技术领域
[0001] 本
发明属于生物技术防治领域，具体涉及一种防治斜纹夜蛾幼虫的微生物菌剂及其制备方法和用途。
背景技术
[0002] 斜纹夜蛾是一类杂食性、暴食性
害虫，危害广泛，除十字花科蔬菜外,还可危害包括瓜、茄、豆、葱、韭菜、菠菜以及粮食、经济作物等近100科、300多种
植物。多年来斜纹夜蛾一直采用化学
农药法进行防治。
[0003]
化学农药防治对迅速控制虫害的发生、扩散起到了积极作用，但化学农药防治斜纹夜蛾存在成本高、用量大、安全性差等弊端且大量使用易造成人畜中毒、污染草原同时杀灭蝗虫天敌危害草原生态环境破坏生态平衡。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种防治斜纹夜蛾幼虫的微生物菌剂及其制备方法和用途，以解决化学农药在防治斜纹夜蛾方面存在的成本高、安全性差、污染严重等问题。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 第一方面，本发明提供一种防治斜纹夜蛾幼虫的微生物菌剂，由以下菌剂按菌液体积比配制而成：绿僵菌菌液44-50％，苏
云金芽胞杆菌菌液16-29％，斯氏泛菌菌液15-18％，生孢梭菌菌液8％-12％；混合菌液中的绿僵菌、苏云金芽胞杆菌、斯氏泛菌及生孢梭菌的菌浓度为1×108-1×1010个/mL。
[0007] 进一步地，由以下菌剂按菌液体积比配制而成：绿僵菌菌液45％，苏云金芽胞杆菌菌液29％，斯氏泛菌菌液18％，生孢梭菌菌液8％。
[0008] 进一步地，所述绿僵菌的保藏号为CGMCC No.7998，所述苏云金芽胞杆菌的保藏号为CICC No.20557，所述斯氏泛菌的保藏号为CICC No.10887，生孢梭菌的保藏号为CICC No.10409。
[0009] 第二方面，本发明还提供一种上述微生物菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：
[0010] S1-菌种准备：准备绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)；
[0011] S2-菌种活化：将绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)分别用相对应的液体培养基活
化成原种；
[0012] S3-扩大培养将活化的原种菌液分别接种到相对应的培养基中，在25-30℃条件下8 10
曝气培养，曝气量为0.16-0.20m/min，当各微生物菌数分别为1×10-1×10 个/mL时，使用储罐收集各个菌种的菌液；
[0013] S4-配制菌剂：将收集的菌液按体积比配制成微生物菌，所述微生物菌剂菌浓度为1×109个/mL-1×1010个/mL。
[0014] 进一步地，在步骤S3中，所述培养基包括4-6g/L胰蛋白胨、2-3g/L
酵母提取物、4-6g/L
氯化钠和10g/L琼脂；所述培养基pH值为7.0-7.3。
[0015] 进一步地，在步骤S3中，所述储罐密闭，置于环境
温度低于20℃的条件下保存。
[0016] 第三方面，本发明还提供上述微生物菌剂的用途，所述用途为：
[0017] 防治斜纹夜蛾、玉米螟、蛴螬、蝗虫、
马铃薯甲虫、松褐天
牛其中一种或几种。
[0018] 与
现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0019] 本发明提供的制备方法，优势在于采用多种菌株培养混合而成，将四种作用机制完全不同的菌剂成分进行复配，增加了靶位点，能使昆虫不易产生抗药性且生产成本低，适合推广和工业化大规模生产。
[0020] 本发明提供的用途，优势在于微生物菌剂除了能防治斜纹夜蛾外，还能对玉米螟、蛴螬、蝗虫、
马铃薯甲虫、松褐天牛进行有效地防治，应用广泛。
[0021] 本发明提供的微生物菌剂杀虫毒
力高，不必多次施加，减轻成本负担；还能减轻对环境的污染，促进农业的可持续发展。
具体实施方式
[0022] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明
实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023] 下面对本发明的实施例作进一步描述。
[0024] 下述实施例中所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 本发明菌株来源：
[0026] 下述实施例中所用的绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株CGMCC No.7998购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0027] 下述实施例中所用的斯氏泛菌(Pantoea stewartii)菌株CICC No.10887购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0028] 下述实施例中所用的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)CICC No.20557购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0029] 下述实施例中所用的生孢梭菌(Clostridium sporogenes)菌株CCTCC AB 205694购自中国典型培养物保藏中心。
[0030] 下述实施例中所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株CCTCC AB 130001购自中国典型培养物保藏中心。
[0031] 本发明试虫来源：
[0032] 斜纹夜蛾(Spodoptera litura(Fabricius))：2～3龄幼虫，扫网法采集于广州市天河区甘蓝地中。
[0033] 亚洲小车蝗(Oedaleus decorus asiaticus B.Bienko)：2～3龄蝗蝻，扫网法采集于内蒙古
锡林郭勒盟西乌旗巴彦高勒北7公里处蝗区。
[0034] 松褐天牛(Bursaphelench xylophilus)：2～3龄幼虫，扫网法采集于娄底市双峰县荷叶镇松林中。
[0035] 以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
[0036] 实施例1
[0037] 一种防治斜纹夜蛾幼虫的微生物菌剂，微生物菌剂按照如下体积比配制成：
[0038] 绿僵菌菌液44％；
[0039] 苏云金芽胞杆菌菌液26％；
[0040] 斯氏泛菌菌液18％；
[0041] 生孢梭菌菌液12％。
[0042] 实施例2
[0043] 一种防治斜纹夜蛾幼虫的微生物菌剂，微生物菌剂按照如下体积比配制成：
[0044] 绿僵菌菌液50％；
[0045] 苏云金芽胞杆菌菌液26％；
[0046] 斯氏泛菌菌液15％；
[0047] 生孢梭菌菌液9％。
[0048] 实施例3
[0049] 一种防治斜纹夜蛾幼虫的微生物菌剂，微生物菌剂按照如下体积比配制成：
[0050] 绿僵菌菌液45％；
[0051] 苏云金芽胞杆菌菌液29％；
[0052] 斯氏泛菌菌液18％；
[0053] 生孢梭菌菌液8％。
[0054] 制备例
[0055] 一种防治斜纹夜蛾幼虫的微生物菌剂的制备方法，包含如下步骤：
[0056] S1-菌种准备：准备绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)；
[0057] S2-菌种活化：将绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)分别用相对应的液体培养基活化成原种；原种菌液浓度为1×106个/mL。
[0058] S3-扩大培养：将活化的原种菌液分别接种到相对应的培养基中，接种量为15％(v/v)，在28℃条件下曝气培养，曝气量为0.20m/min，扩大培养24h，当微生物菌数2×109个/mL时，使用储罐收集各个菌种的菌液；
[0059] S4-配制菌剂：将收集的菌液按体积比配制成复合微生物菌剂，此时所述微生物菌剂菌浓度菌浓为2×109个/mL。
[0060] 实验例1
[0061] 本发明提供的微生物菌剂对鳞翅目昆虫的防治效果
[0062] 本实验例供试药剂：高效菌剂由实施例1、实施例2、实施例3通过制备例所述的制备方法制备，分别得到高效菌剂1、高效菌剂2、高效菌剂3。
[0063] 本实验例试虫：斜纹夜蛾
[0064] 本实验例设8个处理，分别是：A：绿僵菌、B：苏云金芽胞杆菌、C：斯氏泛菌、D：生孢梭菌、E：高效菌剂1、F：高效菌剂2、G：高效菌剂3以及CK：空白对照。
[0065] 对照组用无菌
水加终浓度为0.05％的Tween-80处理；各单菌种菌浓为2×109个/mL，20kg；对照组喷施20kg清水；高效菌剂1、高效菌剂2、高效菌剂3的菌浓为2×109个/mL，20kg。
[0066] 本实验例处理方法如下：将菌剂用浸蘸的施用方式处理斜纹夜蛾2龄幼虫，处理后让其在
滤纸上爬行晾干虫体表面，之后放入养虫皿内，置于恒温恒湿
培养箱(28±1℃，RH 85％，L:D＝14:10)内培养。每个处理20头幼虫，重复3次。统计斜纹夜蛾幼虫7日的存活虫数、死虫数和僵虫数，并对死虫进行保湿培养，根据虫尸体表面长出的特征菌丝确定试虫是否为
真菌侵染致死。
[0067] 表1不同处理下斜纹夜蛾2龄幼虫感染情况
[0068]
[0069]
[0070] 如表1所示，绿僵菌对斜纹夜蛾致死率为55％-60％，苏云金芽胞杆菌对斜纹夜蛾致死率为35％-45％，斯氏泛菌对斜纹夜蛾致死率为0％，生孢梭菌对斜纹夜蛾致死率为0％，实施例1所得高效菌剂1对斜纹夜蛾的致死率可达到65％，实施例2所得高效菌剂2对斜纹夜蛾的致死率可达到65％，实施例3所得高效菌剂3对斜纹夜蛾的致死率达到75％。
[0071] 本发明提供的微生物菌剂中的各菌种具有良好的协同效果，以一定比例配合施用效果优于单施其中某一种菌的
发酵液。其中实施例3所得高效菌剂3对斜纹夜蛾的致死率最高，施用效果最好。斜纹夜蛾为鳞翅目昆虫，本发明提供的微生物菌剂对同为鳞翅目昆虫的玉米螟同样具有良好的防治效果。
[0072] 实验例2
[0073] 本发明提供的微生物菌剂对直翅目昆虫的防治效果
[0074] 本实验例供试药剂：由实施例3通过制备例所述的制备方法制备的高效菌剂3。
[0075] 本实验例试虫：亚洲小车蝗
[0076] 本实验例设两个处理，分别是高效菌剂3实验组和空白对照组。对照组用无菌水加终浓度为0.05％的Tween-80处理，喷施20kg清水；高效菌剂3的菌浓为2×109个/mL，20kg。
[0077] 本实验例处理方法如下：将高效菌剂3用浸蘸的施用方式处理亚洲小车蝗2龄幼虫，处理后让其在滤纸上爬行晾干虫体表面，之后放入养虫皿内，置于恒温恒湿培养箱(28±1℃，RH 85％，L:D＝14:10)内培养。每个处理20头幼虫，重复3次。统计亚洲小车蝗幼虫7日的存活虫数、死虫数和僵虫数，并对死虫进行保湿培养，根据虫尸体表面长出的特征菌丝确定试虫是否为真菌侵染致死。表2不同处理下亚洲小车蝗2龄幼虫感染情况[0078]
[0079] 如表2所示，实施例3所得高效菌剂3对亚洲小车蝗的致死率达到65％。施用效果较佳。
[0080] 实验例3
[0081] 本发明提供的微生物菌剂对鞘翅目昆虫的防治效果
[0082] 本实验例供试药剂：由实施例3通过制备例所述的制备方法制备的高效菌剂3。
[0083] 本实验例试虫：松褐天牛
[0084] 本实验例设两个处理，分别是高效菌剂3实验组和空白对照组。对照组用无菌水加终浓度为0.05％的Tween-80处理，喷施20kg清水；高效菌剂3的菌浓为2×109个/mL，20kg。
[0085] 本实验例处理方法如下：将高效菌剂3用浸蘸的施用方式处理松褐天牛2龄幼虫，处理后让其在滤纸上爬行晾干虫体表面，之后放入养虫皿内，置于恒温恒湿培养箱(28±1℃，RH 85％，L:D＝14:10)内培养。每个处理20头幼虫，重复3次。统计松褐天牛幼虫7日的存活虫数、死虫数和僵虫数，并对死虫进行保湿培养，根据虫尸体表面长出的特征菌丝确定试虫是否为真菌侵染致死。表3不同处理下松褐天牛2龄幼虫感染情况
[0086]
[0087] 如表3所示，实施例3所得高效菌剂3对松褐天牛的致死率达到70％。施用效果佳。松褐天牛为鞘翅目昆虫，本发明提供的微生物菌剂对同为鞘翅目昆虫的蛴螬和马铃薯甲虫同样具有防治效果。
[0088] 实验例4
[0089] 不同施用次对斜纹夜蛾2龄幼虫活性的测定
[0090] 本实验例设两个处理，分别是实施例3实验组和空白对照组，实验组分别为施用一次，施用两次和施用三次，间隔12h。
[0091] 本实验例处理方法如下：将实施例3所得高效菌剂3用浸蘸的施用方式处理斜纹夜蛾2龄幼虫，处理后让其在滤纸上爬行晾干虫体表面，之后放入养虫皿内，置于恒温恒湿培养箱(28±1℃，RH 85％，L:D＝14:10)内培养。每个处理20头幼虫，重复3次，逐日统计斜纹夜蛾幼虫的存活虫数、死虫数和僵虫数，并对死虫进行保湿培养，根据虫尸体表面长出的特征菌丝确定试虫是否为真菌侵染致死。以无菌水加终浓度为0.05％的Tween-80处理作为对照。
[0092] 表4不同施用次数对斜纹夜蛾2龄幼虫致死率的影响
[0093]
[0094]
[0095] 如表4所示，在微生物菌剂浓度为2×109个/mL时，每隔12h施用一次、两次和三次致死率分别为70.00％，73.33％，74.33％。不同施用次数对于斜纹夜蛾低龄幼虫的致死率无明显差异。在斜纹夜蛾的低龄时期，从成本考虑，不必多次施加微生物菌剂。
[0096] 以上数据说明，本发明提供的微生物菌剂可对斜纹夜蛾、玉米螟、蛴螬、蝗虫、马铃薯甲虫、松褐天牛进行有效的防治。将四种作用机制完全不同的菌剂成分进行复配，增加了靶位点，使昆虫不易产生抗药性。本发明提供的微生物菌剂杀虫
毒力高，不必多次施加，进而降低生产成本；还能减轻对环境的污染，促进农业的可持续发展。
