一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法
专利汇可以提供一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种核酸扩增反应 试剂 的冻干微球及其制备方法。冻干微球包括冻干保护剂、缓冲液、酶反应液和特异性核酸扩增反应试剂。冻干微球的制备方法包括以下步骤：核酸扩增反应体系与冻干保护剂混合均匀后，滴入液氮中冷冻成微球，然后将微球在 真空 冷冻干燥 机中冷冻干燥。冻干试剂微球 生物 活性较好，操作简单，便于常温保存和运输。冻干微球用于实时 荧光 定量PCR、普通PCR，与全自动核酸检测仪配套使用，利于现场化快速检测。，下面是一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种核酸扩增反应试剂的冻干微球，其特征在于，包括：冻干保护剂、缓冲液、酶反应液和特异性核酸扩增反应试剂。
2.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述冻干保护剂包括海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂；海藻糖的浓度为2 30%；甘露醇的浓度为1~ ~
20%；右旋糖苷为Dextran 10，Dextran 40或Dextran 70，浓度为0.4 10%； 牛血清白蛋白的~
浓度为0.1 5mg/ml；表面活性剂为Tween20，Tween80或者Triton X-100，浓度为0.2 5%；消~ ~
泡剂的浓度为0.03 1.2%。
~
3.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述缓冲液包括以下一种或者几种成分：Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、氯化钾、氯化镁、甘氨酸、硫酸铵、氯化铵、硫酸镁、脱氧核糖核酸三磷酸。
4.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述酶反应液包括以下一种或者几种试剂：DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、RNA逆转录酶、RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、ATP硫酸化酶、单链结合蛋白、无机焦磷酸酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、拓扑异构酶、解旋酶、RNA酶。
5.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述特异性核酸扩增反应试剂包括以下一种或多种试剂：引物、模板、探针、荧光染料。
6.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，冻干微球的粒径为0.1 5mm。
~
7.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，冻干微球的核酸扩增体系为1 200μL。
~
8.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述微球用于实时荧光定量PCR、数字PCR、特异性核酸片段扩增、RNA逆转录。
9.一种核酸扩增反应试剂的冻干微球制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1） 配制核酸扩增反应试剂混合液；
2） 将混合液利用精确分液系统控制液滴，滴入液氮中，在液氮中冷却后形成微球；
3） 将冷冻微球转入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。
10.根据权利要求9所述的冻干微球制备方法，其特征在于，步骤3）冷冻微球在-80 -50~
℃预冷冻1 24小时。
~
一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
Tween20，Tween80或者Triton X-100，浓度为0.2 5%；消泡剂的浓度为0.03 1.2%。
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2)将混合液利用精确分液系统控制液滴，滴入液氮中，在液氮中冷却后形成微球；
3)将冷冻微球在-80 -50℃预冷冻1 24小时，转入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。
~ ~
附图说明
具体实施方式
2) 将配制好的混合溶液混匀置于冰上。
2) 将微球用液氮预冻的小勺取出，装入-80℃预冻的西林瓶中。
。
Beads为球形，表面较光滑，分散性好，完整性很好。实验结果如图1所示；
2) 冻干微球的直径
利用游标卡尺测得冻干Beads的直径如下表1；
表1
。
2) 以M5 HiPer pTOPO-T载体为模板，扩增2kb目的片段，引物序列为：上游引物F-2k（5'-3'）：TAGCTGTTTCCTGTCCATAG，下游引物R-2k（5'-3'） CTGGCCGTCGTTTTACACAA，如下配制检测溶液:
3)配制阳性对照:
4) 将混合好的检测溶液取30μL加入含有Bead的PCR管中;
5) 混合均匀后，离心，放入PCR仪，设置反应条件为98℃ 5min；30cycles（98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 2min10s）；72℃ 10min；
6) 反应结束后，取5μl上样，1%琼脂糖凝胶电泳。实验结果如图2所示。
2) 将配制好的混合溶液置于冰上。
Beads为球形，表面较光滑，分散性好，完整性很好；
2) 冻干微球的直径
利用游标卡尺测得冻干Beads的直径如下表2；
表2
。
2) 以pET-30a载体为模板，扩增100bp目的片段，Taqman 探针T（5'-3'）：
TGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATC，10μM探针T 10μL，超纯水490μL配制混合溶液；
3) 将混匀的溶液29μL加入含有bead的PCR管中；
4) 分别加含pET-30a 1.8×103、1.8×104、1.8×105 、1.8×106 、1.8×107 1μL模板溶液至含bead的PCR管中，每个模板梯度设置三个重复；
5) 混合均匀后，离心，ABI 7500进行荧光定量PCR，设置反应条件95℃ 5min；40cycles（95℃ 10s，60℃ 45s）；
6) 实时荧光定量PCR的Ct值如表3，扩增曲线结果如图3所示；
表3
。
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