一种具有骨靶向性的药物载体及其制备方法与应用
阅读：927发布：2021-04-11
专利汇可以提供一种具有骨靶向性的药物载体及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种具有骨靶向性的药物载体，包括作为包载药物主体的β-环糊精、作为靶标具有骨靶向性的天冬 氨 酸六肽；天冬氨酸六肽通过柔性链与β-环糊精连接。其制备方法包括：1）将β-CD溶于PBS后，氩气除 氧 保护30min，将柔性链滴加入β-CD溶液中，室温搅拌1小时后，将D6溶液滴加至上述溶液后室温搅拌过夜，收集产物后 透析 3天后 冷冻干燥 成固体粉末。该药物载体能够载入难以包载的疏 水 性抑菌小分子药物，并具有骨靶向性，可以将其制备成具有骨靶向性的药物，该药物能够提高疏水性抑菌小分子药物的亲水性，充分发挥疏水性抑菌小分子药物的抗菌性能，对骨感染等骨性 疾病 进行高效精准的 治疗 。，下面是一种具有骨靶向性的药物载体及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种具有骨靶向性的药物载体，其特征在于，包括作为包载药物主体的β-环糊精、作为靶标具有骨靶向性的天冬氨酸六肽；所述天冬氨酸六肽通过柔性链与β-环糊精连接。
2.根据权利要求1所述的一种具有骨靶向性的药物载体，其特征在于，所述β-环糊精通过柔性链只连接有一个天冬氨酸六肽。
3.根据权利要求1或2所述的一种具有骨靶向性的药物载体，其特征在于，所述柔性链为聚乙二醇。
4.根据权利要求1 3任一项所述的一种具有骨靶向性的药物载体的制备方法，其特征~
在于，包括以下步骤：
（1）将含有一个氨基的改性β-环糊精溶于PBS缓冲液中，并使用氩气除氧保护30min；
（2）接着滴加入柔性链原料溶液，室温搅拌1小时后，滴加一端为巯基的改性天冬氨酸六肽，室温搅拌过夜；
（3）收集产物透析3天后，冷冻干燥成白色固体粉末即得。
5.根据权利要求4所述的一种具有骨靶向性的药物载体的制备方法，其特征在于，加入的所述β-环糊精、柔性链、天冬氨酸六肽之间物质的量比为1.5:1:1.5。
6.根据权利要求4或5所述的一种具有骨靶向性的药物载体的制备方法，其特征在于，加入所述的柔性链原料为一端为马来酰亚胺，另一端为琥珀亚酰胺的聚乙二醇。
7.一种具有骨靶向性的药物，其特征在于，包括权利要求1 3任一项所述的药物载体，~
所述药物载体中β-环糊精的内部，包载有用于治疗骨疾病或预防发生骨感染的疏水小分子药物。
8.根据权利要求7所述的一种具有骨靶向性的药物，其特征在于，所述疏水小分子药物包括诺佛沙星、头孢唑林、复方新诺明、亚胺培南。
9.根据权利要求7所述的一种具有骨靶向性的药物，其特征在于，所述治疗的骨疾病包括骨质疏松症、骨转移瘤、原发性和继发性骨肿瘤、骨性关节炎、骨感染、畸形性骨炎、骨髓炎。
10.根据权利要求7 9任一项所述的一种具有骨靶向性药物的制备方法，其特征在于，~
具体过程如下：
将权利要求1 3任一项所述的具有骨靶向性的药物载体溶于UP水中，加入能够治疗骨~
疾病的疏水小分子药物，药物载体与疏水小分子药物的物质的量比为1:1，并对其进行水浴加热，升温至50℃，待疏水小分子药物粉末溶解后，搅拌1小时，停止加热，搅拌直至室温，将产物收集冷冻干燥成固体粉末，即得。
一种具有骨靶向性的药物载体及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及靶向药物载体技术领域，具体是指一种具有骨靶向性的药物载体及其制备方法与应用。
背景技术
[0002] 骨病的发病率日益升高，受到人们的高度重视，骨骼疾病主要有骨质疏松症、畸形性骨炎、骨转移瘤、原发性和继发性骨肿瘤、骨关节炎等。骨组织主要成分是羟基磷灰石。人体中大部分的钙存在于骨骼中，含量约占钙总量的99％。因此，骨组织具有生物学上的特殊性，如流血量低、密度大、渗透性差，这给临床用药带来很大的难度。传统的给药方式，药物很难按理想状态达到病变部位，疗效低、不良反应大是治疗骨病药物普遍存在的缺点。要解决这一问题，可以研制骨靶向性药物载体，使一些副作用大，能够治疗骨疾病的药物能够直接到达病变部位发挥药效。
[0003] 现有的能够治疗骨疾病的小分子疏水抗菌药物，如诺氟沙星等，在骨性疾病的治疗时，口服抗菌药物，药物起效慢且引起全身血药浓度过高等一系列问题，尤其是在进行手术时对伤口直接用药会导致药物会随体液运输到全身或代谢过快等，这类药物虽然可以对很多骨疾病有很好的治疗效果，如骨感染，但是由于其具有疏水的特性，很难将其应用在骨疾病的治疗中，因此需要一种能够提高该类疏水小分子药物的溶解度，并将其准确运输到骨病变部位，进行骨病治疗的骨靶向性药物载体。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种能够提高该类疏水小分子药物的溶解度，并将其准确运输到骨病变部位，进行骨病治疗的具有骨靶向性的药物载体。
[0005] 本发明另一个目的在于提供上述具有骨靶向性药物载体的制备方法。
[0006] 本发明通过下述技术方案实现：一种具有骨靶向性的药物载体，具体化学结构见下式：
[0007]
[0008] 根据上式化合物结构可知：本药物载体(β-CD-mPEG-D6)选择β-环糊精(β-CD)作为包载药物的主体，天冬氨酸六肽(D6)作为靶标，具体结构为β-环糊精通过聚乙二醇(PEG)连接有一个天冬氨酸六肽(D6)。
[0009] β-环糊精是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的β-环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元。β-环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，在其空洞结构中，外侧上端(较大开口端)由C2和C3的仲羟基构成，下端(较小开口端)由C6的伯羟基构成，具有亲水性，而空腔内由于受到C-H键的屏蔽作用形成了疏水区。其疏水性空洞内可嵌入各种有机化合物，形成包接复合物，并改变被包络物的物理和化学性质。
[0010] 天冬氨酸寡肽作为骨靶向的靶标已应用于多种骨疾病药物的研究。并以天冬氨酸六肽、天冬氨酸七肽、天冬氨酸八肽为靶标，结合药物指的靶向药物，并分别经HA吸附是吸纳、体外药动学及药效学实验进行测试，最终以天冬氨酸六肽为骨靶标取得了最优的结果，达到了骨靶向目标。
[0011] 传统以天冬氨酸六肽为靶标，均是直接将天冬氨酸六肽直接与药物结合，对药物进行直接的改性，使得药物具有骨靶向性，但是有很大的局限性，一方面，不是所有的药物均能够与天冬氨酸药物结合，形成稳定的骨靶向药物，另一方面，与天冬氨酸六肽结合的药物制备过程可能较为复杂，合成的产物无法控制，产生较多副产物，难以去除杂质，获得纯度较高纯度的成品靶向药物，无法用于工业生产。
[0012] 本申请采取了新的技术思路，使用天冬氨酸六肽改性β-环糊精，然后利用β-环糊精的结构特性，利用β-环糊精内部的空腔来包载疏水性药物小分子，这样则能拓宽药物载体包载药物的范围，主要是疏水性的药物小分子均可以使用该药物载体进行包载。
[0013] 该具有骨靶向性的药物载体的具体合成路线如下：
[0014]
[0015] 本申请曾经是准备直接将天冬氨酸六肽接入β-环糊精分子，虽然有成功，但是成功合成的药物载体极少，产率极低，而且由于β-环糊精分子直接与天冬氨酸六肽结合链长过短，会对天冬氨酸六肽的靶向作用造成一定影响。经过多次试验，最终选择聚乙二醇作为柔性链，连接β-环糊精分子和天冬氨酸六肽。
[0016] 在制备该药物载体的过程中，本申请为了提高成品药物载体的产率，减少副产物，保证反应的单一，特别采用三种改性原料：
[0017] 其中一个羟基被替换成氨基的改性β-环糊精(β-CD-NH2)：
[0018] 氨基所在端增加巯基的改性天冬氨酸六肽(DDDDDD-SH)；
[0020] 上述三种药物载体的合成原料均可通过购买成品获得。
[0021] 具有一个氨基的改性β-环糊精与改性聚乙二醇一端的琥珀酰亚胺缩合形成酯键，连接β-环糊精与改性聚乙二醇；改性聚乙二醇另一端的马来酰亚胺与具有巯基的改性天冬氨酸发生迈克尔加成反应，连接天冬氨酸六肽与改性聚乙二醇。因此，该合成路线，保证了反应的单一性，同时提升了成品药物载体的产率，基本不会发生副反应，产生额外的杂质通过透析即可除去，能够获得纯度较高的成品药物载体。而且由于β-环糊精和天冬氨酸六肽之间存在了聚乙二醇的长链，能够避免β-环糊精分子对天冬氨酸六肽靶向性的影响，保证其准确的靶向效果。
[0022] 根据其合成路线，其具体制备方法如下：
[0023] 将β-CD(1.5mM)溶于PBS后，氩气除氧保护30min，将NHS-mPEG-MAL(1mM)溶液滴加入β-CD溶液中，室温搅拌1小时后，将D6(1mM)溶液滴加至上述溶液后室温搅拌过夜，收集产物后透析3天后冷冻干燥成白色固体粉末(β-CD-mPEG-D6)。
[0024] 使用该制备得到的药物载体包载药物的具体过程为，将β-CD-mPEG-D6(1mM)溶于UP水中，加入疏水小分子药物(1mM)粉末，升温至50℃，待疏水小分子药物溶解后搅拌1小时，关闭加热，搅拌直至室温，将产物收集冷冻干燥成固体粉末。该固体粉末即是包载有疏水小分子药物的药物载体，所述疏水小分子药物包载在β-环糊精的空腔结构内。
[0025] 本发明还有提供上述具有骨靶向性药物载体的具体应用，将其制备成一种具有骨靶向性的药物，包括上述的药物载体，所述药物载体中β-环糊精的内部，包载有用于治疗骨疾病或预防发生骨感染的疏水小分子药物。
[0026] 其中，所述疏水小分子药物可以为诺佛沙星、头孢唑林、复方新诺明、亚胺培南等用于骨疾病治疗的药物。
[0027] 能够治疗的骨疾病包括骨质疏松症、骨转移瘤、原发性和继发性骨肿瘤、骨性关节炎、骨感染、畸形性骨炎、骨髓炎等骨疾病。
[0028] 该一种具有骨靶向性药物的制备方法，具体过程如下：
[0029] 将上述的具有骨靶向性的药物载体溶于UP水中，加入能够治疗骨疾病的疏水小分子药物，药物载体与疏水小分子药物的物质的量比为1:1，并对其进行水浴加热，升温至50℃，待疏水小分子药物粉末溶解后，搅拌1小时，停止加热，搅拌直至室温，将产物收集冷冻干燥成固体粉末，即得。
[0030] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
[0031] (1)本发明中的药物载体为天冬氨酸六肽改性的β-环糊精载体，该药物载体能够在β-环糊精的空腔结构内载入难以包载的疏水药物，如抗菌、抗炎、抗癌药物等，有利的提高了疏水药物的亲水性，并对骨中最主要的成分羟基磷灰石的钙离子进行螯合从而进行靶向，使得β-环糊精内腔包载的疏水药物后能够精准的对骨性疾病进行高效精准治疗；
[0032] (2)本发明中药物载体的制备过程中，采用特殊改性后的原料，使其发生固定的反应，基本没有副反应发生，也不会生成多余杂质，能够极大程度的提高药物载体的产率和产物的纯净度；
[0033] (3)本发明采用的原料均有成品出售，整个药物载体的制备过程和使用药物载体进行疏水药物包载的过程都较为简单，反应条件温和，无需复杂的反应设备，极易进行工业化生产转化，具有广泛的应用前景和价值。附图说明
[0034] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其他特征、目的和优点将会变得更为明显：
[0035] 图1为本发明中药物载体在220nm的波长下，CD-D6浓度标准曲线图；
[0036] 图2为本发明HA特异性吸附实验中对照组的荧光图；
[0037] 图3为本发明HA特异性吸附实验中实验组的荧光图；
[0038] 图4为本发明中样品及对照组的红外图谱；
[0039] 图5为本发明中样品及对照组对大肠杆菌的抑菌效果图；
[0040] 图6为本发明中样品及对照组对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图；
[0041] 图7为本发明中骨靶向性药物载体对细胞毒性的影响图。
具体实施方式
[0042] 下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
[0043] 为使本发明的目的、工艺条件及优点作用更加清楚明白，结合以下实施实例，对本发明作进一步详细说明，此处所描述的具体实施实例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0044] 实施例1：
[0045] 本实施例提供一种具有骨靶向性的药物载体，包括作为包载药物主体的β-环糊精、作为靶标具有骨靶向性的天冬氨酸六肽；所述天冬氨酸六肽通过柔性链与β-环糊精连接。
[0046] 其中，所述β-环糊精通过柔性链只连接有一个天冬氨酸六肽；所述柔性链为聚乙二醇。
[0047] 该具有骨靶向性的药物载体的制备方法，包括以下步骤：
[0048] (1)将1.5mM含有一个氨基的改性β-环糊精(β-CD)溶于PBS缓冲液中，并使用氩气除氧保护30min；
[0049] (2)接着滴加入1mM一端为马来酰亚胺，另一端为琥珀亚酰胺的聚乙二醇(NHS-mPEG-MAL)溶液，室温搅拌1小时后，滴加一端为巯基的1mM改性天冬氨酸六肽(D6)，室温搅拌过夜；
[0050] (3)收集产物透析3天后，冷冻干燥成白色固体粉末(β-CD-mPEG-D6)即得。
[0051] 其产率为89％。
[0052] 实施例2：
[0053] 本实施例针对上述实施例制备得到的药物载体(β-CD-mPEG-D6)，对其进行HA片的定量实验。
[0054] 具体实验过程如下：
[0055] 1、作CD-D6的标准曲线图：配制浓度为1mg/mL的CD-D6样品，对其梯度稀释后，利用酶标仪对CD-D6样品进行全谱扫描，得到CD-D6的最大吸收波长为220nm；设定酶标仪波长为220nm，对梯度稀释后的CD-D6样品进行OD值的检测，并作出CD-D6的标准曲线图，如图1所示。
[0056] 2.HA的定量吸附实验：将HA圆片置于孔板中，用移液枪取1mL浓度为1mg/mL的CD-D6样品置于HA圆片上，并放置于4℃冰箱中24h，取100μL液体进行波长为220nm的OD值检测。2
利用CD-D6标准曲线进行浓度换算，得HA得吸附量为0.08mg/cm。
利用CD-D6标准曲线进行浓度换算，得HA得吸附量为0.08mg/cm。
[0057] 实验结论，如图1所示，CD-D6对HA具有吸附作用，且吸附量为0.08mg/cm2。
[0058] 实施例3：
[0059] 本实施例针对上述实施例制备得到的药物载体(β-CD-mPEG-D6)，进行体外羟基磷灰石吸附实验。
[0060] 实验原理：
[0061] 为了让β-环糊精具有荧光作用，使用β-环糊精包裹由荧光标记物FICT标记的金刚烷胺，之所以选择金刚烷胺，是因为金刚烷胺是和β-环糊精的空腔结合和配比匹配最好的物质。接着利用FITC标记ADA，才能利用荧光显微镜观察药物载体是否与HA相互作用。
[0062] 具体实验过程如下：
[0063] 1、使用FITC标记ADA：
[0064] 分别将5mgAd-NH2、1.6mgF-NHS、1m1无水DMSO、50μL无水DIPEA加入1.5ml的玻璃瓶中，25℃、700rpm、避光振荡过夜。将产物通过高效液相色谱(HPLC)分离纯化后用冷冻浓缩离心干燥器干燥；
[0065] 2、分别将F-Ada装载到β-CD与CD-D6中；
[0066] 3、分别将50μL1mM的β-CD和CD-D6溶液加入到50μL，1mM的ADA-F中，将其混合液在25℃、300rpm、避光条件下振荡孵育5h后进行冷冻干燥得F-A-CD和F-A-CD-D6样品；
[0067] 4、将F-A-CD-D6吸附到HA片上并进行荧光检测：
[0068] 分别配制2mg/mLF-A-CD和F-A-CD-D6溶液，将羟基磷灰石片置于24孔板中，加入1mL溶液，静置24h后，用超纯水进行冲洗3次，进行激光共聚焦测试，激发光为488nm。
[0069] 实验结论，如图2，图3所示，图2中未见有任何荧光物质，说明F-A-CD对羟基磷灰石(HA)没有吸附作用，不具有靶向性；图3中可见明显的荧光物质，说明天冬氨酸六肽成功得与β-环糊精结合，并且对HA能够特异性的结合，具有靶向性。
[0070] 实施例4：
[0071] 本实施例以上述实施例制备的得到的药物载体来进行疏水小分子药物的包载，本实施例优选该疏水药物小分子为诺氟沙星(NFX)。
[0072] 所述诺氟沙星为第三代喹诺酮类抗菌药，会阻碍消化道内致病细菌的DNA旋转酶的作用，阻碍细菌DNA复制，对细菌有抑制作用。其在水中极微溶解，因此极难将其作为治疗骨感染的杀菌药物。将诺氟沙星包载在β-环糊精的内腔内，利用β-环糊精的亲水性，能够极大程度提高诺氟沙星的亲水性，在加上天冬氨酸六肽的靶向性作用，使得诺氟沙星在治疗骨感染，在骨处进行杀菌成为可能。
[0073] 使用上述药物载体包载诺氟沙星的过程如下：
[0074] 将β-CD-mPEG-D6(1mM)溶于UP水中，加入NFX(1mM)粉末，升温至50℃，待NFX溶于水后搅拌1小时，关闭加热，搅拌直至室温，将产物收集冷冻干燥成淡黄色固体粉末。
[0075] 其中，制备过程是通过水浴加热的方式进行加热。
[0076] 其产率为90％。
[0077] 实施例5：
[0078] 本实施例对制备的得到的药物载体以及对包载了诺氟沙星的药物载体进行表征测试：
[0079] 分别是β-环糊精(β-CD)、聚乙二醇(m-PEG)、天冬氨酸六肽(D6)、药物载体(β-CD-m-PEG-D6)、诺氟沙星(NFX)、以诺氟沙星为药物模型，测试药物载体进行包载的骨靶向药物(β-CD-m-PEG-D6-NFX)的红外图谱，如图4所示。
[0080] 根据图4可知，在药物载体(β-CD-m-PEG-D6)图谱中，均包含β-环糊精(β-CD)，聚乙-1 -1二醇(m-PEG)以及天冬氨酸六肽(D6)的特征峰，且1650cm 的伸缩振动峰消失，1570cm 的峰伸缩振动加强，是由于NHS-mPEG-MAL中的NHS的酰胺I(C-O)与β-CD的NH2进行了酯化反应，形成了酰胺II(N-H)，1712cm-1是MAL的(C＝C)特征峰消失，是由于MAL的C＝C已经与巯基进行了加成反应。
[0081] 在骨靶向药物(β-CD-m-PEG-D6-NFX)图谱中，可以看出与β-CD-m-PEG-D6特征峰相似，却没有出现NFX的特征峰，可证明NFX已经被包载在β-环糊精的内部。
[0082] 根据各成分的图谱缝隙可知，结论：β-CD-m-PEG-D6与β-CD-m-PEG-D6-NFX均已成功制备出来。
[0083] 实施例6：
[0084] 本实施例以诺氟沙星为药物模型，测试该骨靶向性药物载体的载药量以及负载效率。
[0085] 将β-CD-mPEG-D6(1mM)溶于UP水中，加入NFX(1mM)粉末，升温至50℃，待NFX溶于水后搅拌1小时，关闭加热，搅拌直至室温，将产物收集冷冻干燥成淡黄色固体粉末。
[0086] 本实施例检测诺氟沙星溶液与收集完产物后溶液中的诺氟沙星浓度，通过溶液中的吸光度(λ＝278nm)与药物标准曲线值对比可以计算出。
[0087] 本实施例按照下述公式计算得到复合纳米药物载体的载药量与载药率：
[0088] 载药量(wt.％)＝(负载药物质量/载体质量)×100％；
[0089] 载药率(％)＝(负载药物质量/药物总质量)×100％。
[0090] 本发明最后测得，本实施例药物载体的理论载药量为10(wt.％)，实际载药量为8.97(wt.％)，载药率高达89.7％。
[0091] 实施例7：
[0092] 本实施例以诺氟沙星为药物模型，该骨靶向性药物载体在包载了诺氟沙星制成骨靶向性药物(β-CD-m-PEG-D6-NFX)后，测试其诺氟沙星的释放情况，具体如下：
[0093] 将制备好的β-CD-m-PEG-D6-NFX样品称取2mg至于50mL PBS(pH7.4)中，放入恒温摇床中(37℃，75rpm)，分别在5、15、25、30、45、60、90、120、150、180min时间点取样100μL。
[0094] 利用酶标仪在278nm检测样品吸光度OD值，根据NFX浓度的标准曲线对比得相应浓度值。
[0095] 结论，NFX-CD-D6在20min时已释放到80％，在150min时释放量达到100％，符合β-环糊精包合物的释放速率。
[0096] 实施例8：
[0097] 本实施例以诺氟沙星为药物模型，该骨靶向性药物载体在包载了诺氟沙星制成骨靶向性药物(β-CD-m-PEG-D6-NFX)后，测试其体外抗菌能力。
[0098] 实验一：根据抑菌圈来判断该骨靶向性药物(β-CD-m-PEG-D6-NFX)的抑菌能力。
[0099] 选用菌种为：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
[0100] 具体实验过程：
[0101] 1、准备实验原料，
[0102] 固态原料主要是将药物成分与HA片结合构成，将HA片分别置于浓度为1mg/mL的β-CD-m-PEG-D6-NFX、NFX、CD-D6、空白的溶液中1小时后，取出HA片，并用UP水清洗三次。具体包括含有骨靶向性药物(β-CD-m-PEG-D6-NFX)的HA片、仅含有诺氟沙星(NFX)的HA片、仅含有药物载体(β-CD-m-PEG-D6)的HA片，以及不添加任何成分的HA片(作为空白对照组)。
[0103] 液态原料包括用培养基制成浓度为1mg/mL溶液的骨靶向性药物(β-CD-m-PEG-D6-NFX)、制成溶液的诺氟沙星(NFX)(与β-CD-m-PEG-D6-NFX摩尔比一致)、制成浓度为1mg/mL溶液的药物载体(β-CD-m-PEG-D6)、以及培养基(作为空白对照组)。
[0104] 2、准备培养基
[0105] 取四个细菌培养皿，其中两个细菌培养皿盛装适宜大肠杆菌生长繁殖的培养基，另外两个细菌培养皿盛装适宜金黄色葡萄球菌生长繁殖的培养基。
[0106] 3、接种细菌和抑菌测试
[0107] 对每个样品进行灭菌，然后在适宜大肠杆菌生长繁殖的培养皿内接种大肠杆菌，在每个培养基中，将固态的原料各选一种置于培养基中，分开放置后标记，并倒置孵育24小时后，对其观察；再每个已接种细菌的培养基里，挖四个小孔，将液态的原料均匀分散好后取80μL置于孔内，盖上培养皿盖并标记，孵育24小时后，对其进行观察。
[0108] 在适宜金黄色葡萄球菌生长繁殖的培养皿内接种金黄色葡萄球菌，其具体操作步骤与大肠杆菌的操作一致，这里不重复赘述。
[0109] 结论，根据图5(A)，图6(A)可知，第一，诺氟沙星和包载有诺氟沙星的药物载体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制效果；第二，没有包载诺氟沙星的药物载体，不具有抗菌效果；第三，包载有诺氟沙星的药物载体，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果，均超过直接使用诺氟沙星的抑菌效果，这说明该药物载体包载诺氟沙星后，其对诺氟沙星的抑菌作用有协同和增益效果；第四，无论是液态的诺氟沙星还是液态的包载有诺氟沙星的药物载体其抑菌效果都优于其固态时的抑菌情况，另外，固态的包载有诺氟沙星的药物载体还具有一定的抑菌效果，而固态的诺氟沙星抑菌效果近乎没有。
[0110] 根据图5(B)，图6(B)可知，第一，仅有包载诺氟沙星的药物载体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌圈的出现；第二，诺氟沙星没有抑菌效果说明诺氟沙星药物与HA并没有特性性的结合，可认为其并不存在于HA的表面，即可证明β-CD-m-PEG-D6-NFX已成功制备，能够于HA进行特异性吸附并释放诺氟沙星从而达到抑菌效果。
[0111] 实验二：检测骨靶向性药物(β-CD-m-PEG-D6-NFX)具有优越的体外抗菌性。
[0112] 具体过程如下：使用包载了诺氟沙星制成骨靶向性药物(β-CD-m-PEG-D6-NFX)作为实验组，直接使用诺佛沙星作为对照组，分别测试各组对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。
[0113] 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)如表一，表二所示：
[0114] 表一对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)
[0115]
[0116]
[0117] 注：NFX的浓度与β-CD-m-PEG-D6-NFX的摩尔浓度一致
[0118] 表二对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)
[0119]
[0120] 注：NFX的浓度与β-CD-m-PEG-D6-NFX的摩尔浓度一致
[0121] 结论，由表一和表二可知，本实施例提供的骨靶向性药物的抗菌性能优越，甚至超越了直接使用诺氟沙星的体外抑菌效果，这说明使用该药物载体包载诺氟沙星后，其对诺氟沙星的抑菌作用有协同和增益效果。
[0122] 实施例9：
[0123] 本实施例对骨靶向性药物载体进行体外细胞毒性测试，具体如下：
[0124] 采用L929进行毒性测试。用胰酶将细胞消化后吹打离心，加入培养基后进行细胞计数，调整细胞悬浮液体积后进行接种，在96孔板中加入100μL细胞悬液，接种密度为104个/孔，然后移至细胞培养箱中孵育24h，然后加入200μL无菌的样品：CD、D6、CD-D6、PEG、NFX、NFX-CD-D6，每组6个平行样，并设置空白组，继续孵育24h，然后加入200μLAlamarBlue试剂，混匀后孵育4h，从各孔中吸取200μL检测液置于96-well板中，用酶标仪在波长为570nm和600nm处，测定其吸光度值。因吸光度与活性细胞数量呈正相关，由此可反映细胞的增殖情况。具体计算公式如下所示：
[0125]
[0126]
[0127] 其中，Asample-570nm为待测样品在570nm处的吸光度，Asample-600nm为待测样品在600nm处的吸光度，Ablank-570nm和Ablank-600nm分别为空白孔的AlamarBlue检测液在570nm和600nm处的吸光度。
[0128] 结果如图7所示，根据不同浓度的CD-D6与NFX-CD-D6对细胞的增值率的影响柱状图可知，CD-D6与NFX-CD-D6均无细胞毒性。
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