[1988]Appl.Environ.Microbiol.54：397-404;Ingram等

[1987]Appl.Environ.Microbiol.53：2420-25。Braeu和Sahm[1986a]（见上）首先证实，在过量表达运动发酵单胞菌（Z.mobilis）丙酮酸脱羧酶的重组大肠杆菌（E.coli）中，虽然产生的乙醇浓度很低，乙醇产量可以有所增加。进一步的研究扩充了此项工作。利用另外两种肠道细菌，即菊欧文氏菌（Erwinia    chrysanthemi）和植生克氏杆菌（Klebsiella    planticola），从己糖、戊糖和糖类混合物获得了较高的乙醇产量。见Tolan和Finn

[1987]Appl.Environ.Microbiol.53：2033-38，2039-44。因此，当以简单糖类为原料时，上述微生物才有应用价值。但是，我们发现，地球上大部分廉价而不绝的生物量资源不是以单糖形式，而是以木质纤维素形式存在，后者主要是纤维素、半纤维素和木质素的混合物。纤维素是葡萄糖同聚体，而半纤维素是较为复杂的杂聚体，不仅包含木糖（主要组分），而且包含相当数量的阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。据估计，利用微生物对充斥美国的废纸和生活垃圾中的糖残基进行转化后，可以提供一百亿加仑以上的乙醇。改管上述讨论的微生物可以有效地发酵木质纤维素中的纤维素和半纤维素多聚体的结构单糖，改进的木质纤维素的糖化方法仍是一个主要的研究课题。
目前糖化木质纤维素的方法包括酸水解和酶法水解。酸水解通常需要热量，而且有一些缺点。包括消耗能源，产生酸废物，以及产生毒性化合物妨碍随后的微生物发酵。因而酶法水解就是一种理想的方法。例如，酶可以直接加进包含木质纤维素原料的介质中。
通过遗传工程途径，使产乙醇或乳酸的微生物加上糖化性状，这方面的工作一直着眼于使微生物分泌高水平的酶量到培养基中。就是说，修饰已带有将细胞内产生的酶转动到发酵培养基中所需蛋白质的微生物，这样这些酶就可以作用于多糖底物，产生单糖和寡糖。所以要采用这种方法，是因为很难成功地对不能转动这些蛋白质的菌体进行改造。
因此，本发明的目的之一，就是提供有关微生物，它们在有氧和厌氧生长条件下，都能有效地将丙酮酸转入产乙醇途径。
本发明的另一目的，就是促进重组宿主生长，降低培养基中不需要的代谢产物的积累。
本发明的另一目的，就是提供重组宿主，它们能够在细胞内产生足够的多糖酶，分解葡萄糖或木糖寡聚体，使得同一宿主能够发酵这些分解产物，生成乙醇。
为了实现上述这些以及其他一些目的，依照本发明第一主领域，提供了一种非大肠杆菌（Escherichia    coli）重组宿主，其中包含编码产生乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的异源DNA。该宿主能表达其中异源DNA到足够的功能水平，使乙醇成为该宿主的初级发酵产物。
一项有利的措施是在重组宿主中使用了运动发酵单胞菌（Z.mobilis）中编码乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的基因。第一领域其他方面包括一些带有编码乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶基因的质粒，这些质粒有助于本发明中重组宿主的获得。
在本发明的第二主领域中，重组宿主除了包含编码乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的DNA外，还包含编码有关蛋白质DNA，这些蛋白质能使宿主转动和代谢某种寡糖。宿主表达该DNA达到一定水平后，宿主代谢寡糖所产生的乙醇成为初级发酵产物。该发明领域中所选的宿主包括肠道细菌，如欧文氏菌（Erwinia））和克氏杆菌（Klebsiella）。其它所选的宿主能代谢由五碳糖和/或六碳糖单体（如葡萄糖、木糖）及麦芽糖组成的双糖和或叁糖。
在本发明的第三主领域中，上述的重组宿主还包含产生一种或几种多糖酶所需的DNA。宿主产生多糖酶，随后将其释放到培养基中。这样能减少商业酶用量。这些酶能够将原料降解成为可发酵的单糖和寡糖。
编码多糖的DNA可以是宿主自身的，但在更多情形下是外来的，即异源的。有用的多糖酶包括纤维素分解酶、木聚糖分解酶和淀粉降解酶。宿主至少要能够部分地分泌多糖酶，或者多糖酶能在细胞内大量积累，随后释放出来。有利的是，细胞内积累的酶是热稳定的，当需要时，可以通过热诱导裂解而释放。异源DNA可编码不同的酶，一些酶分泌出来，一些酶积累起来。
可进行其它修饰来增进前述宿主乙醇的产生。例如，宿主还可包含其它异源DNA片段，其表达的蛋白质产物参与运输单糖和/或寡糖进入重组宿主。同样，宿主也可包含糖酵解途径中其他的基因。由此，可以取得高的乙醇得率。
本发明也提供了利用所有前述宿主生产乙醇的方法。还提供了有关处理寡糖原料的方法，可将寡糖转化成乙醇和更简单的寡糖和/或单糖。另一方面还提供了一种方法，利用本发明的转化宿主在培养基中产生乙醇，来降低培养基中酸性代谢产物的积累。此外还提供了一种方法，以增加在过量表达的运动发酵单胞菌（Z.mobilis）adhB基因的重组宿主中功能蛋白质的产生。本发明的另一方面包括有关工序设计，将含寡糖生物量发酵生成乙醇。
下面的详细描述将使本发明的其他目的、特征和优点变得显而易见。但是必须了解，发明的详述和实施例，在表明本发明优先使用范围的同时，仅仅是以例证说明的方式给出，因为在本发明的主旨和范围内，各种改变和修改对于本领域行家，都是显而易见的。
图1示包含运动发酵单胞菌中（Z.mobilis）编码丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶Ⅱ基因的质粒pLOI295的构建。缩写说明：RI，EcoRI;H，Hind    Ⅲ;B，Bam    HI;t，终止子;adh，运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶Ⅱ;pdc，运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶;cat，氯霉素酰基转移酶;Ap，β-内酰胺酶;Zm    Pro    frags，具有启动子活性的运动发酵单胞菌DNA片段;Col    E1，衍生自    pBR322的复制起点;ori    V，衍生自RSF1010的复制起点;Plac，乳糖操纵子启动子;Pzm，运动发酵单胞菌的启动子;P？，载体上隐秘启动子;kb，千碱基。
图2示包含编码运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶Ⅱ基因的几个质粒。
图3示菌株TC4及其包含编码产乙醇酶类质粒的重组子的生长和产酸。
图4示重组宿主丙酮酸脱羧酶活性和生长程度的关系。24小时生长后的细胞量以550纳米处光密度值（O.D.550）表示。
图5示pLOI    510的构建。
图6示欧文氏菌和克氏杆菌产乙醇重组子发酵纤维二糖产生的乙醇浓度。
图7A、7B和7C示包含xyn    Z和xyl    B基因的重组质粒的构建。
图8A和8B示利用大肠杆菌（E.coli）KO11（pLOI2003）水解木聚糖的薄层层析分析结果。细菌在45℃（图8A）或60℃（图8B）培养于包含4%桦木木聚糖的Luria肉汤培养基中（pH6.0）。
图9A和9B示重组大肠杆菌KO11（图9A）和催娩克氏杆菌（K.oxytoca）M5A1（图9B）利用寡聚木糖的生长情况。
图10A和10B示重组催娩克氏杆菌（K.oxytoca）M5A1转化木糖和木聚糖水解物成为乙醇。图10A示生长，图10B示乙醇产生。
图11A和11B示通过重组催娩克氏杆菌（K.oxytoca）M5A1菌株产生乙醇。图11A示菌株M5aI（pLOI555），带有整合的pet基因菌株P2，带有整合的pet基因菌株B1。利用葡萄糖（100克/升）生成乙醇，图11B示通过菌株P2从纤维二糖（100克/升）发酵产生乙醇。
图12示经120小时后，加入商品纤维素酶对从SOLKA    FLOC    SW40（50克/升）产乙醇的量的影响。
图13A、B和C示利用菌株P2（pCT    603T）水解和发酵纤维素后的薄层层析分析结果。图13A，酸涨纤维素;图13B，碱涨纤维素;图13C，晶状纤维素。
图14示用cel    D基因产物预处理和利用1%纤维素酶对乙醇产生的促进作用，结果与用5%CYTOLASE处理相同。
图15示质粒pLOI140和pLOI141的构建。它们包含来自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus    stearothermophilus）的α-淀粉酶基因和热厌氧细菌（Thermoanaerobinm    brockii）的支链淀粉酶基因。
图16A和B分别示KO11发酵葡萄糖和麦芽糖的乙醇产生和细胞量。
图17示重组大肠杆菌（E：coli）KO11（pLOI140）和KO11（pLOI141）淀粉发酵之结果。（因两者结果基本相同，只显示了KO11（pLOI141）数据。）图18示发酵过程中（72小时），KO11（pLOI141）玉米淀粉发酵的薄层层析分析结果。
图19为根据本发明进行的发酵过程示意图。
Ⅰ.常规碳水化合物代谢在大多数动物和植物以及细菌、酵母和真菌中，葡萄糖在进行氧化或发酵代谢之前，先要通过厌氧途径降解。最普通的这种途径称为糖酵解，包括一系列酶促步骤，通过形成许多中间产物将六碳葡萄糖分子，分解成两分子的三碳化合物丙酮酸。在此过程中，两分子的NAD+还原成NADH。葡萄糖转换成丙酮酸过程的净反应为：葡萄糖+2Pi+2ADP+2NAD+→2丙酮酸+2ATP+2NADH+2H+为使糖酵解继续进行，此过程消耗的NAD+必须通过NADH氧化再生。氧化代谢过程中，NADH通常经过一系列步骤把氢递给氧而形成水。但是大多数有机体包含另外的厌氧途径，使糖酵解过程在氧气等不存在时得以继续。这种厌氧过程称为发酵，而单纯乳酸发酵可能是许多细菌和动物中最常见的厌氧发酵途径之一。在单纯乳酸发酵过程中，葡萄糖最终转化为两分子的三碳酸乳酸。NADH被氧化，其氢传递给丙酮酸，生成乳酸。乳酸发酵再生NAD+过程净反应为：2丙酮酸+2NADH→2乳酸+2NAD+如前所述，产乙醇生物如运动发酵单胞菌和啤酒酵母，它们具有另一条（乙醇）发酵途径，葡萄糖由此代谢生成两分子乙醇和两分子二氧化碳。乙醇发酵与乳酸发酵不同点在于再生NAD+的步骤。乙醇发酵需两个不同的步骤。丙酮酸脱羧酶使丙酮酸分解或乙醛和二氧化碳。乙醇脱氢酶将氢从NADH转到乙醛，而再生NAD+，并产生乙醇。乙醇发酵再生NAD+过程反应为：2丙酮酸→2乙醛+2CO22乙醛+2NADH→2乙醇+2NAD+净反应：2丙酮酸+2NADH→2乙醇+2CO2+2NAD+编码每种酶的DNA已分别克隆，并且运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶已通过重组方法表达。如参见Braeu和Sahm[1986a]（见前）。但是，并不能确定，在不产生乙醇作为初级代谢产物的生物（“非产乙醇生物”）中，糖酵解途径是否能在丙酮酸阶段大幅度转向，即使能够在某种程度上修饰这种生物，使其表达乙醇发酵所需的两种酶。
相反，有人认为这种转向也许会使重组宿主发生丙酮酸及其正常产物饥饿。见Braeu和Sohm[1986a，b]（见前）。还有一种可能性，就是在本来不产生乙醇的生物中，从糖酵解转到产乙醇过程的碳的转向，可能会打乱对相互关联的产能途径和生物合成途径至关重要的NAD/NADH比例。
Ⅱ.按照本发明的发酵但是，已经发现可对进行糖酵解或类似过程的生物进行遗传工程改造。按照本发明，通过改造，在丙酮酸阶段，糖酵解过程95%的碳会转向一实质上的合成途径。该途径包含由异源丙酮酸脱羧酶（pdc）和乙醇脱氢酶（adh）基因编码的两种酶。结果产生一种遗传工程菌，其产生乙醇作为它的初级发酵产物。就是说，产生的乙醇超过总的发酵产物的50%。
另外发现，可以选择宿主来进行这种异源表达，依靠宿主本身转运和代谢寡糖的能力，它们能够发酵更复杂的原料。（本文中，“寡糖”指一种分子，其包含两种或更多的糖单体。包括但不限于双糖如纤维二糖、麦芽糖和木二糖，叁糖如纤维叁糖和木叁糖，及长链的多糖如纤维素、半纤维素、淀粉、糖原、果胶和菊粉。）这样选择和转化的宿主，其能力可进一步扩充，即可通过在同一宿主中表达一种或几种编码多糖酶的基因，多糖酶能催化复杂的寡糖分解或较小的寡糖和/或单糖。
（A）通过遗传工程产生人工产乙醇途径：本发明的一个重要方面是一个能使细胞产生乙醇的操纵子。本发明的一个构建体是这种操纵子的一个示例，称为“pet操纵子”。它包含运动发酵单胞菌分别编码乙醇脱氢酶Ⅱ和丙酮酸脱羧酶活性的基因，以及相应的调节序列，如启动子、操纵基因、核糖体结合部位和转录终止子。这样，通过联合运动发酵单胞菌编码乙醇脱氢酶Ⅱ和丙酮酸脱羧酶基因构成一个pet操纵子，摒弃了以前重组系统中的依赖内源乙醇脱氢酶产生乙醇的方式。而且，在有氧和厌氧条件下，包含pet操纵子的重组子都能产生大量的乙醇。
为了赋予微生物产生多糖酶（如木聚糖酶和纤维素酶）的能力，可加上编码所需酶的基因以修饰本发明的产乙醇操纵子。或者，可将一种或几种多糖酶编码基因组入质粒，转化已经带有指导乙醇产生的操纵子（如上所述）的宿主。（本发明这方面内容详见下面第二节（E）。）通过另一种途径，可选择本身具有表达多糖酶的能力的宿主作为转化产乙醇操纵子的宿主。还有一种方法是将外加的多糖酶基因整合到染色体中。
在单一的构建体中，把编码一代谢途径的酶的基因组合在一起，这一方法普遍适用于不同情形，可把来自不同座位的基因装到一起，构成一人工操纵子。这样，pet操纵子的构建，只不过是本发明应用的一个例子。例如，来自不同生物的编码乙醇脱氢酶的基因，可与其它编码丙酮酸脱羧酶的基因组合在一起，以构建编码所需途径的操纵子。编码其它途径的操纵子也可以构建。同样明显的是，对于上面讨论的产乙醇途径，编码乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的基因不必受共同控制;它们可受分别的控制，甚至位于不同的质粒或位于染色体上不同位置。同样，编码多糖酶的基因可受共同的或分别的控制，或位于不同质粒，或在染色体不同位置上。
本发明另一方面涉及利用产乙醇重组宿主来有效地产生重组多肽或蛋白质，就是说，重组子细胞可进一步用编码有用产物（非多糖酶）的基因转化（这些另外的基因可位于质粒上，或整合到染色体中）。
尤其是，编码产乙醇酶的基因通常高水平地表达，在厌氧生长时，支配自丙酮酸和NADH氧化的碳流。在这样条件下，丙酮酸碳架的流动可从产有机酸转向产乙醇，作为主要的发酵产物。
这样，每单位细胞蛋白酸化的程度，通过乙醇的产生而不是有机酸的产生，降到最低程度。在微生物密集的培养物中生长的过程中，氧气的转移常常是一主要的限制因素。正是由于这一限制，导致培养养基中酸的产生和pH值变化。与此相反，本发明中，表达产乙醇操纵子的重组体中，异源的产乙醇酶能将部分丙酮酸从糖酵解转向产乙醛，再氧化NADH产生乙醇，一种损害较小的代谢产物。这样，包含氧化磷酸化功能呼吸链和乙醇产生酶类的菌株，甚至可以生长达到更高的细胞密度，因为在再生NAD+和降低酸性废物产生的过程中这两个系统均起作用。这种内在的变化的结果是对流程控制要求较少并增加重组产品的容积产量。
从其它方式产生的有机酸的积累被认为是在厌氧生长过程发酵的结果。但是即使在有氧条件下，也会产生可观量的乙酸。这样，乙酸可能从生长最初阶段就逐渐产生，并不限于后期，后期细胞密度很高，厌氧条件占主导。从葡萄糖产生的酸，即使在有氧条件下，也会限制在液体和固体培养基中的生长，这可由在含磷酸缓冲液的培养基中最终细胞密度的增加来显示。
因此，本发明的产乙醇转化子，也是生产重组产物的好的宿主，它即使在厌氧条件下，也只伴随产生最低限度的酸。许多重组蛋白质和多肽包含半胱氨酸或二硫键，其适当的折叠或反应为形成有活性的酶所必需。由于氧促进二硫键的形成，因此在厌氧条件下合成的这类蛋白质，在分离和在控制条件下折叠之前，较少有机会不正常折叠，由此可回收较多的有生物活性的产物。
将adh    B用于这些构建体可能具有特别的优越性。AdhB编码一种逆境蛋白质（An等

[1991]FEBS    LETTERS    282：205-208）。业已表明逆境蛋白质有助于异源蛋白质的适当折叠以保留其生物活性。（Lee等.

[1992]J.Biol.Chem.267：2849-2852）。因此使用adh    B可能增进重组生物中有功能蛋白质的产生。有氧条件下，大肠杆菌中糖酵解产生的丙酮酸主要由丙酮酸脱氢酶复合体和乳酸脱氢酶代谢，多余的乙酰辅酶A被转化成乙酸。见Gottschalk著BACTERIAL METABOLISM pp.210-80（Springer-Verlag 1986）。这两种酶的表观米氏常数Km值分别是0.4和7.2mM。运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶的表观Km值与大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的相等，而低于乳酸脱氢酶表观Km值，这样有助于乙醛产生。有氧条件下NAD+的再生主要来自于生物合成和NADH氧化酶（与电子传递系统偶联，其表现Km值为50μM）。运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶Ⅱ表现Km值比大肠杆菌NAD+氧化酶表观Km值要低四到五倍，使得运动发酵单胞菌该酶能有效地竞争内源NADH库，以还原乙醛成乙醇。由此，运动发酵单胞菌产乙醇酶类的性质及其相对高水平的表达非常适合于在有氧条件下使碳流转向生成乙醇。
厌氧条件下，大肠菌杆中糖酵解产生的丙酮酸主要由乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂合酶代谢。该两种酶的表观Km值比运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶表观Km值分别高18倍和5倍。类似地，大肠杆菌中参与NAD+再生的主要酶类其Km值也都显著高于运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶Ⅱ的表观Km值。这样，与大肠杆菌正常的发酵酶类和氧化磷酸化相比，来自运动发酵单胞菌的产乙醇酶类对碳（丙酮酸）和还原力（NADH）具有相当的竞争力，使得糖酵解产物有效地流向产乙醇途径。
已经发现，乳糖和存在于纤维素和半纤维素中的主要糖类（即葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖），根据本发明，均可被能够表达产乙醇酶类（如组成上面讨论的运动发酵单胞菌乙醇途径的酶）的重组宿主转化成乙醇。
在选择适合按照本发明进行乙醇生产的宿主菌株时，必须考虑种种因素。这些因素包括底物范围和对环境的耐受性如耐糖性、耐盐性、耐乙醇性、耐低pH性及耐热性。例如，如下所述，大肠杆菌菌株ATCC9637（Waksman    W株）表现出优越的环境耐受性，尽管从葡萄糖产生的乙醇量低于其他菌株。选择菌株ATCC    9637主要是因其具有利用蔗糖的独特能力。有利的是，ATCC    9637此特性使该菌株得以用于发酵甜菜糖、甘蔗糖和其它含蔗糖原料。ATCC    11303（Luria    B株）和ATCC    15244（Kepes    ML300株）包含pLOI    297时，产生出最高水平的乙醇，并表现出可接受水平的环境耐受性。在这两个构建体中，质粒相当稳定，它们被选为最佳候选菌株以进一步改进乙醇产量。两构建体都高水平表达有效产生乙醇所需的运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶。见Ingram等（1987）。
包含来自运动发酵单胞菌乙醇途径的重组大肠杆菌，能将植物生物量中所有主要糖分转化成乙醇。其葡萄糖和木糖转化成乙醇的效率高于以前报道的啤酒酵母，见Lovitt等（1988）CRC    Crit.Rev.Biotechnol    7：107-186，和戊糖发酵酵母系统。见Back

[1989]Biotechnol.bioeng.Symp.17：617-627;Jeffries等

[1988]Biotechnol.Bioeng.31：502-506;Skoog等

[1988]Enzyme    Microbiol    Technol    10：66-79;Slininger等

[1985]Biotechnol.Lett    7：431-436）。重组大肠杆菌转化木糖成乙醇的效率高于啤酒酵母转化葡萄糖的效率，如Lovitt等报道（见前）。用木糖发酵获得不寻常的高乙醇得率（超过理论值的100%），这可能归结于复合营养基质的分解代谢产生了乙醇。许多氨基酸和复合培养基组分可分解代谢成糖酵解中间物或丙酮酸。这样生成的丙酮酸然后可被转化为乙醇。根据本发明，pdc和adh基因可转化进入种种不同宿主，用不同启动子表达。本领域中受过训练者很容易进行这些转化。例如，可容易地将pdc和adh基因插入具有不同宿主范围的各种质粒。构建的能在大肠杆菌和另一种目标生物中复制的质粒特称为“穿梭载体”，因其能在两种或更多宿主中复制。这些质粒便于得到，易于使用。大多数常见的穿梭组合为大肠杆菌与其他细菌，大肠杆菌与酵母及大肠杆菌与动物细胞。这些载体可见于产品目录，且为本领域行家熟知。
运动发酵单胞菌pdc和adh基因已被插入黄单胞菌（Xanthomonas）、克氏杆菌（Klebsiella）和欧文氏菌（Erwinia）并在其中表达。在其它生物中也可容易取得类似结果。虽然可能需要进行一些直接修饰如改造启动子以产生最适构建体，但根据可溶性细胞质蛋白质的生化性质及当前有关其表达的知识，取得成功是在预料之中的。表达改变丙酮酸代谢所需酶活性的外源基因，依照本发明，甚至可以整合到染色体中，不需要质粒就能表达。见第二节（C）（见下）。例如缺乏启动子的pet基因构建体可以整合到大肠杆菌染色体中，刚好位于丙酮酸甲酸裂合酶基因（pfl）启动子之后。类似地可整合到大多数生物中pfl或其它基因中，这只需要一段这些目标基因的片段来决定通过同源重组而整合的位点。除pfl基因，其它目标基因也可用于整合。因为在指示平板上可容易地鉴别表达pet的构建体，这一方法广泛地适用于快速有效地构建其他生物体，用于乙醇生产。
有许多教科书描述表达外源基因的步骤。产品目录也列出有关载体，可用于不同生物体。用于革兰氏阴性细菌克隆载体，革兰氏阳性细菌克隆载体，具广泛宿主能力的载体，真菌克隆载体，昆虫克隆载体，动物细胞克隆载体，和植物细胞克隆载体，这些都为本领域行家所熟知。有关产品目录很容易得到，从中可预定这些克隆载体，这已为本领域内行家所熟知。例如，参见Marino

[1989]BioPharm    2：18-33;VECTORS：A    SURVEY    OF    MOLECULAR    CLONING    VECTORS    ANO    THEIR    USES（《载体：分子克隆载体及其应用概览》）（Butterworths    1988）。利用上面提到的运动发酵单胞菌基因为探针，或更好一点，通过在指示平板上观察活性，以此为鉴定，熟练操作者还可获得其它来源的pdc和adh基因或其它与之类似的基因。为达到本发明之目的，编码乙醇脱氢酶活性的基因来源并不要紧，无论是分离自马、酵母、人、昆虫，还是其它细菌。由于乙醇脱氢酶活性的表达可以直接从乙醛指示平板上观察到，因此不需要有关顺序资料，来分离编码具此酶活性的蛋白质的其它基因。的确，许多乙醇脱氢酶基因已为本领域行家熟晓，以为佐证，至1991年3月，Genbank数据库中列举了252种adh基因（IntelliGenetics    Inc.，700    E.El    Camino    Drive，Mountain    View，CA    94040）。
运动发酵单胞菌包含两种编码有功能的乙醇脱氢酶的基因，其中一种adh进化上与下列基因相关：丙酮丁醇梭菌（Clostridium    acetobutylicum）丁醇脱氢酶，大肠杆菌丙二醇氧化还原酶，和酵母乙醇脱氢酶ADH    IV。所有这些基因都已被克隆并测定序列。运动发酵单胞菌另一种乙醇脱氢酶基因adh    A是一种锌乙醇脱氢酶，也已被克隆并测定序列。根据上与动物和植物的典型的乙醇脱氢酶基因及酵母中占优势的adh基因有相关。adhA基因和其它乙醇脱氢酶基因可代替于此说明的原先的adhB基因。
由于同样的原因，为达到本发明的目的，编码丙酮酸脱羧酶活性的基因来源也无关紧要，无论其来自运动发酵单胞菌，还是来自玉米，酵母或某些其他生物体。生命形式是从共同的祖先进化而来，这已广为接受，并通过分子遗传学方法详尽地予以说明。不仅生物体可以根据其宏观特征排列成系统进化树，而且在进化过程中，进化产生的具特定功能的祖先基因保留有这些功能所需的保守特征。这种高度保守性使本领域行家能够利用酶家族的一个或多个成员的原始信息，从其它生物体中分离出功能相同的、遗传上相关的酶。糖酵解酶类就属于这方面最好的例子，因为这些酶已被广泛研究。
的确，就是利用这样的方法，根据运动发酵单胞菌pdc和啤酒酵母pdc有关资料设计DNA探针，成功地从玉米中分离出丙酮酸脱羧酶基因。参见Kelly

[1989]Plant    Molecular    Biology    13：213-22。其它方法也可用整个基因作探针。由于具丙酮酸脱羧酶活性（丙酮酸转化成乙醛及二氧化碳）的蛋白质的合成可以直接从乙醛指示平板上观察到，并不需要序列资料来找出其它基因，尽管利用了序列资料来分离玉米基因。许多具有同样功能的丙酮酸脱羧酶基因可以从其它生物体中分离出来。这些基因可能适于代替运动发酵单胞菌的pdc基因，就正象有几种乙醇脱氢酶基因已证明有此类似功能。至1991年3月，GenBank数据库列举了至少5种pdc基因。作为进一步的改进，本发明中的一种重组宿主可用运动发酵单胞菌中编码葡萄糖转运的关键组分的基因，即编码运动发酵单胞菌葡萄糖激酶（glk）和葡萄糖协助扩散蛋白（glf）的基因转化。特别是，glk和glf可以组合到一个人工操作纵子中，如上述的产乙醇操纵子pet，并转化到已带有pet操纵子的重组体中。glk/glf操纵子的表达将导致过膜葡萄糖流量增加，由此导致乙醇产率增加。同样，其它宿主中编码寡糖转运功能的关键组分的基因，或编码糖酵解途径的关键组分的基因，按照本发明，也可用来进一步转化宿主。可以预计，用编码流通过程限速步骤的基因转化宿主后，将增加乙醇产率，提高作为生物合成骨架来源的糖酵解中间物的水平。
（B）发酵参数：按照本发明，异源的产乙醇基因的表达水平有利于重组宿主发酵产生乙醇。如上所述，将异源的产乙醇基因插入合适的不能产生乙醇的宿主后，转化的宿主可以利用纤维二糖、纤维三糖、木二糖和木三糖等寡糖产生相当数量的乙醇。如下所述，本发明中的重组宿主所产生的乙醇浓度为1M，高的可达1.5M。
（C）外源基因整合进入染色体：同质粒携带相比较，外源基因整合在染色体上有几方面的好处。质粒构建体在商业方面有许多限制。与染色体基因相比，质粒构建体本身较不稳定，而且是一种环境公害，一种转移异源性状的库源。质粒构建体的不稳定性常由于多种质粒的加入而加剧。尽管如此，由于能够容易地转化宿主细胞，质粒构建体在异源基因表达的初始实验中非常有用，例如编码纤维素酶的基因。但是为了方便所需蛋白质（例如，一种纤维素酶）的筛选，常常需要用染色体整合的基因来替代质粒携带的产乙醇基因，就象本发明中所示。产乙醇基因已经被整合在大肠杆菌B株（E.coli    B）的染色体上，见Ohta等（1991）Appl.Environ.Microbiol.57：893-900。总而言之，先要纯化一个DNA片段，它包括位于氯霉素基因上游的目的基因和来源于受体细胞的一段同源DNA片段。这个DNA片段连接形成没有复制子的DNA环后用来转化受体。这样，在大肠杆菌（E.coli）中，pfl基因可作为受体基因，克氏杆菌（Klebsiella）中短的随机的Sau    3A酶切片段可在连接后用来促进同源重组。
用20毫克/升的氯霉素（Cm）平板让单拷贝整合的重组子生长来初筛重组子。重组子获得的频率可能非常低。乙醇产生基因刚开始的表述可能非常低，不足以有效地发酵乙醇。高水平的表达可通过在600-1000毫克/升氯霉素的平板上一次性筛选而获得。这样获得的菌株非常稳定。可以预见，这种方法在更合适的克氏杆菌（Kebsiella）和欧文氏菌（Erwinia）菌株中同样能成功地使用。对一些野生型菌株的初步试验表明，电穿孔法能增加质粒的转化率但可能降低染色体整合的频率。（见下述实施例16）。
（D）宿主选择：如上所述，适合于用来表达异源pdc和adh基因的生物包括真核细胞、非天然产乙醇的酵母和不能产生乙醇的细菌，真核细胞例如有动物细胞、昆虫细胞和真菌细胞。例如，除了大肠杆菌（E.coli）以外，其它属的肠道细菌，如欧文氏菌属（Ewinia）的菊欧文氏菌（E.chrysathemi）和克氏杆菌属（Klebsiella）的植生克氏杆菌（K.planticola）和催娩克氏杆菌（K.oxytoca），都是特别有吸引力的宿主，因为它们能利用许多不同的糖类，包括戊糖。有优势的宿主还可以从更广的范围内来选择，革兰氏阴性菌中例如黄杆菌属（Xanthomonas）的菌种，革兰氏阳性菌中例如芽孢杆菌属（Bacillus）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）和纤维单胞菌属（Lellulomonas）中的菌种。上述不同种类的宿主都可用适当的转化方法转化。按照本发明，前述微生物中的某些种类也具备了将寡糖发酵为乙醇的宿主的条件。更具体地说，如果（1）能产生将寡糖转移进入细胞所必需的蛋白质和（2）能代谢寡糖的位于细胞内（细胞质）的酶，那么这种微生物可以被选作宿主。前述的符合这些条件的微生物包括肠道细菌中的菊欧文氏菌（E.chrysanthemi）和其它欧文氏菌、克氏杆菌属（klebsiella）的催娩克氏杆菌（K.oxytoca）和植生克氏杆菌（K.planticola）。催娩克氏杆菌自身产生β-木糖苷酶。某些大肠杆菌（E.coli）也满足这些标准，因为它们能运输和代谢纤维二糖、麦芽糖和（或）麦芽三糖。例见Hall等（1987）J.Bacteriol.169：2713-17。
按上述标准（1）和（2），可以在较宽的范围内选择宿主，例如革兰氏阴性菌中黄杆菌属（Xanthomonas）的菌株和革兰氏阳性菌中的属于芽孢杆菌属（Bacillus）的短小芽孢杆菌（B.pumilus）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和凝结芽孢杆菌（B.coagnlans），属于梭芽孢杆菌属（Clostridium）的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌（Cl.acetobutyricum）、耐气梭状芽孢杆菌（Cl.aerotolerans）、热纤梭状芽孢杆菌（Cl.thermocellum）、热氢硫化物梭状芽胞杆菌（Cl.thermohydrosulfurium）和热解糖梭状芽孢杆菌（Cl.thermosaccharolytium），属于纤维单胞菌属（Lellulomonas）的潮湿纤维单胞菌（C.uda）、丁酸弧形纤维单胞菌（C.butyrivibrio）和溶纤维纤维单胞菌（C.fibrisolvens）。可作宿主的酵母中有隐球酵母属（Cryptococcus）的白色隐球酵母（C.albidus）、属于念珠菌属（Monilia）的种，树干毕赤氏酵母（Pichia    stipitis）和出芽短梗孢糖芽霉菌（Pullularia    pullulans）。可作宿主的其它能代谢寡糖的细菌还包括但不限于产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides    succinogenes）、热厌氧杆菌属（Thermoanae-robacter）的乙醇热厌氧杆菌（T.ethanolicus）、热厌氧细菌属（Thermoanaerobium）的热厌氧细菌（T.brochii）、热拟杆菌属（Thermobacteroides）的丙酮乙烯热拟杆菌（T.acetoethylicus）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）的生黄瘤胃球菌（R.flavefaciens）、高温单孢菌属（Thermonospora）的高温单孢菌（T.fusca）和醋化弧菌属（Acetivibrio）的溶纤维醋化弧菌（A.cellulolyticus）。所有这些不同的宿主均已有适当的转化方法。
与符合宿主标准的微生物相关的文献例见Biely（1985）Trends    in    Biotech.3：286-90、Robsen等（1989）Enzyme    Microb.Technol.11：626-44和Beguin（1990）Ann.Rev.Microbiol.44：219-48。这些文献各自的内容在此以参考文献的形式整入本文。本领域行家将发现，许多其它宿主适用于本发明。因此，通过试验微生物是否能转运和代谢寡糖就能选择出合适的宿主。这样的筛选可用多种方法来实现。例如，通过试验能否在合适的寡糖底物上生长，那些不仅仅是能将单糖转动进入细胞的微生物可被筛选出来。例见上述Hall等（1987）。另外，可以通过测定细胞内酶（如β-木糖苷酶）的活性来筛选宿主。
适用于本发明的一个筛选示例是用包含果胶的基本培养基从腐烂的植物材料中分离出致软腐的欧文氏菌（Erwinia）菌株。见Star，“The    Genus    Erwinia”载于PROKARYOTES    第二卷，1260-71页（Springer-Verlag    1981）。能在钙稳定的果胶中形成纹孔的分离菌株可进行进一步的鉴定。见《伯杰氏手册》第一卷，469-76页。
合适的克氏杆菌属（Klebsiella）菌株例如可从佛罗里达州的Peny和Palatka等地加工植物的废溪中获得。克氏杆菌（Klebsiella）在废纸浆中极为丰富（Huntley等（1976）J.Water    Pollution    Control    Federation    48：1766-71;Knittel等（1977）Appl.Environ.Microbiol.34：557-63）。在这些废物中大量克氏杆菌（Klebsiella）的存在将促进筛选具有抗毒性化学品和能利用寡糖这些优点的特别有用的菌株。这些菌株可通过在特异的筛状培养基上的生长进行初筛，见Seidler“克氏杆菌属（非医学方面）”《原核生物》PROKARYOTES第二卷1166-72。进一步可通过吲哚产生、Voges-Proskauer反应和柠檬酸等来鉴定。见《伯杰氏手册》第一卷，461-65页。
分离的克氏杆菌（Klebsiella）和欧文氏菌（Erwinia）可在pH6.0（30℃）的平板上来比较它们降解模式底物的能力。模式底物包括羧甲基纤维素木聚糖兰、甲基-伞形糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷、甲基-伞形糖基纤维二糖、甲基-伞形糖基木糖苷和甲基-伞形糖基阿拉伯糖苷，降解所需的相应的酶是内切葡聚糖酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶。菌株也可通过其代谢单糖（己糖和戊糖）和纤维二糖、纤维三糖、木二糖和木三糖的能力而被筛选。可用薄层层析的方法来测定过夜试管培养物中二糖和三糖被利用的水平。用热纤维梭状芽孢杆菌（C.thermorellum）的木聚糖酶处理桦木的木聚糖（sigma公司）后，可产生木糖苷酶。
使用同筛选大肠杆菌B株（E.coli    B）基本相似的方法，可进一步筛选出耐乙醇、耐卤和耐温的有前途的菌株。见Altenhum等（1989）Appl.Environ.Microbiol.55：1943-8;Beall等（1991）Biotechnol.&    Bioeng.38：296-303。虽然大多数分离菌株在液氮中冰冻保存，每一组中最有希望的三个菌株被选出来作进一步操作。保存的菌株可作为新的多糖酶基因的来源，在以后的研究中非常有用。
最佳的菌株应该保留有效利用所有木质纤维素组分（二糖、三糖和单糖）的能力，能在大于440克/升的乙醇浓度中生长，能耐受0.3M的盐水平，能耐受0.2M的乙酸，能耐受40℃高温以及能产生高水平的分解纤维素、半纤维素和果胶的酶并具最少的蛋白酶活性。某些菌也可能包含有内源的木聚糖酶和纤维素酶。外源的产乙醇基因整入后，最适的构建体应该可以利用所有试验过的糖产生乙醇，达到理论得率的90%以上，并且保持上述有用的性状。
进一步的研究可估算分泌的纤维素酶的最适pH值和温度并测定热稳定性。这些资料将有助于设计将水解和发酵过程合为一体的最适条件。
（E）异源多糖酶的表达：如上所述，本发明的一项优先措施，是考虑产生能表达异源多糖酶的重组子，以便降低寡糖发酵物中商业酶的需要量。多糖酶例如包括纤维素裂解酶、半纤维素裂解酶、木聚糖裂解酶和淀粉降解酶。
其中一项有利措施是，多糖酶是热稳定的。从这点上考虑，热纤维梭状芽孢杆菌（Clostridium    thermorellum）中的嗜热蛋白基因（cel    A、B、C和D）可分别在细胞质中高水平表达。发酵结束后收集细胞，将这些细胞加热到它们几乎具有最大活力和良好稳定性的温度（如60℃）以便将热稳定的酶从细胞中释放出来，这样就可以收集到重组产生的酶。然后，这些酶可用来在预定的时间内（如12小时）对复合多糖底物起作用。去掉目的基因的信号肽部分，大大增加它们在大肠杆菌（E.coli）中的表达活力，并且可能在克氏杆菌（Klebsiella）和欧文氏菌（Erwinia）有相似的效果。
本发明特地使用cel    D基因。本发明中用cel    D转化得到的重组子可以用来发酵SOLKA-FLOC，一种将纯化的木浆机械粉碎后得到的粉状纤维素产品。如下实施例18和图14所示，同没有cel    D基因的重组子相比较，预先用cel    D编码的酶水解底物可将商业纤维素酶用量减少约五分之一。按照本发明，用在细胞内累积的异源表达的酶，快速起动复合底物糖化过程，这种方去可用于任何用多糖酶基因转化的产乙醇重组子，其回收的表达产物可用来裂解复合寡糖（纤维素、半纤维素、淀粉、糖原、果胶、菊粉等）。见下实施例17-19。
这样，前一步发酵的细胞可用来作为后一步发酵过程所需的酶的来源。另外，也不需要酶向外分泌，而利用酶在细胞内的累积来回收。刚开始就会出现高水平表达的酶，而不是在生长和发酵过程中缓慢累积。而且微生物污染的危险很小，因为能利用寡糖的微生物很少，所以很少有污染的微生物群落来竞争这些糖。
另一项有利措施是，如上所述的产乙醇重组子表达的多糖酶至少能部分分泌到细胞外催化细胞外复合寡糖的水解。这样的基因的产物，例如cen    A基因的产物内切葡聚糖酶和cex基因的产物外切葡聚糖酶，可以增加在糖化和乙醇生成过程中常规添加的一种或多种酶的活力。适用于这种用途的编码多糖酶的基因是粪肥纤维单胞菌（lellulomonas    fimi）中的纤维素酶基因，当转化进入克氏杆菌（Klebslella）和欧文氏菌（Erwinia）中时，能向细胞外部分分泌（约50%到60%）。在一个用cex基因转化的欧文氏菌（Erwinia）实验室菌株中，超过50%的异源表达产物分泌到了培养基中。
分泌的效率可通过分别同克氏杆菌（Klebsiella）中的支链淀粉酶和欧文氏菌中的果胶酸裂解酶的信号顺序相融而提高。见Murooka（1990）Ferment.Technol.Ind.Appl.40-50、Pugsley等（1990）Ann.Rev.Genetics    24：67-90、He等（1991）Proc.Nat′l    Acad.Sci.USA88：1079-83和Saarilahti等（1990）Gene    90：9-14。
本发明中特别令人注意的是既能表达热稳定的基因产物又能表达可分泌的基因产物的产乙醇转化子。这种转化子既有裂解，酶的活力，在预处理时能将纤维素或其它复合底物裂解成为寡糖和单糖，又有分泌酶的活力，在发酵过程中不断使底物解聚。
在特殊情形下，具有异源基因和能引起自身性状过量表达的突变或遗传修饰的宿主是非常有用的。例如，可在欧文氏菌中通过突变而筛选能提高内源内切葡聚糖酶表达水平的菌株。某些情况中，内切葡聚糖酶被高浓度的葡萄糖所抑制。在葡萄糖-羧甲基纤维素平板上可筛选到去抑制的突变体，这些突变体已不受葡萄糖浓度所控制，其中有些菌株还可能过量表达内切葡聚糖酶。
本领域行家知道，根据本发明这一方面，可以利用许多不同的多糖。同样，根据本发明这一方面，许多转化载体均可使用。进行必要的常规实验可选出最佳配合的宿主和载体。例如，可构建质粒RSF1010衍生的载体，见Conway等（1987C）Appl.Environ.Microbiol.53：235-41，其宿主范围广的性质可允许将异源基因引入许多革兰氏阴性菌中，包括所有的欧文氏菌和克氏杆菌，其选择标记是四环素抗性。与此相反，puc衍生的质粒在某些欧文氏菌中不稳定，因此，puc衍生的质粒比RSF1010衍生的质粒使用得少。
其它适用于本发明的多糖酶基因包括编码下例任何一种具有纤维素裂解活性的酶的基因：
内切葡聚糖酶随机水解β-1，4，糖苷键。它不能作用于纤维二糖，但是可以水解纤维糊精、磷酸发胀的纤维素和纤维素替代品如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素。某些内切葡聚糖酶也能作用于晶状纤维素。
相反，纤维二糖水解酶作用于纤维素，具体是从链的非还原端切下纤维二糖单位。纤维二糖水解酶水解纤维糊精，但不水解纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖和纤维寡糖生成葡萄糖，但不能作用于纤维素和高聚的纤维糊精。
除了上述的热纤维梭状芽孢杆菌（C.thermocellum）中编码纤维素酶的基因外，其它编码纤维素裂解活性的基因也有描述。例见Beguin（1990）Ann.Rev.Microbiol.44：219-48，其内容特以参考文献的方式列入本文。这些基因甚至可以通过GenBanK的数据库更容易地得到。到1991年3月为止，GenBank的数据库中包括13个内切葡聚糖酶基因、3个纤维二糖水解酶基因和3个β-葡萄糖苷酶基因。
同样，按照本发明，编码木聚糖裂解酶的基因可如上所述地被使用。特别是编码内切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和乙酰木聚糖酯酶等木聚糖水解酶类的基因。示例如热纤维梭状芽孢杆菌（C.thermocellum）的xynZ基因和溶纤维丁酸弧菌（Butyvivibrio    fibrisolvens）的xylB基因的各自的编码产物，这两个基因都在产乙醇的转化子中表达，如下所述（见实施例17）。同样，编码木聚糖酶的基因很容易在GenBank条目中得到，至1991年3月，有7个内切-1，4-β木聚糖酶基因，5个β-木糖苷酶基因和1个d-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因。
类似地，本发明同样适用于使用那些编码淀粉分解酶类的基因。这类酶及其生物来源和其它性质见表。
a内切淀粉酶b外切淀粉酶降解淀粉的酶的示例如下述的嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶和热厌氧细菌的支链淀粉酶。这些酶的基因在GenBank中很容易得到，至1991年3月，GenBank中有190个α淀粉酶基因、3个β-淀粉酶基因，8个葡糖淀粉酶基因和3个支链淀粉酶基因。其它的多糖酶如β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶和果胶酸裂解酶的基因在GenBank和克隆这些基因的文献中很容易得到。
按照本发明，芽孢杆菌（Bacillus）的多糖酶基因常在大肠杆菌中表达很好，因此它也应该适合于在一般的肠道细菌中表达。事实上，芽孢杆菌科的许多菌株分泌许多种类的多糖酶，包括淀粉酶、β-葡聚糖酶和半纤维素酶。许多菌株分泌纤维素酶，这些菌株包括枯草芽孢杆菌（B.subtilis），多粘芽孢杆菌（B.polymyxa）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）和蜡状芽孢杆菌（B.cereus）。见Beguin（1990）（见上）、Robson等（1989）Enzyme    Microb、Technol.11：626-44，这些内容以参考文献的形式整入本文。如果信号肽序列与异源基因的融合体在所选宿主如克氏杆菌和欧文氏菌中没有功能，那么常常用来自宿主的信号肽序列与外源基因融合而使异源的酶得以分泌。
嗜热脂肪芽孢杆菌中编码热稳定的水解酶和其它活性，如内切葡聚糖酶（羧甲基纤维素酶和硝基苯基纤维二糖苷酶）的基因，可在本发明中使用并具有好处。这类基因已被鉴定并在Gen    Bank和相关的文献中可以得到。见Beguin（1990）（见上）。
（F）宿主筛选和转化：为了选择能表达异源多糖酶基因的宿主，可以测试本发明中整合有产乙醇基因的重组菌株发酵纤维素底物SOLKA-FLOC的能力，同时用商业纤维素酶水解纤维素。作出乙醇产量和纤维素转换率（商业用酶制剂的作用所致）相应的剂量曲线。工业纤维素酶制剂（如SPEZYME、MULTIFECT和CYTOLASE[Genencor产品]）可用于这些pH受控制的发酵实验（35℃，pH6.0）。
异源多糖酶的添加可通过实施例17-19所述的方式而完成。例如，利用同源重组将具有特殊优点的多糖酶基因整合后，初始的重组子用5毫克/升的四环素筛选，较高浓度的四环素用于筛选高水平表达目的基因的突变体。5-丁基-吡啶-2-甲酸可用来失活四环素抗生基因，所以多种酶的基因可用相同的方法依次加入宿主。然后可以估算这些构建体在一步和多步纤维素发酵过程中的作用。
构建产乙醇的革兰氏阳性菌，如枯草芽孢杆菌属或纤维单胞菌属菌株，常采用的路线是化学诱变后用运动发酵单胞菌（Z.mobilis）的丙酮酸脱羧酶的抗体筛选，来检测表达水平提高了的克隆。有高水平表达的克隆进一步研究其形成该表型的机利。这些突变体可能有用并应适合于作为其它异源蛋白表达的宿主，一般认为这些宿主是安全的（GRAS）。
在用异源纤维素酶基因转化产乙醇宿主以获得高浓度的细胞内活性酶时，可能需要使用其它常规的遗传操作和筛选手段，这些手段视不同的宿主和所选择的纤维素酶而不同。例如，宿主分泌的蛋白酶可能成为本发明中异源表达的一个障碍。可用几个方法来获得基本克服这个问题的突变体，例如使用蛋白酶活性的指示平板和选择高水平表达异源酶的宿主。
但是，任何异源蛋白质（包括多糖酶）的产生，常常要影响宿主的生长速率和效率。这种“基因负担”可以通过测试特别有用的基因的多种构建体来减小。整合的位点也可能影响到“基因负担”，因此，按照本发明，应该测试不同整合位点的构建体。
如此得到的构建体然后可用于纤维素发酵试验，如实施例18所示，来评估分泌酶的作用效率（同商品酶一起）和发酵的效率。在一步发酵过程中，商品用酶在用产乙醇能分泌纤维素酶的转化宿主接种时就一起加入，因此，可以测试转化宿主分泌的纤维素酶替代商品纤维素酶的能力。将预发酵中含有嗜热纤维素酶的产乙醇细胞加入60℃的纤维素悬液中可以测试嗜热纤维素酶的作用。在这种特殊酶的最适条件下保温可持续一段时间，如12小时。在大多数情况下，可降低温度和pH值以给商品酶提供最适条件。例如SPEZYME、MULTIFECT和CYTOLASE，并持续保温12小时。把温度降到35℃，pH值升至6.0后，将重组的产乙醇菌接种到培养基中。然后可测定乙醇的得率。这个方法可加以改变，以适应各个酶达到最大活性的特殊需要。
所需用的分子遗传方法已很成熟。例见Maniatis等《分子克降实验手册》（冷泉港实验室，1989）、Ausubel等《分子遗传学实验手册》（1987）。发酵可在上述和实施例中所示的pH水平上进行。乙醇可用气-液层析测定，见Goel等（1984）Biotechnol.Lett.3：177-82和Dombek等（1985）Appl.Environ.Microbiol.5：197-200。单体糖可用比色法或高压液相层析测定，见Ashwell（1966）Methods    Enzymol.8：93-95、Wood等（1988）Methods    Enzymol，160。寡糖可用高压液相层析和薄层层析分析。液体培养可在复合培养基（如Luria培养基）或基本培养基中进行。见Starr等《原核生物》第二卷1166-72，1260-71（Springer-Verlag    1981）、Mizutani等（1986）Biotechnol    Bioeng.28：204-9。微生物可长在含1.5%琼脂的因体培养基上，保存在-70℃的甘油中。
纤维素酶的测定基本按照Curry等（1988）Appl.Environ.Microbiol.54：476-84和Gripenet等（1988）J.Bacteriol.170：4576-81。外切葡聚糖酶活性可用对硝基苯基纤维二糖作模式底物来测定。羧甲基纤维素酶（内切葡聚糖酶）可通过还原糖释放来测定。纤维素酶的活性也可用传统的方法即在滤纸上测定释放出来的还原糖的量来测定。甲基-伞形糖衍生物、羧甲基纤维素和果胶酸均可用来作定性比较的指示平板，以鉴别出能产生高水平的水解这些底物的酶的菌株。
（G）提高转化子的乙醇耐受性和乙醇产量本发明中产乙醇重组子产生的乙醇的最大浓度可超过1M。大肠杆菌KO11（E.coli    KO11）转化子发酵乳糖所产生的乙醇可超过1.5M，该菌株保藏号是ATCC55124。因此，增加本发明中产乙醇重组子的乙醇耐受性特别有用。对膜脂和（或）逆境蛋白质的改变也许能达到这个目的。运动发酵单胞菌（Z.mobilis）的adh    B基因是本发明中所用的产乙醇操纵子的一个组分，其编码产物已经被鉴定为明显是运动发酵单胞菌中对温度和乙醇起反应的逆境蛋白质。见Haejung等（1991）J.Bacteriol.173：5975-82。其它运动发酵单胞菌中的编码逆境蛋白质的基因同样应该是有用的。最后，大肠杆菌中表达主要选择蛋白的基因，见Johnson等（1989）J.Bacteriol.171：1590-6、Ang等（1989）J.Bcteriol.171：2748-55、Lipinska等（1988）Nucleic    Acids    Res.16：7545-61和Fayet等（1986）Mol.Gen.Genet.202：435-45，可作为探针分离运动发酵单胞菌中相应的基因。
脂类合成基因也有可能也对乙醇耐受性有用。将基因文库直接转化产乙醇菌株，在含过量糖的发酵培养基中经过一系列传代富集，可以筛选得到对乙醇耐受性有用的基因，过量的糖是为了保证在乙醇浓度超过原始接种物的耐性范围后，那些具有乙醇抗性的菌可以进一步生长。使用恒化器也可能对这些选择特别有利。
高乙醇抗性的同型腐酒乳杆菌（Lactobacillus    homohiochii）和异型腐酒乳杆菌（Lactobacillus    heterohiochii）的基因文库，见Ingram（1990）Critical.Rev.Biotechnol，9：305-19，也可在富集过程中测试。因为这些微生物影响米酒酸败，所以它们能耐受15%（V/V）乙醇（超过2.5M）。通过这种方法，能常规产生至少每升80克乙醇的重组菌株可以得到。
另外，运动发酵单胞菌的糖酵解酶类可用来改进本发明中的产乙醇重组子。也就是说，编码糖酵解酶类的十三个基因中的一个或多个的表达应该增加糖酵解流量并由此增加乙醇的产量。
（H）发酵工序设计：根据本文可设计许多发酵工序来实施本发明。一般地讲，这种工序至少分两个步骤：“糖化”步骤，其中，生物量同多糖酶接触后寡糖被裂解为较简单的寡糖或（和）单糖，接下来是“发酵”步骤，其中，简单的寡糖和/或单糖被发酵成为乙醇。最好这两个步骤分别进行，因为每一步的最适条件大不相同。糖化的最适条件是温度约50-60℃，pH值约4.5-5.5。发酵的最适条件是温度约30-35℃，pH值约6.0。
为了提高整个工序的效率，可能需要从发酵阶段到糖化阶段进行原料的再循环。因为发酵的温度是约30-35℃，所以糖化阶段的高温流体先要在热交换器中由再循环原料冷却后再进入发酵阶段。示例过程如下所述并见图19。
在图19中，酶反应器10中加入多糖酶和预先处理过的生物量，在其中，生物量中的起始寡糖被裂解为简单寡糖和单糖。酶反应器10温度维持在约50-60℃，pH约4.5-5.0。固体和液体的混合物通过通道12从酶反应器10进入固/液分离器14，在14中固体和液体被分离（例如通过离心）。
分离出的固体通过通道16回到酶反应器10，分离器中的流体通过通道18进入热交换器20，在20中流体冷却至约30-35℃。流体然后经通道22到膜分离器24分离出高分子量多糖，后者经通道26回到酶反应器10。膜分离器例如可以是超滤膜，如杜邦公司（Du Pont
）制造的CARRE滤膜，其分离能力大约为10-3至10-4微米。或者，可以去掉膜分离器24，流体直接进入发酵罐30。其余由寡糖和单糖组成的糖溶液，经通道28转到发酵罐30。但在进入发酵罐前，糖溶液的pH值要通过例如加碱来调高。
发酵罐中二氧化碳经由通道32排除。流体通过线34进入蒸馏柱（未显示）以便蒸馏出乙醇。发酵罐中的糊状物经线36进入固液分离器40（例如一台离心机）。分离器40中分出来的微生物经通道42回到发酵罐。分离器40中的流体进入热交换器20以冷却来自固液分离器14中的流体。离开热交换器20后，流体的pH通过加酸调节低至pH值约4.5-5.0，然后流体进入酶反应器10。酶反应器10和发酵罐30可以带有混合器48和50，这两者可以是任何传统的种类。
或者，在连续的基础上，含乙醇约0.5-5%，常是1-2%的液体（啤酒）还可经通道52从发酵罐30进入气化器54，在54中乙醇和水被气化并经线56进入另一蒸馏阶段（未显示）。线56中的乙醇浓度可约从20%到25%。离开气化器54而经线58回到发酵罐30的啤酒乙醇浓度常少于0.5%，通常也就大约为0.3%。以这种方式，发酵罐中乙醇浓度维持在较低水平，而乙醇的产量却维持在较高水平。
同样，经通道36、44和46回到反应器10的流体乙醇浓度较低因而对反应器中的反应较少抑制。这个连续过程通过不断在反应器10中加入生物量而驱动。但是要定期去掉反应器10和发酵罐30中的内容物以便去掉凝结的固体和降低污染的可能性。
这样，上述的发酵工序可以提供一个将生物量发酵为乙醇的有效方法。本领域行家知道发酵工序中可以附加许多步骤和（或）阶段。例如，可包括生物量预处理阶段，将生物量磨碎，水解（用或不用蒸汽和/或酸）和用多糖酶和/或其它酶处理等。另外，可以有一个起始步骤，将能在细胞内表达和积累多糖酶的重组宿主细胞加热到裂解以释放出多糖酶。还有，可以采用多步发酵的方法，并附加有固体和流体的分离和再循环装置。
Ⅲ.实施例本发明通过下列参考实例得到进一步描述，但不能作为限制。所有百分数均为重量比，所有溶液比例除特别指出外均为体积比。实施例中涉及的其他方法如下所述：微生物及生长条件：本文使用大肠杆菌（Escherichia coli）TC4（见Conway et al，[1987a]）及其含质粒的衍生菌。载有运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因的质粒（pLOI276）以及载有该菌乙醇脱氢酶Ⅱ基因的质粒（PLOI284）见Conway et al.[1987b]所述。
菌株及生长条件：质粒pUC18和pUC19见Yanisch-Perron    etal，（

[1985]Gene    33：103-19）所述，质粒pLOI204和pLOI295见Conway    et    al.[1987b]及Ingram    et    al.

[1987]。质粒pLOI292，pLOI291，pLOI297，pLOI308，pLOI308-2，pLOI308-5和pLOI308-10的构建及特性见后。培养物在37℃下在每升含50克葡萄糖的Luria培养基（见Luria    &M.Delbruck

[1943]Genetics    28：491-511）中进行培养。用于酶分析和发酵种子的细胞在37℃下在装3毫升LB的试管（13×100毫米）中进行培养，试管置于试管旋转器上。培养过夜的培养物以一百倍稀释接入新鲜培养基。好氧培养物（250毫升烧瓶中装50毫升Luria培养液）在往复式水浴中振荡（每分钟120转）培养。厌氧培养物培养在封口血清瓶（130毫升瓶子中装100毫升Luria培养液）中，用回旋式振荡器（每分钟150转）37℃培养。厌氧培养时，瓶塞上插一只25号针头导出发酵的气体产物。菌体生长情况用Spectronic    70分光光度计（Bausch    &    Lomb，Inc.Rochester，NY）在550nm处进行检测，比色杯为一次性培养试管（10×75毫米）。在此处的实验条件下，一个吸收单位大约相当于每毫升含0.25毫克细胞蛋白。
带有本发明各重组质粒的大肠杆菌宿主保存在American    Type    Culture    Collection（ATCC），12301    Parklawn    Drive，Rochville，Maryland    20852    USA。其注册号如下：培养物    注册号    收藏日期E.coli  pLOI308-10    ATCC  67983    1989年5月15日TC4(pLOI292)    ATCC  68237    1990年2月23日TC4(pLOI308-11)    ATCC  68238    1990年2月23日TC4(pLOI297)    ATCC  68239    1990年2月23日TC4(pLOI295)    ATCC  68240    1990年2月23日E.coli  pLOI1510    ATCC  68484
K.oxytoca  M5A1    ATCC  68564    1991年3月14日(pLOI555)收藏本培养物须确保在本专利申请期间只有经美国专利和商标管理官员据37    CFR    1.14和35USC    122授权的人员才可得到该培养物。在本发明申请或其成果副本已注册的国家，可按该国专利法要求索取该保存培养物。但必须清楚的是获得本培养物并不意味着可以侵犯政府授予的专利权而应用本发明。
另外，本发明培养物将按布达佩斯微生物保存公约的条款保存和公开。即培养物必须十分小心地保存使之在每次提供被索取样品后至少五年内保持存活并不受污染，并且自保存之日起至少三十年时间里或在规定的培养物公开日期前的专利有效期内保持戚并不受污染。如果由于保存条件的问题而导致不能提供被索取样品时，保存单位有义务更新该保存物。自专利公开之日起，所有有关该培养物公开的限制自动失效。
遗传方法：转化、质粒构建、DNA酶切和分析均按前述方法进行。重组子在含葡萄糖（每升培养基2克）及适当抗菌素的固体平板（1.5%琼脂）上进行选择。其中形态特大的菌落即被认为是带运动发酵单胞菌产乙醇基因的重组子。若观察到该重组子在不含葡萄糖的Luria琼脂平板上生长不良以及在乙醛指示培养基上有乙醇脱氢酶基因的表达，便可确证其重组性状。
酶分析：细胞的破碎、热失活及丙酮酸脱羧酶活性（对热稳定）的测定见Conway    et    al.[1987b]。细胞的制备及催化乙醇氧化反应的乙醇脱氢酶Ⅱ的活性的测定按前述方法，但细胞在现加固体硫酸亚铁铵固体（终浓度0.5mM）和维生素C钠盐（终浓度1mM）的磷酸钾盐缓冲液中洗涤和破碎，见Neale    et    al.

[1986]Eur.J.Biochem.154：119-24。经修改的方法得到的制备物不经存放立即测定乙醇脱氢酶洁性，其比活比报道的高得多。为计算乙醇产率，细胞量用福啉酚法测定（Lowry    et    al.，J.Biol.Chem.193：265-75），结果以培养物中蛋白含量表示。发酵产物分析：用澄清培养液，在附有折射率检测仪和电子和积分析的Millpore/Waters高效液相层析仪（Millipore    Corporation    Bed    ford，MA）上测定发酵产物，产量分离在Aminex    HPX-87H柱（长300毫米，直径7.8毫米）（购于Bio.Rad    Laboratories，Richmond    CA）上进行。洗脱速度0.25毫升/分钟（进样量100微升），温度65℃，以可靠标准确定峰。先于葡萄糖出现的两个峰及在45.4至45.8分钟之间出现的另一稍迟的未知峰即为非接种培养基的组分。
实施例1.菌株的构建编码丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶Ⅱ的结构基因大小分别为1.7Kb和1.1Kb。编码的蛋白质分子量分别为60KD和40.1KD。这两个基因位于pUC18衍生质粒上，受Lac启动子的调控（图1）。将pLOI284（载有乙醇脱氢酶基因）上EcoRI和SalI双酶切的1.4Kb无启动子片段插入pLOI276上丙酮酸脱羧酶基因下游的BamH1位点，形成二个基因的重组体。选择对氨苄青霉素有抗性的菌落，同时在新发明的检测乙醛生成的副品红-乙醇指示培养基上检查乙醇脱氢酶的表达。带有pLOI295构建质粒的菌株，在不含葡萄糖的Luria琼脂平板上生长不良（好氧条件下），但不含2%葡萄糖的平板上其生长密度比不带质粒的菌和带pLOI276或pLOI284质粒的菌株都要高得多。
带pet操纵子的重组子因其在含葡萄糖的Luria琼脂平板（好氧条件下）上长成较大、较不透明的菌落而易于检出。这种菌落大小和透明度方面的差异是鉴定带有同时表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶质粒重组子的有效标记。
已知pLOI295的全部碱基顺序。编码丙酮酸脱羧酶基因的开放阅读框架始于Lac启动子下游第163个碱基，并在编码乙醇脱氢酶Ⅱ基因的开放阅读框架上游的第85个碱基处以两个终止密码子结束。这两个基因在紧邻各自开放阅读框架的上游区均有类似于核糖体结合位点的序列。编码乙醇脱氢酶Ⅱ的基因有一个终止密码子，其后还有一个13个碱基对的回文序列结构作为转录终止子。
实施例2.运动发酵单胞菌基因在大肠杆菌中的表达丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因无论是单独地（分别在pLOI276和pLOI284上）还是联合地在Lac启动子调控的大肠杆菌中，均高表达。野生型大肠杆菌没有丙酮酸脱羧酶，仅有低浓度的诱导型的乙醇脱氢酶。重组大肠杆菌在有葡萄糖条件下生长时，其表达的运动发酵单胞菌酶的比活下降约50%，这与葡萄糖对Lac启动子的阻遏相一致。pet操纵子近端基因编码的丙酮酸脱羧酶在pLOI295中表达的比活比在pLOI276中的高三倍。pet操纵子远端基因，即乙醇脱氢酶基因，编码的酶在pLOI295中表达的比活是在pLOI284中的两倍。
实施例3.重组菌株的葡萄糖发酵pet操纵子的表达使重组大肠杆菌相在厌氧生长时主要发酵产物为乙醇。亲本株主要发酵产物则是琥珀酸（1.5mM）、乳酸（18mM）和乙酸（7mM）（图3A）。在带pLOI234（载有乙醇脱氢酶Ⅱ基因）的细胞中观察到同样的发酵曲线（图3c）。在载有编码丙酮酸脱羧酶基因的pLOI276宿主菌株中，乙醇峰很明显（18mM），占发酵积累产物的1/3。这种乙醇高水平的产生是大肠杆菌中外源运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶和内源乙醇脱氢酶共同作用所致。带pet操纵子（含运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因）的pLOI295宿主大肠杆菌产生大量乙醇（750mM;4.3%体积比），占发酵产物95%以上。
带pet操纵子的大肠杆菌高水平表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶，控制着NADH的氧化。因而此细菌的发酵过程可转变成同啤酒酵母和运动发酵单胞菌相同的发酵作用。在正常发酵生长时，丙酮酸由丙酮酸脱氢酶复合物作用转变成乙酰辅酶A，或由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用转变成草酰乙酸（继而变成琥珀酸），或由丙酮酸甲酸裂解酶作用转变为甲酸和乙酰辅酶，或由乳酸脱氢酶作用转变为乳酸。最后一种转变途径是野生型大肠杆菌再生NAD+的主要方式，但细菌乳酸脱氢酶KmS值相当高，约为10mM至1，000mM（Garvie，E.I.

[1980]“Bacterial Lactate dehydrogenases，”Microbiol.Rev.44：106-139;Tarmy，E.M.，and N.O. Kaplan

[1968]“Kinetics of E·coli BD-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate controlled change in conformation，”J.Biol.Chem.243：2587-2596）。运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶的Km值为0.4mM（Bringer-Meyer，S.，K.-L.Schimz，and H.Sahm

[1986]“Pyruvate decarboxylase from Zymononas mobilis：Isolation and partial characterization”Arch.Microbiol.146：105-110），大量的该酶，加上较低的Km值可有效地将糖酵解不断产生的丙酮酸转变为乙醇。在适度振摇或抖动培养容器以促进气体交换的培养条件下，可以获得高细胞密度的培养物。在这种条件下，培养液最终pH为6.3或更高，取决于气体交换的程度。
实施例4.质粒构建及运动发酵单胞菌产乙醇酶在大肠杆菌中的表达质粒pLOI295带有lac启动子调控的运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶Ⅱ基因。该构建体称作pet操纵子，在构建其他带不同启动子的质粒中作为产乙醇基因的来源。来自pLOI295带产乙醇基因的EcoRI-SalI片段，用DNA聚合酶的Klenow片段填平末端后，插入pUC19（其lac启动子下游紧接pdc基团）的SmaI位点，得到编号为pLOI293的质粒，该质粒带有一侧是BamHI位点的pet基因。将带编码产乙醇酶基因的BamHI片段插入表达载体pLOI204，构成质体pLOI291和pLOI292（插入方向相反）。该BamHI片段上有核糖体结合位点、两个目的基因的完整序列和一个adhB远端的转录终止子。在pLOI292中，这两个基因的表达受原表达载体上运动发酵单胞菌启动子的调控。
构建质粒pLOI308，去除控制pet基因的lac启动子，但保留上游BamHI位点，以备插入其他启动子。用BamH1部分酶解pLOI293，经Klenow处理，去掉adhB基因远端的BamHI位点。从该质粒中切下带产乙醇基因的无启动子BamHI（紧邻pdc）-EcoRI（远离adhB）片段，定向插入pUC18    BamHI-EcoRI位点，产生pLOI308。该质粒在乙醛指示平板上低水平表达adhB，但并不表现出大菌落表型，该表型与其它pet功能质粒pLOI295，pLOI291和pLOI292有关。
运动发酵单胞菌染色体DNA用SauBA部分酶解，使得大多数DNA片段小于4Kb。以此未经分级分离的DNA作为启动子片段来源，连接到pLOI308去磷酸化BamHI位点。在含葡萄糖的Luria培养基平板上，带有表达良好的pet操纵子的氨苄青霉素抗性重组子以大菌落形式出现。选取其中三个重组子质粒pLOI308-2，pLOI308-5和pLOI308-10进行研究。这些质粒中具启动子活性的运动发酵单胞菌DNA片段分别长6、2、和2Kb。
表1总结重组体大肠杆菌（E.coli）过夜培养物中丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的活性。丙酮酸脱羧酶活力可从TC4（pLOI292）的0.37U/毫克细胞蛋白到TC4（pLOI295）的8.23U。按照丙酮酸脱羧酶活力从大到小，TC4重组体依次排列如下：pLOI295＞pLOI308＞pLOI308-10＞pLOI308-2＞pLOI308-5＞pLOI292＞pLOI291。
表1
运动发酵单胞菌的产乙醇酶在大肠杆菌中的表达质粒    丙酮酸脱羧酶    乙醇脱氢酶比活a%细胞蛋白b比活a%细胞蛋白cpLOI291    0.37    0.4    0.21    0.02pLOI292    0.48    0.5    0.30    0.03pLOI308-2    2.26    2.3    1.54    0.21pLOI308-5    1.11    1.1    0.76    0.10pLOI308-10    6.5    6.5    2.51    0.34pLOI295    8.2    8.2    9.65    1.4无    0    0    0.08a.以每毫克总细胞蛋白每分钟转化底物的毫摩尔数表示b.计算时假定纯酶比活为100c.计算时假定扣除内源乙醇脱氢酶活性后的纯酶比活为710在各个带不同质粒的重组菌株中，乙醇脱氢酶活性变化趋势与丙酮酸脱羧酶的相同。测得的乙醇脱氢酶活性是大肠杆菌内源酶和运动发酵单胞菌酶共同作用的活力。与带有运动发酵单胞菌基因质粒的菌株相比，不带质粒的TCA菌株中观察到的酶活性水平较低。运动发酵单胞菌酶活性（扣除大肠杆菌内源乙醇脱氢酶活性）范围为0.13IU/毫克细胞蛋白（带pLOI291的TC4菌株）到9.6IU/毫克细胞蛋白（带pLOI295的TC4菌株）。
实施例5.含运动发酵单胞菌产乙醇基因的重组菌株的生长由葡萄糖的分解代谢转变为乙醇的合成代谢也会影响菌体的生长量和培养基的酸度变化。虽然发酵产物相对无毒，但有可能在发酵过程中累积至一定水平产生毒害效应。细菌在含10%葡萄糖的LB培养液中厌氧生长，不含质粒的菌株和携带质粒pLOI284（带有编码乙醇脱氢酶Ⅱ的基因）的菌株在培养48小时后都能达到每毫升培养液含0.25毫升菌细胞蛋白的终浓度，同时液体的pH值降到4.4。对于携带质粒pLOI276（带有编码丙酮酸脱羧酶的基因）的菌株，细胞浓度可增加两倍，pH值则降为4.5。携带质粒pLOI295（即带pet操纵子）菌株的最终细胞浓度为2.5毫克/毫升，比对照菌要高出10倍，最终pH则降到4.7。当细菌浓度达到每毫升有2.5毫克细胞蛋白时，镁离子似乎成为限制因子;若此时加入0.5mM的MgSO4溶液，则细胞浓度还可提高1.5倍。
对重组菌株在好氧和厌氧两种条件下的生长情况都作了观察（见图3）。在好氧培养条件下（见图3A和表2），菌株TC4在生长的最快速时期以约每30分钟一代的速度增殖。携带质粒pLOI308衍生质粒的菌株TC4表现出同等的最大生长速度，传代时间为26至30分钟。菌株TC4（pLOI295）在同样的条件下生长情况不佳（传代时间71分钟），并伴有部分溶菌。菌株TC4（pLOI291）和TC4（pLOI292）生长速率中等，传代时间为46分钟。
表2有氧和厌氧培养条件下的最大代时、最终菌体浓度和培养液的最终pH值生长质粒菌体浓度a代时最终条件    (毫克蛋白/毫升)    (分)    pH值有氧    无    0.7    29    4.4pLOI291    0.7    46    5.3pLOI292    1.3    46    5.1pLOI295    1.1    71    5.7pLOI308-2    1.7    27    5.5pLOI308-5    0.8    30    5.0pLOI308-10    2.5    26    5.0厌氧    无    0.3    32    4.4pLOI291    0.4    40    4.5pLOI292    1.0    48    5.0pLOI295    2.1    39    4.7pLOI308-2    0.8    42    5.7pLOI308-5    0.4    38    4.9pLOI308    2.2    41    5.2a.测定在培养24小时后进行。
在厌氧培养条件下（见图3B和表2），不含质粒的菌株TC4的传代时间为32分钟，比含有产乙醇酶类的重组菌株要短得多。所有的重组菌株都表现相近的最大生长速率，传代时间都在38到41分钟之间，只有菌株TC4（pLOI292）的生长速率略微慢一些，传代时间为48分钟。
除菌株TC4（pLOI295）外，所有的重组菌株，无论是好氧培养还是厌氧培养，在生长12小时后，菌体浓度都达到与不含质粒的菌株TC4相等的水平或甚至更高（见图3A和B）。表2总结了菌株TC4和重组菌株在生长24小时后最终菌体浓度的数据。在好氧条件下，含质粒pLOI308-10的TC4菌株有最大的细菌浓度，其次分别是含质粒pLOI308-2的TC4菌株、含pLOI292菌株、含pLOI295菌株（菌体呈部分裂解），和含pLOI308-5的TC4菌。
在厌氧条件下，含pLOI308-10的TC4菌和含pLOI295的TC4菌的最终菌体浓度大致相同，其次分别是含pLOI292、pLOI308-2、pLOI308-5和pLOI291的TC4菌株。
图4显示了菌体细胞的丙酮酸脱羧酶活性水平与细菌生长24小时后最终菌体浓度之间的关系。由于在重组菌株中丙酮酸脱羧酶的合成与乙醇脱氢酶Ⅱ的合成相偶联，因而此曲线也代表运动发酵单胞菌Z.mobilisNAD+再生系统对最终菌体浓度的影响。这些数据清楚地表明，无论是好氧条件还是厌氧条件，运动发酵单胞菌乙醇合成途径的表达都提高了最终菌体浓度。在菌株TC4（pLOI308-10）中，丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶Ⅱ的表达水平（分别为6.5IU和2.5IU）在好氧和厌氧条件下都接近最佳水平。菌株TC4（pLOI295）中产乙醇基因的表达水平甚至过量，导致在好氧条件下细胞生长受阻，并有部分的裂解;在厌氧条件下生长速度则略为下降。
菌株TC4（pLOI295）在厌氧条件下生长加快，并有轻微的表观裂解;而在快速振荡的培养瓶中生长不良同时发生裂解，这说明对于此人工构建菌株，高度通气的生长环境对细菌有害。如振荡速度降低到原来的三分之一，可大幅度降低重组菌株的裂解程度并提高细菌的最终浓度。
实施例6.产乙醇酶系在生长过程中的培养液的酸化效应图3C显示了在厌氧培养条件下培养液酸酸度变化曲线。对于不含质粒的TC4菌株，在培养的最初6小时中，溶液的pH值迅速下降;而对于含有产乙醇基因的衍生菌株，此下降趋势大为减缓。最初12小时的酸化作用在含pLOI295的TC4菌中减缓最多，以下依次分别是含pLOI308-10、pLOI308-2和pLOI308-5质粒的TC4衍生菌。TC4（pLOI291）和TC4（pLOI292）菌的测示结果未在图中显示，但分别位于TC4（pLOI308-5）的下方和上方。尽管重组菌有较高的最终浓度，它们在厌氧和好氧条件下生长24小时后培养液的酸度都要比不含产乙醇基因的TC4菌的培养液为低（见表2）。
重组菌株在酸化速度和程度下降的同时，其细胞生长有所提高，这说明即使在高度通气的条件下，pH值下降也是限制生长的主要因子。下述实验的结果支持这种看法。不含质粒子的TC4菌在加有1/10体积比的1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）的培养液中生长，其最终细胞浓度可增加85%。减少缓冲液的添加量则细菌的生长水平介于上述两者之间。
实施例7.产乙醇酶系对发酵产物的影响表3总结了TC4菌和重组菌在好氧和厌氧条件下培养24小时后发酵产物的分析结果。在好氧条件下，乙酸是不含质粒的TC4菌在丰富培养液中的主要发酵产物并在生长过程中不断积累，乙醇的生成则检测不到。对含有运动发酵单胞菌产乙醇基因的菌株，乙酸的生成量大为降低，而乙醇则成为主要的发酵产物。含pLOI308-10的TC4菌所产的乙醇量最高，以下依次分别是含pLOI295、pLOI308-2、pLOI292、pLOI308-5和pLOI291的TC4菌。在好氧条件下，所有的菌株还生成少量的乳酸（0.6至1.2mM）。仅含质粒pLOI308-10的TC4菌累积一定量的琥珀酸，但只占全部发酵产物的1%，而94%的发酵产物为乙醇。
表3有氧和无氧生长条件下发酵产物的比较发酵产物[mM（标准差）]生长条件    质粒    琥珀酸    乳酸    乙酸    乙醇有氧    无    0.2(0.1)    0.6(0.2)    55(2)    TrpLOI308-2    Tr    1.2(0.3)    22(2)    98(3)pLOI308-5    Tr    0.9(0.2)    43(3)    15(2)pLOI308-10    4.9(0.5)    1.0(0.2)    17(2)    337(21)
pLOI295    Tr    1.1(0.4)    13(1)    114(10)pLOI291    Tr    0.6(0.2)    34(3)    7(1)pLOI292    Tr    1.3(0.2)    30(1.5)    24(1)无氧    无    0.9(0.1)    22(1)    7(0.3)    0.4(0.2)pLOI308-2    0.8(0.1)    7(0.5)    4(0.3)    71(5)pLOI308-5    0.3(0.1)    18(2)    6(1)    16(2)pLOI308-10    5.0(0.4)    10(1)    1.2(0.2)    482(23)pLOI295    2.2(0.20)    6(1)    3(0.3)    90(2)pLOI291    1.1(0.1)    15(0.5)    7(0.2)    4(0.5)pLOI292    2.3(0.2)    9(0.7)    7.2(0.3)    21(1)在厌氧条件下，乳酸是不含质粒的TC4菌在添加葡萄糖的丰富培养液中的主要发酵产物，并在生长的24小时中不断积累，而乙酸、琥珀酸和乙醇的生成有所减少。在含有产乙醇酶系的重组菌中，乳酸的产量显著降低，同时有相当大量的乙醇生成。TC4（pLOI308-10）生成的乙醇量最大，占可溶性发酵产物总量的97%。测试各个菌株发现乙醇生成的趋势与好氧生长条件下的结果一致。实际上，除TC4（pLOI308-10）以外，所有的菌株在厌氧条件下培养24小时生成的乙醇量比好氧培养时的生成量要低，这可能是由于厌氧培养形成的菌体总细胞量较少，导致乙醇产量的体积比减少，因而降低了乙醇的积累水平。
在厌氧和好氧条件下乙醇的生成量（见表3）直接关系到运动发酵单胞菌产乙醇基因的表达水平（见表1）。在菌株TC4（pLOI308-10）中，乙醇合成的表达似乎达到最适水平，丙酮酸脱羧酶的活性为6IU，乙醇脱氢酶Ⅱ的活性为2.5IU。
含有表达运动发酵单胞菌产乙醇基因的大肠杆菌TC4衍生菌可培养生长到比不含质粒的亲本菌更高的菌体细胞浓度水平。最终菌体浓度的提高、培养液中乙醇的累积量及生长过程中培养液的酸化作用减缓率都同运动发酵单胞菌产乙醇基因的表达水平有关。为减少任何与转录调节有关的问题产生，除质粒pLOI295（lac）外，都利用了异源启动子来控制构造菌株中基因的表达。表达水平在生长和乙醇生成两方面都达到最佳状态的是质粒pLOI308-10（丙酮酸脱羧酶活性和乙醇脱氢酶Ⅱ活性分别为每毫克细胞蛋白6.5IU和2.5IU）大肠杆菌中该表达水平显著高于运动发酵单胞菌CP4，后者只包含乙醇途径再生NAD+。
产乙醇基因在菌株TC4（pLOI295）中的表达水平似乎过高（约占可溶性细胞蛋白的17%）。在好氧条件下，这种高水平基因表达的同时伴随着菌体的部分裂解、生长缓慢和乙醇产量的降低。此效应在减慢振荡和转为厌氧培养后得到缓解。在高度通气的条件下发生的表观损害和部分裂解可能与表现高度活性的运动发酵单胞菌乙n醇脱氢酶Ⅱ和内源NADH氧化酶（与电子传递系统相偶联）的共同作用导致NADH的耗尽有关系。
作为主要的发酵产物，乙醇的生成似乎并不会反向影响大肠杆菌TC4的生长速率。携带pLOI308（含ColEI复制子）衍生质粒的菌株能表达pet操纵子和生成乙醇，其在好氧添加葡萄糖的生长条件下有和亲本菌相同的生长速率，并能达到比亲本菌还要高的最终菌体浓度。在好氧条件下，携带含RSF1010复制子的质粒pLOI291或pLOI292的菌株生长要慢得多。由于这两个构造菌株表达的产乙醇基因和产生的乙醇量都比质粒pLOI308-10要低，这种生长缓慢可归因于载体的特性而非pet-操纵子的表达水平。
实施例8.附加菌株的制备测试其他的大肠杆菌菌株，以选出性状优良的产乙醇菌株。经过测试的大肠杆菌菌株包括：ATCC8677，ATCC8739，ATCC9637，ATCC11303，ATCC11775，ATCC14948，ATCC15244和ATCC23227。所有菌株都在30℃的振荡水浴中进行培养，培养液为含有牛肉膏（10克/升）、酵母提取物（5克/升）、Nacl（5克/升）和可发酵糖的LB培养液（Luria，S.E.和M.Delbruek

[1943]Genetics    28：491-511）。在不作特别说明的情况下，葡萄糖和乳糖以100克/升的浓度加入培养液，木糖的使用浓度则为80克/升。各种糖以两倍于使用浓度配制于蒸馏水中单独消毒（121℃下15分钟）。木糖（Sigma    Chemical    Co.，St.Louis，MO）溶液呈酸性，因而在消毒之前要用NaOH溶液调至中性，否则在消毒后溶液会变成棕色糖成分分解。使用各种经高压消毒或过滤灭菌的糖分都获得相同的发酵结果。在培养液中或固体平板上携带编码乙醇途径有关酶的基因的重组菌株的存活要求培养基中含有可发酵糖组分。如所示，四环素的最终使用浓度为10毫克/升。实施例9.附加菌株对环境的耐受性在将控制乙醇合成的质粒导入上述的八个不同的大肠杆菌株之前，先比较了它们对恶劣环境的耐受能力。检查了这些菌株对NaCl、糖、低pH和乙醇的抵抗能力。表4列出了所用的NaCl和糖的不同浓度，其中也包括原始培养基中两者的浓度。原始培养基的pH值为6.8，实验时以HCl调节到所需的酸度。酸性培养基过滤灭菌。乙醇在经高压灭菌的培养基冷却后加入。糖组分须单独消毒。菌体先在不含测试组分的各种糖培养基中过夜培养，然后稀释60倍在有3ml测试培养基的13×75mm试管中进行培养。48小时后测定培养液在550mm处的O.D.值。O.D.等于1.0即相当于0.25毫克/毫升的菌体蛋白和0.33毫克的细胞干重。在环境耐受性测试中，最终0.D.值低于0.2即反映了细菌倍增不到二次，其生长可忽略。
表4总结了在含葡萄糖的培养液中进行上述实验的结果。在含乳糖或木糖的培养液中进行的实验结果相同。菌株ATCC8677、ATCC8739和ATCC11775对低浓度的乙醇的抑制作用特别敏感。除菌株ATCC23227外，其它菌株在pH4.0酸度下都仍然能够倍增至少2至4次，其中又以ATCC9637和ATCC11775对低pH值的耐受性最强。所有的菌株在45℃下培养长成后在更高的温度中都只有有限的生长。所有的菌株在45℃以上的温度环境中传代级培养都未能成功。所有的菌株在含有20%葡葱糖、或20%乳糖、或12%木糖的培养液中都能生长。
表4.化学和物理胁迫下大肠杆菌在含100克/升葡萄糖的LB培养液中的生长情况胁迫条件    大肠杆菌菌(ATCC编号)的生长情况8677    8739    9637    11303    11775    14948    15224    23227NaCl(克/升)50    +    ++    ++    ++    ++    ++    ++    ++60    0    +    ++    ++    +    ++    +    ++70    0    0    +    +    0    +    +    +乙醇(%体积比)3.8    ++    ++    ++    ++    ++    ++    ++    ++5.0    ++    ++    +    +    +    +    +    +6.3    0    ++    +    +    +    +    +    07.5    0    +    +    0    0    +    0    08.8    0    0    0    0    0    0    0    0酸度pH4.50    ++    ++    ++    ++    ++    ++    ++    ++pH4.25    ++    ++    ++    +    ++    ++    ++    +pH4.00    +    +    ++    +    ++    +    +    0pH3.75    0    0    +    0    +    0    0    0温度℃45    ++    ++    ++    ++    +    ++    ++    ++47    +    +    +    +    +    +    +    +49    0    0    +    +    0    0    +    +0＝O.D.550nm测定值低于两次菌体增倍
+＝二至四次菌体增倍++＝四次以上菌体增倍实施例10.附加菌株的糖分利用糖分的利用通过两种方法进行检测。对于在添加2%糖成分的MacConkey琼脂上长成红色单菌落的菌株，其糖利用能力可直接进行测定（Silhavy，T.J.和J.R.Beckwith

[1985]Microbiol.Rev.49：398-418）。也可以根据产品说明书上的介绍用Biolog EC plates法（Biolog，Inc.，Hayward，CA）检测菌体细胞。Biolog plates法快捷而可靠，以测定NADH的产量（即由某四唑盐到不溶性甲的转化，作为底物利用的指标。对测试的13种糖，两种方法的结果完全一致。
所有测试的菌株都能利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、乳糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸。菌株11775不能利用木糖。麦芽糖和麦芽三糖则不能为菌株ATCC11303和ATCC23227所利用。所有菌株对纤维素二糖都有微弱的正反应能力。蔗糖仅为菌株ATCC9637所利用。糖分利用为研究结果汇总如表5。
表5    携质粒pLOI297和pLOI308-11的大肠杆菌生长情况糖    质粒    E.coli菌株(ATCC编号)0.D.550nm的最终值8677    8739    9637    11303    11775    14948    15224    23227葡萄糖    无    4.0    3.7    6.1    6.0    4.7    5.6    7.0    6.6葡萄糖    pLOI297    10.0    10.5    10.5    10.0    9.5    -    9.5    10.2葡萄糖    pLOI308-11    9.8    9.5    11.4    11.2    -    9.3    10.8    11.4乳糖    无    4.3    3.8    7.5    6.0    4.5    6.1    7.0    6.4乳糖    pLOI1297    13.0    6.8    11.6    10.8    7.6    -    10.5    7.0乳糖    pLOI308-11    10.0    10.0    11.5    11.0    -    7.3    10.0    10.0木糖    无    4.1    3.7    7.7    7.3    4.9    5.9    7.2    7.0木糖    pLOI297    8.1    10.6    10.8    10.6    4.7    -    11.0    11.0木糖    pLOI308-11    10.0    6.8    11.4    8.5    -    11.4    10.6    12.0横线示数据暂缺实施例11附加菌株的遗传改造通过常规方法构建了两个新质粒（Maniatis，T.，E.F.Fritsch，和J.Sambrook

[1982]Molecular    Cloning：a    Laboratory    Manual.Cold    Spring    Harbor    Laboratory，Cold    Spring    Harbor，NY），它们都含有对抗氨苄青霉素和四环素的抗性基因作为筛选标记。从质粒pLOI308-10（Ingram与Conway

[1988]，Supra）上将一个5.2Kb的含有乙醇合成操纵子（pet-operon，包括一个内源运动发酵单胞菌启动子，丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶和转录终止子）的EcoRI酶切片段分离并插入pBR322的EcoRI酶切位点上构建成pLOI308-11。质粒pLOI297则是通过将来自质粒pCOS2EMBL（Poustka，A.，H.R.Rackwitz    A.-M.Firschauf，和H.Lehrach

[1984]Proc.Natl.acad.Sci.USA    81：4129-4133）的含四环素抗性基因的2.6Kb    EcoRI酶切片段插入pLOI295（Ingram    et    al.

[1987]，supra）的SalI酶切位点上而构建。在连接前将样品用E.coli    DNA聚合酶的Klenow片段处理即可填平粘性末端（Maniatis    et    al.，supra）。根据Mandel和Higa所述的氯化钙转化法（Mandel，M.和A.Higa

[1970]J.Mol.Biol.53：159-162），将质粒转入各个E.coli菌株，在含有2%葡萄糖和四环素的固体培养基上进行选择。质粒的稳定性以无抗菌素选择的条件下继代25代后仍保留抗药性标记的菌体百分数来表示。重组的菌株获得了带乙醇合成基因的质粒，在含有添加糖分的固体培养基上生长24到48小时后，形成特别大的、呈黄色的菌落。在液体培养液中，重组菌的最终细胞浓度比不含质粒的对照菌要高出二至三倍。质粒pLOI297对菌株ATCC14948的转化子，以及质粒pLOI308-11对菌株ATCC11775的转化子则始终无法获得。不能利用木糖作的菌株11775。其重组子在以木糖作为富加糖分的培养条件时生长浓度不高于对照菌，但在添加乳糖和葡萄糖时其生长速度加快。
质粒稳定性的检测在含葡萄糖的培养基上传代25代后进行（见表6）。两个质粒具有相同的复制子，在除ATCC8677和ATCC8739以外的所有其它菌株中都能很稳定地保留下来。
表6    质粒pLOI297和pLOI308-11在没有抗菌素选择，含葡萄糖的条件下生长25代后的稳定性ATCC菌株    保留质粒的细胞数(%)pLOI297    pLOI308-118677    75    858739    44    479637    100    9011303    98    9811775    100    ---14948    ---    9715224    99    10023227    91    100虚线表示数据缺。
实施例12丙酮酸脱羧酶在遗传改变的菌株中的表达丙酮酸脱羧酶活性的测定依前述（Conway    et    al.

[1987]见前，Neale    et    al.

[1987]见前），但在O.D.4.0时收集细胞，此时生长量约为最高值的一半。对运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶活性表达的检测在含四环素的培养条件下生长后进行（见表7）。对质粒pLOI297，运动发酵单胞菌基因的表达受大肠杆菌乳糖合成启动子的控制;质粒pLOI308-11则利用内源的运动发酵单胞菌启动子来调节pet-操纵子的表达。菌株ATCC11303（pLOI297）、ATCC11775（pLOI297）和ATCC15224（pLOI297）表现活性最高。
表7    在含葡萄糖的生长条件下运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因在携质粒pLOI297和pLOI308-11的大肠杆菌菌株中表达ATCC菌株    丙酮酸脱羧酶活性pLOI297    pLOI308-118677    5.7    6.08739    0.8    1.49637    1.1    1.411303    16.7    2.111775 17.1 ---b14948 ---b2.515224    16.3    1.823227    2.3    1.7a酶活性以每毫克菌体蛋白的国际单位值表示b虚线表示数据暂缺实施例13遗传改造菌株的乙醇产量在Luria培养液中另加pH7.0的磷酸钾缓冲液至0.2M终浓度以适用于发酵试验。磷酸缓冲液、复合培养液成分和糖分分别消毒并冷却后再予混合。四环素的使用浓度为10毫克/升。接种物为新鲜分离的菌落，生长24小时后，以待测发酵培养基洗涤，加入发酵液中，使其浓度为O.D.550nm约1.0。发酵温度为30℃或37℃。在100毫升三角烧瓶中装80毫升发酵溶液，以橡皮塞塞口，塞子上插一只25号针头导出发酵产生的气体。发酵烧瓶要浸入温控水浴器中，以磁力搅拌子以100rpm速度搅拌。
乙醇浓度依前述以气相色谱法进行测定。（Dombek，K，M.和L.O.Ingram

[1985]Appl，Environ.Microbiol.51：197-200），测定值以体积百分比表示。转化率根据所加糖分计算，设定每20克葡萄糖或木糖生成12.75毫升（10.2克）乙醇或每20克乳糖生成13.5毫升（10.8克）乙醇的转化率为100%。所有的经遗传改造的大肠杆菌菌株在添加葡萄时都产生大量的乙醇（见表8）。以菌株ATCC15244（pLOI297）进行的预备实验表明，含有0.2M，pH7.0磷酸钾缓冲液的培养液可使菌株生成更多的乙醇。预计如使用自动酸度调节系统以取代此磷酸钾缓冲液可获得类似或更佳的结果。当葡萄糖浓度为15%时，生长48小时后，30℃生长的细菌的乙醇产量比37℃下生长的菌要多。乳糖和木糖的发酵试验只在较低的温度即30℃下进行。总的来看，带质粒pLOI297的菌体乙醇产量要高出带质粒pLOI308-11的菌。在15%的葡萄糖中生长48小时后，菌株ATCC11303（pLOI297）、ATCC11775（pLOI297）和ATCC15224（pLOI297）产生乙醇的量最多，占总体积的5.8-6.9%。在最初实验中，大多数菌株对木糖的耐受性较差，因而发酵实验的比较即在8%的木糖中进行。在8%的木糖中生长72小时后，菌株ATCC9637（pLOI297）、ATCC11303（pLOI297）和ATCC15224（pLOI297）产生的乙醇量最多。所有的菌株在15%乳糖中都能很好地生长。在乳糖中生长48小后，菌株ATCC11303（pLOI297）和ATCC15224（pLOI297）产生的乙醇量最多，分别为6.1%和5.6%体积比。
表8    携质粒pLOI297和pLOI308-11的大肠杆菌菌株在含葡萄糖（48小时）、木糖（72小时）和乳糖（48小时）的生长条件下经液体发酵的乙醇产量糖    质粒    大肠杆菌(ATCC编号)的乙醇产量(%,V/V)8677    8739    9637    11303    11775    14948    15224    2322715%葡萄糖 pLOI297a2.4 4.7 4.2 4.3 4.8 - 4.8 0.915%葡萄糖 pLOI308-11a3.6 1.4 2.1 1.3 - 3.4 2.8 1.315%葡萄糖 pLOI297b3.2 4.7 4.1 5.8 6.9 - 6.1 3.1
15%葡萄糖 pLOI308-11b5.8 5.0 3.5 1.5 - 3.8 3.0 3.215%乳糖 pLOI297b2.3 4.4 5.3 6.1 4.5 - 5.6 3.715%乳糖 pLOI308-11b2.3 2.1 3.4 0.9 - 2.9 2.7 3.08%木糖 pLOI297b0.9 4.1 4.8 5.2 - - 4.8 1.28%木糖 pLOI308-11b2.0 2.8 2.8 1.2 - 2.0 3.5 1.0虚线表示数据暂缺a.保温在37℃b.保温在30℃比较这些研究结果，可以发现菌株ATCC11303（pLOI297）和ATCC15224（pLOI297）为乙醇生产的最佳构建菌株。经过测定建立了这两个菌株在12%葡萄糖、12%乳糖和8%木糖中的生长时间一乙醇产量关系图（见图1）。菌体量增加了近十倍。终浓度达到每升3.6克干重。菌体量在木糖中的增长率只有在葡萄糖或乳糖中的一半。在这三种糖中，乙醇产量和菌体生长的关系在乙醇浓度达到5%以前大致呈线性相关。
将三组细菌生长120小时后，乙醇终浓度加以平均，以计算由糖生成乙醇的转化率（见表6）。在12%葡萄糖中生长的培养物最终乙醇浓度为7.2%（体积化），为葡萄糖发酵理论得率的94%。对于12%的乳糖，乙醇的终浓度为6.5%，为理论得率的80%。对于8%木糖，其产量总能达到理论值的100%甚至更高。这种在木糖中生长缓慢而又有高产率的现象可能反映了菌体中除由葡萄糖向丙酮酸的转化生成乙醇外，尚有来源于复合营养成分分解代谢的丙酮酸向乙醇的转化。
通过图1所示，计算出乙醇生成率并汇总为表9。乙醇的体积比生成率各有差异，从葡萄糖中的每小时1.4克/升，到木糖中的每小时0.64克/升。在三种糖中，乙醇的生成率在培养的最初阶段均表现为最大，其中最大值在葡萄糖中发现，为每小时2.1克乙醇/克细胞干重。利用木糖可以取得相对每克糖分的最大乙醇得率，超过了仅仅相对糖分的最大理论得率。
表9    菌株ATCC11303（pLOI297）和ATCC15224（pLOI297）产生乙醇的动力学参数平均值糖体积比产量a比生成率b得率c生成效率d乙醇量e12%glucoee    1.4    2.1    0.48    95    5812%lactoee    1.3    2.0    0.43    80    528%xyloee    0.6    1.3    0.52    102    42a克乙醇/升/小时b克乙醇/克菌体干重·/小时c克乙醇/克糖d (生成的乙醇)/(由糖底物转化的理论最大值) ×100e最终乙醇浓度（单位为克/升）对ATCC11303（pLOI297）进行了有关实验，以检查利用阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖生成乙醇的情况。在30℃中培养48小时后乙醇浓度在3%到4%之间，但末能进行进一步的实验。这三种糖类的代谢途径与葡萄糖和木糖的代谢途径相似，估计能取得相近的乙醇得率（Lin，E.CC.

[1987]“Dissimilatory    pathways    for    sugars，polyols，and    carboxylates”，In    F.C.Neidhardt，J.L.Ingraham，K.B.Low，B.Magasanik，and    M.Schaechter[eds]，Escherichia    coli    and    Salmonella    typhimurium，Vol    1，pp    244-284页American    Society    for    Microbiology，Washington，D.C.）实施例14非大肠杆菌宿主的乙醇生产由于不同菌种间代谢途径的高度相似性，预计有很多宿生菌可以接受转化，获得外源基因，从而产生乙醇作为其发醇产物。如文中所述，当宿主要用adh和pdc基因的转化时，完全可以预计，能够利用合适载体达到表达。一旦表达成功，就可以基于不同宿主间代谢途径的一致性而对乙醇的产量作出相当接近的估计。实施例15转化的克氏杆菌中乙醇的产生本发明所应用的克氏菌菌株原先命名为肺炎克氏杆菌M5A1菌株（Klebsiella    pneumoniae    M5A1，MahL，M.C.，P.W.Wilson，M.A.Fife，W.H.Ewing

[1965]J.Bacteriol.89：1482-1487）。该菌株是一种固氮生物，最初曾鉴定为产气杆菌，以后根据其抗原特性重新命名。自第8版《伯杰氏手册》对肺炎克氏杆菌的新分类学标准加以明确说明后，该菌株的物种形成得到了进一步的研究。菌株M5A1在10℃时可在含葡萄糖的基本培养基上生长，但在44.5℃时不能从乳糖产生气体。该菌株吲哚反应阳性，并能利用间羟基苯甲酸盐或二羟苯甲酸盐作为唯一的碳源，在30℃或37℃的温度中生长。基于这些试验结果，M5A1被定名为催娩克氏杆菌（K.oxytoca）。除带有含运动发酵单胞菌（Z.mobilis）基因的质粒的重组细菌外，菌株都在不加糖分的Luria琼脂平板上进行传代培养。含有adhB和pdc基因的重组细菌要求培养基中含某种可发酵糖分才能存活，其菌种在含2%葡萄糖或木糖的平板上传代。所用的抗菌素浓度如下：氨苄青霉素50微克/毫升，氯霉素40微克/毫升，四环素12.5微克/毫升。运动发酵单胞菌adh    Ⅱ基因在重组菌体中的表达通过乙醛指示平板加以筛选。大肠杆菌（Escherichia    coli）菌株TC4作为所有质粒构建体的宿主。由于M5A1对于青霉素及其衍生物有相当高的抗性，我们构建了带有cat（Cmr）或tet（Tcr）基因的大肠杆菌穿梭载体。通过在质粒pLOI276的SalⅠ位点上插入一段来自pcos2EMBL（Poustka，A.，H.R.Rackwitz，A.-M.Frischauf，B.Hohn，H.Lehrach

[1984]Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：4129-4133）的2.6Kb的EcoRI酶切片段，即可向含运动发酵单胞菌pdc基因的pLOI276再插入一个tet基因。粘性末端可在连接反应前经大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段处理而去除。所得构建体经限制性酶切分析加以确证，并编号为pLOI560。以往的研究表明大肠杆菌B（ATCC11303）带有内源的低拷贝数质粒。把运动发酵单胞菌pdc和adh B基因以及cat基因体整合到这些质粒中，即可得到有用的新载体。这个质粒的构建要求先从pLOI510中分离一段不含有启动子而携带pdc、adh B和cat基因的4.6Kb的PstⅠ酶片段。这个片段不具备复制功能。经自连接环化后，这些片段可转化到大肠杆菌B中，在含有2%葡萄糖的Luria琼脂平板上筛选Cmr抗性标记。转化子再在乙醛指示平板上加以鉴定，形成暗红色菌落的即被选为有高水平adhB基因表达活性的转化子。从这些菌株制备质粒再通过转化大肠TC4试验其抗性标记和运动发酵单胞菌基因的共转移能力。所有的转化子都对氨苄青霉素敏感，表明不带含有bla和Col E1复制子的pUC18片段。其中一个质粒，pLOI555（8.4kb），在含乙醛指示平板上形成的菌落红色最深，赋予大肠杆菌极好的产乙醇能力，而根据小量质粒制备所得产率看来，是以低拷贝数存在于菌中。该质粒以及pLOI297和pLOI560可用于转化催娩克氏杆菌M5A1，并以氯霉素抗性（Cmr）加以筛选。
三个含有编码运动发酵单胞菌PDC的基因的质粒构建体转化到M5A1中（见表10）。两个puc构建体（pLOI297和pLOI560）转化子的PDC活性比pLOI555转化子要高出8倍。假定纯PDC的最大比活为100U，则此酶所占细胞质蛋白比例在M5A1（pLOI297）和M5A1（pLOI560）中为25%，在M5A1（pLOI555）中为3.6%。
表10    M5A1重组菌株中质粒稳定性和pdc表达24小时后PDC活性保留性状百分比a,b质粒    U/毫克蛋白    (传代次数)pLOI555    3.6    100(38.5)    98(68.5)pLOI297    28    52(38.6)    10(68.60)pLOI560    27    97(32.9)    0(62.9)
a    培养时两次取样b    乙醛性状和抗性同时消失运动发酵单胞菌（Z.mobilis）基因在M5A1中的表达可进一步通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳加以证实。通过与原始菌株比较，即可容易地辨别出代表PDC和ADH    Ⅱ的样品带。基于pUC的重组子的PDC带与M5A1（pLOI555）相比要宽得多，这一结果与酶活性测定结果相符合。虽然ADHⅡ比PDC含量少，该运动发酵单胞菌基因在M5A1（pLOI297）中的表达比在M5A1（pLOI555）中的也要高些。在只带有运动发酵单胞菌pdc基因的M5A1（pLOI560）中，检测不到相应于ADHⅡ的条带。
根据小量质粒制备实验中的得率，推测pLOI555的拷贝数不到另两个重组体拷贝数的十分之一。虽然这只是大致的推测，但有一点是清楚的，即在以作为载体的重组体中，PDC的高水平表达部分原因在于其拷贝数较高。
带pLOI555，pLOI297，或pLOI560的菌体在30℃含10%葡萄糖而不含抗菌素的Luria培养基连续传代60代以上。培养物经适当稀释后涂布于含2%葡萄糖但不含抗菌素的Luria平板上。使用乙醛指示平板检测菌落是否保留运动发酵单胞菌的产乙醇基因和对适当抗菌素的抗性。
已有报道克隆在pBR322衍生的载体上的运动发酵单胞菌基因在植生克氏杆菌（Klebsiella    planticola）中非常不稳定（Tolan，J.S.，R.K.Finn

[1987]Appl.Eviron.Microbiol.53：2039-2044），不能用于工业生产。带pLOI555的重组子则非常稳定，菌群中98%保留了抗性基因和运动发酵单胞菌基因。虽然通过乙醛指示培养基只检测了adhⅡ基因的表达，这些重组子仍保留了菌落大的表型，表明pdc和adhⅡ基因均已表达。在含10%（w/v）葡萄糖或木糖的Luria培养基中，30℃，pH6.0，100rpm振荡培养条件下进行发酵。将单菌落接种在静止烧瓶中30℃培养过夜，获取种子培养物。用种子培养物接种发酵溶液到初始浓度为OD550    1.0（相当于330毫克细胞干重/升）。用Bausch    and    Lomb    Spectronic    70分光光度计监测菌体生长情况。
乙醇浓度用气液层析法测定。计算转化率时，假定所有糖都被代谢，并校正由于碱的加入而引起的体积变化。由木糖和葡萄糖产生乙醇量的最大理论值据计算为每克糖0.51克乙醇，不计入转化为CO2的部分。以体积比表示的产率根据活性最高的阶段来估算，代表最大活性值。图表中所有发酵数据均为两批以上发酵的平均值。
表11显示了运动发酵单胞菌的PDC及ADH    Ⅱ对M5A1菌株分别从葡萄糖和木糖产生乙醇的影响。显而易见，M5A（pLOL555）是最佳的构建菌株，它利用葡萄糖和木糖产生乙醇的最大产率均达到每小时2.1克/升。该重组子以这两种糖中的任一种作为底物，在30小时后，可产生约37克/升乙醇，49小时后发酵基本结束，产率为45克乙醇/升。
表11通过M5A1重组菌株从葡萄糖和木糖生成乙醇a质粒/基因b碱c时间d乙醇得率理论 VPe30小时细胞量(mmol    (小时)    (克/升)(克/克糖)    得率    (克/升    乙醇    (克/克/克糖)    (%)    /小时)    (克/升)    糖)葡萄糖无质粒    1.0    48    15    0.16    31    1.1    15    0.044pLOI560    0.8    72    44    0.46    90    1.1    15    0.018/pdcpLOI297    0.7    72    50    0.52    102    1.3    24    0.020/pdc  adhBpLOI555    1.0    48    48    0.50    98    2.1    43    0.040/pdc  adhB木糖无质粒    1.9    96    14    0.16    31    0.5    7    0.044pLOI560    0.7    96    37    0.38    75    0.5    5    0.025/pdcpLOI297    0.9    96    37    0.39    76    1.0    12    0.024/pdc  adhB
pLOI560    1.1    48    46    0.48    94    2.0    37    0.054/pdc  adhBa根据最初所加糖总量计算b所标基因来自运动发酵单抱菌（Z.mobilis）c发酵时维持pH6.0所耗碱量d最大乙醇浓度的时间eVP，批量发酵时最大容积产量就乙醇产生而言，M5A1（pLOI555）的生长具有明显优势。该重组子的生长与其亲本菌株几乎相同。与亲本株不同的是细胞密度在培养15小时时达到最大，然后持续下降。由于见不到菌体的裂解，这种下降可能反映了由于乙醇积累而造成的折射率下降。不需要添加碱以控制pH值，带pdc和adh    Ⅱ的重组子，由于减小了酸性产物（中性发酵产物比例较高）的产生，其菌体密度可达到亲本株的两倍以上，如在大肠杆菌中观察的结果一样。
在保持同样高的效率和乙醇终浓度情况下，其最大乙醇产率（每小时2.1克/升）几乎是大肠杆菌重组子的两倍。与大肠杆菌不同的是，M5A1（pLOI555）以同样速率发酵木糖和葡萄糖。在无抗性选择情况下，质粒pLOI555可以在M5A1中稳定存在。就乙醇产生而言，由于M5A1的底物范围与大肠杆菌的相同，M5A1重组子具有明显而始料未及的优势。
实施例16利用欧文菌属及克氏杆菌属产乙醇重组子发酵纤维二糖产生乙醇本例描述了利用欧文氏菌属和克氏杆菌属产乙醇重组子发酵一种寡糖（纤维二糖）。本例所用的欧文氏菌是一典型的胡萝卜软腐欧文氏菌菌株（Erwinia    carotevara）。用实施例15中所述的pLOI555转化欧文氏菌。该转化按Ho等

[1988]Ag.and    Biol    Chem.52（1）293-4的方法，使用Biorad电穿孔器将pLOI555转入欧文氏菌（电压2.0kv，电容25μF，电阻100Ω）。得到大量转化子，转化率大于100，000个转化子/μg质粒DNA。本例所用的克氏杆菌为催娩克氏杆菌M5A1菌株P2，该菌株由实施例18中所述方法获得。
按实施例5中方法，在含10%纤维二糖的Luira培养基（pH6，30℃），100rpm振荡条件下进行发酵。欧文氏菌和克氏杆菌产生的乙醇浓度分别为1.113molar和1.065molar。该实验结果见图6，乙醇浓度以g/L表示。符号■代表欧文氏菌，□代表克氏杆菌。
实施例17利用单一的遗传工程改造的微生物发酵多聚体原料生成乙醇本例描述了用两步法将多聚体底物发酵成乙醇，所用的单一微生物经过遗传工程改造后，可以产生胞内木聚糖酶并产生乙醇作为初级发酵产物。具体过程是，将嗜热细菌热纤维梭状芽孢杆菌木聚糖酶基因切除上游部分与lacZ基因N-末端融合以去除分泌信号。该重组基因在前述的大肠杆菌和催娩克氏杆菌（pLOI555）中能够高水平表达，乙醇发酵时胞内积累大量木聚糖酶。发酵结束时收集含木聚糖酶的菌体，加到较高温度的木聚糖溶液中以释放其具糖化作用的木聚糖酶。冷却后，利用同种微生物将水解产物发酵生成乙醇，同时产生随后的糖化作用所需的木聚糖酶。
微生物及其生长：本例所用细菌菌株和质粒列于表12中。
表12    细菌苗株和质粒细菌/质粒    性状    来源或参考文献大肠杆菌DH5a    lacZM15,recA    Bethesda研究实验室大肠杆菌KO11 frd,Cmr,IpetaOhta等催娩克氏杆菌M5A1 Cmr,petb实施例15,同上(pLOI1555)pCT1202 Apr,xynZ+Grepinet等pLOI1001 Apr,xyIB+Utt等
pLOI2000 Apr,xyIB+本实施例pLOI2001 Apr,lacZ,xynZ+本实施例pLOI2002 Apr,lacZ::xynZ+本实施例pLOI2003 Apr,lacZ::xynZ+,Xy- 本实施例IB+aIpet表示Z.mobilis pdc和adhB基因整合在染色体上。
bpet表示Z.mobilis pdc和adhB基因存在于质粒pLOI555上。
cOhta等

[1991]Appl.Environ.Microbiol.57：893-900.dGerpinet等

[1988]J.Bacteriol.170：4582-4588.eUtt等

[1991]Appl.Environ.Microbiol.57：1227-1234.菌株在添加了50克木糖/升的Luria培养基中培养。大肠杆菌转化子在含50毫克氨苄青霉素/升或40毫克氯霉素/升的Luria琼指平板上筛选。催娩克氏杆菌M5A1转化子在含1000毫克氨苄青霉素/升或40毫克氯霉素/升的Luria琼脂平板上选择。
用含4-甲基伞形糖基-β-D呋喃纤维二糖苷（100毫克/升）的微滴定平板（Millet

[1985]FEMS    Microbiol.Lett.29：145-149）筛选有木聚糖酶活性的重组子。同样，用含4-甲基伞形糖基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷（20毫克/升）的固体培养基（Utt    et    al

[1991]Appl.Environ    Microbiol    57：1227-1234）筛选表达木糖酶和阿拉伯糖苷酶的XylB基因的重组子。阳性克隆水解这些底物后产生一种340nm紫外光下易于检测的荧光产物（伞形酮）。遗传操作和重组技术：质粒制备、限制性内切酶酶切、连接、转化以及凝胶电泳均使用标准方法。在所有质粒构建过程中，均用大肠杆菌DH5α菌株作为宿主。多聚酶链式反应在TempCycler    Modle    50（Coy实验产品公司，Ann    Abor，密执安州.，Ann    Arbor    MI）和含Taq多聚酶的GeneAmp    Kit（试剂盒）（Perkin    Elmer    Cetus，Norwalk，CT）中进行。扩增反应液为100μl，其中dNTP各含2mM，每种引物为100pmol，模板20mg以及2.5    UTaq多聚酶。产物在扩增循环30次（94℃1分钟，47℃2分钟及72℃1分钟;最后一次72℃3分钟）后分离。
酶活性的测定：木聚糖、吡喃木糖苷酶和呋喃阿拉伯糖苷酶活性在30℃过夜培养的重组子中测定。离心（7000g，10分钟）收集菌体，洗涤两次。测定木聚糖酶活性所用洗液为磷酸一柠檬酸缓冲剂（50mM磷酸钾和12.5mM柠檬酸，pH6.3），测定木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性则选用磷酸缓冲液（5mM磷酸钠缓冲液，含100mM    2-巯基乙醇，pH6.8）。菌体在法式压力容器中（20，000psi）破碎两次，得到的裂解物离心（13，000g，30分钟，4℃）以除去菌体碎片。
木糖苷酶和呋喃阿拉伯糖苷酶活性按前述方法测定（Utt，见前）。木聚糖酶活性用同样方法测定，但底物使用对硝基-β-D-纤维二糖苷。木聚糖酶活性也通过测定水解桦木木聚糖（Sigma    Chemical    Company    St，Louis，Mo）产生的还原糖量（Bergmeyer编

[1983]Methods    of    emzymatic    analysis    Vol.Ⅱ，3rd    edition，P151-2，Verlay    Chemie，Weinheim.Germany）来估算。所有活性均以每分种产生产物的mmole数表示。蛋白质浓度用Bradford（Bradford

[1976]Anal.Biochem，72：248-254）方法测定。薄层层析法分离寡糖木糖：用三氟乙酸部分水解0.5%桦木木聚糖（Domer

[1988]Meth    Enzymol    160：176-180）制备寡聚木糖混合液。然后在室温下真空浓缩10倍，并取1μl作为标准。寡聚木糖Whatman    150A硅胶板（Whatman    Inc.，Clifton，New    Jersey）上用由丙酮、乙酸乙酯和乙酸（2∶1∶1）组成的溶剂于室温层析分离。干燥后，如Bounias（Bounoas

[1980]Anal    Biochem    106：291-295）所述，用萘乙二胺试剂使寡聚糖显色。发酵试验：发酵液接种物由新鲜的单菌落接种后在30℃静止培养过夜而制备的。发酵液中初始接种量使O.D.550为0.1或0.3，然后在搅拌的pH恒定器（350ml体积，pH6.0）（Beall    et    al

[1991]Biotechnol    Bioengin    38：296-303;Ohta    et    al

[1991]Appl.Environ    Micnosiol    57：893-900;和Ohta    et    al

[1991]Appl.Gwiron    Microbiol57：2810-2815）30℃保温，发酵液中含氯霉素或同时含氯霉素和氨苄青霉素。木聚糖用两步法来发酵，先在高温下降解木聚糖，然后在30℃发酵。为降解木聚糖，菌体从培养48小时的350ml发酵液中离心（7，000g，10分钟）收集细胞，悬浮于等体积含4%木聚糖（pH6.0）的新鲜Luria培养液中，60℃保温65小时。发酵液冷却到30℃后，用重组微生物接种使接种后的O.D.550为0.3。
在不同时间取样以检测寡聚木糖苷（薄层层析法）、菌体生长（O.D.550）和乙醇。乙醇用气液层析法（Dombek    et    al.

[1985]Appl.Envion    Microbiol    51：197-200）测定。用于水解木聚糖重组质粒的构建：水解天然木聚糖至少需要两种酶的活性，即内切木聚糖酶和木糖苷酶。构建了三个质粒应用于木聚糖发酵，在这些质粒中，源于嗜热菌热纤维梭状芽孢杆菌（Grepinet    et    al

[1988]J.Bacteriol.170：4582-4588）的xynZ（木聚糖酶）基因和源于溶纤维丁酸弧菌（Utt，见前）的xylB（木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶）基因，或单独表达或组成一个操纵子中表达（图7A、7B和7C）。图7A、7B和7C阐述了载有xynZ和xylB的重组质粒的构建。编码区被框出。热纤维梭状芽孢杆菌和溶纤维丁酸弧菌DNA用细线表示，粗线代表载体DNA。平头连接位点用“X”表示。“F”标明未改变阅读框架的lacZ∷xynZ融合基因的编码区。
将xyIB基因亚克隆到pUC18中。具体做法是，切下pLOI1001中带核糖结合位点和xyIB基因氨基末端0.3kbp    Xbal-Pst1片段和带其余xylB基因编码区及翻译终止子的2.4kbp    Pst1片段，将其插入到pUC18多克隆位点中Xbal到Pst切点之间。得到的质粒pLOI2000中lac启动子控制xylB基因的表达。
以前的研究（Grepinet    et    al.，见前）已表明缺失了一个编码分泌信号和木聚糖酶氨基末端大片段的xylB基因与lacZ基因融合，木聚糖酶的表达可被提高。通过将带有切去氨基端xynZ基因的pCT1202的2.4kbp    StyI片段经Klenow处理平头连接到pUC18经Klenow处理的Pst1位点上，构建了类似的lacZ∷xynZ基因融合体。得到的质粒pLOI2001中，两个基因的阅读框架互相匹配。
在构建木聚糖酶和木糖苷酶编码基因同时共表达的质粒前，有必要除去lacZ∷zynZ编码区下游30pb处的转录终止子并在融合基因3′末端加进一个新的SstI位点。这些修饰利用多聚酶链式反应进行。pLOI2001质粒为模板，5′-GAATTCGAGCTCGGTAC-3′为5′端引物，5′-GGGAGCTCCGGCATCATTATATCTG-3′为3′端引物（包含一个新SstI位点）。经SstI酶切后，该片段分别插入pUC18和pLOI2000的多克隆位点中的SstI位点，分别构成质粒pLOI2001和pLOI2003。
有关木聚糖降解的酶的表达：先测定作为质粒构建宿主的DH5α菌株在稳定生长期菌株中表达的木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶的活性（表13）。与带pLOI2001（只携带xynZ基因）的菌株相比，带pLOI2003（在xynZ下游还携带xyIB基因）的菌株中木聚糖酶活性下降60%。然而，在分别带有pLO2000（只携带xyIB基因）和带pLOI2003（xyIB上游还携带XynZ基因）的菌株中，木糖苷酶及阿拉伯糖苷酶活性相近。
表13降解木聚糖的重组酶的比活性菌株和质粒    比活(mU/mg)木糖苷酶阿拉糖苷酶木聚糖木聚糖酶b大肠杆菌DH5a    0    0    0    0pLOI1200    1.2    2.2    0    0pLOI2001    0    0    1.4    124pLOI2003    1.5    2.5    0.5    48大肠杆菌KO11    0    0    0    0pLOI2001    0    0    0.4    38pLOI2003    1.3    2.4    0.3    25pLOI2003c1.1 1.9 0.3 47pLOI2003c,dnd nd 0.8 93催娩克氏杆菌M5A1    53    0    0    0(pLOI555)和pLOI2001    49    0    0.4    39pLOI2003    56    2.6    0.2    24pLOI2001c30 0 0.7 0pLOI2001c,dnd nd 1.8 144pLOI2003c38 2.9 0.4 58pLOI2003c,dnd nd 0.8 144除特别指明外，细胞在含5%木糖的Luria培养基的摆瓶中生长，20小时后收集（静止期）;木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶的活性在30℃测定，木聚糖酶活性在45℃测定。
a木聚糖酶活性以对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷作底物而测定b木聚糖酶活性以0.5%桦木聚糖作底物而测定c发酵结束后从pH恒定器（8%木糖的Luria培养基pH6.0）中收集细胞。
d木聚糖酶活性在60℃测定将质粒pLOI2001和pLOI2003转化到产乙醇基因整合到染色体上的产乙醇菌株E.coli    KO11中。比较在振荡培养稳定生长期菌体中以及在发酵结束后pH恒定器中的菌体中的表达活性（表13）。木糖苷酶、阿拉伯糖苷和木聚糖酶活性与在DH5α中观察到的相近，并且在带pLOI2003（下游携带xyIB基因）的菌株中，木聚糖酶活性下降。
同时测定带pLOI555（携带Z.mobilis中产生乙醇基因）的K.oxytoca    M5A1菌株中的表达活性。虽然不知道pLOI555的复制子类型，但在衍生自pUC18的另一个质粒存在的情况下，pLO555似乎十分稳定。其阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶活性与在E.coli中观察到的大致相同。在M5A1中发现丰富的内源木糖苷酶。与pH恒定发酵液中菌体相比，在振荡培养的菌体中木糖苷酶活性高一些，而木聚糖酶活性变化正相反。
在所用的测试条件下，阿拉伯苷酶活性比木糖苷酶活性高1.5倍到1.7倍，与已所道（Utt    et    al，见前）的结果相同。测定内源木聚糖酶的最佳温度为60℃（Gerpinet    et    al.，见前），47℃下测得的活性仅为60℃的一半。从现有数据来看，从还原性糖测试算出的融合木聚糖酶比活性比根据水解对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷测得的比活高大约100倍，这表明该酶优选利用内源底物。
重组菌株在高温下对木聚糖的水解：KO11（pLOI2003）菌株在含8%木糖的pH恒定培养液中进行培养，然后测定其木聚糖水解酶活性。菌体悬浮于等体积含4%木聚糖的新鲜Luria培养液中，在45℃或65℃下培养，前者是溶纤维丁酸弧菌木聚糖酶可稳定存在的最高温度，后者是热纤维梭状芽孢杆菌木聚糖酶的最佳温度。虽然木聚糖酶和木糖苷酶为胞产物，最初的实验表明它们在45℃和60℃下保温时易于释放到培养基中。在不同时间取样用薄层层析分析水解产物（图8A和8B）。
图8A和8B显示对在45℃（图8A）或60℃（图8B）含4%桦木木聚糖的Luria培养基（pH6.0）中培养的E.coli    KO11（pLOI2003）菌株水解木聚糖后得到的产物进行的薄层层析分析结果。每点样孔加样1μl，各孔下方是培养的时间（以小时表示）。木聚糖的酸性水解产物做为标准加在第一孔（S）中。
发酵产物中可鉴定地出木糖、木二糖、木三糖和木四糖，其中木二糖为主要发酵产物。单体木糖缓慢地积累。对24小时和48小时后水解程度的比较表明，45℃时的水解程度不如60℃，尽管60℃时木糖苷酶不稳定。
尽管60℃65小时后木聚糖水解不完全，此时木聚糖酶仍保持较高的活力，用4-甲基伞形糖基β-D-纤维二糖苷作为底物很容易检测出来。在此温度下木糖苷酶迅速失活。加入含这两种酶的细菌裂解液在60℃继续保温24小时，薄层层析结果表明，木聚糖水解情况不变。因此该寡糖木糖产物是水解Sigma桦木聚糖终极水解产物，可能是氧化型产物或取代成分阻碍其彻底水解。
大肠杆菌和催娩克氏杆菌重组菌株对木聚糖水解产物的利用：进行了小规模试验，以评估E.coli    KO11（pLOI2003）菌株和K.oxytoca    M5A1菌株代谢寡糖木糖的程度。将菌株接入1毫升木聚糖水解液（60℃，65小时;离心除去菌体，留取上清）30℃静止培养48小时。用薄层层析分析样品（图9A和9B）。
图9A和9B显示了大肠杆菌KO11（图9A）及K.oxytoca    M5A1（图9B）重组菌株分别利用寡糖木聚生长的情况。木聚糖（4%）与大肠杆菌KO11菌株（携带pLOI2003）在LB（pH6.0）共保温，65小时后，水解液经离心后过滤除菌，然后接入细菌，30℃培养。每隔24小时取样进行薄层层析分析（各取样时间标于相应点样孔下方）。在第一孔（S）中加入一种寡糖木聚糖混合物作为标准对照。
尽管有活性溶纤维丁酸弧菌木糖苷酶存在，重组大肠杆菌只代谢木糖。而木糖、木二糖和木三糖均可被产乙醇催娩克氏杆菌完全利用。因此选用催娩克氏杆菌衍生菌进行由木聚糖转变为乙醇的进一步研究。
催娩克氏杆菌M5A1衍生菌株对木糖和木聚糖的发酵：木聚糖的发酵采用两步法，预先发酵的菌体被收集后悬浮于含4%木聚酶的Luria培养基进行糖化作用（60℃，65小时）。糖化的木聚糖液接种后在30℃发酵（pH6.0）。同时进行用作对照的平行试验，接种前离心除去菌体碎片，发酵在4.47%的木糖中进行（相当于4%木聚糖中的木糖浓度。这些发酵的数据见表14。
图10A和10B显示了催娩克氏杆菌M5A1将木糖和木聚糖转换为乙醇的情况。预先发酵得到的菌体作为酶源，60℃下水解木聚糖65小时。图10A显示菌体的生长，图10B显示乙醇的产量。符号：▲，M5A1（pLOI555）对4.47%木糖的发酵;○，M5A1（pLOI555和pLI2001）对4.4%木糖的发酵;●，M5A1（pLOI555和PlOI2001）对糖化后未除去菌体碎片的4%木聚糖水解液的发酵;□离心除去菌体碎片后M5A1（pLOI555和pLOI2001）对4%木聚糖水解液的发酵。
表14重组菌株K.oxytoca M5A1（pLOI555）发酵木糖和木寡糖的乙醇得率a底物和第二质粒    碱量    时间    乙醇得率    理论得率    VP    细胞得率mM/g糖 h g/l g/g底物 (%)d(g/l/h)e(g/g糖)木糖(4.47%)    1.2    36    22.6    0.51    99    1.29    0.07单独pLOI555带pLOI2001    1.5    48    21.7    0.49    95    1.02    0.08带pLOI2003    1.3    36    20.6    0.47    91    0.83    0.07木聚糖(40%)带pLOI2001f0.7 24 7.7 0.19 34 0.37 0.04带pLOI2003f1.3 36 7.7 0.19 34 0.31 0.04带pLOI2001g1.3 60 7.8 0.20 34 0.28 nd带pLOI2003g1.1 60 7.9 0.20 35 0.30 nda根据所加总底物计算
b发酵中维持pH6.0所消耗的碱量c达到最大乙醇浓度所需时间d理论得率（按重量计算）对木糖是0.51，对木聚糖是0.56e批量发酵中的最大体积比产量f离心除去糖化碎片的水解液g包含糖化碎片的水解液。
可以看到，M5A1（pLOI555）高效率地生成乙醇。24小时木糖发酵基本完全，可获得为理论最大值93%的产量。在pLOI2001或pLOI2003同时存在时，该菌株在木糖中的生长和乙醇产量均会下降。该菌株在携带pLOI2001后，所需发酵时间延长到约36小时，乙醇产量为理论值的91%。这种由单糖生成乙醇产率的下降反映了表达外源酶对重组菌株是额外负担。
用携带质粒pLOI2001（含本苷酶基因和重组木聚糖酶基因的M5A1（pLOI555）水解木聚酶（60℃，65小时）。其水解产物的薄层层析结果表明，水解液成分与KO11（pLOI2003）的（见图9A和9B）相同。这两个M5A1衍生的菌对木聚糖水解的程度相同。
水解产物中接入糖化作用时各自的微生物后，测定菌体的生长和乙醇的产量（图10A和10B）。在澄清水解液中，生长量仅为在同等水平木糖中的一半，而其发酵速度稍快些，24小时后发酵基本完全。由木聚糖产生乙醇的得率约为理论最大值的1/3，为7.7到7.9g/l。
发酵液中的寡聚木糖用薄层层析监测，发酵结束时各成分的情况与图9B（48小时）所示的相同，其中木糖、木二糖和木三糖被完成代谢，木四糖和更长的寡糖体仍然存在。
讨论由此可见，经高度改造的K.oxytoca    M5A1菌株既可作为酶源用于多聚体的水解又可用于发酵木聚糖生成乙醇。该菌体内源的胞内木糖苷酶的存在及其运输和代谢寡糖木糖能力，以前从未报道。据报道，野生型大肠杆菌有纤维二糖磷酸转移酶系统和一种胞内磷酸纤维二糖酶（Hall    et    al.

[1987]J.Bacteriol    169：2713-2717;Kricker    et    al.

[1987]Genetics    115    419-429）。K.oxytoca    M5A1在代谢木二糖和木三糖的过程中可能存在类似系统。K.oxytoca    M5A1中存在的转运系统和代谢单体、二聚体和三聚体木糖酶，使之在进一步利用乙醇产生所需的生物量方面较大肠杆菌或啤酒酵母系统有很大优势。以前用遗传工程手段改造单微生物使之能降解多聚体并产生乙醇时所出现的问题，在使用细胞内热稳定蛋白质的两步法发酵过程中得到了解决。高水平合成分泌蛋白常常会影响正常细胞生理过程，切除N端分泌信号，使酶在细胞内表达，这样，可以缓解这个问题。由于在转换中水解时间是限制因素，高水平的水解酶将最利于在转换过程中最初就最大量地为快速发酵提供糖分。在需要酶分泌的过程中，起始时酶量水平很低，接近发酵结束时，积累达到最高。但是如果用预先发酵菌体作为酶源，一开始就可以达到最大酶量水平。使用热稳定酶水解除有利于减少污染并提高水解速率外，最大好处在于可从收集菌体中方便地释放胞内酶。
乙醇耐性在降解纤维素和木聚糖的天然微生物中往往是个问题。这些微生物产生的乙醇一般少于20克/升（见Taillez    et    al

[1989]Appl    Environ.Microbiol.55：203-06）。尽管由木聚糖生成乙醇的水平还不高，M5A1（pLOI555）至少能够从100克/升木糖产生48克/升乙醇（约为理论最大得率的95%）。从桦木木聚糖产生乙醇的总量比预期低，主要归因于木聚糖水解不完全。糖化65小时后，似有未降解的寡聚木糖。虽然我们的重组体表达的木聚糖酶水平比Grepinet    et    al.，（见前）所述的最佳木聚糖酶融合重组体表达的水平低些，但它仍有足够的表达水平。以105μmoles/分钟的水解速率，24小时后木聚糖（40克/升;约0.3moles的脱水木糖）应被完全降解为木聚二糖。发酵所得菌体约4.5g细胞蛋白/升，木聚糖比活性为144μmoles/分钟/克细胞蛋白，总活性为648umoles/分钟。65小时后尽管木聚糖酶尚有活性，仍有未降解的寡聚木糖存在，在加入新酶继续保温24小时后，寡聚木糖水平不变。水解不完全可能归因于寡聚木糖对水解的竞争性抑制。在45℃水解反应中检测这种竞争性抑制情况，该温度下木聚糖酶和M5A1中内源的代谢木糖、木聚二糖及木聚三糖的酶均保持活性。该条件下的寡糖成分与M5A1发酵后的寡糖成分相同都还有同样水平的未降解的木聚四糖和更长的寡糖存在（数据未列出）。这些寡糖看来限制水解，但限制水解的基因的实质尚属未知。据制造商的指标，其桦木聚糖含99%木糖。本发明的研究者推测此产品含有在贮藏和取代过程中产生经碱提取和纯化处理后仍然存在的氧化性残基，（Chesson等

[1983]J.Sci.Food.Agric    34：1330-1340）。在美国乙醇发酵产量约为每年十亿加仑（38亿立升）（Lynd等Science    251：1318-1323）。许多细菌，如经遗传改造的催娩克氏杆菌、大肠杆菌、啤酒酵母或运动发酵单胞菌等，均可用于生产一系列酶蛋白，作为乙醇发酵的共产物。以每升啤酒2克蛋白的最低细胞得率计算，只要有5%的细胞蛋白获得转化，就可获得至少3，800，000千克的酶蛋白共产物。这些酶并不仅限于催化底物解聚以供发酵用的酶类，也可以包括一些需求量很大的其他酶类，如应用于去污剂工业、食品工业、木材制浆业、或用生物催化剂生产化学药品的新兴工业等行业的各种酶。如果这些市场能够得到发展，则这些酶的应用价值才会远远超过目前用于生产乙醇的价值。
实施例18    通过重组催娩克氏杆菌（Klebsiella    oxytoca），其携带有整合在染色体上的运动发酵单胞菌（Z.mobilis）产乙醇基因和表达热纤维梭状芽孢杆菌（Clostridium    thermocellum）热稳定纤维素酶基因的质粒，发酵纤维二糖、无定形纤维素和晶状纤维素生产乙醇在本实验中，运动发酵单胞菌（Z.mobilis）产乙醇基因被整合到催娩克氏杆菌（Klebsiella    pneumonia）M5A1菌株染色体上。菌株P2是其中最佳构建体，它除了从单体糖还从纤维二糖有效地产生乙醇。该菌株对纤维二糖和纤维三糖的利用，免去了对外源β-葡萄糖苷酶的需要，降低了发酵SOLKA    FLOC    SW40（主要为晶状纤维素）所需商品纤维素酶的用量。加入带有编码热纤维梭状芽胞杆菌（Clostridium    thermocellum）内切葡聚糖酶的基因的质粒，导致在发酵过程中细胞内热稳定酶类作为乙醇共产物而积累。最佳构建体P2（pCT603T）包含celD基因，它被用来将无定形纤维素水解成纤维二糖，在二步发酵过程中产生乙醇。也对P2（pCT603T）与商品纤维素酶联合应用进行了试验。在60℃用内切葡聚糖酶D对SOLKA    FLOC    SW    40进行预处理，能降低发酵SOLKA    FLOC    SW    40所需的商品纤维素酶用量，幅度可达80%。内切葡聚糖酶预处理产生的促进作用，可能是由于无定形区域的水解所致，由此暴露出更多的位点而受到真菌纤维素酶的作用。内切葡聚糖酶D在热纤维梭状芽孢杆菌中作为一复合体的组分行使功能，因此很可能该酶与真菌酶形成复合体，或者与纤维素结合产生更多的开放结构，进行水解。
实施例17说明了在催娩克氏杆菌M5A1，作为乙醇的共同产物，积累热纤维梭状芽孢杆菌木聚糖酶的优越性。在本例中，本发明者将产乙醇基因整合进催娩克氏杆菌M5A1中，并说明产生的细菌能有效地将纤维二糖转化成乙醇。该菌看来能够转运和代谢纤维二糖和纤维三糖，免去对异源β-葡萄糖苷酶的需要。在该整合体中加入质粒，使得与乙醇一起产生热稳定内切葡聚糖酶，从而在纤维素发酵过程中降低对商品纤维素酶的需要。
菌种及生长条件：表15列出了本研究所用的新菌种和质粒。带有产乙醇基因的菌种长在含2%葡萄糖的Luria琼脂板上（3）;其他菌株长在不加糖的Luria琼脂板上。除特地说明外，选择时使用氯霉素（50μg/ml），四环素（6μg/ml），和氨苄青霉素（50μg/ml）。按常规，大肠杆菌（E.coli）在37℃培养，催娩克氏杆菌在30℃培养。运动发酵单胞菌产乙醇操纵子的表达根据乙醛指示平板颜色出现的快慢来检测（Conway等

[1987]J.Bacteriol.169：2591-2597）。筛选具纤维素酶活性的菌落，先在含羧甲基纤维素的Luria琼脂板上，55℃培养1至2小时，然后用刚果红染色（Wood等

[1988]Meth.Enzymol.160：59-74）。表    15    本研究所用菌株和质粒细菌菌株/质粒    特性    来源或参考文献菌株催娩克氏杆菌M5A1 Cmr,petb实施例15(pLOI555)S1 Cmr,Ipeta本实施例S2 Cmr,Ipeta本实施例S3 Cmr,Ipeta本实施例P1 Cmr,Ipeta本实施例P1 Cmr,Ipeta本实施例P2 Cmr,Ipeta本实施例B1 Cmr,Ipeta本实施例质粒pCOS2EMBL TcrPoustka et al.cpLOI510 CmrpetbOhta et al.dpCT105 AprcelA+Cornet et al.epCT207 AprcelB+JeffriesfpCT301 AprTcrcelC+Petre et al.gpCT603 AprTcrcelD+Joliff et al.hpCT105T AprTcrcelA+本实施例pCT207T AprTcrcelB+本实施例pCT603T AprTcrcelD+本实施例aIpet表示Z.mobilis pdc和adhB基因整合在染色体上。
bpet表示Z.mobilis pdc和adhB基因在质粒pLOI555上。
cPoustka等（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：4129-4133.
dOhta等（1991）Appl.Environ.Microbiol.57：2810-2815.
eCornet等（1983）Bio/Technology 1：589-594.
fJeffries;载于J.F.Kennedy等编《木材与纤维素研究：工业利用，生物工艺学，结构和性质》John Wiley & Sons，New York（1988）.
gPetre等（1986）Biochimie 68：687-695.
hJoliff等（1986）Bio/Technology 4：896-900.
遗传学技术和质粒构建：按照标准方法进行操作。用缺少所有复制功能的环化DNA转化菌体细胞，从而将pet基因整合进入菌株M5A1，其中所用的环化DNA包括三个基本组分：1）大肠杆菌的pfl基因或M5A1的DNA;2）Z.mobilis的pet基因;3）用于选择的cat基因。重组子先用20μg/ml氯霉素的培养基选择，并表达低水平的Z.mobilis酶蛋白。在大肠杆菌的转化子中（Ohta等

[1991]Appl.Environ.Microbiol.57：893-900），用600μg/ml的氯霉素直接选择出抗性变种，其外源基因的表达大为增强。保留每一独立整合一个表现高水平抗性的单菌落。将四环素抗性分别加到含celA基因（pCT105）、celB基因（pCT207）和celD基因（pCT603）的质粒中。质粒pCT105和pCT207以BamHI酶切后，用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段处理以获得平头末端。质粒pBR322经EcoRI酶切后以用同样方法形成平头末端。这三种质粒再以SalI酶切，将得到的pBR322含tet基因5r-末端的小片段连接到由pCT105和pCT207得到的大片段上，形成有功能的tet基因（先因插入热纤维梭状芽胞杆菌DNA而失活），构建的质粒分别称为pCT105T和pCT207T。将质粒pCOS2EMBL（Poustka等，见前）的一个含完整tet基因的2.5kb EcoRI酶切片段，插入到质粒pCT 603中唯一的EcoRI位点上形成质粒pCT603T。质粒pCT301同时带有celC基因和功能tet基因，因而无需改造。所有含纤维素酶基因的质粒转入催娩克氏杆菌重组子，都用四环素抗性选择。
纤维素酶活性：含菌培养液和无菌培养液的内切葡聚糖活性，以对硝基苯-β-D-纤维二糖苷为底物，在60℃测定（Petre等，见前）。内切葡聚糖酶D的活性也根据由无定形纤维素产生还原糖的量来测算。无定形纤维素（酸涨和碱涨）依以前的方法（Wood

[1988]Meth.Enzymol.160：19-25）从SOLKA    FLOC    SW40制备。还原糖依Nelson-Somogyi方法进行测定（Bergmeyer等

[1983]pp.151-152，载于Bergmeyer    H.U.（编）Methods    of    enzymatic    analysis（酶学分析方法）Vol    Ⅱ.3rd    edition（第二卷第三版），Verlag    Chemie，Weinheim，Germany.无定形纤维素的起始浓度作为总糖依酚-硫酸法测定（Wood

[1988].Meth    Enzymol.160：87-116）。在含乙醇酶系基因并表达cel基因活性的重组子之间内切葡聚糖酶活性的比较依下述方法进行：在18mm×150mm培养试管中，先放入约15毫升的用10%低粘度羧甲基纤维素（Sigma    Chemical    Company，St.Louis，Mo.）固化的LB培养基，再铺以2ml的静止期培养液。在55℃培养48小时后，通过倒转试管来确定液化程度。
纤维素水解产物依前述测定木糖苷和木聚糖水解物的方法，用薄层层析法分析（Domer等

[1988]Meth.Enzymol.160：355-362）。葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖可与寡糖分开。用纤维二糖和葡萄糖作标准。发酵实验：发酵在带pH恒定器的500ml    Fleaker中进行，发酵体积350ml，基本按照以前所述进行（Beall等，见前）。用含10%葡萄糖或10%纤维二糖的Luria培养基在30℃、pH6.0、100rpm转速条件下进行试验。发酵种子培养物生长在含50ml    Luria培养基（含4%葡萄糖）的250ml烧瓶中，30℃静止培养过夜。混合后，在550nm下测菌体浓度，以计算所需体积，使起始菌浓度为0.32mg细菌干重/ml（O.D.550nm＝1.0）。离心收集这部分体积的菌体，以各pH恒定培养器中的少量培养液悬浮开始发酵。
糖溶液通过过滤单独进行灭菌。纤维素发酵包含50克/升SOL-KA    FLOC    SW    40（购自James    River    Corporation，Saddle    Brook，NJ），在35℃进行。纤维素以干粉形式高压灭菌。为考察商品酶类在纤维素发酵中的效用，在接种时另加了CYTOLASE或MULTIPECT。
取样后测定其中的菌体数（O.D.550nm）和乙醇量（气相液相层析;依Beall等，见前）。乙醇浓度以克/升表示。由于发酵过程中加碱增大了发酵的体积因此乙醇得率要作校正并参照总糖或纤维素的起始浓度进行计算。糖残基无需校正。经糖酵解和发酵的乙醇最大理论得率为0.51克/克葡萄糖、0.536克/克纤维二糖、0.56克/克纤维素。除特别指出的以外，结果均为两次或更多次发酵的平均值。
商品纤维素酶：检测了两种商品纤维素酶，即CYTOLASE    M104和MULTIFECT    CL（Genencor    International，Rolling    Meadows，IL）。两种酶都以溶液状态提供，估计为来自经适当修改的Trichoderma    longibranchiatum变种培养液。按说明书，两种酶皆为包括果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶的混合物。这些酶制剂目前经改造用于食品加工。
运动发酵单胞菌（Z.mobilis）pet基因整合到M5A1染色体上：有三种途径可将pet基因整合到M5A1的染色体中（Orsdov

[1984]P461-465，载于N.R.Kreig和J.G.Holt编《伯杰氏手册》第一卷。由于催娩克氏杆菌的大肠杆菌和亲缘性很近，可将大肠杆菌的pfl基因作为潜在的同源DNA，以促进类似用于大肠杆菌的方法中的重组过程（Ohta等，Appl.Environ.Microbiol.57：893-900）。从质粒pLOI510中，分离出携带位于大肠杆菌（E.coli）pfl基因中的pet基因和cat基因的8.6kb    SalI酶切片段。此片段（不含与复制有关的基因）经连接环化后，转入M5A1并直接选择获得整合的重组子。也可以分离仅包括大肠杆菌pfl基因两侧较短序列的一个5kb的PstI酶切片段用同样方法整合。第三种方法是将催娩克氏杆菌M5A1的同源DNA（2kb长Sau    3A随机酶切片段）连接到一个4.6kb长的只含有pet基因和cat基因（非大肠杆菌DNA）的Bam    HI酶切片段用于细菌转化。在三种方法中，都用含2%葡萄糖和20μg/ml氯霉素的LB固体平板来选择已整合的菌株。经SalI酶切的片段获得3个整合菌株，Pst片段处理的得到2个整合菌株，BamHI片段的整合菌株只挑到一个。在液体培养液中过夜培养后，取0.1ml的静止期细菌在含600μg/ml氯霉素和2%葡萄糖的固体平板上涂布，以挑选高表达的菌株。保留来自各个独立的整合形态较大的单菌落，并根据构建时所用的内切酶而进行编号，即S1、S2、S3、P1、P2和B1。对这些单菌落再进行小量制备DNA的转化试验以确定质粒的存在，并进行乙醛指示剂平板上的pet基因表达实验（表16）。抽取重组菌落DNA，若经酶切后证实了存在pLOI510（估计凝胶电泳纯化片段中有少量污染），则弃去该带携带cat基因的质粒的假整合菌株。出发菌株和M5A1（pLOI555）（后者为理想的产乙醇菌）在实验中分别作为负、正对照菌株。菌株B1和P2表达的产乙醇基因活性水平接近M5A1（pLOI555）。
表16含整合的pet基因的M5A1菌株在10%葡萄糖环境中（48小时）的发酵反应菌株a碱菌体量b乙醇量乙醛平板反应c质粒d(mM/L)    (g/L)    (g/L)M5A1    108    3.2    15    -    -M5A1    91    5.1    45    ++++    +(pLOI555)S1    120    2.9    37    +    -S2    171    3.2    44    ++    -S3    97    2.4    37    ++    -
P1    120    2.0    38    ++    -P2    91    3.7    44    +++    -B1    63    4.0    47    ++++    -a提供的数据多为一次实验得到的结果。其中某些数据在后继试验中经过重复和平均处理。
b菌体量根据O.D.550nm处的最大值计算（干重约0.32克/升/O.D.单位。
c以30℃中乙醛指示剂平板上颜色形成的相对速度作为pet操纵子表达的相对测定值。
d在琼脂糖凝胶上测定DNA的小量制备，并检测其在转化过程中将对抗生素的耐药性转移给大肠杆菌DH5α的能力整合菌株与M5A1（pLOI555）菌株葡萄糖发酵的比较：培养48小时后，有四株整合了pet基因的菌株产生与M5A1（pLOI555）同样高水平的乙醇（见表16）。其中两株菌长到最大密度，产生的酸性共产物最少，这两株命名为P2和B1的菌被挑选出来作进一步考察。
菌株P2和B1的葡萄糖发酵和纤维二糖发酵：检查了菌株P2和B1发酵10%葡萄糖和10%纤维二糖的能力（见表17）。在葡萄糖发酵过程中（见表17A），这两株整合菌株都能产生比出发菌M5A1高3倍的乙醇量，但在乙醇的得率和体积比产量方面都略低于菌株M5A1（PLOI555）（含质粒携带的pet基因）。出乎意料的是，菌株B1中pet基因的整合及高水平表达，却伴随着发酵纤维二糖的能力的丧失。而菌株P2在纤维二糖存在时生长良好并生成乙醇（见图11B），其得率达到理论最大值的96%。
图11A和图11B说明了各个催娩克氏杆菌M5A1的重组菌株产生乙醇的情况。图11A显示了由葡萄糖（100克/升）获得的乙醇量。图例说明：●，菌株M5A1（pLOI555）;▲，整合了pet基因的P2菌株;■，整合了pet基因的B1菌株;○，对照菌M5A1。图11B显示了P2菌株经纤维二糖发酵的乙醇产生。图例说明：▲，乙醇量;△，细胞量。
a葡萄糖和纤维素二糖的发酵在30℃进行;其它的发酵过程在35℃进行;
b酶在接种的同时加入。
c在6至24小时之间计算。
d对发酵中用于稀释的碱液进行校正。S（底物）代表葡萄糖、纤维素二糖或SOLKA FLOC SW40。
e计算时以最大理论得率为：51克乙醇/100克葡萄糖，53.5克乙醇/100克纤维素二糖，28克乙醇/50克纤维素。未对底物残基进行数据校正。
fSOLKA FLOC SW40经由预发酵收集的细胞在60℃预处理12个小时。预发酵可获得热纤维梭状芽孢杆菌celD产物。冷却至35℃后在培养液接入菌液并加入1%体积比的商业纤维素酶开始发酵。
在不同浓度的商品纤维素酶存在下，催娩克氏杆菌M5A1重组菌株与大肠杆菌对结晶态纤维素（SOLKA    FLOC    SW    40）发酵的比较：含产乙醇基因的大肠杆菌只能利用葡萄糖。催娩克氏杆菌的重组子P2与此不同，它还能发酵纤维二糖，并不需外源β-葡萄糖苷酶。为测定利用纤维二糖对从用商品酶由纤维素生产乙醇的产量提高程度，发酵以50克SOLKA    FLOC    SW40为底物，在含有0-10%的CYTOLASE或MULTIFECT溶液中进行（见图12和表17）。这两种酶制剂都含有一套包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶在内的真菌酶混合物。
图12显示发酵120小时后添加了商品纤维素对酶由每升发酵液中50克SOLKA    FLOC    SW    40转化的乙醇得率的影响。虚线表示仅由添加的纤维素转化的乙醇最大产量。较高水平的乙醇生成主要是由于加入了适当改进后的MULTIFECT    CL制剂作为额外底物。图例说明：▲，催娩克氏杆菌与MULTIFECT的发酵;■，大肠杆菌KO11菌株MULTIPECT的发酵;△，催娩克氏杆菌与CYTOLASE的发酵;□，大肠杆菌KO11菌株与CYTOLASE的发酵。
在低浓度时，CYTOLASE的作用似更为有效，但高浓度的制剂，对细菌有某种毒害作用。在所有实验中，催娩克氏杆菌整合菌株表现的性质要比大肠杆菌KO11菌株为佳，尽管有β-葡萄糖苷酶的商品纤维素酶制剂存在。综合上述结果，说明市购纤维素酶制剂中的β-葡萄糖苷酶相对于其它的纤维素酶活性而言，其活性并未达至饱和状态。
在最大浓度的MULTIFECT存在时，观察到由纤维素（50g/L）取得的乙醇得率超过了理论最大值。为研究这部分额外乙醇的代谢来源，发酵作用在不加糖或酶的LB培养液及加10%CYTOLASE或10%MULTIFECT但不加糖的LB培养液中分别进行。在单独LB培养条件下均产生1克/升乙醇，而在添加10%纤维素酶的培养条件下产生的乙醇量约为5克/升。因而在含10%MULTIFECT的发酵作用中，产生的乙醇中有大约4克/升的量来源于对商品添加剂或酶稳定剂的利用。还可能由低浓度纤维素酶产生一定比例的乙醇。扣除可能由LB组分和10%MULTIFECT转化成的乙醇，纤维素发酵的乙醇得率约为理论最大值的94%。
热纤维梭状芽孢杆菌的纤维素基因在P2菌株中的表达：纤维二糖能被菌株P2段利用，也是内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶催化的纤维素酶解反应的主要产物。虽然本发明中所用的菌株都不能合成这两种酶。但在把pet基因整合到染色体上后，有利于引入包含编码这些酶的异源基因的质粒，从而在发酵过程以共产物形式合成这两种酶。在进行了四环素抗性选择之后，又对嗜热菌热纤维梭状芽孢杆菌的四种内切葡聚糖酶的表达进行了检测。celD基因在大肠杆菌中的表达水平非常高，在P2菌株的表达也较强。菌体细胞保持了大部分由这些基因产生的内切葡聚糖酶活力，尽管已知克氏细菌菌株具有蛋白质分泌系统而不排除有部分酶分泌到胞外。
对CMC液化效应的定性比较在55℃生长48小时内的试管培养物中进行，其结果与活性检测定的结果一致，即带celD基因（pCT603T）的重组菌株最为有效，其次是带cel    C基因（PCT301）的重组菌株。带cel    B基因（pCT    207T）的P2菌株生长情况很差，未作进一步的测试。cel    A（pCT105T）重组子只有轻微的液化效应。
对异源基因产物的合成对发酵作用的影响也作了研究。在获得了可表达任何cel基因的质粒后，菌体在10%葡萄糖发酵中最终细胞浓度下降10-30%，乙醇产量也有所下降（见表18）。celD基因的表达对细胞损害最小，此时产率为每克葡萄糖0.32克乙醇，是理论最大值的62%。测定在60℃中以对-硝基苯-β-D-纤维二糖苷为底物进行，单位为每分钟里每毫升含菌培养液或经离心除菌的培养液中生成水解物的微摩尔数。
表    18热纤维梭状芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因在P2菌株中的表达基因    质粒    活性(单位/毫升)菌体+培养液    培养液    相关细胞百分比对照    无    0.2celA    pCT105T    2.3    0.4    83celB    pCT207T    17    0.8    95celC    pCT301    41    6.2    85celD    pCT603T    49    13    73表达celD基因的P2菌株对无定形纤维素的水解和发酵利用：celD基因的产物不能水解结晶形纤维素，但已知此酶能水解无定形纤维素（Beguin等，Joliff等，前述）。测试了表达该基因的菌株P2（pCT603T）转化无定形纤维素生成乙醇的能力。通过两步法批量发酵，检测了经磷酸或碱液（氢氧化钠）涨泡处理的SOLKA    FLOC    SW40生成乙醇的情况，在此实验中预先葡萄糖发酵，获得P2（pCT    603T）菌体，以提供内切葡聚糖酶D，再用该菌体发酵产生乙醇。
反应的第一步是将细菌在3ml含76mg/ml酸涨纤维素或32mg/ml碱涨纤维素的LB培养液中，在60℃（pH6.0）培养72小时，所用细菌先经等体积的葡萄糖发酵后收集获得。加热到60℃，使细胞失活，释放内切葡聚糖酶D，同时也为酶作用提供近似最适温度。水解过程中检测还原性糖的释放量。虽然底物浓度不同一样，但酸涨纤维素的水解是碱涨纤维素的两倍，在培养24小时后分别产生240μmolar当量的60μmolor当量的纤维二糖。纤维素经碱涨后十分粘稠，使取样比较困难。对碱涨纤维素酶解72小时后，可产生110μmolar当量的纤维二糖。上述结果都表明经酸涨或碱涨处理的纤维素，其水解都比较完全。
图13A、B、C为纤维素经菌株P2（pCT603T）水解和发酵利用后的薄层层析分析结果。对酸涨纤维素（图13A）、碱涨纤维素（图13B）和结晶形纤维素（图13C;SOLKA    FLOC    SW40）都做了检查。每张图中的第一条道为纤维二糖和葡萄糖的标准样品。图13A和B中，由第二至第六条道分别为水解无定形纤维素过程中同时间取的样（分别为0、6、12、24、48和72小时）;第七条道为第六条道好样品培养液与菌株P2（pCT603T）在30℃发酵24小时后的获取的样品。
图13C为结晶形纤维素（SOLKA    FLOC    SW40）经1%MULTIFECT和表达热纤维梭状芽孢杆菌celD基因活性的PZ（pCT603T）菌共同发酵后的薄层层析结果。每条道样品分别为：2，酶解前新配的SOLKA    FLOC悬液;3，经内切葡聚糖酶D    60℃酶解24小时的培养液;酶由经预发酵的P2（pCT603T）提供;4，第三条道样品再经P2（pCT603T）菌发酵24小时;5，再经P2（pCT603T）菌35℃35℃发酵24小时（总发酵时间48小时）后的样品。
总之，图13A和13B中第二至第六条道分别显示了经酸涨和碱涨处理的纤维素在不同时间的酶解产物情况。纤维二糖在两种情况下都是主要的产物，同时还产生少量的葡萄糖。对酸涨纤维素酶解后还有少量的纤维三糖形成。将这些培养液冷却至35℃后，接入50微升的P2（pCT603T）菌，在静止和pH不控制的条件下发酵24小时。在此期间葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖（见图13A和B中的第7孔带），得到约5克/升的乙醇产物。在碱涨纤维素中，乙醇产量为0.16克/克纤维素。pH的下降可能会抑制乙醇的生成，但乙醇得率达到了理论最大值的27%。
以热纤维梭状芽孢杆菌内源的内切葡聚糖酶部分替代商品纤维素酶：P2（pCT603T）菌株并不需要另加β-葡萄糖苷酶，其本身即能形成内切葡聚糖酶D来水解无定形纤维素，但当水解结晶态纤维素时则要求其它酶活性。在两步法发酵中，测试了此菌株部分替代商品纤维素酶的能力。预经葡萄糖发酵的菌体细胞经收集后悬浮在等体积含50克/升SOLKA    FLOC    SW40的LB培养液中，在60℃培养24小时后冷却至35℃，再接入同一菌株，并加入1%商品纤维素酶。对CYTOLASE和MULTIFECT都得到相近的结果，乙醇得率为17.4克/升，为理论最大值的65%（见表17）。
如图14所示，使用CYTOLASE情形下，以celD基因产物进行预处理可大大提高利用1%纤维素酶产乙醇量，所得乙醇得率相当于5%CYTOLASE的乙醇得率。图14中，纤维素（50克/升的SOLKA    FLOC    SW40）经CYTOLASE和内切葡聚糖酶D不完全糖化作用后，由P2菌株和P2（pCT603T）菌株发酵。图例说明：△，在接种时每100毫升培养液加入5毫升CYTOLASE，P2菌进行发酵;□，在接种时每100毫升培养液加入1毫升CYTOLASE，P2菌进行发酵;○，在接种时每100毫升培养液加入0.1毫升CYTOLASE，P2菌进行发酵;□，SOLKA    FLOC    SW40经P2（pCT603T）菌株60℃预处理12小时后进行发酵，菌株经预发酵作用以提供热纤维梭状芽孢杆菌内切葡聚糖酶D。冷却至35℃后，加入P2（pCT603T）菌株和每100ml发酵液含1ml的商品纤维素酶，开始发酵。
图13C显示了用MULTIFECT在两步法发酵的不同阶段中取样的薄层层析结果。葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖同样被完全代谢。因而经由第一步发酵中以乙醇共产物产生了内切葡聚糖酶D的重组菌株预处理后，糖化作用所需的商品素酶用量可最多可减少80%。
讨论：已知由β-葡萄糖苷酶催化的从纤维二糖到单糖的水解反应通常会限制真菌培养液对纤维素的水解。在有效水解纤维素所需的关键酶中，β-葡萄糖苷酶活性通常最少，同时也最不稳定。纤维素酶水解产物纤维二糖的积累是寡聚糖进一步水解的竞争性抑制物（Eriksson等

[1990]Microbiol    and    enzymatic    degradation    of    wood    and    wood    components.Springer-Verlag，New    York;Jeffries，见前）。催娩克氏杆菌P2菌株是最先报道的能快速有效地转化纤维二糖生成高水平乙醇的细菌。这种细菌似乎能够主动转运纤维二糖和纤维三糖，从而降低了纤维二糖的积累，不需再加入外源酶进一步解聚。对催娩克氏杆菌中的纤维素二糖转运系统未作研究（Al

[1989]J.Biotechnol.12：79-86），但与其亲缘关系很近的大肠杆菌携有编码磷酸转移酶组分和磷酸葡萄糖苷酶的基因，这两种酶在纤维二糖的代谢中发挥作用，大多数实验用菌株中该代谢是隐性的，但在自然界的微生物中发挥作用（Hall等J.Bacteriol    169：2713-2717;Kricker等。

[1987]Geneties    115：419-429），在催娩克氏杆菌中可能是相似的基因在起作用（Al，同前述）。乙醇产生有关因整合到染色体后，有利于乙醇发酵的同时合成由质粒编码的重组蛋白。热纤维梭状芽孢杆菌纤维素酶基因的应用只是一个例子，其它更多的有价值的重组蛋白，如脂酶、蛋白酶、糖水解酶、动物激素和生物医学产物等均可通过同样的方法生产。用P2菌株生成热纤维梭状芽孢杆菌纤维素酶作为共产物的同时，发酵效率意外地出现下降。这种现象的原因尚不清楚，尽管本发明在带热厌氧细菌（Thermoanaerobium    brockii）支链淀粉酶基因的产乙醇大肠杆菌和表达热纤维梭状芽孢杆菌木聚糖酶基因的多质粒产乙醇催娩克氏杆菌改造菌株中，也观察到同样的现象。
由此，以前述实施例中的催娩克氏杆菌为基础，改进由纤维素转换生成乙醇的途径。已知纤维二糖和纤维三糖是内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制物，而β-葡萄糖苷酶催化这些寡糖向葡萄糖单体的转变。但产乙醇重组菌株，如P2菌株，代谢时不需糖的解聚过程，因而不需β-葡萄糖苷酶，同时也减少了纤维二糖和纤维三糖对纤维素酶的末端产物抑制作用。使用该菌株的另一个优点是减少了污染的可能性，因为相对而言能利用纤维二糖或纤维三糖的细菌比能利用单体葡萄糖的菌种要少得多。比起不能利用纤维二糖的大肠杆菌KO11，催产克氏杆菌所表现的转运和分解纤维二糖及纤维三糖的功能减少了在纤维素发酵过程中对商品酶类的需求量。
通过利用补充的发酵共产物内切葡聚糖酶，商品纤维素酶的用量可以进一步减少。从这个角度出发，热稳定酶显然特别有用，因为该酶在发酵后的菌体中大量存在，只须升高温度便可以活性形式从菌体释放出来，并在该温度下活性最大。将SOLKA    FLOC    SW40经预发酵合成的内切葡聚糖酶的预处理，可以大大提高Genencor纤维素酶的效率。由于内切葡聚糖酶D只对纤维素的无定形区域有催化活性（Beguin等，同前述），因此上述预处理有利于形成商品纤维素酶作用新位点。在热纤维梭状芽孢杆菌中，内切葡聚糖酶D为纤维素酶复合体的组份（Beguin等，见前）。该酶也有可能与真菌性酶复合在一起或结合了纤维素，因而有利于打开纤维素的结构，进行水解。
P2（pCT603T）菌株为所构建的由纤维素发酵生成乙醇的最佳菌株，但其效率不如出发菌株热纤维梭状芽孢杆菌（Tailliez等

[1989]Appl.Environ.Microbiol.55：203-211）。催娩克氏杆菌的P2（pCT603T）菌株不象热纤维梭状芽孢杆菌，它没有完整的纤维素酶系统，但在与1%的商品CYTOLASE或MULTIFECT共同发酵后，P2（pCT603）在35℃发酵所产生的乙醇得率和最终浓度都比热纤维梭状芽孢杆菌耐乙醇突变株在65℃发酵的高。该菌株在遗传性和工艺方面还可做进一步的改进。实施例19    利用染色体上整合有运动发酵单胞菌（Z.mobilis）的产乙醇基因和质粒上携带有能表达热稳定糖化蛋白的基因的大肠杆菌重组子从淀粉发酵生产乙醇产乙醇的大肠杆菌菌株经改造后能在细胞内表达可糖化淀粉的热稳定酶。发酵结束后，将收集的含这些酶细胞加热至酶呈最大活性的温度（60-70℃），以释放出糖化酶。这些微生物可作为酵母发酵中酶的来源，而只产生少量乙醇共产品。
本例中，利用大肠杆菌中缺乏蛋白质分泌系统这个优势从而发展出了能在细胞内表达热稳定的α-淀粉酶和几丁质酶的产乙醇菌株。发酵结束后收集这些细胞并加热至酶呈最大活性的温度，以释放热稳定的酶来糖化淀粉。
菌株和生长条件：所有乙醇发酵都用大肠杆菌KO11（Ohta等，1991，见前）在含糖的Luria培养基中进行。菌株中所带质粒均标出。
质粒构建：用标准方法构建了两个质粒pLOI140和pLOI141（图15A和B），它们带有嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶基因[Mielenz等（1985），美国专利号4，493，893]和热厌氧细菌（Thermoanaerobium brockii）的支链淀粉酶基因[Coleman等（1986）美国专利号4，612，287;Coleman等（1987）J.Bacteriol 169：4302-7]。质粒pWL625Amy（ATCC31，791）上带有淀粉酶基因的一段长5.4kb的Hind Ⅲr酶切片段被插入经部分酶切后的pCPC90Z[Cole，an等（1986）见上]的Hind Ⅲ位点。在含淀粉和支链淀粉的Luria平板上比较后得知，只有在一个位点插入后得到的质粒能够同时高水平表达两个基因，这个质粒命名为pLOI568。用EcoRI酶部分酶切pLOI568后，将质粒pCOS2EMBL[Poustka等（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：4129-33]上一段带四环素抗性基因的长2.5kb的EcoRI酶切片段插入形成质粒pLOI140和pLOI141。最后的质粒带有pBR322的复利子，在菌株KO11中非常稳定，在不加抗菌素的条件下生长48代后仍有96%的细胞带有该质粒。
图15A和B所用的缩写是：amy，编码嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillus    stearothermophilus）α-淀粉酶的基因;pul，编码热厌氧细菌（Thermoanaerobium    brockii）支链淀粉酶的基因;tet，四环素抗性基因;amp，氨苄青霉素抗性基因;ori，colE1复制子。
发酵和分析：发酵基本按照以前所述方法（Beall等，见上）在500ml摇瓶中进行，摇瓶作为pH恒定器（工作体积350ml）。培养基包含Luria培养基，分别加上10%葡萄糖、5%葡萄糖、10%麦芽糖、5%麦芽糖或4.5%淀粉（30℃发酵，pH6.0，100rpm）。发酵所接种的细胞浓度是0.03毫克干重/毫升。糖另外用过滤法灭菌。淀粉不灭菌。
细胞量测定其O.D.550值（1O.D.相当于0.32克细胞干重/升）。总糖化活性用在60℃发酵测定还原的糖量来决定（Bergmeyor等，见前）。乙醇用气液层析测定（Dombek等，见前）。乙醇浓度用克/升来表示。乙醇得率通过在发酵过程中加入碱来校正稀释，并按总糖量或总淀粉量来计算，而不计没有使用的糖量。理论上发酵的最大得率约是0.51克乙醇/克葡萄糖、0.53克乙醇/克麦芽糖和0.56克乙醇/克淀粉。结果由两次或多次发酵的平均值而得到。
淀粉发酵：为了发酵淀粉，收集预先在10%葡萄糖中发酵了72小时的KO11（pLOI140）和KO11（pLOI141）细胞并冰冻保存。把这些细胞悬浮在25毫升pH值为6.0的Luria培养基中，15.75克淀粉悬浮于325ml    pH值为6.0的Luria培养基中。加一半细胞悬浮液到淀粉悬浮液，在沸水中搅拌保温至70℃并在70℃保温5分钟。混合物冷却至60℃，加入其余的细胞并在60℃继续保温24小时。加热可使重组大肠杆菌失活并释放出热稳定的酶水解淀粉。糖化后的淀粉冷却至30℃并用无菌蒸馏水调节体积到350ml。
接种物在5%葡萄糖中过夜生长后离心收集，并用来起始发酵（0.03克活细胞干重/升）。取样以检查乙醇的发酵并用薄层层析分析。
使用未活化的Whatman150A硅胶板（Whatman公司，Clifton，New    Jersey）分离葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。分离在室温进行，用1微升样品，其中含糖5-50微克。分离在丙酮、乙酸乙酯和乙酸的混合物（2∶1∶1）中进行，该混合物使用前加入2%的水。干板染色见Bounias（1980）Anal.Biochem.106：291-5。淀粉和糖来自Sigma化学公司（St.Louis，Mo）。
用重组大肠杆菌菌株发酵葡萄糖和麦芽糖：观察菌株KO11发酵葡萄糖和麦芽糖的情况，结果见图16A和B，其分别反映乙醇产量和细胞量。图中所用符号为：●，在10%葡萄糖中的菌株KO11;△在10%葡萄糖中的菌株KO11（pLOI140）;□，在10%葡萄糖中的菌株KO11（pLOI141）;○，在5%麦芽糖中的菌株KO11（5%和10%麦芽糖结果相同）。
虽然有氧培养时大肠杆菌利用麦芽糖的情况研究得很清楚，在麦芽糖中菌的生长和乙醇产量都较在葡萄糖中慢。在10%麦芽糖中的得率少于最大理论得率（53.5克乙醇/升）的25%，在5%的麦芽糖中得率少于最大理论得率（26.8克乙醇/升）的50%。因为在两种麦芽糖浓度中获得的结果相似，所以不可能是由于麦芽糖的直接毒性导致较慢地生长和发酵。麦芽糖与葡萄糖相比发酵较慢，可能是由于其它限制如糖运输和葡萄糖磷酸化等。
如图16A和B，加入编码α-淀粉酶和支链淀粉酶的质粒pLOI140和pLOI141后，菌株KO11在葡萄糖中的生长速率和乙醇产量都有降低。72小时后的细胞得率和乙醇得率均降低约1/3。
糖化酶的表达：用在Luria培养基（pH6.0）中的土豆淀粉悬浮液作底物（70℃），发酵结束后（72小时）还原多糖的释放量可用于测定菌株KO11（pLOI140）和KO11（pLOI141）的总糖化活性。两个菌的活性相似，为30微摩尔还原糖/毫升培养液/分钟。其中90%以上是细胞内活性，但加热到70℃后，这些活性很容易被释放出来。
淀粉发酵：在两步法中试验菌株KO11（pLOI140）和KO11（pLOI141），其中的微生物既能产生糖化酶又能表达产乙醇酶。收集在10%葡萄糖中预发酵细胞，悬浮后作为酶源来水解等体积4.5%淀粉的冷悬浮液（Luria培养基，pH6.0）。加入一半收集的细胞，混合物很快加热到70℃并在水浴中70℃保温约5分钟。混合物移到60℃，加入另一半细胞以利于水解，分别测试了玉米、土豆、水稻和小麦的淀粉，其结果相似。在加热和水解过程中淀粉悬浮液保持液体状。与此相对，使用不带淀粉基因的KO11菌株，加热后三分钟内淀粉悬浮液完全固化。
在60℃保温24小时后，将含有水解淀粉的Luria培养基冷却至30℃并接种以起始发酵（pH6.0，100rpm，接种量为0.03克细胞干重/升），如前所述（Beall等，1991，同上）。最初24小时内，乙醇产量为0.26-0.28克/升，所有类型的淀粉结果都相似，最后乙醇得率为0.35-0.37克/克淀粉，而理论上最大得率为0.56克/克淀粉。淀粉发酵的结果见图17。
因为以菌株KO11（pLOI140）和KO11（pLOI141）获得的数据本质上相同，因此图17中，只显示了KO11（pLOI141）的数据。图17中所用符号如下：△，玉米淀粉（S-4126）;□，土豆淀粉（-2004）;○，水稻淀粉（S-7260）;▲，小麦淀粉（S-5127）;■，玉米淀粉加2mM CaCl2;●KO11，葡萄糖5%，作对照。
两步法发酵玉米淀粉中，在不同阶段取出样品用薄层层析法分析（图18）。24小时后，水解产物有葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖和较长的寡糖。葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖被KO11（pLOI141）用来发酵（72小时）。
图18显示玉米淀粉发酵的薄层层析分析结果。麦芽糖和葡萄糖作为标准物。葡萄糖到麦芽四糖分别标为G1到G4。第一条道为葡萄糖和麦芽糖作标准物;第二条道为使用在60℃糖化24小时后的培养液;第三条道为60℃糖化24小时后再发酵72小时的培养液。
钙离子常常能稳定淀粉降解酶。用含2mM CaCl2的Luria培养液中的玉米淀粉进行的发酵实验表明发酵速率略为加快，得率也较高，分别为每小时0.29克乙醇/升和0.40克乙醇/克淀粉。同传统的用酵母和酶发酵相比，重组大肠杆菌发酵较慢，最后的乙醇浓度较低。使用一种微生物通过两步法发酵淀粉总的乙醇得率约为使用酵母和附加酶的当前的商业方法得率（约0.47克乙醇/克淀粉）的85%。
本例表明使用重组大肠杆菌产生乙醇的发酵可用来产生部分淀粉糖化所需要的酶，虽然还需进一步改进。因为不需要通气条件，所以酶的产生非常简单。热稳定的细菌酶作用的最适pH值与大肠杆菌发酵所需的pH值相同（约pH6.0）。利用这些生物，低价值原料（如玉米壳）中的残留淀粉可用作底物，玉米茎汁可用作复合营养物的来源。类似这样的工序可以降低糖化酶的价格并增加玉米发酵中的乙醇得率。