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一株银杏内生真菌及其应用

阅读：955发布：2020-05-19

专利汇可以提供一株银杏内生真菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一株银杏内生真菌及其应用。本发明从银杏树皮中分离到了具有抗肿瘤活性的银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，通过菌落形态和18sRNA测序相结合的方法，判断菌株的种属，然后利用MTT法检测菌株粗提物的抗宫颈癌活性，最后利用半制备HPLC的方法，对抑制率大于50％的菌株的次级代谢产物进行分离，有助于进一步筛选具有抗肿瘤活性的化合物单体。，下面是一株银杏内生真菌及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一株银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，已于2017年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种如权利要求1所述的银杏内生真菌层生镰刀菌的发酵培养液，其特征在于，制备方法如下：将所述内生真菌接种于液体培养基七天后，所得的液体培养液即为该内生菌的发酵培养液。
3.一种如权利要求1所述的银杏内生真菌层生镰刀菌的发酵培养液的乙酸乙酯提取物，其特征在于，制备方法如下：
将菌丝块接种于液体培养基后培养七天后，以体积比1:1向培养基中加入乙酸乙酯培养四天，过滤除去菌丝后，回收含有银杏内生真菌次级代谢产物有机相中的乙酸乙酯部位，将乙酸乙酯部位浓缩并干燥后溶于DMSO中得到的物质为发酵培养液的乙酸乙酯提取物。
4.一种抗宫颈癌活性组合物，其特征在于，包含权利要求2所述的发酵培养液和权利要求3所述的发酵培养液的乙酸乙酯提取物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含药物学上可接受的载体；所述载体选自稀释剂、分散剂、稳定剂中的一种或几种。

说明书全文

一株银杏内生真菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域及肿瘤治疗领域，具体涉及一株银杏内生真菌及其在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

[0002] 癌症是当今危害人类健康的主要疾病之一，严重威胁着人类的生命。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，近年来其发病有年轻化的趋势。目前临床上常用的抗肿瘤药物有50多种，但大多数药物只能使病情缓解，无法达到完全治愈的目的。所以抗肿瘤新药的研发一直是药物研究领域的主要方面。

[0003] 银杏树是我国特产药用植物，至今已发现银杏叶含有100多种化学成分，主要有黄酮类化合物、萜内酯类化合物，其提取物中白果黄素、聚戊烯醇等都具有抗肿瘤作用。常见银杏提取物主要有银杏叶复合提取物(EGb)、银杏叶聚戊烯醇(GP)、银杏叶多糖类化合物(GBLP)、银杏外种皮多糖(GBEP)四大类。EGb中含有多种成分,主要是黄酮类化合物和萜烯，研究发现EGb对小鼠移植肉瘤S180和肝癌H22细胞在体内、外均有抑制作用(嵇玉峰等，银杏提取物抗肿瘤作用的实验研究.中医研究.2005,18(7):14-16)。GP在体外对于人胃癌细胞株SGC-7901、人结肠腺癌细胞株LOVO和人宫颈癌Hela细胞株抑瘤率达60％～80％，在体内对移植性肿瘤细胞Heps、S180和EC的抑瘤率达到50％～65％(王成章等，银杏叶聚戊烯基磷酸酯体内外抗肿瘤的生物活性研究.林产化学与工业.2006,26(3):13-16)。GBEP在10～320μg/mL剂量下，体外作用24～72h，对人肝癌细胞株BEL-7404、胃腺癌细胞株SGC-7901及肺腺癌细胞株SPC-A-1皆有抑制作用。银杏提取物抗肿瘤的可能作用机制有：抗氧化和清除自由基、影响肿瘤细胞的增殖和诱导凋亡、抑制肿瘤血管的形成、对肿瘤及相关基因的调节作用、对肿瘤细胞的细胞毒作用等。

[0004] 然而银杏生长缓慢，自然条件下从栽种到结果要20年以上，制约了其药用功效的开发，根据植物内生真菌内共生理论推断，银杏中很有可能存在着某些内生真菌，能够产生跟银杏相同或相似的化学成分，所以银杏内生真菌成为研究的热点，人们期待其能成为银杏类药物的新来源或其生物活性物质的新途径。而关于银杏内生真菌的研究比较少，特别是对于银杏内生真菌抗肿瘤活性的研究更是少之甚少。郭建新等从陕西杨凌的银杏中分离得到522株内生真菌，采用菌丝生长抑制法测定了其对7种植物病原真菌的抑制作用，结果显示有占总数50.7％的菌株具有抗菌活性(郭建新等，银杏内生真菌抗真菌活性菌株的分离和筛选.西北农业学报.2005,14(4):14-17)。缪莉等体外抗肿瘤试验表明，安徽阜阳地区分离得到的19株银杏内生真菌，其中活性最强的菌株为YX5，其发酵液粗提物对肿瘤细胞EC109、人鼻咽癌HONE1和人宫颈癌HeLa的抑制率IC50分别为18.3、3.6和6.5μg/ml(缪莉,王元元,朱磊,吴正军,周如梅.四种植物内生真菌的分离及其抗肿瘤活性的筛选.微生物学通报.2009,36(6):865-869)。

[0005] 开展银杏植物内生真菌活性物质的研究，对开发我国银杏植物药用内生真菌资源及新的微生物药物均具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

发明内容

[0006] 针对上述现有技术存在的问题，本发明针对银杏内生真菌进行研究，以期获得抗肿瘤的药物或生物活性物质。

[0007] 为实现上述发明目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：

[0008] 首先，本发明公开了一株银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，已于2017年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

[0009] 其次，本发明公开了所述内生真菌的培养方法，其可在PDA培养上进行活化、培养或发酵。

[0010] 进一步的，本发明公开了所述内生真菌在制备抗肿瘤的活性药物中的应用。优选的，所述肿瘤为宫颈癌。

[0011] 此外，本发明还公开了所述内生真菌的发酵培养液、发酵培养液的乙酸乙酯提取物，其均具有抗肿瘤活性，尤其是针对宫颈癌具有治疗活性。

[0012] 本发明还公开了一种抗肿瘤活性组合物，其包含所述内生真菌的发酵培养液、发酵培养液的乙酸乙酯提取物。

[0013] 优选的，上述组合物，可以进一步包含药物学上可接受的载体。

[0014] 所说的载体是指药学领域常规的载体，如稀释剂、分散剂、稳定剂等。

[0015] 本发明取得了以下有益效果：

[0016] 本发明从银杏树皮中分离到了具有抗宫颈癌活性的银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，通过菌落形态和18sRNA测序相结合的方法，判断菌株的种属，然后利用MTT法检测菌株粗提物的抗宫颈癌活性，最后利用半制备HPLC的方法，对抑制率大于50％的菌株的次级代谢产物进行分离，有助于进一步筛选具有抗肿瘤活性的化合物单体。附图说明

[0017] 图1三株银杏内生真菌的菌落和菌丝形态，a菌株J-1；b菌株J-2；c菌株J-3；

[0018] 图2三株银杏内生真菌的系统进化树1：菌株J-1；2：菌株J-2；3：菌株J-3；

[0019] 图3菌株J-1和J-3抗宫颈癌活性的MTT检测(处理24h)

[0020] 图4菌株J-1次级代谢产物的HPLC峰形图

[0021] 图5菌株J-3次级代谢产物的HPLC峰形图

具体实施方式

[0022] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

[0023] 实施例1：银杏内生真菌的筛选及鉴定

[0024] 分离材料：银杏采自山东临沂市，取材部位为距地面2cm左右的主干树皮，厚度约3-8mm，银杏树龄30年左右，树干直径约55cm。取采集的新鲜银杏树皮，用蒸馏水将其表面洗干净，稍干后去外表皮，取其木质部内切成适宜长度的小段，在75％乙醇中浸泡6min，再用无菌水冲洗2-3次，无菌滤纸吸干。然后将其切成小块放于含链霉素和青霉素的PDA培养基上，置于25℃培养箱中培养3-20d，待组织周围长出菌丝后，将其转移至新的PDA培养基上，
25℃培养箱中继续培养。直至长出的菌落鉴定为纯菌。纯化后的菌株在10％的无菌甘油管内-80℃保存。共分离获得三株纯化的内生真菌(分别为J-1、J-2、J-3，为发明人的自命名)，每株菌取10ml发酵液，送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行18sRNA测序分析。

[0025] 三株内生真菌菌落形态如图1所示，三株银杏内生真菌的系统进化树如图2所示。菌株J-1和J-2的18sRNA与层生镰刀菌的相似度分别为99％和98％，同时结合菌落特征的结果表明，菌株J-1和J-2属于层生镰刀菌属(见图1和图2)。而J-3的18sRNA序列与层生镰刀菌属的保守序列相似度仅为97％，因此初步推测菌株J-3可能也属于镰刀菌属，但需要进一步观察孢子形态甚至利用其他分子生物学手段确认。

[0026] 实施例2：银杏内生真菌的抗肿瘤活性研究

[0027] 发酵液与菌丝粗提物的制备：挖取PDA固体培养基中培养好的三株银杏内生真菌，将菌丝块接种于装有250ml PDA液体培养基的三角瓶中,20℃、120r/min摇床培养7d。然后向每个培养瓶中按1:1的体积比加入乙酸乙酯，继续在摇床中培养4d。发酵液经3-4层纱布过滤后除菌丝体，用分液漏斗进行分层，获得含有银杏内生真菌次级代谢产物的有机相。利用旋转蒸发仪将有机相中大多数乙酸乙酯回收，得到含有银杏内生真菌次级代谢产物的浓缩液。最后，利用真空浓缩干燥器将浓缩液完全干燥，溶于DMSO中即为菌体粗提物。

[0028] MTT法检测粗提物的抗宫颈癌活性：采用宫颈癌HeLa细胞系，培养细胞的培养基：10％的新生牛血清，89％的RPMI1640完全培养基，1％的双抗(青霉素-链霉素)，在37℃下通入5％CO2的细胞培养箱中培养传代，采用MTT法测定粗提物的抗宫颈癌肿瘤活性。取对数生长期的肿瘤细胞，用胰蛋白酶消化后，用完全培养基制成细胞悬浮液，血球计数板计数，随后取100μL接种于96孔板，留出两孔做为空白对照。置于5％CO2培养箱中37℃培养48h后，加入20μL经完全培养液稀释的样品(阴性对照组加20μL培养液，空白组加入100μL的培养液，每个样品做3个重复)，继续培养2d后取出，吸取孔内培养基丢掉，每孔加入2.5μg/μL的MTT溶液20μL，37℃下反应4h后，每孔再加100μL DMSO，37℃下溶解30min；用酶标仪测量出各孔的吸光值(测量波长分别570nm)。最后按下式计算抑制率:抑制率＝(阴性对照OD值-实验组OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)×100％。

[0029] 发酵液粗提物抗宫颈癌活性测定结果(图3)显示，菌株J-1和J-3对宫颈癌细胞的抑制率分别为59.6％和59.1％，而J-2的抑制率仅为13.3％。因此选择菌株J-1和J-3进行下一步实验。

[0030] 选取抗宫颈癌活性较高的J-1菌株进行保藏，保藏名称为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，已于2017年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

[0031] 实施例3银杏内生真菌抗肿瘤活性物质研究

[0032] 半制备HPLC法分析分离银杏内生真菌次级代谢产物：色谱柱为C18柱(250mmx10mm，5μm)，流动相为甲醇-水。20％甲醇洗脱，体积流量1.0ml/min，检测波长210nm，柱温35℃，进样量100μl。根据不同菌株次级代谢产物的峰形，分离出不同的物质。再将每一种物质与宫颈癌HeLa细胞共培养，利用MTT法确定有效的抗宫颈癌肿瘤活性物质。

[0033] 采用半制备HPLC法对菌株J-1和J-3的次级代谢产物进行分离测定，分离结果如图4和图5所示，从半制备HPLC峰形图(图4和图5)上可以看出，菌株J-1和J-3的次级代谢产物不同，且都含有很多种物质。收集每一种峰形代表的化合物，进行MTT检测以确定具有抗宫颈癌肿瘤活性的单体化合物。

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