技术领域
[0001] 本
发明涉及一株产川芎哚的昆虫内生真菌，以及应用该菌株制备川芎哚的方法，属于
微生物生物技术、生物制药技术领域。
背景技术
[0002] 川芎哚(川芎Ⅲ号
碱，perlolyrine，PL)是传统中药川芎的有效活性生物碱之一，其化学结构为1-(5-羟甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚，属于β-咔啉(β-Carboline)类生物碱。川芎哚具有很高的药理活性，对冠心病和脑血管病有一定疗效作用。
[0003] 天然川芎哚主要从
植物中分离得到，如伞形科植物川芎、禾本科植物黑麦草、远志科植物远志等，川芎中的含量最高，但也仅占川芎样品的千万分之三。特别要强调的是，目前为止，微生物来源的川芎哚，非常少见，只有两株放线菌Streptomyces sp.和Jishengella endophytica 161111能产川芎哚，真菌中未见报道。
[0004] 昆虫肠道呈碱性，且含丰富的各种酶系，构建了一个特殊的环境，特殊的生存环境可能孕育着特殊的新的微生物物种，这些微生物可能会有独特的代谢途径，能够产生骨架新颖的活性
次级代谢产物。所以，近年来，为提高新颖活性化合物发现的几率，人们将微生物研究的对象从陆地/海洋延生到昆虫体内。
[0005] 目前，人们对昆虫
内生菌的研究相对较少，对其次级代谢产物的研究尚处于起步阶段，可以预见，昆虫内生菌的研究将为天然产物的发展拓展新的领域，也为开发新颖活性先导化合物提供重要来源，是创新药物研发的新热点，具有广阔的前景。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一株能够生产川芎哚的菌株巴西类壳小圆孢MZ-1(Paraconiothyrium brasilienseMZ-1)及用其制备川芎哚的方法。
[0007] 内生真菌巴西类壳小圆孢菌株MZ-1(Paraconiothyrium brasilienseMZ-1)，于2016年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016279，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。
[0008] 本发明巴西类壳小圆孢MZ-1菌株的菌落特征为：在PDA培养基上，28℃倒置培养生长速度较快，4天后菌落直径约为4.0cm，7天后菌落直径达8.2cm，菌落中部呈现棕黄色，边缘呈白色，气生菌丝
棉毛状，边缘呈锯齿状。菌丝暗色，分隔，未见分生孢子。
[0009] 本发明从昆虫中华剑
角蝗(Acridacinerea)肠道体内获得一系列内生真菌菌株，经分离筛选后，得到一株能生产川芎哚的菌株，编号为MZ-1。经过形态学鉴定和菌株ITS序列分析，将其鉴定为巴西类壳小圆孢MZ-1(Paraconiothyrium brasiliense MZ-1)。
[0010] GenBank序列登录号：KM880019。
[0011] 本发明还提供一种内生真菌巴西类壳小圆孢菌株MZ-1(Paraconiothyrium brasiliense MZ-1)分离方法，包括如下步骤：
[0012] 将昆虫中华剑角蝗虫体用蒸馏
水冲洗干净，无菌条件下将其置于75％
乙醇中消毒1min后用无菌水冲洗4次，再用3％的
次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗4次，再用无菌
剪刀从腹部剪开虫体取肠剪开用接种环蘸其肠道液划线到PDA培养基平板上，置于28℃恒温培养，定时观察，待长出菌丝后，采用菌丝顶端纯化法，挑取菌丝顶端在新的PDA培养基平板上纯化，当有不同
颜色或形态的菌落生长出来以后，继续以菌丝顶端纯化法进行纯化操作直至各个菌落为单一纯培养为止，从中分离得到真菌巴西类壳小圆孢的纯菌株接入PDA斜面，置于28℃
培养箱培养48小时，用无菌的液体
石蜡封口，4℃
冰箱中保藏，即可完成内生真菌巴西类壳小圆孢菌株MZ-1(Paraconiothyrium brasilienseMZ-1)分离。
[0013] 本发明将所述的内生真菌巴西类壳小圆孢菌株MZ-1(Paraconiothyrium brasilienseMZ-1)在制备川芎哚上的应用，具体是从巴西类壳小圆孢菌株MZ-1(Paraconiothyrium brasiliense MZ-1)的代谢产物中制备川芎哚。其制备方法如下：
[0014] 1)巴西类壳小圆孢菌的培养及
发酵菌株的培养：将保藏菌株接种到PDA培养基平板上，28℃恒温培养箱中培养48小时。菌株的发酵：将培养好的菌株用接种针挑取一
块约1cm×1cm的菌体接种到装有PDA液体培养基的容器中，在
温度为28℃，转速为180rpm条件下，用恒温振荡摇床培养5天后，获得
种子液，种子液按照5mL接种量接种到装有200mL PDA液体培养基的容器中，在温度为28℃，转速为180rpm条件下，用恒温振荡摇床继续培养20天；
[0015] 2)次级代谢产物的提取：发酵结束后，分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用乙酸乙酯萃取3次，每次发酵液与乙酸乙酯的体积比为1:1，合并所有乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩至浸膏状得到发酵液乙酸乙酯萃取物，菌丝体在45℃条件下烘干，然后
研磨粉碎，按菌丝体重量：乙酸乙酯体积＝1:10加入乙酸乙酯浸泡过夜，超声提取30min，反复提取3次，合并所有乙酸乙酯提取液，经减压浓缩至浸膏状得到菌丝体乙酸乙酯提取物，合并发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯提取物即为次级代谢产物的总提取物；
[0016] 3)川芎哚的分离纯化：次级代谢产物的总提取物进行正相
硅胶柱层析分离，采用氯仿-甲醇＝20:1的体积比横梯度洗脱，共得到50个流份，进行TLC检测，展开体系为：氯仿-甲醇＝15:1的体积比，在365nm紫外灯下观察
荧光，再用碘化必
钾喷雾显色，观察有无橙色斑点，若有橙色斑点的流份，合并有橙色斑点的流份后经半制备高效液相精制纯化得到巴西类壳小圆孢菌生产的川芎哚。高效液相色谱的洗脱条件：流动相为乙腈与水以40：60的体积比，流速为3.0mL/min，检测
波长为237nm，运行时间为30min，川芎哚在HPLC中的保留时间为25min。巴西类壳小圆孢菌的摇瓶发酵后的川芎哚的产量可达606.3μg/L。
[0017] 本发明为今后菌种改造，发酵培养条件优化，选育能够适用于工业化大规模生产川芎哚的菌株提供了可能和
基础。
[0018] 本发明巴西类壳小圆孢MZ-1(Paraconiothyrium brasilienseMZ-1)菌株所产川芎哚已经被证实，其结构和川芎哚标准品完全一致。
附图说明
[0019] 图1为本发明的巴西类壳小圆孢MZ-1(Paraconiothyrium brasilienseMZ-1)的菌落形态，其中1-1为
正面示意图，1-2为背面示意图。
[0020] 图2为利用
电子轰击离子源(EI)质谱仪测试本发明菌株所生产的川芎哚的质谱图。
[0021] 图3为利用
核磁共振仪测试本发明所述菌株生产的川芎哚的氢谱(1H-NMR)图。图4为利用核磁共振仪测试本发明所述菌株生产的川芎哚的
碳谱(13C-NMR)图。
[0022] 图5为本发明的巴西类壳小圆孢(Paraconiothyrium brasiliense)的18S rDNA系统发育树。
具体实施方式
[0023] 下面结合
实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
[0024] 实施例1
[0025] 巴西类壳小圆孢MZ-1(Paraconiothyrium brasilienseMZ-1)的分离和保存：
[0026] 2011年10月在湖北省神农架地区的大九湖国家湿地公园采集昆虫中华剑角蝗，将虫体用蒸馏水冲洗干净，无菌条件下将其置于75％乙醇中消毒1min后用无菌水冲洗4次，再用3％的次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗4次，再用无菌剪刀从腹部剪开虫体取肠剪开用接种环蘸其肠道液划线到PDA培养基平板上，置于28℃恒温培养，定时观察，待长出菌丝后，采用菌丝顶端纯化法，挑取菌丝顶端在新的PDA培养基平板上纯化，当有不同颜色或形态的菌落生长出来以后，继续以菌丝顶端纯化法进行纯化操作直至各个菌落为单一纯培养为止。从中分离得到真菌巴西类壳小圆孢的纯菌株接入PDA斜面，置于28℃培养箱培养48小时，用无菌的液体石蜡封口，4℃冰箱中保藏。
[0027] 实施例2
[0028] 巴西类壳小圆孢MZ-1(Paraconiothyrium brasilienseMZ-1)的鉴定：
[0029] 巴西类壳小圆孢菌株序列测定：菌株经PDA液体培养后过滤收集菌丝，取适量菌丝用液氮迅速研磨成粉末，然后采用Ezup柱式基因组DNA抽提
试剂盒(真菌)提取菌株的DNA，用灭菌的双蒸水洗脱提取的DNA，用于PCR扩增。采用一对通用引物ITS5/ITS4进行ITS rDNA的PCR扩增。
[0030] 正向引物ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，反向引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0031] 采用即用PCR扩增试剂盒扩增，PCR反应体系为：模板DNA 1μL，dNTP(各2.5mmol/L)2μL，引物各1μL，10×PCRbuffer 2μL，Taq酶0.2μL，ddH2O 12.8μL，总体系20μL。反应程序为：94℃变性1min，56℃
退火30s，72℃延伸1min，一共是33个循环；在72℃进行最后一次延伸，时间10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶
电泳检测，上样5μL，80V，30min。凝胶成像仪检测扩增目的条带，采用DNA纯化回收试剂盒挑取目的
片段回收，测序由生工
生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0032] 将测得的序列提交至GenBank，并获得登录号KM880019。将此序列在GenBank中进行Blast比对，并选取同源性较高的菌株的序列用MEGA4.1
软件构建18S rDNA系统发育树。通过Blast与GenBank收录的序列进行比对，发现MZ-1与Paraconiothyriumbrasiliense JQ
936270的同源性为100％。用MEGA4.1进化树见附图5，故鉴定菌株MZ-1为巴西类壳小圆孢(Paraconiothyrium brasiliense)。
[0033] 实施例3
[0034] 一种从巴西类壳小圆孢菌代谢产物中制备川芎哚的方法，包括以下步骤：
[0035] 步骤1：巴西类壳小圆孢菌的培养及发酵：将菌株接种到PDA培养基平板上，28℃恒温培养箱中培养2天后，用接种针挑取一块约1cm×1cm的菌体接种到装有200mL PDA液体培养基的三角瓶(500mL)中，在温度为28℃，转速为180rpm条件下，用恒温振荡摇床培养5天后，获得种子液。种子液按照5mL接种量接种到装有200mL PDA液体培养基的三角瓶(500mL)中，在温度为28℃，转速为180rpm条件下，用恒温振荡摇床继续培养20天。
[0036] 步骤2：次级代谢产物的提取：发酵结束后，分别收集发酵液和菌丝体。发酵液用乙酸乙酯萃取3次，每次发酵液与乙酸乙酯的体积比为1:1，合并所有乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩至浸膏状得到发酵液乙酸乙酯萃取物。菌丝体在45℃条件下烘干，然后研磨粉碎，按菌丝体重量：乙酸乙酯体积＝1:10(g∶mL)加入乙酸乙酯浸泡过夜，超声(45℃、60W)提取30min。反复提取3次，合并所有乙酸乙酯提取液，经减压浓缩至浸膏状得到菌丝体乙酸乙酯提取物。合并发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯提取物即为次级代谢产物的总提取物。
[0037] 步骤3：川芎哚的分离纯化：次级代谢产物的总提取物进行正相硅胶(200-300目)柱层析分离，采用氯仿-甲醇＝20:1(体积比)横梯度洗脱，共得到50个流份。进行TLC检测，展开体系为：氯仿-甲醇＝15:1(体积比)，在365nm紫外灯下观察荧光，再用改良碘化必钾喷雾显色，观察有无橙色斑点，经TLC检测发现第25个到第30个流份，共6个流份中具有紫外365nm荧光显色和改良碘化必钾喷雾显橙色的斑点，合并这6个流份。合并后经半制备高效液相(HPLC)精制纯化得到巴西类壳小圆孢菌生产的川芎哚。HPLC洗脱条件：流动相为乙腈：
水＝40:60(体积比)，流速为3.0mL/min，检测波长为237nm，运行时间为30min，川芎哚在HPLC中的保留时间为25min。依据本实施方式，经计算，巴西类壳小圆孢菌的摇瓶发酵后的川芎哚的产量可达606.3μg/L。
[0038] 实施例4
[0039] 实施例3中所得巴西类壳小圆孢菌生产的川芎哚的结构鉴定：
[0040] 实施例3中所得巴西类壳小圆孢菌生产的川芎哚的外观为淡黄色针状晶体，利用电子轰击离子源(EI)质谱仪测试，从图谱可看出该化合物的分子离子峰为EI-MS m/z：264[M]+。该化合物经核磁共振仪测试，在氢谱(1H-NMR)的低场区出现六个特征芳香质子
信号，推测可能为苯环或吡啶环的质子信号。1H-NMR谱中化学位移在δ8.26(1H,d,J＝7.88Hz,H-5)，7.28(1H,t,J＝7.92Hz,H-6)，7.59(1H,t,J＝7.08Hz,H-7)，7.79(1H,d,J＝8.24Hz,H-8)的芳香质子信号，推测为二取代苯环的质子信号。化学位移在δ8.36(1H,d,J＝5.12Hz,H-
3)，8.07(1H,d,J＝5.12Hz,H-4)的质子信号，推测为吡啶环的质子信号。化学位移δ7.20(1H,d,J＝3.36Hz,H-3')，6.28(1H,d,J＝3.36Hz,H-4')为烯
烃质子信号。13C-NMR谱中显示
16个碳，其中化学位移δ121.59(C-5)，129.43(C-6)，119.68(C-7)，109.02(C-8)，130.48(C-
12)，138.15(C-13)为苯环的特征碳信号，化学位移δ140.97(C-1)，133.14(C-3)，113.61(C-
4)，128.38(C-10)，120.60(C-11)为吡啶环的特征碳信号，化学位移δ156.73(C-2')，112.47(C-3')，109.57(C-4')，152.14(C-5')为呋喃环的特征碳信号。
[0041] 归纳上述，该化合物由苯环、吡啶环和呋喃环构成，经查阅文献，该化合物的质谱、碳谱和氢谱数据与川芎哚标准品完全一致，故鉴定该化合物为川芎哚。
[0042] 巴西类壳小圆孢菌生产的川芎哚的物理常数和波谱数据：淡黄色针状晶体，m.p.185-187℃；UVλmax＝237,252,275,292,364,378nm；EI-MS m/z：264[M]+；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δH：8.36(1H,d,J＝5.12Hz,H-3)，8.07(1H,d,J＝5.12Hz,H-4)，8.26(1H,d,J＝7.88Hz,H-5)，7.28(1H,t,J＝7.92Hz,H-6)，7.59(1H,t,J＝7.08Hz,H-7)，7.79(1H,d,J＝
8.24Hz,H-8)，11.30(1H,s,H-9)，7.20(1H,d,J＝3.36Hz,H-3')，6.28(1H,d,J＝3.36Hz,H-
4')，4.65(2H,s,H-6')；13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δC：140.97(C-1)，133.14(C-3)，113.61(C-4)，121.59(C-5)，129.43(C-6)，119.68(C-7)，109.02(C-8)，128.38(C-10)，120.60(C-
11)，130.48(C-12)，138.15(C-13)，156.73(C-2')，112.47(C-3')，109.57(C-4')，152.14(C-5')，55.92(C-6')。
