一种大田甜樱桃矮化砧木染色体倍性的检测方法
专利汇可以提供一种大田甜樱桃矮化砧木染色体倍性的检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于果树 生物 技术领域，具体涉及一种大田甜樱桃 染色 体倍性的检测方法。所述检测方法采用以下步骤：（1）取材；（2）解离：称取0.1 g 叶片 置于培养皿中，加入解离液，切碎叶片，制成 混合液 ，静置于 冰 上10 min；所述解离液配方：20 mM Tris，5 mM Na2EDTA，0.5 mM spermine.4HCl，80 mM KCl，20 mM NaCl，0.1% (v/v) TritonX-100，pH 8.0；（3）过滤（4）染色；（5）上机检测及数据分析。本发明的方法不受材料限制，制样简单，短时间内可以快速分析多个样本该方法 分辨率 高，准确性好。，下面是一种大田甜樱桃矮化砧木染色体倍性的检测方法专利的具体信息内容。
1.一种大田甜樱桃矮化砧木染色体倍性的检测方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）取材:从大田甜樱桃矮化砧木多倍体植株上选取植株叶片，用含有0.1% (v/v) TritonX-100的蒸馏水清洗叶片5 min，并用吸水纸吸干叶片表面水分；
（2）解离：称取0.1 g叶片置于培养皿中，加入解离液，切碎叶片，制成混合液，静置于冰上10 min；所述解离液配方：20 mM Tris，5 mM Na2EDTA，0.5 mM spermine.4HCl，80 mM KCl，20 mM NaCl，0.1% (v/v) TritonX-100，pH 8.0；
（3）过滤：将步骤（2）制备的混合液转移至离心管中，过滤，得细胞悬浮液；
（4）染色：向步骤（3）制备的细胞悬浮液中分别加入碘化丙啶和RNA酶，使得碘化丙啶和RNA酶的终浓度均为20 mg/L，4℃，避光染色20 min得染色后的细胞核悬浮液；
（5）上机检测及数据分析： 步骤（4）制备的细胞核悬浮液用流式细胞仪测定倍性，通过计算目标峰的荧光强度获得倍性关系。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的解离的具体操作步骤为：
（1）先将培养皿预冷；
（2）称取0.1 g叶片加入步骤（1）所述的培养皿中；
（3）在步骤（2）所述的培养皿中加入解离液，边加解离液边切叶片得混合液，其中所述的加解离液的时间与切叶片的时间相同，均为10-12秒；
（4）将步骤（3）所述的混合液静置于冰上10 min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的叶片为植株中上部幼嫩叶片。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）所述的离心管为2mL，离心管中放置400目滤膜。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤（5）所述的上机检测及数据分析前将步骤（4）制备的染色后的细胞核悬浮液用400目滤膜过滤2次。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（5）所述流式细胞仪为美国BD公司的FACSAriaⅢ，激发光为561 nm； 所述分析用美国BD公司的Cell Quest软件获取数据。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，调节步骤（5）所述流式细胞仪，收集分析≥10000 个的细胞核。
一种大田甜樱桃矮化砧木染色体倍性的检测方法
技术领域
背景技术
发明内容
（1）取材:从大田甜樱桃矮化砧木多倍体植株上选取植株叶片，用含有0.1% (v/v) TritonX-100的蒸馏水清洗叶片5 min，并用吸水纸吸干叶片表面水分；
（2）解离：称取0.1 g叶片置于培养皿中，加入解离液，切碎叶片，制成混合液，静置于冰上10 min；所述解离液配方：20 mM Tris，5 mM Na2EDTA，0.5 mM spermine.4HCl，80 mM KCl，20 mM NaCl，0.1% (v/v) TritonX-100，pH 8.0；
（3）过滤：将步骤（2）制备的混合液转移至离心管中，过滤，得细胞悬浮液；
（4）染色：向步骤（3）制备的细胞悬浮液中分别加入碘化丙啶和RNA酶，使得碘化丙啶和RNA酶的终浓度均为20 mg/L，4℃，避光染色20 min得染色后的细胞核悬浮液；
（5）上机检测及数据分析： 步骤（4）制备的细胞核悬浮液用流式细胞仪测定倍性，通过计算目标峰的荧光强度获得倍性关系。
（2）称取0.1 g叶片加入步骤（1）所述的培养皿中；
（3）在步骤（2）所述的培养皿中加入解离液，边加解离液边切叶片得混合液，其中所述的加解离液的时间与切叶片的时间相同，均为10-12秒；
（4）将步骤（3）所述的混合液静置于冰上10 min。
附图说明
1.1 从大田甜樱桃矮化砧木吉塞拉多倍体植株上选取植株中上部叶片放入保鲜袋中；
1.2 用含有0.1% (v/v) TritonX-100的蒸馏水清清洗叶片5 min，并用吸水纸吸干叶片表面水分；
2. 解离
2.1先将培养皿预冷，称取0.1 g叶片加入预冷培养皿中；
2.2在2.1所述的培养皿中加入解离液，边加解离液边切叶片得混合液，其中所述的加解离液的时间与切叶片的时间相同，均为10秒；
2.3 将2.2所述的混合液静置于冰上10 min，所述解离液的配方为：：20 mM Tris，5 mM Na2EDTA，0.5 mM spermine.4HCl，80 mM KCl，20 mM NaCl，0.1% (v/v) TritonX-100，pH
8.0；
3. 过滤
3.1 将400目滤膜固定于2 mL离心管中，放于冰上待用；
3.2 用移液器将上述混合液转移至3.1中准备的离心管中，自然重力条件下过滤，得
1.2mL细胞悬浮液；
4. 染色
4.1 向上述3.2的细胞悬浮液中分别加入碘化丙啶和RNA酶。使得两者的终浓度均为20 mg/L，4 ℃，避光染色20 min；
4.2 上机前再用400目滤膜将染色后的悬浮液过滤2遍，以防堵塞管道；
5. 上机检测及数据分析
5.1 本实验所用流式细胞仪为美国BD公司的FACSAriaⅢ，激发光为561 nm；
5.2 根据仪器具体操作流程要求，调节参数，每个样品收集分析10 000 个以上的细胞核；
5.3 用美国BD公司的Cell Quest软件获取数据并进行后续分析。
1.取材
1.1 从大田甜樱桃矮化砧木吉塞拉多倍体植株上选取植株中上部幼嫩叶片放入保鲜袋中；
1.2 用含有0.1% (v/v) TritonX-100的蒸馏水清清洗叶片5 min，并用吸水纸吸干叶片表面水分；
2. 解离
2.1先将培养皿预冷，称取0.1 g叶片加入预冷培养皿中；
2.2在2.1所述的培养皿中加入解离液，边加解离液边切叶片得混合液，其中所述的加解离液的时间与切叶片的时间相同，均为12秒；
2.3 将2.2所述的混合液静置于冰上10 min，所述解离液的配方为：20 mM Tris，5 mM Na2EDTA，0.5 mM spermine.4HCl，80 mM KCl，20 mM NaCl，0.1% (v/v) TritonX-100，pH
8.0；
3. 过滤
3.1 将400目滤膜固定于2 mL离心管中，放于冰上待用；
3.2 用移液器将上述混合液转移至3.1中准备的离心管中，自然重力条件下过滤，得
1.2mL细胞悬浮液；
4. 染色
4.1 向上述3.2的细胞悬浮液中分别加入碘化丙啶和RNA酶。使得两者的终浓度均为20 mg/L，4 ℃，避光染色20 min；
4.2 上机前再用400目滤膜将染色后的悬浮液过滤2遍，以防堵塞管道；
5. 上机检测及数据分析
5.1 本实验所用流式细胞仪为美国BD公司的FACSAriaⅢ，激发光为561 nm；
5.2 根据仪器具体操作流程要求，调节参数，每个样品收集分析10 000 个以上的细胞核；
5.3 用美国BD公司的Cell Quest软件获取数据并进行后续分析。
1.1 从大田甜樱桃矮化砧木吉塞拉多倍体植株上选取植株中上部幼嫩叶片更佳，放入保鲜袋中；
1.2 用含有0.1% (v/v) TritonX-100的蒸馏水清清洗叶片5 min，并用吸水纸吸干叶片表面水分。
2.2在2.1所述的培养皿中加入解离液，边加解离液边切叶片得混合液，其中所述的加解离液的时间与切叶片的时间相同，均为15秒；
2.3 将2.2所述的混合液静置于冰上10 min，所述解离液的配方为：15 mM Tris，2 mM Na2EDTA，0.5 mM spermine.4HCl，80 mM KCl，20 mM NaCl，0.1% (v/v) TritonX-100，pH
7.5。
1.1 从大田甜樱桃矮化砧木吉塞拉多倍体植株上选取植株中上部幼嫩叶片更佳，放入保鲜袋中。
0.1% (v/v) TritonX-100，pH 8.0。
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