来源于发炎的细胞或组织的抗炎外泌体
阅读：2发布：2020-07-28
专利汇可以提供来源于发炎的细胞或组织的抗炎外泌体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了抗炎外泌体，当将所述抗炎外泌体局部或全身 给药 于被诊断患有炎性 疾病 或病症的受试者时，其将抑制受试者的 炎症 过程。，下面是来源于发炎的细胞或组织的抗炎外泌体专利的具体信息内容。
1.一种制备抗炎外泌体的方法，所述抗炎外泌体能够抑制被诊断患有炎性疾病或病症的受试者中的炎症，所述外泌体通过包括以下步骤的方法制得：
(a)将动物细胞或组织在合适的培养基中培养一段时间，以使培养基积累有效浓度的抗炎外泌体，其中，所述培养基包含活化组合物，
(b)收集步骤(a)的培养基，以及
(c)从步骤(b)收集的培养基中分离出抗炎外泌体；
其中，所述活化组合物包括以下中的至少一种：
(i)从被诊断患有炎性疾病或病症的哺乳动物的发炎组织或其他解剖学结构中提取的流体，
(ii)来自被诊断患有炎性疾病或病症的受试者的血液、血浆或血清，
(iii)进一步包含至少一种细胞因子的(i)或(ii)所示的流体，至少一种细胞因子的浓度足以提高包含(i)或(ii)的活化组合物的效力，
(iv)一种或多种细胞因子，其浓度足以诱导动物细胞分泌能够抑制受试者中的炎症的抗炎外泌体，并且所述活化组合物不包括(i)的流体和/或(ii)的血液、血浆或血清。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，(iii)或(iv)中的至少一种细胞因子选自由干扰素-γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1-β(1IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素12b(IL-12b)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)及它们的组合所组成的组中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子以约10ng/ml至约50ng/ml的浓度存在。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中培养的时间为约24小时至约72小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中培养的时间为约3天至约6天。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗炎外泌体能够将M1巨噬细胞转变为M2巨噬细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，通过选自由聚合物沉淀、免疫分离、磁免疫捕获及它们的组合所组成的组中的方法从步骤(a)的培养基中分离出抗炎外泌体。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，通过选自由超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱和超滤所组成的组中的方法从步骤(a)的培养基中分离出抗炎外泌体。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病或病症是组织特异性疾病或病症。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病或病症选自由代谢X综合征引起的炎性疾病、胃肠系统的炎性疾病、肺系统的炎性疾病、皮肤的炎性疾病、肌肉组织的炎性疾病、关节的炎性疾病和神经系统的炎性疾病所组成的组中。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病或病症选自由冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、支气管炎、炎性肠病(IBD)、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎(IBM)、青少年肌炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、淀粉样变性、强直性脊柱炎、滑囊炎、银屑病性关节炎、斯提耳氏病和癌前病症所组成的组中。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述动物细胞为哺乳动物细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述动物细胞为人细胞。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述动物细胞为源于选自由以下组织组成的组中的细胞：脐带血、胎盘、存在于羊水中的非胎儿细胞、脂肪组织、骨髓、外周血、毛囊、胃肠器官、神经系统，即中枢神经系统和/或外周神经系统、循环系统、呼吸系统、免疫系统和分泌器官所组成的组中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述动物细胞不是干细胞并且不是癌细胞。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者为选自由人、犬、猫科动物、猪科动物和马科动物所组成的组中的哺乳动物。
17.由权利要求1所述的方法制备的抗炎外泌体。
18.一种治疗被诊断患有炎性疾病或病症的受试者的方法，包括将有效量的权利要求
17所述的抗炎外泌体给药于所述受试者。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述炎性疾病或病症为组织特异性疾病或病症。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述炎性疾病或病症选自由由代谢综合征引起的炎性疾病、胃肠系统的炎性疾病、肺系统的炎性疾病、皮肤的炎性疾病、肌肉组织的炎性疾病、关节的炎性疾病和神经系统炎性疾病所组成的组中。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述炎性疾病或病症选自由冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、支气管炎、炎性肠病(IBD)、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎(IBM)、青少年肌炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、淀粉样变性、强直性脊柱炎、滑囊炎、银屑病性关节炎和斯提耳氏病所组成的组中。
22.根据权利要求18所述的方法，其中，将所述抗炎外泌体通过选自由静脉注射、肌内注射、关节内注射或输注、皮下注射和鞘内注射或输注所组成的组中的途径进行给药。
23.根据权利要求18所述的方法，其中，所述炎性疾病或病症为肺部的疾病或病症，且所述方法包括将所述抗炎外泌体作为吸入的雾或气雾进行给药。
24.根据权利要求18所述的方法，其中，所述受试者为选自由人、犬科动物、猪科动物、猫科动物和马科动物所组成的组中的哺乳动物。
25.根据权利要求18所述的方法，其中，将所述抗炎外泌体以每千克总体重约1.5×1010至约1.5×1013个外泌体颗粒的量进行全身给药。
26.根据权利要求18所述的方法，其中，所述抗炎外泌体以约1.5×1010至1.5×1011个外泌体颗粒的量注射或输注入局部组织或解剖学空间中而进行给药。
27.根据权利要求18的方法，还包括使用至少一种额外的抗炎剂共同治疗所述受试者，所述至少一种额外的抗炎剂选自由甾体抗炎药、非甾体抗炎药、抗炎性抗TNFα抗体和它们的组合所组成的组中。
28.一种药物组合物，包含权利要求17所述的抗炎外泌体和生理学上可接受的载体。
来源于发炎的细胞或组织的抗炎外泌体
技术领域
背景技术
[0003] 炎症是免疫系统针对各种对活组织的损伤、感染和/或其他损害所作出的正常反应。通常，炎症由急性的损伤或疾病过程引起，并且发炎的症状(例如疼痛、发热、发红、肿胀和功能丧失)存在范围和持续时间有限。炎症反应由多种免疫细胞和化学介质(如缓激肽和组胺)以及各种细胞因子的复杂相互作用调节。不幸的是，某些类型的损伤和/或疾病过程，特别是那些长期和慢性的过程，会在活组织中引起相应的持久性炎症过程，这将对受影响的周围组织、器官或整个有机体造成进一步的损害。
[0004] 慢性炎症与几乎每个器官系统中各种疾病过程(局部的和全身的)相关或被发现能够引起这些疾病过程。例如，代谢综合征(也称为“代谢X综合征”)是可以发生于哺乳动物(包括人)的慢性病症，其表现出长期高于正常水平的中央脂肪沉积(central fat deposits)和运动不足。代谢综合征是与急性期蛋白(例如C-反应蛋白(“CRP”))水平升高相关的全身性炎性病症。代谢综合征还与冠状动脉疾病的风险增加有关，例如动脉粥样硬化和缺血性心脏病、2型糖尿病，其他末端动脉器官疾病、外周动脉疾病和相关病症。
[0006] 此外，慢性炎症与许多肠道疾病有关，例如炎性肠病或IBD。IBD包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。与炎症相关的皮肤病包括例如皮炎、湿疹和牛皮癣。还有人提出，许多中枢神经系统疾病，包括阿尔茨海默病和帕金森病，都是由慢性炎症过程引起或加重的。某些肌肉组织疾病也由慢性炎症引起或加重，例如多发性肌炎、皮肌炎(影响皮肤和肌肉)、包涵体肌炎(IBM)和青少年肌炎(juvenile myositis)。由慢性炎症引起或加重的关节疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、淀粉样变性、强直性脊柱炎、滑囊炎、银屑病性关节炎、斯提耳氏病(Still's disease)等。
[0007] 迄今为止，慢性炎性病症的医学治疗主要包括给药抗炎药物，例如甾体或非甾体抗炎药剂。给药这些药剂以缓解疼痛和炎症。有时还施用镇痛药，例如对乙酰氨基酚和/或阿片类药物(opiates)以促进疼痛的缓解。甾体抗炎药物，例如倍他米松、甲基强的松龙(methylprednisolone)、曲安奈德和数百种类似药物，可以通过局部、口服、全身注射，例如肌肉注射、静脉注射和/或通过直接注射或输注(infusion)入到受影响的组织中，或通过吸入用于肺部病症。
[0008] 非甾体抗炎药剂(NSAID)可以全身给药(例如口服、肌肉注射和/或静脉注射)以及局部给药。NSAID包括，例如，阿司匹林及其衍生物、布洛芬、酮咯酸、氟比洛芬、塞来昔布、依托度酸和萘普生，仅列举几个这些药物。抗炎药物和镇痛药有时具有有限的长期效力，短期和长期使用这些药物都会增加潜在严重副作用的风险。
[0009] 慢性炎症还与发展成某些类型的癌前病症(precancerous conditions，例如，增生、化生、发育异常(dysplasia)和/或癌症的易感性或增加的风险相关。例如，参见Schacter等人，2002，Oncology 16：217-26的综述文章，特别是Schacter等人在表1中提供的易患癌症的炎性病症的列表。例如，由幽门螺旋杆菌引起的胃炎与胃腺癌的风险相关，由某些细菌和/或结石形成引起的慢性胆囊炎与胆囊癌的风险相关，炎症性肠病与结肠癌的风险相关，以及石棉肺或矽肺病与间皮瘤或肺癌的风险相关。
[0010] 外泌体(exosomes)是宽分类范围内的生物体中包括干细胞在内的大多数种类细胞分泌的小的膜结合颗粒(Yu et al.,2014,Int J Mol Sci.7；15(3):4142-57.doi:10.3390/ijms15034142)。外泌体源于细胞内化过程中细胞质膜的内出芽，源于被认定为多泡核内体(MVE)的细胞结构，该细胞结构包裹细胞质材料作为膜结合的囊泡。各种报道称外泌体的直径范围为30nm至约200nm，更具体为约40nm至约100nm。外泌体被发现利于细胞间蛋白质、脂肪和核酸的运输和转移。正常和病变细胞均释放外泌体，外泌体也存在于血液和其他体液中。
[0011] 已经证明外泌体具有调节免疫系统的免疫刺激(Zitvogel等,US20040028692)和免疫抑制调节作用(Whiteside等，2005,British Journal of Cancer 92:209-211)。Robbins等人US20060116321描述了源自树突细胞的外泌体的免疫抑制特性。
[0012] 然而，本领域长期需要用于治疗慢性炎性病症的改良药剂，以及长期需要获得抗炎外泌体的改进方法和使用它们的方法。
发明内容
[0013] 因此，本发明提供了抗炎外泌体及其制备和使用方法。
[0014] 在第一个实施方式中，本发明提供了制备抗炎外泌体的方法，所述抗炎外泌体能够抑制被诊断患有炎性疾病或病症的受试者中的炎症，所述外泌体通过包括以下步骤的方法产生：
[0015] a)将动物细胞在合适的培养基中培养一段时间，以使培养基积累有效浓度(useful concentration)的抗炎外泌体，其中，所述培养基包含活化组合物，[0016] (b)收集步骤(a)的培养基，以及
[0017] (c)从步骤(b)收集的培养基中分离出抗炎外泌体；
[0018] 其中，所述活化组合物包括以下中的至少一种：
[0019] (i)从被诊断患有炎性疾病或病症的哺乳动物的发炎组织或其他解剖学结构(anatomical structure)中提取的流体，
[0020] (ii)来自被诊断患有炎性疾病或病症的受试者的血液、血浆或血清，[0021] (iii)进一步包含至少一种细胞因子的(i)或(ii)所示的流体，至少一种细胞因子的浓度足以提高包含(i)或(ii)的活化组合物的效力，
[0022] (iv)一种或多种细胞因子，其浓度足以诱导动物细胞分泌能够抑制受试者中的炎症的抗炎外泌体，并且所述活化组合物不包括(i)的流体和/或(ii)的血液、血浆或血清。
[0023] 优选地，(iii)或(iv)中的至少一种细胞因子为干扰素-γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1-β(1IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素12b(IL-12b)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)和/或它们的组合。所述细胞因子以约10ng/ml至约50ng/ml的浓度存在，步骤(a)中培养的时间为约24小时至约72小时。或者，步骤(a)中培养的时间为约3天至约6天。
[0025] 优选地，本发明方法使用的动物细胞为哺乳动物细胞，更优选为人细胞，尽管可以任选地使用包括鸟类细胞在内的其他动物细胞类型。所述动物细胞源自适合于该目的的任何组织或细胞类型，包括但不限于源自脐带血、胎盘、存在于羊水中的非胎儿细胞、脂肪组织、骨髓、外周血、毛囊、胃肠器官、神经系统(即中枢神经系统和/或外周神经系统)、循环系统、呼吸系统、免疫系统和/或分泌器官。
[0026] 在本发明的某些具体方面，所述动物细胞不是干细胞或癌细胞。
[0027] 受试者可以为有此需要的有利地响应本发明所述外泌体给药的任何动物，包括例如哺乳动物，例如人、犬科动物(canine)、猫科动物(feline)、猪科动物(porcine)和马科动物(equine)或鸟(avian)。
[0028] 在第二个实施方式中，本发明提供了通过上述本发明所述的方法产生的抗炎外泌体。
[0029] 在第三个实施方式中，本发明提供了通过将有效量的本发明所述方法产生的抗炎外泌体给药于受试者来治疗被诊断患有炎性疾病或病症的受试者的方法。在本发明的某些方面，所述炎性疾病或病症是组织特异性疾病或病症，例如由代谢X综合征引起的炎性疾病、胃肠系统的炎性疾病、肺系统的炎性疾病、皮肤的炎性疾病、肌肉组织的炎性疾病、关节的炎症性疾病和神经系统的炎性疾病。
[0030] 或者，炎性疾病或病症为冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、支气管炎、炎性肠病(IBD)、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎(IBM)、青少年肌炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、淀粉样变性、强直性脊柱炎、滑囊炎、银屑病性关节炎、斯提耳氏病和/或癌前病症。
[0031] 在进行本发明所述治疗炎性疾病或病症的方法时，所述抗炎外泌体通过任何本领域已知的合适的途径进行给药，例如静脉注射、肌内注射、关节内注射或输注、皮下注射和鞘内注射和/或输注，如果合适的话。有效的全身量的范围为例如每千克总体重约1.5×1010至约1.5×1013个外泌体颗粒。局部输注的有效量范围例如约1.5×1010至1.5×1011个外泌体颗粒被注射或输注入局部组织或解剖学空间内。例如，当炎性疾病或病症在肺部时，该方法可选地包括将抗炎外泌体作为吸入的雾或气雾(aerosol)进行给药。
[0032] 如上所述，受试者可以是任何有此需求的将有利地响应本发明所述外泌体给药的动物，包括例如哺乳动物，诸如人、犬科动物、猫科动物、猪科动物和马科动物，和/或鸟。
[0033] 在第四个实施方式中，本发明提供了使用至少一种额外的抗炎药剂共同治疗受试者，例如甾体抗炎药、非甾体抗炎药、抗炎性抗TNFα抗体和它们的组合。
[0034] 在本发明的第五个实施方式中，本发明提供了药物组合物，包含所述抗炎外泌体和适于全身注射、局部输注和/或吸入疗法的生理上可接受的载体。
具体实施方式
[0035] 本发明提供了抗炎外泌体以及获得和使用抗炎外泌体以抑制或下调(downregulate)受试者中免疫系统炎症反应的方法。受试者宽泛地为任何动物，包括哺乳动物和/或鸟，并且在特定的实施方式中，所述动物为需要此种治疗的人或兽类受试者(veterinary subject)。
[0036] 本发明还提供了使用本发明所述的抗炎外泌体通过下调或抑制引起某些癌症或癌前病症的炎症过程来治疗或预防受试者的癌症或癌前病症的免疫疗法。
[0037] 为了理解本发明，定义了以下术语。除非另有说明，否则将使用下列术语，并且除非另有说明，否则应按所述进行定义。在整个说明书中可以出现其他术语的定义。除非另有说明，否则所有单数术语也包括术语的复数、主动时态和过去时形式。
[0038] 本发明所述的抗炎外泌体是当将其给药于患有炎性疾病或病症的受试者时，将抑制或下调炎症过程的外泌体。抗炎外泌体由已经被活化以增强由这些细胞或组织产生或分泌的外泌体的免疫抑制活性的细胞或组织产生。该方法概括地包括将合适的细胞或组织与适当的活化组合物接触，例如培养。一旦与活化组合物接触，所处理的细胞或组织就释放抗炎外泌体，当所述抗炎外泌体被收集、纯化并给药于被诊断患有炎性疾病或病症的受试者时，将抑制或下调接受治疗的受试者中的炎症。
[0039] 如本文所用，术语细胞或组织旨在广泛地包括源自或提取自动物(例如哺乳动物)的组织、血液或体液的任何正常细胞或正常组织。在某些替代实施方式中，该定义不包括肿瘤或癌症细胞或组织。
[0040] 短语“基本上由......组成”是指组合物或方法可包括额外的成分和/或步骤，但只要所述额外的成分和/或步骤不实质上改变要求保护的组合物或方法的基础和新颖的特征，即，所述额外的成分和/或步骤对于要求保护的组合物或方法提供无用的材料。
[0041] 在本发明的某些实施方式中，细胞或组织来源于但不限于脐带、胎盘、存在于羊水中的非胎儿细胞、脂肪组织、骨髓、外周血、毛囊、胃肠器官、神经系统(即中枢神经系统和/或外周神经系统)、循环系统、呼吸系统、免疫系统和分泌器官如乳腺。
[0042] 源自胃肠器官的细胞或组织包括但不限于源自食道、胃、小肠、大肠、肝、胰腺、胆囊、唾液腺和其他胃肠道储存和/或分泌器官的粘膜表面、肠肌丛(myenteric plexus)、平滑肌和/或腺体组织的细胞或组织。
[0043] 源自神经系统组织的细胞或组织包括源自中枢神经系统(包括脑、视网膜和脊髓)的细胞或组织。源自神经系统组织的细胞或组织还包括源自外周神经系统的细胞或组织。
[0044] 源自循环系统的细胞或组织包括源自血细胞的细胞或组织，以及源自心脏(例如心肌和/或心脏瓣膜)、动脉、静脉和淋巴系统的细胞或组织。
[0045] 源自呼吸系统的细胞或组织包括源自肺、支气管、细支气管、咽和鼻咽的细胞或组织。
[0046] 源自免疫系统的细胞或组织可选地包括与免疫系统相关的那些源自骨髓、脾和外周组织的成体干细胞。
[0047] 任选地，所述细胞或组织来自待治疗的受试者。
[0048] 术语“培养”是指于体外在合适的培养基中维持、分化和/或增殖细胞。“富集的”是指含有细胞的组合物中细胞以更高的总细胞百分比存在，与发现其存在生物体的组织中时相比。
[0049] 用于培养从受试者提取的细胞或组织的方法包括本领域已知的方法。广泛地，使用来自实验动物的组织，和/或来自人或兽类患者的活体组织切片。如果组织是实体组织，则将组织切碎，用胶原酶培养以分解结缔组织，处理以中和胶原酶，并离心和/或过滤以分离组织特性的细胞。
[0050] 然后在炎性条件下培养分离的细胞。
[0051] 可以调整培养期的持续时间以优化效率、细胞计数、细胞饲养(cell feeding)和外泌体积累。在一个实施方式中，用活化组合物培养细胞的时间为约24小时至约72小时。在一个替代实施方式中，所述时间为约3天至约6天，并且在另一替代实施方式中，为约5天。
[0052] 概括地说，本发明所述“活化组合物”是指有效诱导所培养的动物细胞分泌抗炎外泌体的任何组合物。在具体的实施方式中，活化组合物包括以下的一种或多种：
[0053] (i)从被诊断患有炎性疾病或病症的哺乳动物的发炎的组织或其他解剖学结构中提取的流体，
[0054] (ii)来自被诊断患有炎性疾病或病症的哺乳动物的血液、血浆或血清，[0055] (iii)至少一种细胞因子，其浓度足以提高包含(i)或(ii)的活化组合物的效力，或
[0056] (iv)至少一种细胞因子，其浓度足以诱导所培养的细胞分泌能够抑制哺乳动物炎症的抗炎外泌体，并且所述活化组合物不包括(i)的流体和/或(ii)的血液、血浆或血清。
[0057] 优选地，(iii)或(iv)的至少一种细胞因子选自由干扰素-γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1-β(1IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素12b(IL-12b)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)及其组合组成的组中，并且以约10ng/ml至约50ng/ml的浓度存在。任选地，(iii)和/或(iv)所述的细胞因子是外源的细胞因子。
[0058] “外源的细胞因子”是从培养基的外部来源添加的细胞因子，其被添加到培养基中的水平或浓度高于其被发现于从受试者获得的流体、血液、血浆或血清中的水平或浓度。
[0059] (iv)所述的实施方式提供了合成的活化组合物，所述合成的活化组合物包含一种或多种细胞因子和可选的其它试剂而不包括从患有炎性病症的受试者获得的流体、血液、血清和/或血浆，所述细胞因子诱导所培养的细胞分泌抗炎外泌体。任选地，合成的活化组合物以脂质体的形式制备，设计成模拟外泌体的性质和组成，优选地，其尺寸为约40nm至约100nm，密度为1.15g/ml(Lane等人，2015，Scientific Reports 5，文章号：7639doi：
10.1038/srep07639)。
10.1038/srep07639)。
[0060] 合成的活化组合物包括但不限于细胞因子，如IFNγ、TNFα、IL1α和IL1β，浓度范围为约10ng/ml至约50ng/ml。
[0061] 在本发明的其他实施方式中，可以对细胞进行基因工程改造以表达编码一种或多种异种活化剂的基因。这些基因将编码细胞因子，包括IFNγ、TNFα、IL1α和/或IL1β。或者，所培养的细胞可以在支持细胞的基质上生长，例如成纤维细胞，所述支持细胞经改造以表达以上所列的活化剂。
[0062] 用于体外培养哺乳动物细胞系的培养基是本领域技术人员已知并且常用的。例如，合适的培养基是Eagle’s最低基础培养基，含有10％胎牛血清、10mL/L的Pen/Strep溶液、2mM的Ala-Gln溶液、10ng/ml表皮生长因子、10μg/ml胰岛素溶液、100μM的2-fosfo-L-抗坏血酸三钠盐和0.01μM地塞米松。
[0063] 例如，通过接种培养基培养细胞，每毫升约30000至约50000个细胞。
[0064] 在37℃下培育约2天至约4天后，收集被接种的培养基，从所述培养基中纯化和分离外泌体。这可以通过本领域已知的任何合适的方法来实现。例如，参见Robbins等人，US20060116321或Lane等人，Id.，Brownlee等人，2014，J Immunol Methods，407：120-126，doi：10.1016/j.jim.2014.04.003。这些方法包括，例如，通过差异超速离心分离外泌体的原始方法，和更新的方法，例如聚合物沉淀(来自SBI，Palo Alto，CA的ExoQuickTM)、免疫亲和捕获(Greening等人2015，Methods in Molecular Biology，影响因子：1.29)、免疫磁捕获(Exo-FLOWTM，SBI)、Invitrogen总外泌体分离试剂盒(Life Technologies，USA)和ExoSpin外泌体纯化试剂盒(Cell Guidance Systems，USA)。
[0065] 免疫亲和纯化是基于表面标志物选择性捕获特定外泌体的方法。该方法使用被链霉亲和素共价包覆的磁珠，其可以以高亲和力方式与生物素化的捕获抗体偶联。所捕获的外泌体被洗脱并且是完整的且具有生物活性。
[0066] 通过测定蛋白质含量和乙酰辅酶A乙酰胆碱酯酶的活性来量化纯化的外泌体，并通过纳米颗粒追踪分析来分析尺寸分布和浓度。通过流式细胞术和蛋白质印迹验证分离的外泌体的外泌体标志物表达。
[0067] 本发明还提供了治疗受试者的方法，所述受试者包括被诊断患有由炎性病症引起或加重的疾病或病症，和/或需要免疫系统调节的受试者。当所述受试者是人类受试者时，预期此类疾病或病症包括但不限于关节炎，过敏症，哮喘或自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、I型糖尿病、韦格纳氏肉芽肿病、多发性硬化症、克罗恩病、牛皮癣、格雷夫斯病、口炎性腹泻(celiac sprue)、斑秃、中枢神经系统血管炎、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)、自身免疫性溶血性贫血、Guillan-Barre综合征、结节性多动脉炎、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytic purpura)、巨细胞动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、艾迪生病、强直性脊柱炎、瑞特氏综合征、高安氏动脉炎和白癜风(vitligo)。可以理想地治疗的其他病症包括诸如肌营养不良症的疾病，以及炎症可以干扰自身愈合的病症，例如软组织、韧带或骨中的意外或医源性伤口，或由非免疫事件损伤的组织，例如，心肌梗塞后的心肌。
[0068] 根据本发明这些预期治疗的疾病或病症包括全身和组织特异性疾病或病症。全身性疾病包括，例如，代谢综合征的各种临床表现，例如冠状动脉疾病，例如动脉粥样硬化和缺血性心脏病，2型糖尿病，其他末端动脉器官疾病，外周动脉疾病和相关病症。
[0069] 组织特异性疾病包括局限于特定器官或组织类型的炎性疾病，如下所述。
[0070] 待治疗的呼吸系统的疾病或病症包括例如哮喘、支气管炎和慢性阻塞性肺病(COPD)。待治疗的胃肠系统的疾病或病症包括例如炎性肠病或IBD，例如溃疡性结肠炎和克罗恩病。待治疗的皮肤病包括例如皮炎、湿疹和牛皮癣。待治疗的中枢神经系统疾病或病症包括例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和任选的偏头痛病症。待治疗的肌肉组织的疾病或病症包括例如多发性肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎(IBM)和青少年肌炎。待治疗的关节的疾病或病症包括例如类风湿性关节炎、骨关节炎、淀粉样变性、强直性脊柱炎、滑囊炎，银屑病性关节炎、斯提耳氏病等。
[0071] 在某些实施方式中，所述炎性疾病或病症是倾向于更高癌症风险的那些，例如各种炎性胃肠疾病，例如炎性肠病和巴雷特氏食道癌(Barrett’s esophagous)；慢性细菌感染，例如幽门螺旋杆菌感染、慢性石棉肺病、矽肺病和吸入或其他因摄入不可生物降解的粉尘引起的组织炎症，寄生虫感染，如血吸虫病，病毒感染，如Epstein-Barr病毒、人类乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒和人类疱疹病毒-8，暴露于烟草制品引起的慢性炎症等等。
[0072] 在另一个实施方式中，待治疗的炎性疾病或病症是骨关节炎，并且活化组合物包括但不限于来自骨关节炎哺乳动物的一个或多个发炎关节的滑液。哺乳动物受试者可以是需要进行炎性疾病治疗的人类受试者或兽类受试者，例如但不限于驯养动物，通常作为宠物或工作动物饲养的动物，和/或外来动物(exotic animals)，例如动物园动物。例如，预期将本发明所述的方法，应用于不限于包括人和兽类受试者的受试者。兽类受试者包括哺乳动物和鸟。除人之外，哺乳动物受试者包括例如非人的灵长类动物、牛科动物(例如牛或奶牛)，猪科动物(例如阉猪(hogs)或猪)，羊(ovine，例如山羊或绵羊)，马科动物(例如马)，犬科动物(例如狗)，猫科动物(例如家猫)，骆驼，鹿，羚羊，兔子，豚鼠和啮齿动物(例如松鼠、大鼠、小鼠、沙鼠和仓鼠)，鲸目动物(鲸鱼、海豚(dolphins)、鼠海豚(porpoise))，鳍足亚目动物(海豹、海象)。仅举例来说，鸟类受试者包括雁鸭科(例如，天鹅、鸭和鹅)，鸠鸽科(例如白鸽和鸽子)，雉科(例如鹧鸪、松鸡和火鸡)，鸡(Thesienidae，例如家养鸡)，鹦鹉科(例如，长尾小鹦鹉、金刚鹦鹉和鹦鹉)，猎鸟和平胸鸟(例如鸵鸟)。
[0073] 本发明还提供了通过上述方法制备的纯化的抗炎外泌体。
[0074] 不受任何关于本发明如何操作的理论或假设的约束，由在活化组合物存在下培养的细胞或组织产生的抗炎外泌体诱导存在于发炎组织中的巨噬细胞从M1促炎表型转变为M2巨噬细胞免疫抑制表型，所述活化组合物包含由炎性组织分泌的因子。
[0075] M1巨噬细胞是具有有效的抗微生物活性的、可促进T辅助细胞反应的促炎性细胞。M1巨噬细胞也与许多炎性疾病有关，例如骨关节炎。M2巨噬细胞是可以支持T辅助细胞2(Th细胞2)相关的效应子功能的免疫抑制细胞。M2巨噬细胞产生抗炎细胞因子(
2015，Mediators Inflamm，2015：816460.doi：10.1155/2015/816460)，并被认为在炎症、组织重塑和伤口修复的改善(resolution)中起主要作用。
2015，Mediators Inflamm，2015：816460.doi：10.1155/2015/816460)，并被认为在炎症、组织重塑和伤口修复的改善(resolution)中起主要作用。
[0076] 抗炎外泌体通过任何临床上适当的途径给药以将外泌体递送至发炎的组织或器官，或者可以在临床上合适时进行全身递送。举例来说，抗炎外泌体通过诸如静脉、肌肉内、关节内、皮下和/或鞘内和/或通过直接注射、输注或滴注、滴鼻或通过吸入给药进入发炎组织或器官，以及局部给药于皮肤。
[0077] “有效量”是足以产生有益或所需结果的量，例如下调的炎症反应、治疗、预防或医学病症(疾病、感染等)的改善。有效量可以以一次或多次给药、施用或剂量进行给药。有效量，即合适的剂量，将根据待治疗的体重、年龄、健康、疾病或病症和以及给药途径而发生变化。给药于受试者的外泌体的剂量时随着时间推移有效地在受试者体中实现期望的有益治疗反应的量。
[0078] 本领域技术人员将能够容易地通过滴定剂量和给药的持续时间来确定待给药的外泌体的量，以达到最佳临床反应，例如正在治疗的疾病或病症的炎症过程的缓解。
[0079] 特别地，将抗炎外泌体以每千克总体重约1.5×1010至约1.5×1013个外泌体颗粒的量进行全身给药。或者，将抗炎外泌体以约1.5×1010至1.5×1011个外泌体颗粒的量注射或输注入局部组织或解剖学空间中进行给药。
[0080] 制剂中外泌体的数量可通过本领域任何已知的方法进行确定。在非限制性实例中，外泌体颗粒数可以通过使用NanoSight仪器直接计数来确定，例如 NS300，NanoSight 或 LM10(Malvern Instruments，Ltd，Worcestershire，UK)。或者，可以通过测量乙酰辅酶A乙酰胆碱酯酶(外泌体内存在的酶)的活性，然后通过参考预先制备的外泌体计数与乙酰辅酶A水平的标准曲线来估计外泌体的数量。
[0081] 根据需要重复治疗直至获得积极的抗炎结果。可选地，根据需要以每日、每周或每月间隔重复治疗，以维持对炎症过程的抑制。
[0082] 在另一个实施方式中，本发明考虑用至少一种额外的抗炎剂共同治疗有此需要的受试者，所述至少一种额外的抗炎剂包括例如甾体抗炎药，非甾体抗炎药、抗TNFα抗体及它们的组合。
[0083] 甾体抗炎药包括但不限于可的松、曲安奈德、地塞米松、氢化可的松、强的松、甲泼尼龙、泼尼松龙氢化可的松(prednisolone hydrocortisone)、羟基曲安奈德(hydroxyltriamcinolone)、α-甲基地塞米松、地塞米松磷酸盐、二丙酸倍氯米松、戊酸氯倍他索(clobetasol valerat)、地奈德、去羟米松(desoxymethasone)、醋酸去氧皮质酮、地塞米松、二氯松(dichlorisone)、醋酸双氟拉松(diflorasone diacetate)、戊酸二氟可龙、氟哌隆酮(fluadrenolone)、氟氯缩松(fluclorolone acetonide)、氟氢可的松、氟米松新戊酸酯(flumethasone pivalate)、氟喹诺酮(fluosinolone acetonide)、氟轻松醋酸酯、氟可的松丁酯(flucortine butylesters)、氟可龙(fluocortolone)、氟泼尼定(氟泼立定(fluprednylidene))乙酸酯、氟氢缩松、哈西奈德、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、甲基强的松龙、醋酸曲安奈德(triamcinolone acetonide)、可地松、可托多松、醋酸氟轻松(flucetonide)、氟氢可地松、二氟龙松二醋酸酯(difluorosone diacetate)、氟拉唑酮(fluradrenolone)、氟氢可的松、二氟龙松二醋酸酯、氟雷松(fluradrenolone acetonide)、甲羟孕酮、安西法尔(amcinafel)，安西非特、倍他米松及其平衡酯、氯泼尼松(chloroprednisone)、氯泼尼松醋酸酯、氯哌酮(clocortelone)、氟哌啶酮(clescinolone)、二氯松、二氟哌啶(diflurprednate)、氟二氯松、氟尼缩松、氟米龙(fluoromethalone)、氟培龙(fluperolone)、氟泼尼龙、戊酸氢化可的松、氢化可的松环戊基丙酸酯、氢可他酯、甲泼尼龙、帕拉米松(paramethasone)、泼尼松龙、泼尼松、二丙酸倍氯米松、曲安缩松、以及它们的混合物。
[0084] 配制用于吸入疗法的甾体抗炎药包括但不限于倍氯米松、布地奈德、环索奈德、氟尼缩松、氟替卡松和曲安奈德。
[0085] 非甾体抗炎药(NSAID)代表了一大类具有镇痛、抗炎和退热性能的治疗剂。NSAID通常通过阻断环氧化酶1和/或环氧化酶2(COX 1和COX 2)来缓解炎症。选择性抑制COX 2酶的NSAID更能保护胃粘膜，其中COX1是优势酶。代表性的NSAID包括但不限于。
[0086] 非甾体抗炎药(NSAID)代表了一大类具有镇痛、抗炎和退热作用的治疗剂。NSAID通常通过阻断环氧化酶1和/或环氧化酶2(COX 1和COX 2)酶来缓解炎症。选择性抑制COX 2酶的NSAID更能保护胃粘膜，其中COX1是优势酶。代表性的NSAID包括但不限于醋氯芬酸、阿西美辛、阿克他利、阿氯芬酸(alcofenac)、阿明洛芬、氨芬酸、阿洛西平(aloxipirin)、阿司匹林、阿扎丙宗、苄达明(前列腺素合成酶抑制剂)、布替布芬(butibufen)、塞来昔布、氯塞诺沙星(chlorthenoxacin)、水杨酸胆碱、右酮洛芬(dexketoprofen)、双氯芬酸、二氟尼柳、依莫法宗、依匹唑；依托度酸、依托考昔(etoricoxib)、苯氯布宗、联苯乙酸(felbinac)、芬布芬(fenbufen)、芬氯酸(fenclofenac)、非诺洛芬、氟比洛芬、格拉非宁(glafenine)、水杨酸羟乙酯(hydroxylethyl salicylate)、布洛芬、吲哚美辛(indomethacin)、吲哚布洛芬、酮洛芬、酮咯酸、氯索洛芬、罗美昔布、甲灭酸(mefenamic acid)、美洛昔康、安乃近、甲灭酸、甲嗪酸(metiazinic acid)、莫非保松、莫苯唑酸、纳布美通、萘普生、尼芬那宗、尼氟灭酸、奥沙普秦、吡罗昔康、普拉洛芬、异丙安替比林、普罗喹宗、丙替嗪酸(protizinic acid)、罗非考昔、水杨酰胺、水杨酰水杨酸、苏灵大、舒洛芬、噻拉米特、替诺立定(tinoridine)、托灭酸(tolfenamic acid)、甲苯酰吡啶乙酸和伐地考昔。
[0087] 基于抗体的抗炎药物包括但不限于英夫利昔、依那西普、阿仑单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、依法利珠单抗(efalizumab)、阿法赛特、那他珠单抗、阿巴西普、塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、康纳单抗、拖珠单抗、优特克单抗(MAbs.2010年5月-6月；2(3)：233-255)、维多珠单抗(Vedolizumab)、他利珠单抗、阿不睿鲁单抗(abrilumab)、英克拉库单抗(inclacumab)、安弗露单抗(anifrolumab)、安如开珠单抗(anrukinzumab)、苯拉利珠单抗(benralizumab)、博达路单抗(brodalumab)、卡扎克珠单抗(clazakizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、艾德伦单抗(eldelumab)、艾托利珠单抗(etrolizumab)、功米立西单抗(gomiliximab)、马瑞伦单抗(mavrilimumab)、奥克伦单抗(oxelumab)、帕特利珠单抗(pateclizumab)、帕拉开珠单抗(perakizumab)、奎利珠单抗(quilizumab)、容塔利珠单抗(rontalizumab)、丝如库单抗(sirukumab)、特则帕鲁单抗(tezepelumab)、替达克珠单抗(Tildrakizumab)和扎诺伦单抗(zanolimumab)。
[0088] 实施例
[0089] 提供以下实施例是为了解释说明本发明，而不旨在限制本发明的范围。
[0090] 实施例1
[0091] 从发炎的组织中分离细胞
[0092] 从被诊断患有巴雷特氏食道癌的患者的食道获得表现出特征性化生的组织的活组织切片检查样品。基本上按照Secunda R，2015，Cytotechnology 67(5)：793-807，doi：10.1007/s10616-014-9718-z中所述的方法分离细胞。将活组织切片检查样品切碎并用
0.075％的I型胶原酶在37℃下消化30分钟，然后通过加入含有20％热灭活的胎牛血清的α-MEM中和I型胶原酶的活性。
0.075％的I型胶原酶在37℃下消化30分钟，然后通过加入含有20％热灭活的胎牛血清的α-MEM中和I型胶原酶的活性。
[0093] 中和酶后，将样品以600×g离心10分钟，并通过70μm细胞过滤器进行过滤。将新鲜分离的细胞(1.5×106)铺在100mm培养皿上的Eagle's最低基础培养基(含10％胎牛血清、10mL/L Pen/Strep溶液、2mM的Ala-Gln溶液、10ng/ml表皮生长因子、10μg/ml胰岛素溶液、
100μM的2-fosfo-L-抗坏血酸三钠盐和0.01μM地塞米松)中。
100μM的2-fosfo-L-抗坏血酸三钠盐和0.01μM地塞米松)中。
[0094] 每4天用新鲜培养基替换培养基。一旦细胞达到70％至80％覆盖率(confluence)，通过TrypLE Express分离细胞并以1×103/cm2至2×103/cm2的密度重新铺板。
[0095] 实施例2
[0096] 在具有活化组合物的炎性条件下培养分离的细胞
[0097] 例如，通过接种培养基培养细胞，每毫升约30000至约50000个细胞。
[0098] 将实施例1中获得的细胞在炎性条件下于合适的培养基中进行孵育。通过在37℃向培养基中加入一种或多种促炎性细胞因子和/或从发炎组织中提取的流体以提供炎性条件。培养足以积累有用水平的抗炎外泌体的一段时间后，例如，约2天至约4天，从培养基中分离出培养的细胞，并收集培养基。
[0099] 实施例3
[0100] 分离抗炎外泌体
[0101] 通过聚合物沉淀(来自SBI，Palo Alto，CA的ExoQuickTM)、免疫亲和捕获(Greening等人2015，Methods in Molecular Biology，影响因子：1.29)从实施例2中收集的培养基中纯化和分离外泌体。
[0102] 通过与磁珠(Exo-FLOWTM，SBI)结合而进一步纯化由聚合物沉淀分离的外泌体。将磁珠[9.1μm，1.6×107珠/ml]与抗CD9或抗CD63或抗CD81生物素化抗体在冰上偶联2小时，然后与外泌体在旋转架上于4℃温育过夜以实施捕获。珠子分别用三种不同的抗体包覆，然后混合以捕获外泌体。
[0103] 实施例4
[0104] 验证分离的外泌体
[0105] 通过测定蛋白质含量和乙酰辅酶A乙酰胆碱酯酶的活性来定量实施例4纯化的外泌体，并通过纳米颗粒跟踪分析分析尺寸分布和浓度。通过流式细胞术和蛋白质印迹验证分离的外泌体的外泌体标志物表达。
[0106] 使用特异性外泌体标志物TSG101通过蛋白质印迹，以及使用Exo-FITCTM染色通过流式细胞术验证外泌体。该染色利用了大多数外泌体表面蛋白具有修饰的事实，例如糖基化，碳水化合物附加物等，其与SBI蛋白质-异硫氰酸荧光素(FITC)缀合物(可以从Exo-FITCTM(SBI)商购获得)的蛋白质组分结合。数据表明约90％与珠子结合的外泌体对染色呈阳性。通过NanosightTM分析SF衍生的外泌体的尺寸分布和浓度。
[0107] 实施例5
[0108] 确认分离的抗炎外泌体的抗炎活性
[0109] 通过细胞因子基因表达分析评估实施例1-4制备和纯化的外泌体的M1刺激性质。将M1巨噬细胞与纯化的外泌体一起孵育6小时，并通过RT-PCR评估细胞因子编码mRNA表达。
观察到IL-1β基因表达的显著上调，以及IL12b表达的下调。
观察到IL-1β基因表达的显著上调，以及IL12b表达的下调。
[0110] 总体结果证实，源自滑液的外泌体能够刺激M1巨噬细胞。
[0111] 参考文献的引入
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