技术领域

本发明涉及一种高效率形成水稻多倍体的技术方法，根本点在于利用种 子、幼穗和茎段三个不同层次的外植体，发挥组织培养和化学诱导结合的优 势，高效率高质量地培育水稻多倍体。

                     背景资料

在环境不断恶化，人口持续增长，土地急剧减少，粮食短缺潜在危机的紧 迫形势下，世界水稻育种界正在进行超级稻和超级杂交稻育种，其中中国专利 公开的00114471.5号专利申请中提出的“利用远缘杂交和多倍体双重优势选育 超级稻”是一个新的育种思路，正日益引起国内外学者的重视。要实现多倍体 水稻育种，首先就要解决如何获得多倍体的问题。长期以来，获得水稻多倍体 的方法主要有两种，一种是用秋水仙素处理浸泡的种子或者发芽的种子；另一 种是利用秋水仙素处理发育中的秧苗。这两种方法存在着两个主要问题：一是 加倍形成多倍体水稻的频率低，一般在5～10％左右；二是产生嵌合体，即同一 个水稻植株上，有的穗子上结二倍体种子，有的穗子上结多倍体种子，还有的 穗子上既结二倍体种子，也结多倍体种子。这样大大影响了多倍体水稻育种的 效率，尤其是对于难以获得的少数几粒杂交种子是难于用它进行加倍处理的。 尽管范昆华等(1991)，黄慧君等(1995)也应用组织培养进行水稻多倍体研 究，但所用外植体、培养条件和诱导频率等方面仍然存在一些问题。因此，自 从1951年鲍文奎开始水稻多倍体研究以来，国内外学者主要局限于亚洲栽培稻 品种，品种间或籼粳亚种间杂种的同源多倍体的研究，而对非洲栽培稻以及众 多野生稻，尤其是非A基因组野生稻没有进行多倍体加倍研究。

                          发明内容

本发明的目的在于避免上述多倍体诱导形成中存在的应用材料单一、应用 范围窄、诱导效率不高，易产生嵌合体等不足，提供一种全程应用水稻发育阶 段为组织培养的试材，优化组织培养技术，高效率、高质量地诱导水稻多倍体 的方法。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

一种组织培养和化学诱导相结合高效率高质量培育水稻多倍体的方法，包 括全程应用水稻试材、优化愈伤组织培养方法、结合组织培养和秋水仙素处理 诱导形成多倍体、多倍体植株的获得、多倍体植株的鉴定和培育。

下面是详细培育步骤：

当采用水稻种子和幼穗作外植体时，需经过以下七个培养阶段：a、愈伤 组织诱导，b、秋水仙素液体培养加倍，c、继代培养，d、分化出芽培养，e、 生根培养，f、壮苗培养，g、育苗成熟及多倍体植株鉴定。

当采用水稻茎段(带节含有潜伏芽)为外植体时，需经过以下七个培养阶 段：a、丛芽诱导和增殖，b、秋水仙素液体培养加倍，c、继代培养，d、丛芽 生长，e、生根培养，f、壮苗培养，g、育苗成熟及多倍体植株鉴定。

具体操作过程为：

一、当采用水稻种子和幼穗作外植体时。

a、愈伤组织诱导过程为，将栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻杂种种子或 幼穗经消毒处理后接种于N6(或MS)+2，4-D 1～2.5mg/l+NAA 1～2mg/l+6BA (或KT)0.1～0.5mg/l+蔗糖5～6％+水解酪蛋白5～150mg/l+琼脂0.65～0.75％、 pH5.8～6.2的诱导培养基中，在25～30℃、黑暗或光照800～10001x下培养25～45 天而形成愈伤组织；

b、秋水仙素液体培养加倍过程为，将在诱导培养基中形成的栽培稻、野 生稻、栽培稻x野生稻杂种的愈伤组织转入到N6(或MS)+2，4-D1～2.5mg/l+ NAA 1～2mg/l+6BA(或KT)0.1-0.5mg/l+秋水仙素500-700mg/l+蔗糖3～5％+水解 酪蛋白100mg/l、pH5.8～6.2的加倍培养基中，在20～22℃、95～105rpm转速下振 荡培养40～48小时；

c、继代培养过程为，将加倍处理的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻杂种 的愈伤组织经无菌水充分洗涤后转入与上述诱导培养基相同的培养基中，温度 25～30℃、黑暗或光照600～1000 1x下继代培养7-10天；

d、分化出芽培养过程为，将继代后的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻杂 种的愈伤组织转入到MS+6BA 1～2mg/l+KT 2～3mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+水解酪 蛋白100～200mg/l+蔗糖3％+琼脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的分化培养基中，在25 ～30℃、光照1500～2000 1x下分化培养20～45天，分化出水稻芽苗；

e、生根培养过程为，将经愈伤组织分化培养出的水稻芽苗转入1/2MS+ 6BA 0.1～0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+IAA 0.5～1mg/l+水解酪蛋 白100mg/l+活性碳0.03％+蔗糖2％+琼脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的生根培养基 中生根，长出完整小植株；

f、壮苗培养过程为，将来源于愈伤组织分化形成的水稻完整小植株转入 1/2 MS+6BA 0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+多效唑2～3mg/l+水解 酪蛋白100～200mg/l+蔗糖2％+琼脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的壮苗培养基中生长 成健壮的小植株；

g、育苗成熟及多倍体植株鉴定过程为，将壮苗培养生长的健壮小植株， 移植到由2/3砂和1/3腐熟细土组成培养土的栽培容器中，移植成活并培育植株 至成熟，在生长过程中，根据形态学特征(有芒、大粒、叶增大厚、茎杆变 粗)和细胞遗传学证据(叶片气孔增大、根尖染色体成倍增加)鉴别多倍体水 稻植株。

二、当采用水稻茎段(带节含有潜伏芽)为外植体时。

a、丛芽诱导和增殖过程为，将栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻杂种植株 的茎段经消毒处理后接种到2/3MS+6BA 1～3mg/l+KT 2～3mg/l+NAA 0.2～0.5mg/ l+多效唑3～5mg/l+蔗糖2％+琼脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的诱导多丛芽培养基 中，在25～30℃、光照1500～2000 1x下培养10～30天而形成多丛芽；

b、秋水仙素液体培养加倍过程为，将形成的栽培稻、野生稻、栽培稻x野 生稻杂种的多丛芽转入到1/2MS+6BA 1～2mg/l+KT 2～3mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+ 多效唑3～5mg/l+秋水仙素500-700mg/l+蔗糖2～3％、pH5.8-6.2的培养基中，在光 照500～800 1x、温度20～22℃、转速95～105rpm的摇床上振荡培养18～24小时；

c、继代培养过程为，将丛芽加倍处理的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻 杂种的多丛芽经无菌水充分洗涤后转入与上述诱导多丛芽培养基相同的培养基 中，在温度25～30℃、光照1500～2000 1x下继代培养7～10天；

d、丛芽生长过程为，将继代培养的栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻杂种 的多丛芽经无菌水充分洗涤后转入到1/2MS+6BA 1-2mg/l+KT 2-3mg/l+NAA 0.2 -0.5mg/l+多效唑3-5mg/L+水解酪蛋白100-200mg/l+蔗糖2％+琼脂0.65-0.75％、 pH5.8-6.2的培养基中，在光照1500-2000 1x、温度25-30℃下培养出多丛芽苗；

e、生根培养过程为，将栽培稻、野生稻、栽培稻x野生稻杂种的多丛芽苗 转入1/2MS+6BA 0.1～0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+IAA 0.5～1mg/l +水解酪蛋白100mg/l+活性碳0.03％+蔗糖2％+琼脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的 生根培养基中生根，长出完整小植株；

f、壮苗培养过程为，将来源于多丛芽增殖形成的水稻小植株转入1/2MS+ 6BA 0.5mg/l+KT 0.1～0.2mg/l+NAA 0.2～0.3mg/l+多效唑2～3mg/l+水解酪蛋白 100～200mg/l+蔗糖2％+琼脂0.65～0.75％、pH5.8～6.2的壮苗培养基中生长成健壮 的小植株；

g、育苗成熟及多倍体植株鉴定过程为，将壮苗培养生长的健壮小植株， 移植到由2/3砂和1/3腐熟细土组成培养土的栽培容器中，移植成活并培育植株 至成熟，在生长过程中根据形态学特征和细胞遗传学证据鉴别多倍体水稻植 株。

从上面看出，本发明应用试验材料与以往的多倍体水稻研究有明显不同：

(1)应用未成熟或成熟的种子、生长发育中的幼穗和抽穗后带节的茎段 为材料，突破了通常水稻多倍体诱导主要用分蘖期幼苗的局限，拓宽了应用材 料的类型，在水稻从种子发育、小苗生长至抽穗开花的全生育过程中都可以作 为试材，经过组织培养和秋水仙素处理而形成多倍体植株，即在第一阶段(种 子)未加倍成功的情况下，可在第二阶段(幼穗)进行处理，在第一、第二阶 段未成功的情况下用第三阶段(茎段)处理，确保少数种源能够加倍形成多倍 体；(2)扩大应用的范围。改变了原来多倍体诱导仅在亚洲栽培稻中应用的 状态，把该方法应用于亚洲栽培稻的籼稻、粳稻和爪哇稻品种、籼粳亚种杂 种、非洲栽培稻品种、亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种、非洲野生稻等A基 因组野生稻及其它非A基因组的野生稻物种、以及栽培稻与野生稻杂种的多倍 体诱导形成。(3)同时也可以看出，本发明优化了组织培养方法。

稻属不同物种的组织培养反应存在着明显的差异性。一般讲，栽培稻比野 生稻更易组织培养，A基因组野生稻比非A基因组野生稻较易培养，从而在培 养容易程度上表现出一个基本趋势，即粳稻＞爪哇稻＞籼稻＞A基因组野生稻 ＞非A基因组野生稻。由于以前的研究仅针对籼稻、粳稻的组织培养的培养方 式和培养基已不能适应于更多种类稻种的组织培养和多倍体诱导形成。所以在 以种子和幼穗作外植体时，采用愈伤组织诱导，秋水仙素液体培养加倍，继代 培养，分化出芽培养，生根培养和壮苗培养等六个培养阶段；在以茎段为外植 体时，采用丛芽诱导和增殖，秋水仙素液体培养加倍，继代培养，丛芽生长、 生根培养和壮苗培养六个培养阶段。诱导形成愈伤组织的种子可以是未成熟种 子，也可以是成熟种子，幼穗以第二次枝梗至雌雄蕊形成时期为佳，茎段必须 带节，即含有潜伏芽的下部节段。

诱导种子或幼穗形成愈伤组织的培养基是N6(MS)+2，4-D 1～2.5mg/l+ NAA 1～2mg/l+6BA(KT)0.1～0.5mg/l+蔗糖5～6％+水解酪蛋白50～150mg/l+琼脂 0.65-0.75％，pH5.8-6.2。较易培养的粳稻、籼稻品种和杂种采用浓度较低的含 量，而较难培养的野生稻采用较高浓度的组合，在25-30℃、黑暗或800-1000 1x下培养25-45天形成愈伤组织。两种类型的生长素类组合更有利于愈伤组织 的形成，而低浓度的细胞分裂素的添加使愈伤组织生长结构和生理状态更有利 于后续的分化培养。

多丛芽的诱导培养基是2/3 MS+6BA 1-3mg/l+KT 2-3mg/l+NAA0.2-0.5mg/l +多效唑3-5mg/l+蔗糖2％+琼脂0.65-0.75％，pH5.8-6.2。

在秋水仙素处理诱导形成多倍体中，本发明采用液体振荡持续培养是将经 诱导培养后的愈伤组织和多丛芽转入液体培养基中进行细胞染色体加倍，增加 了秋水仙素进入细胞中的机会，提高多倍体形成频率。既提高了加倍效果，又 减少了秋水仙素用量。

本发明与以前的活体(即自然条件下的完整植株)多倍体水稻诱导技术相 比具有如下优点：

1.拓宽了试验材料，使水稻发育的全过程中的重要器官----种子、幼穗和 茎段(包含有潜伏芽)都可以用作诱导多倍体的材料，从三个层次上保证用少 数材料就能够诱导出多倍体。

2.根据不同水稻材料的特点，在培养基成分、培养方式等方面优化培养 技术，不仅使栽培稻品种和杂种能够用于多倍体诱导，而且野生稻、栽培稻x 野生稻杂种也能够用于多倍体诱导，扩大了应用范围。

3.采用组织培养和化学诱导相结合的技术，发挥了组织培养大量增殖细 胞增殖芽的优势，以及在液体培养基中添加秋水仙素在持续培养中进行加倍处 理，既使秋水仙素能够充分地与细胞相接触发挥效用，提高了形成多倍体的频 率，由活体处理的5-10％的加倍频率，提高到46.7％，最高达75.0％；而且降低 了秋水仙素的浓度。本发明仅用0.05-0.07％的秋水仙素，而以前大多数多倍体 植株诱导使用浓度为0.2-0.3％。

4.在常规条件下的秋水仙素处理后的水稻种苗成活率低是活体植物诱导 多倍体的主要问题之一。本发明采用无菌条件下的诱导、分化、生根、壮苗培 养等系列培养措施，不仅使水稻小苗加倍的效率提高，而且使已加倍的小植株 能够在试管中健壮成长，并能够高成活率地移植到培养容器中，直至长成成熟 水稻植株。

5.克服了活体植株多倍体诱导主要产生多倍体和二倍体嵌合水稻植株的 缺点。由于活体植株多倍体诱导应用的主要是发芽中的种苗，或者分蘖秧苗， 其生长点部位有正在分裂的细胞和未分裂的细胞，分裂的细胞受秋水仙素抑制 而形成多倍体细胞，它与未发生改变的二倍体细胞一起发育而形成嵌合体植 株，而且往往是二倍体占优势。本发明利用秋水仙素处理旺盛发育中的愈伤组 织和多丛芽原基与完整植株有明显不同。愈伤组织中的许多细胞加倍后可以以 单个细胞起源的方式独立地分化出芽、生长成完整的多倍体水稻，很少有嵌合 体现象；多丛芽原基中的生长点细胞在持续液体培养处理下，绝大多数细胞被 加倍成四倍体了，因而在随后的增殖生长中形成完整的多倍体植株，也很少有 嵌合体现象。