技术领域
[0001] 本
发明涉及纳米材料
生物安全性检测领域，尤其涉及一种原初态纳米材料致哺乳动物癌变的方法。
背景技术
[0002] 现代医学研究表明，癌症的发生发展是由多基因、多因素、多阶段共同长期相互作用的结果。
机体自身遗传因素(Genetic factors,基因突变及遗传变异)和环境污染物(Environmental pollutants)为导致癌症发生发展的两大类重要因素。环境污染物一方面可能会导致基因突变而致癌，另一方面因为已经发生基因突变的机体对环境污染物的刺激更加敏感，而易发生癌症。同时，有报道表明，环境污染物的持续作用还能增强多种
肿瘤的发展。纳米材料作为人类广泛
接触的一种新型环境污染物，已被证实可致DNA损伤和基因突变，但其致/促癌性目前尚无定论。为何纳米材料可致突却未见致癌？我们认为不一定是纳米材料没有致癌性(纳米二
氧化
钛已被列为疑似致癌物)，而可能是由于目前研究思路和研究手段受限。我们推测其中一个重要的原因可能在于：受试模型的选择还不是十分适合。我们需要更多的考虑“机体自身遗传因素”的影响，选择自身已具有某个/些基因突变的受试细胞和实验动物模型。事实上，我们现实生活中也有很多人很多动物自身就具有遗传不
稳定性。据报道，人类在进化历程中，突变可自然发生。保守的估计，自人类与黑猩猩区分的那一刻起，人类每代每个二倍体基因组平均发生4.2个
氨基酸的突变。虽然这些突变至少有38％为自然选择所去除，但每代二倍
体细胞中每个基因组仍可保留1.6个新突变。这些已经存在的突变可能会导致个体更容易受环境污染物(比如纳米材料)的诱导而发生癌症。纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的有效暴露方法请参考我们之前
申请的
专利(申请号：
201611078908.X)。本发明旨在上述体外细胞实验(in vitro)的
基础上，将经过“原初态”纳米材料(指生产出来后尚未释放入环境中的原始状态的纳米材料)长期的、慢性的、低剂量的处理后发生了恶性转化的哺乳动物细胞(该细胞系自身存在酪氨酸
磷酸酶SHP-2基因的点突变，具有遗传不稳定性)注射入小鼠皮下，一定时间之后我们既能直接肉眼观察“原初态”纳米材料是否诱发肿瘤，又能通过病理切片、显微观察等技术手段鉴定该肿瘤是否会发生迁移转化。该发明既能为纳米材料的致癌性研究提供体内实验(in vivo)数据，又能为纳米材料安全性评估和肿瘤的高发提供新的线索，具有重要的现实意义。
[0003] 现有纳米材料致癌性的研究结果基本都是阴性的，其中一个重要原因在于纳米材料本身存在各种有别于常规材料的特性，目前的大量研究都是针对纳米材料的短时间较高剂量急性暴露的遗传效应，而缺乏适用于纳米材料的慢性低剂量长期暴露的稳定方法。总体来说，当前针对纳米材料的安全性评估并不完善。已有的大量研究采用各类细菌(bacteria)为受试对象，但由于很大一部分纳米材料(如纳米
银、纳米氧化锌和纳米氧化钛等)均具有抗菌特性，再加上细菌本身缺乏将纳米材料吞噬入体的能
力，所以以细菌为受试对象的研究结果大多都是阴性的结果，即使有少部分研究暗示纳米材料具有一定的遗传毒性和致突能力，这部分研究也不能准确反映纳米材料的真实毒性，原因就在于细菌并不适用于纳米材料的毒性研究。哺乳动物细胞(mammalian cell)是来自哺乳动物体的细胞，目前已建成许多来自鼠、猴和人等重要的细胞系，这些离体细胞的培养由于可用来大量生产
疫苗、重组蛋白和其他医疗产品而倍受重视，也被广泛用于各种毒理学研究。生物医学中经常用到哺乳动物细胞培养等离体实验，例如，观察某种新型药物对肿瘤的影响，就不能直接作用于人体，而是要先在培养的肿瘤细胞上，只有动物模型通过了，才能到临床试验阶段！针对纳米材料的毒理学和致癌性研究也应先以哺乳动物细胞为受试对象进行in vitro
水平的实验研究，在in vitro研究结果的基础上再开展动物个体水平的in vivo研究。目前采用哺乳动物细胞为受试对象的纳米毒理学研究也已大量开展，但在动物个体水平的研究还较匮乏，少量已有的研究结果也基本都是阴性的。综上所述，以哺乳动物为受试对象，建立和发展一种针对纳米材料进行个体水平(如小鼠)的致癌性研究的有效方法显得尤为重要。
发明内容
[0004] 本发明公开了一种原初态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，用于解决
现有技术中纳米材料致癌性研究的不足，以及对受试对象选择的不合理，本发明选用了哺乳动物细胞作为受试对象，经过长时间的、低剂量的慢性暴露并将恶性转化的细胞植入小鼠体内，检测原初态纳米材料对哺乳动物癌变的影响，为纳米材料安全性评估和肿瘤的高发提供新的线索，具有重要的现实意义；本发明公开的技术方案如下：
[0005] 本发明公开了一种原初态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，包括以下实验步骤：
[0006] 步骤一、原初态纳米材料母液的配置：将纳米氧化锌粉末直接分散于超纯水中，配置成浓度为1mg/ml的储备液，经高温、高压灭菌后，室温密闭、避光保存，备用；
[0007] 步骤二、原初态纳米材料致哺乳动物细胞的恶性转化，操作如下：
[0008] A.将正常小鼠胚胎
成纤维细胞(SHP-2+/+MEF)和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞(SHP-2D61G/+MEF)用含10％胎
牛血清的DMEM培养基在
培养箱中培养；
[0009] B.分别取一皿处于对数期的、满度为80％的SHP-2+/+MEF细胞和SHP-2D61G/+MEF细胞，经胰蛋白酶消化后分别种植于60mm培养皿中，培养24小时，待细胞生长至对数生长期后，弃去原培养液；再向每个培养皿中分别加入稀释后的储备液与含10％胎牛血清的DMEM培养基
混合液，培养24小时后，去除混合液，每皿细胞用1.5ml
磷酸盐缓冲液漂洗3遍，漂洗后，每个培养皿细胞中再加入4ml含10％胎牛血清的DMEM培养基连续培养3天；待长满后，用胰蛋白酶酶解消化后开始第二轮纳米材料的慢性处理；循环操作，连续暴露60代(即6个月)完成慢性暴露的过程；
[0010] 步骤三、用原初态纳米材料诱发裸鼠成瘤：购买4周龄的雌BALB/c裸鼠，SPF级环境中饲养一周后，提取步骤二中正处于对数生长期的、经过原初态纳米氧化锌慢性刺激达6个月的并发生恶性转化的正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞组成细胞悬液，将细胞悬液在无菌培养室内接种至裸鼠皮下，诱发成肿瘤；
[0011] 步骤四、对小鼠进行病理研究：待步骤三中的裸鼠有肉眼可见的瘤体后，每隔1天对所述瘤体的体积进行测量；待瘤体长大后，取出称重，提取裸鼠肝、脾、
肺等器官细胞，用
电子显微仪器进行细胞检测，检测肿瘤是否发生转移。
[0012] 进一步的，为了更加有利于细胞的培养，步骤二的操作A中培养箱为二氧化
碳培养箱，培养箱内的培养环境为恒温37℃，培养箱内含5％体积浓度的二氧化碳、恒定的酸
碱度(pH值：7.2-7.4)和较高的相对饱和湿度(95％)。
[0013] 进一步的，为了提供低剂量的(一般为亚细胞毒性的较低剂量)的毒性环境，步骤二的操作B中稀释后的储备液浓度为1.5μg/ml。
[0014] 进一步的，考虑到现实生活中应用较多的纳米材料的粒径大小，步骤一中纳米氧化锌的粒径为20nm。
[0015] 进一步的，步骤二的操作B中正常小鼠胚胎成纤维细胞(SHP-2+/+MEF)和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞(SHP-2D61G/+MEF)，经胰蛋白酶消化后分别用细胞计数仪计数，种5
植的细胞数量均为1*10个。
[0016] 进一步的，为了检测连续慢性暴露细胞的恶性生物学行为，以及进一步反映纳米材料的致癌性，步骤二的操作B中连续暴露60代(即6个月)完成慢性暴露的过程中，期间每隔5代冻存部分细胞。
[0017] 进一步的，步骤三中细胞悬液中正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞浓度均为1*107/100μl。
[0018] 进一步的，步骤三中细胞悬液在无菌培养室内接种至裸鼠的腋下。
[0019] 进一步的，为了更好的研究肿瘤细胞在小鼠体内的生长情况，以进行更好的研究，步骤四中在对瘤体的体积进行测量时，用游标卡尺分别测量肿瘤垂直方向上的最长直径a和最短直径b，肿瘤体积V＝0.5*a*b2，并将测量数据进行记录。
[0020] 与现有技术相比，本发明提供了“原初态”纳米材料在小鼠个体水平进行致癌性研究的有效方法。利用酪氨酸磷酸酶突变的小鼠胚胎成纤维细胞所具备的自身遗传不稳定性，加之纳米材料长期的、低剂量的、慢性暴露之后所获得的60代稳定细胞系，可避免因急性短时间暴露不适用于研究致癌性这一缺点，获得发生恶性转化的哺乳动物细胞。然后利用这种已经发生的恶性转化的细胞注射入小鼠(腋下)皮下，利用存在免疫
缺陷的裸鼠模型进行“原初态”纳米材料的致癌性研究，可为纳米材料的致癌性研究提供新的方法和思路。本发明提供的方法简单，易于操作，成本低，结果可靠，可为纳米材料安全性评估提供新的线索和依据，为纳米材料致癌性研究提供新的思路和方法。
附图说明
[0021] 图1为本发明原初态纳米氧化锌导致含SHP-2基因突变的小鼠胚胎成纤维细胞软琼脂集落形成能力提高的示意图。
具体实施方式
[0022] 下面对本发明的
实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0023] 实施例1
[0024] 实施例1公开了一种原初态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，包括以下实验步骤：
[0025] 步骤一、原初态纳米材料母液的配置：将粒径为20nm的纳米氧化锌分散于超纯水中，配置成浓度为1mg/ml的储备液，经高温、高压灭菌后，室温避光保存、备用；
[0026] 步骤二、原初态纳米材料致哺乳动物细胞的恶性转化，操作如下：
[0027] A.将正常的小鼠胚胎成纤维细胞(SHP-2+/+MEF)和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞(SHP-2D61G/+MEF)用含10％胎牛血清的DMEM培养基在二氧化碳培养箱中培养；培养箱的培养环境为恒温37℃，培养箱内含5％体积浓度的二氧化碳、恒定的酸碱度(pH值：7.2-7.4)和相对饱和湿度为95％；
[0028] B.分别取一皿处于对数期的、满度为80％的SHP-2+/+MEF细胞和SHP-2D61G/+MEF细胞，经胰蛋白酶消化后分别用细胞计数仪计数，分别种植1*105的细胞于60mm培养皿中，培养24小时，待细胞生长至对数生长期后，弃去原培养液；再向每个培养皿中分别加入稀释后浓度为1.5μg/ml的上述储备液与含10％胎牛血清的DMEM培养基混合液，培养24小时后，去除混合液，每皿细胞用1.5ml磷酸盐缓冲液漂洗3遍，漂洗后，每个培养皿细胞中再加入4ml含10％胎牛血清的DMEM培养基连续培养3天；待长满后，用胰蛋白酶酶解消化后开始第二轮纳米材料的慢性处理；循环操作，连续暴露60代完成慢性暴露的过程；如图1所示，用“原初+/+ D61G/+态”纳米氧化锌刺激的SHP-2 MEF和SHP-2 MEF分别在软琼脂上培养，结果说明，该“原初态”氧化锌纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的暴露方法确实有效，为了检测连续慢性暴露细胞的恶性生物学行为，以及反映纳米材料的致癌性，步骤二的操作B中连续暴露60代(即6个月)完成慢性暴露的过程中，期间每隔5代冻存部分细胞；
[0029] 步骤三、用原初态纳米材料诱发裸鼠成瘤：购买4周龄的雌BALB/c裸鼠，SPF级环境中饲养一周后，提取步骤二中正处于对数生长期的、经过原初态纳米氧化锌慢性刺激达6个月的并发生恶性转化的正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞组成细胞悬液，细胞悬液中正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞浓度均为1*107/100μl；将细胞悬液在无菌培养室内接种至裸鼠皮下，诱发成肿瘤；
[0030] 步骤四、对小鼠进行病理研究：待步骤三中的裸鼠有肉眼可见的瘤体后，每隔1天对所述瘤体的体积进行测量；在对瘤体的体积进行测量时，用游标卡尺分别测量肿瘤垂直方向上的最长直径a和最短直径b，肿瘤体积V＝0.5*a*b2，并将测量数据进行记录；待瘤体长大后，取出称重，提取裸鼠肝、脾、肺等器官细胞，用电子显微仪器进行细胞检测，检测肿瘤是否发生转移。
[0031] 实施例2
[0032] 实施例2公开了一种原初态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，包括以下实验步骤：
[0033] ①“原初态”纳米材料母液的配置方法，其步骤是：将购自美国NanoAmor公司的纳米氧化锌(粒径20nm)，用超纯水悬浮，配置成1mg/mL的储备液，经高温高压灭菌后，在室温避光保存备用。
[0034] ②“原初态”纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的有效暴露方法，其步骤是：正常小鼠胚胎成纤维细胞(SHP-2+/+MEF)和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞(SHP-2D61G/+MEF)(来源于美国Case Western Reserve University的Qu CK实验室)用含10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃，含5％CO2的二氧化碳培养箱中培养(详见《细胞细胞培养-基本技术指南(第四版)》)。分别取一皿处于对数期的满度约80％的SHP-2+/+MEF细胞和SHP-2D61G/+MEF细胞，经胰蛋白酶消化后用细胞计数仪计数，种植1×105的细胞于50mm培养皿中，培养24小时，待细胞生长至对数生长期后，弃去原培养液，加入含有1.5μg/ml(一般为亚细胞毒性的较低剂量)上述“原初态”(Fresh)纳米材料悬浊液的新鲜培养液(纳米材料+含10％胎牛血清的DMEM)，培养24小时后，去除条件培养基，每皿细胞用1.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞5遍。漂洗后，每皿细胞加入4ml新鲜的不含纳米材料的培养液(含10％胎牛血清的DMEM)连续培养3天，待长满后，用胰蛋白酶酶解消化后开始第二轮纳米材料的低剂量慢性处理(纳米材料浓度同上)。如此循环，连续暴露60代完成慢性暴露的过程，期间可每隔5代冻存部分细胞，以用于检测这些细胞的恶性生物学行为(可在一定程度上有效反映纳米材料的致癌性)。结果说明，该“原初态”氧化锌纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的暴露方法确实有效。
[0035] ③“原初态”纳米材料诱发裸鼠成瘤的研究方法，其具体步骤是：
[0036] 购买4周龄的雌Balb/c裸鼠(裸鼠被越来越多的应用在肿瘤的研究领域，裸鼠的应用实现了在活体动物的条件下观察肿瘤生长情况的可能)，SPF级环境中饲养一周后，取正处于对数生长期的已经经过“原初态”氧化锌纳米材料慢性刺激达6个月之久的、并已被证实发生了恶性转化的野生型小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、突变型小鼠胚胎成纤维细胞(D+)7
(接种量为2x10/100μl)悬液在无菌培养室内接种至裸鼠腋下。注射后每隔3天观察肿瘤生长状况，并称重。待观察到有肉眼可见的瘤体后，每隔1天测量瘤体体积V(mm3)＝0.5×a×b2(用游标卡尺测量肿瘤两个垂直方向的直径，最长径a(mm)和最短经b(mm))，分别记录实验数据。代瘤体长大合适大小后，取出瘤体，称量瘤体的重量，同时提取肝、肺、脾等器官细胞进行电子显微检测。
