要求1或2所述方法在链霉菌天然产物高产改造中的应用。
基于转录组学链霉菌次级代谢强启动子挖掘方法及应用
技术领域
背景技术
[0002] 链霉菌是一种革兰氏阳性菌，由于其在次级代谢过程中能产生丰富的具有重要生物活性的抗生素，抗癌药物等天然产物而具有巨大工业价值。为了大量地生产重要的天然产物，需要各种用于生物合成基因簇和相关调控网络精确控制的代谢工程和合成生物学工具。一些高效的组成型启动子已经被很好地表征，例如ermE*p,kasO*p以及SF14p。另外，还有一些诱导型启动子被用于各类研究。
[0003] 众所周知，次级代谢产物是由乙酰辅酶A，氨基酸等前体生物合成产生的。这些前体主要来自初级代谢，并且在菌体生长过程中是细胞结构和生物活性分子的必要组成单位。由组成型启动子控制下的天然产物生物合成过早开始将不可避免地消耗这些初级代谢产物。同时一些有着特定生物活性的万古霉素等次级代谢产物，经常有抑制菌体细胞生长的生理学效应。上述这些都会对细胞的生长繁殖有毒害作用，尤其是在工业化扩大生产的过程中。这些负面作用可能最终将会抵消高效的组成型启动子的积极作用。
[0004] 另一方面，由于化学诱导剂的使用，诱导性启动子在菌体生理上也有一些负面的作用。同时在工业生产中，诱导剂通常过于昂贵。此外，为了最佳的诱导效果，诱导剂的使用需要精心控制并避免污染。
[0005] 所以，与基因簇表达模式相符合的强启动子将会更适用于基因簇的过表达。为了这一目标，就要设法寻找在初级代谢阶段沉默，而在细胞进入次级代谢后高效表达的启动子。在这样的情况下，由于启动子的活性依赖于生理开关，所以不需要诱导剂。
[0006] 工业生产菌，恰塔努加链霉菌L10能产生大环内酯类抗生素，纳他霉素。纳他霉素的生物合成需要大量的乙酰辅酶A和海藻糖等前体物质，其中一些代谢产物对于菌体有毒害作用。基于恰塔努加链霉菌L10的转录组基因芯片数据，经筛选得到了一个启动子，其相对表达水平(36小时/12小时值)大于50，并且经验证，在次级代谢中其活性比ermE*p高7倍。除此之外，使用这个启动子高表达纳他霉素正调控因子显示出比ermE*p高30％的纳他霉素产量。这是一种筛选在次级代谢中自动诱导的启动子元件的新方法。这种方法筛选的启动子将可以用于链霉菌中天然产物的发现与高产改造。
[0007] 基于以上考虑，我们发明了基于转录组学链霉菌次级代谢强启动子挖掘方法。该方法高效，准确，操作方便，为寻找内源的链霉菌次级代谢高效调控强启动子提供了一种新的方法。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供基于转录组学链霉菌次级代谢强启动子挖掘方法，针对的是为链霉菌次级代谢高效调控强启动子的挖掘，提供一种基于转录组学的方法。这是一种基于链霉菌转录组基因芯片数据，快速分析挖掘链霉菌次级代谢高效调控强启动子的新技术。本发明方法具体用以下步骤实现：
[0009] (1)根据链霉菌转录组基因芯片数据，初步筛选出链霉菌次级代谢中表达水平相对提高明显的基因；(2)根据步骤(1)中确定的基因，剔除其中基因间隔区过短或者没有基因间隔区的基因后得到若干个基因，取这些基因的启动子区域作为备选启动子；
[0010] (3)扩增出步骤(2)中的备选启动子，克隆插入pIJ8660载体中，使得备选启动子位于egfp基因的上游，测序检验序列正确性后，即得到若干分别依次带有一段备选启动子和egfp基因的pIJ8660重组质粒，同时扩增出ermE*p启动子，克隆插入pIJ8660载体的相同位点，得到依次带有ermE*p启动子和egfp基因的pIJ8660重组质粒；
[0011] (4)将步骤(3)中的所有重组质粒分别接合转导进入链霉菌中，得到突变株若干；
[0013] (6)取步骤(5)中24、48、72以及96小时的各突变株发酵液，离心收取菌体，超声破碎细胞获得菌体总蛋白；
[0014] (7)取步骤(6)中等量的各样品进行菌体总蛋白Western blot实验，检测eGFP在24、48、72以及96小时的表达水平同时利用等量的各样品进行蛋白胶电泳后考马斯亮蓝染色，确定各样品总蛋白上样量一致；
[0015] (8)根据步骤(7)中Western blot实验相对定量检测eGFP的结果，进一步确认在链霉菌中次级代谢高效调控强启动子，其特点为在初级代谢中低活性并且在次级代谢中高活性。
[0016] 本发明的目的是提供所述方法在链霉菌次级代谢基因表达调控中的应用。
[0017] 1.本发明方法是根据链霉菌转录组基因芯片数据分析出在链霉菌次级代谢中相对于初级代谢具有明显较高活性的启动子。
[0018] 2.本发明方法是将备选启动子插入egfp基因上游，利用eGFP蛋白的表达水平来表征备选启动子活性，从而便于后续的检测。
[0019] 3.本发明方法筛选得到的启动子是经转录组基因芯片筛选和报告基因egfp筛选后确认的链霉菌次级代谢高效调控强启动子，其特征是在初级代谢中低活性并且在次级代谢中高活性，从而能够保证使用该启动子时，链霉菌初级代谢中不受影响而在次级代谢中保证相关次级代谢产物高效产出。
[0020] 本发明具有的明显优点：1)本发明能够利用通用步骤快速筛选出链霉菌次级代谢高效调控强启动子。2)本发明为链霉菌各种天然产物的生物合成以及隐性基因簇的激活提供了寻找强启动子元件的方法工具。3)本发明在天然产物的生物合成中应用广泛，所有可以进行遗传操作的宿主都可以使用本发明进行启动子挖掘。附图说明
[0021] 图1为恰塔努加链霉菌L10基因芯片部分数据，15个备选基因的在次级代谢中相对表达强度提高明显(36小时/12小时值大于50)。
[0022] 图2为测定恰塔努加链霉菌L10中，thlM4p调控下的报告基因egfp的表达水平的Western blot实验结果，实验以ermE*p调控下egfp在第3天时的表达水平为对照。检测eGFP在第1、2、3以及4天的表达水平同时利用等量的蛋白进行蛋白胶电泳后考马斯亮蓝染色，确定各样品上样量一致。
[0023] 图3为以thlM4p和ermE*p高表达scnRII后，恰塔努加链霉菌L10的纳他霉素的产量曲线。
[0024] 图4为以thlM4p和ermE*p高表达scnRII后，恰塔努加链霉菌L10的干重曲线。
具体实施方式
[0025] 下面结合附图和具体实施例作进一步详细描述。
[0026] 实施例1
[0027] 以使用本方法挖掘恰塔努加链霉菌L10次级代谢高效调控强启动子为例，详细描述本发明。具体实施步骤如下：
[0028] 1)根据恰塔努加链霉菌L10转录组基因芯片数据，初步筛选出恰塔努加链霉菌L10次级代谢中表达水平相对提高明显(36小时/12小时值大于50)的基因，得到57个基因。所述恰塔努加链霉菌L10，分类命名为：Streptomyces chattanoogensis L10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC 2644，保藏日：2008年8月27日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，邮编：100101；
[0029] 2)根据步骤1)中确定的57个基因，剔除其中基因间隔区过短或者没有基因间隔区的基因后得到15个备选基因，取这些基因的启动子区域作为备选启动子。(见表1与附图1)[0030] 表1 15个基因间隔区大小合适的备选基因的相对表达水平
[0031]
[0032]
[0033] 3)由引物对1+2；3+4；5+6；7+8；9+10；11+12；13+14；15+16；17+18；19+20；21+22；23+24；25+26；27+28；29+30；(见表2)扩增出步骤2)中的15个备选启动子，克隆插入pIJ8660载体的BamHI/NdeI位点，使得15个备选启动子分别位于egfp基因的上游，测序检验序列正确性后，即得到15个分别依次带有一段备选启动子和egfp基因的pIJ8660重组质粒，命名为pIJ8660-P1～P15。同时由引物对31+32(见表2)扩增出ermE*p启动子，克隆插入pIJ8660载体的BamHI/NdeI位点，得到依次带有ermE*p启动子和egfp基因的pIJ8660重组质粒，命名为pIJ8660-P16。
[0034] 表2 构建报告质粒所用引物
[0035]
[0036]
[0037] 4)将步骤3)中的16个重组质粒分别接合转导进入恰塔努加链霉菌L10中，得到相应16株突变株。
[0038] 5)将步骤4)中的16株恰塔努加链霉菌L10突变株进行发酵。
[0039] 6)取步骤5)中24、48、72以及96小时的各突变株发酵液，离心收取菌体，超声破碎细胞获得菌体总蛋白。
[0040] 7)取步骤6)中各样品20μg进行菌体总蛋白Western blot实验，检测eGFP在24、48、72以及96小时的表达水平同时利用等量的各样品进行蛋白胶电泳后考马斯亮蓝染色，确定各样品总蛋白上样量一致。
[0041] 8)根据步骤7)中Western blot实验相对定量检测eGFP的结果，进一步确认了在恰塔努加链霉菌L10中次级代谢高效调控强启动子thlM4p(见附图2)，其特点为在初级代谢中低活性并且在次级代谢中高活性。
[0042] thlM4p序列:
[0043] tcgcccgttttgtcgtcccggtactccacacggtccgcgggtcggtgggtcatggctctctccacatctggggtaggtcggctgggctcgtttcgacgacggacgccccgcatccgccgcggagcgccgcaccccagcccaccgccgcctcggccgcccggcaaccgcagtggtccgaatggagggcccggtacctgggccgctccggcgggttcccatggcccgacccgtccgtcttccggacaccgattccgcccaacggacgttttccggccaattagttgaacggagcctgacaaccggccatccgtggtgggactcttccccgcaaccgccgcacgggcccccacagccccacgcccggcggcagctcgtaccacggacaaccggctgcacccgcgcacccgtacgtctccccccacacgctccacgagttctgcctcgctctgcccggacggccgctccgccgcccggtccccctcggccgcgccgacatctcgcggccccgcagaaggagtcagtgtgagacgcaccccccatgggtccatgcacagaagcggcacctcccccagacgcacc。
[0044] 实施例2
[0045] 1)选取恰塔努加链霉菌L10中纳他霉素合成途径特异性正调控基因scnRII作为靶基因，利用引物对33+34(见表3)扩增thlM4p启动子，同时利用引物对35+36(见表3)扩增scnRII基因，将thlM4p启动子和scnRII基因以无缝克隆的方法插入pIJ8660载体的BamHI/NotI位点，即得到依次带有thlM4p启动子和scnRII基因的pIJ8660重组质粒，命名为pIJ8660-thlM4p-scnRII。另外，利用引物对37+38(见表3)扩增ermE*p启动子，同时利用引物对39+40(见表3)扩增scnRII基因，将ermE*p启动子和scnRII基因以无缝克隆的方法插入pIJ8660载体的BamHI/NotI位点，即得到依次带有ermE*p启动子和scnRII基因的pIJ8660重组质粒，命名为pIJ8660-ermE*p-scnRII。
[0046] 表3 构建高表达质粒所用引物
[0047]33 cgagatctgatatcgtcgcccgttttgtcgtcccg
34 ttatcaaggctcgccatggtgcgtctgggggagg
35 atggcgagccttgataaaacgttgac
36 cgggctgcagccgggcggccgctcacttcacgaagtcgtccacaac
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38 tatgtccgcctcctttggtcactcagtcag
39 gaccaaaggaggcggacatatggcgagccttgataaaacgttgac
40 cgggctgcagccgggcggccgctcacttcacgaagtcgtccacaac
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39 gaccaaaggaggcggacatatggcgagccttgataaaacgttgac
40 cgggctgcagccgggcggccgctcacttcacgaagtcgtccacaac
[0048] 2)将步骤1)中的2个重组质粒分别接合转导进入恰塔努加链霉菌L10中，得到相应2株高表达scnRII的突变株。
[0049] 3)将步骤2)中的2株恰塔努加链霉菌L10突变株进行发酵。
[0050] 4)取步骤3)中24、48、72、96以及120小时的各突变株发酵液，甲醇提取后HPLC测定纳他霉素产量。经检测thlM4p高表达scnRII的恰塔努加链霉菌L10突变株纳他霉素的产量比ermE*p高表达scnRII的恰塔努加链霉菌L10突变株高30％，同时菌体干重未发现明显变化。(见附图3与附图4)。thlM4p序列同实施例1所示。
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