一种采用盐醇法制备透明质酸的方法
阅读：47发布：2023-12-30
专利汇可以提供一种采用盐醇法制备透明质酸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于透明质酸制备技术领域，公开了一种采用盐醇法制备透明质酸的方法，其包括如下步骤:步骤1) 发酵 ，步骤2)粗提溶解，步骤3)盐析，步骤4) 乙醇 沉淀，步骤5)离心干燥。本发明解决了透明质酸生产效率和提取收率低等问题，从而缩短生产周期，降低生产成本，提高产品 质量 。，下面是一种采用盐醇法制备透明质酸的方法专利的具体信息内容。
1.一种采用盐醇法制备透明质酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2) 粗提溶解，步骤3) 盐析，步骤4) 乙醇沉淀，步骤5) 离心干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）发酵：将兽疫链球菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中培养24h，发酵过程中的温度控制在 35-36℃，搅拌速度为300-400rpm，压力控制在
0.1Mpa，pH值控制在7.0-7.1，通过搅拌和通风控制溶氧在15-20%，流加葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量为15-25g/L；
步骤2) 粗提溶解：往步骤1）所得透明质酸发酵液添加无水乙醇，待有沉淀析出时停止添加，并且停止搅拌，5h后，观察没有大量胶体颗粒沉降时，收集所得沉淀；
步骤3) 盐析：将步骤2）所得沉淀加入纯水，待完全溶解后，加入2%的过滤介质，并用盐酸调节pH值至4.5-4.8，搅拌1小时，再加入2%的氯化钠进行一次过滤，得到晶体A；往晶体A中加入纯水再次溶解，利用氢氧化钠调节pH值至11，然后加入1%的氯化钠进行二次过滤，收集晶体B；将晶体B加入纯水再次溶解，通过陶瓷膜进行过滤，得到滤液C；
步骤4) 乙醇沉淀：将步骤3）所得滤液C中加入浓度为95%、体积为滤液C体积2倍的乙醇，搅拌均匀，静置，弃去上清液，收集沉淀；
步骤5) 离心干燥：将步骤4）所得沉淀脱水、离心、烘干，得透明质酸成品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵过程中，分别于10、15和20h注入占发酵液1%体积比的H2O2。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵过程中，在发酵至6h时，于每升发酵液中以2-6ml/h的流速往发酵罐中流加2%的Na5P3O10溶液，直至发酵结束。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵过程中，在发酵至6h时，于每升发酵液中以2-4ml/h的流速往发酵罐中流加5%（v/v）草酸溶液，直至发酵结束。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖70g/L，蛋白胨15g/L，牛肉浸膏5g/L，酵母膏5g/L，七水硫酸镁0.3g/L，磷酸氢二钾1.4g/L，磷酸氢二钠1g/L，氯化钾0.4g/L，氯化锌1g/L。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述过滤介质的组分为：活性炭、硅藻土及珍珠岩的质量比为2:1:1。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵过程中，在发酵至6h时，于每升发酵液中以4ml/h的流速往发酵罐中流加2%的Na5P3O10溶液，直至发酵结束。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵过程中，在发酵至6h时，于每升发酵液中以3ml/h的流速往发酵罐中流加5%（v/v）草酸溶液，直至发酵结束。
10.按照权利要求1-9所述的方法制备得到的透明质酸。
一种采用盐醇法制备透明质酸的方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于透明质酸生产领域，具体涉及一种采用盐醇法制备透明质酸的方法。
背景技术
[0003] 透明质酸（Hyaluronic acid 简称 HA），又名玻尿酸，它由葡萄糖醛酸和N-乙酞氨基葡萄糖的双糖单位重复连接形成，是一种酸性粘多糖类高分子化合物。广泛存在于人和动物的结缔组织、眼球玻璃体、细胞间质、关节滑膜液、角膜及细菌壁中。HA以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，是一种具有较高临床价值的生化药物，广泛应用于各类眼科手术；还可用于治疗关节炎和加速伤口愈合；将其用于化妆品中，能起到独特的保护皮肤作用，保持皮肤、头发的水分，滋润皮肤、头发，增加光泽，并能防止皮肤皲裂及皱纹的产生。尤为重要的是，HA具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。
[0004] 随着近几年国内外化妆品行业的迅速发展，对HA的需求与日激增，因此HA在医疗、医疗美容及化妆品行业表现出良好的市场潜力和广阔的发展前景。透明质酸最早是从牛眼的玻璃体中发现的，自此以后，相关研究人员逐渐解析了透明质酸的结构，并对其理化性质展开研究，在此基础上，透明质酸优良的生理生化性能引起了越来越多的关注，更多的学者投入到透明质酸生产制备的研究中。透明质酸生产主要采用动物组织提取和微生物发酵生产两种方式。
[0005] 动物组织提取透明质酸的生产方法存在以下明显的缺点：第一，生产过程中使用大量酸碱盐化学试剂，易造成环境污染；第二，原料的供应范围相对较窄，存在较大的局限性；第三，产品生产工艺相对繁杂、步骤较多并且程序复杂；第四，产品收率不高一般不超过1％；第五，由于透明质酸与动物组织中其他生物大分子物质尤其是糖胺聚糖结合紧密，获取高聚合度透明质酸难度较大。这些不利因素直接造成动物组织提取透明质酸的成本居高不下，也使得动物源透明质酸产品价格昂贵，限制了其在实际中的广泛应用。
[0006] 相较于动物提取，发酵法具有不受原料来源限制、工艺简便、易形成生产规模并且无病毒交叉感染的风险，更为重要的是，该方法大大降低了生产成本，使透明质酸的应用范围得到了极大地推广。目前，透明质酸的发酵产率一般在2-3g/L，产率较低，通过优化发酵工艺来进一步提升透明质酸的产量是我们需要解决的技术问题。
[0007] 虽然我国对HA提取工艺的研究己趋于成熟，但由于原料短缺，生产出的HA多用于医药研究领域，无法满足国内在化妆品及临床医学上的需求。如何采用盐醇法提取HA从而实现大规模生产，降低成本，提高透明质酸的纯度、发酵效率以及提取收率是现有技术需要解决的重要问题。
发明内容
[0009] 本发明是通过如下技术方案来实现的 ：一种采用盐醇法制备透明质酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2) 粗提溶解，步骤3) 盐析，步骤4) 乙醇沉淀，步骤5) 离心干燥。
[0010] 进一步地，所述方法包括如下步骤：步骤1）发酵：将兽疫链球菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中培养24h，发酵过程中的温度控制在 35-36℃，搅拌速度为300-400rpm，压力控制在
0.1Mpa，pH值控制在7.0-7.1，通过搅拌和通风控制溶氧在15-20%，流加葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量为15-25g/L；
步骤2) 粗提溶解：往步骤1）所得透明质酸发酵液添加无水乙醇，待有沉淀析出时停止添加，并且停止搅拌，5h后，观察没有大量胶体颗粒沉降时，收集所得沉淀；
步骤3) 盐析：将步骤2）所得沉淀加入纯水，待完全溶解后，加入2%的过滤介质，并用盐酸调节pH值至4.5-4.8，搅拌1小时，再加入2%的氯化钠进行一次过滤，得到晶体A；往晶体A中加入纯水再次溶解，利用氢氧化钠调节PH值至11，然后加入1%的氯化钠进行二次过滤，收集晶体B；将晶体B加入纯水再次溶解，通过陶瓷膜进行过滤，得到滤液C；
步骤4) 乙醇沉淀：将步骤3）所得滤液C中加入浓度为95%、体积为滤液C体积2倍的乙醇，搅拌均匀，静置，弃去上清液，收集沉淀。
0.1Mpa，pH值控制在7.0-7.1，通过搅拌和通风控制溶氧在15-20%，流加葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量为15-25g/L；
步骤2) 粗提溶解：往步骤1）所得透明质酸发酵液添加无水乙醇，待有沉淀析出时停止添加，并且停止搅拌，5h后，观察没有大量胶体颗粒沉降时，收集所得沉淀；
步骤3) 盐析：将步骤2）所得沉淀加入纯水，待完全溶解后，加入2%的过滤介质，并用盐酸调节pH值至4.5-4.8，搅拌1小时，再加入2%的氯化钠进行一次过滤，得到晶体A；往晶体A中加入纯水再次溶解，利用氢氧化钠调节PH值至11，然后加入1%的氯化钠进行二次过滤，收集晶体B；将晶体B加入纯水再次溶解，通过陶瓷膜进行过滤，得到滤液C；
步骤4) 乙醇沉淀：将步骤3）所得滤液C中加入浓度为95%、体积为滤液C体积2倍的乙醇，搅拌均匀，静置，弃去上清液，收集沉淀。
[0011] 步骤5) 离心干燥：将步骤4）所得沉淀脱水、离心、烘干，得透明质酸成品。
[0012] 进一步地，发酵过程中，分别于10、15和20h注入占发酵液1%体积比的的H2O2。
[0013] 进一步地，发酵过程中，在发酵至6h时，于每升发酵液中以2-6ml/h的流速往发酵罐中流加2%的Na5P3O10溶液，直至发酵结束。
[0014] 进一步地，发酵过程中，在发酵至6h时，于每升发酵液中以2-4ml/h的流速往发酵罐中流加5%（v/v）草酸溶液，直至发酵结束。
[0015] 优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖70g/L，蛋白胨15g/L，牛肉浸膏5g/L，酵母膏5g/L，七水硫酸镁0.3g/L，磷酸氢二钾1.4g/L，磷酸氢二钠1g/L，氯化钾0.4g/L，氯化锌1g/L。
[0017] 优选地，发酵过程中，在发酵至6h时，于每升发酵液中以4ml/h的流速往发酵罐中流加2%的Na5P3O10溶液，直至发酵结束；优选地，发酵过程中，在发酵至6h时，于每升发酵液中以3ml/h的流速往发酵罐中流加
5%（v/v）草酸溶液，直至发酵结束。
5%（v/v）草酸溶液，直至发酵结束。
[0018] 本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性 ：1、本发明采用在发酵中后期，采用多次注入的方式添加H2O2，强化菌株的自我保护强度，分泌更厚荚膜保护层，从而产生更多的透明质酸；H2O2还能够提升发酵体系溶解氧含量，促进微生物的代谢效率，从而提升透明质酸的产量；较单次注入添加，在总添加量不变的前提下，能够提高透明质酸的产量；
链球菌的生长都伴随着乳酸的形成，从某种程度上说，有机酸的积累会对微生物生长代谢产生抑制作用；兽疫链球菌主要代谢产物是乳酸而不是透明质酸，在发酵过程中乳酸大量合成并分泌到细胞外，造成发酵体系pH急剧下降，强酸环境强烈抑制菌体生长和透明质酸合成，因此，调控pH有利于改善透明质酸发酵效果。控制乳酸的生成量，有助于降低乳酸对菌株增殖的抑制以及更多地代谢流流向透明质酸合成，在发酵中后期，乳酸的浓度不断增加，由此导致发酵 后期，细胞生长和HA 的合成均停止，且随着乳酸浓度的进一步增高，HA 的产量有所下降；适量的草酸对菌株增殖不会产生影响，但能够抑制乳酸脱氢酶的活力，从而降低乳酸的产生量，使得代谢流更多地流向透明质酸途径；
Na5P3O10含有高能磷酸键，兽疫链球菌具有高能磷酸转移酶，可以在机体内将高能磷酸键转移生成ATP分子，提升能量供给水平，从而导致透明质酸产量提高。
链球菌的生长都伴随着乳酸的形成，从某种程度上说，有机酸的积累会对微生物生长代谢产生抑制作用；兽疫链球菌主要代谢产物是乳酸而不是透明质酸，在发酵过程中乳酸大量合成并分泌到细胞外，造成发酵体系pH急剧下降，强酸环境强烈抑制菌体生长和透明质酸合成，因此，调控pH有利于改善透明质酸发酵效果。控制乳酸的生成量，有助于降低乳酸对菌株增殖的抑制以及更多地代谢流流向透明质酸合成，在发酵中后期，乳酸的浓度不断增加，由此导致发酵 后期，细胞生长和HA 的合成均停止，且随着乳酸浓度的进一步增高，HA 的产量有所下降；适量的草酸对菌株增殖不会产生影响，但能够抑制乳酸脱氢酶的活力，从而降低乳酸的产生量，使得代谢流更多地流向透明质酸途径；
Na5P3O10含有高能磷酸键，兽疫链球菌具有高能磷酸转移酶，可以在机体内将高能磷酸键转移生成ATP分子，提升能量供给水平，从而导致透明质酸产量提高。
[0019] 2、本发明采用活性炭、硅藻土、珍珠岩等不同的物质可以一次性过滤不同的杂质类型，节约时间。
[0020] 3、本发明主要整合了盐法提取和醇法提取的优势，发酵液先经过盐沉，然后经过醇沉，缩短了工艺流程，避免了盐析提取过程中透明质酸的流失和过程损耗，大大提高了产品总收率和产品质量。
[0022] 图1：H2O2对发酵液中透明质酸含量的影响；图2：Na5P3O10溶液添加量对透明质酸含量的影响；
图3：草酸溶液添加量对透明质酸含量的影响。
图3：草酸溶液添加量对透明质酸含量的影响。
[0023] 具体实施方式：为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0024] 实施例1一种采用盐醇法制备透明质酸的方法，其包括如下步骤 ：
1）发酵：以兽疫链球菌ATCC39920为试验菌株，将兽疫链球菌种子液（密度OD620=4.0）按照10％的接种量接种于含有1000L发酵培养基（组分为：葡萄糖70 g/L，蛋白胨15 g/L，牛肉浸膏5 g/L，酵母膏5 g/L，七水硫酸镁0.3 g/L，磷酸氢二钾1.4 g/L，磷酸氢二钠1 g/L，氯化钾0.4 g/L，氯化锌1 g/L）的1500L发酵罐中培养24h，发酵过程中的温度控制在 36℃，搅拌速度为300rpm，压力控制在0.1Mpa，pH值控制在7.1，通过搅拌和通风控制溶氧在15%，流加200g/L的葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量为20g/L；
（1）发酵过程中，分别于10、15和20h注入10L的H2O2；
（2）在培养至6h时，于每升发酵液中以4ml/h的流速往发酵罐中流加2%（w/v）Na5P3O10溶液，直至发酵结束；
（3）在培养至6h时，于每升发酵液中以3ml/h的流速往发酵罐中流加5%（v/v）草酸溶液，直至发酵结束；
2) 粗提溶解：往步骤1）所得透明质酸发酵液添加无水乙醇，待有沉淀析出时停止添加，并且停止搅拌，5h后观察没有大量胶体颗粒沉降时，收集所得沉淀；
3) 盐析：将步骤2）所得沉淀加入纯水，待完全溶解后，加入2%的（w/v，即100L溶液中添加2kg过滤介质）过滤介质（活性炭、硅藻土及珍珠岩的质量比为2:1:1），并用盐酸调节pH值至4.8，搅拌1小时，再加入2%（w/v，即100L溶液中添加1kg氯化钠）的氯化钠进行一次过滤，得到晶体A；往晶体A中加入纯水再次溶解，利用氢氧化钠调节PH值至11，然后加入1%（w/v，即100L溶液中添加1kg氯化钠）的氯化钠进行二次过滤，收集晶体B；将晶体B加入纯水再次溶解，通过陶瓷膜进行过滤，得到滤液C；
4) 乙醇沉淀：将步骤3）所得滤液C中加入浓度为95%、体积为滤液C体积2倍的乙醇，搅拌均匀，静置，弃去上清液，收集沉淀。
1）发酵：以兽疫链球菌ATCC39920为试验菌株，将兽疫链球菌种子液（密度OD620=4.0）按照10％的接种量接种于含有1000L发酵培养基（组分为：葡萄糖70 g/L，蛋白胨15 g/L，牛肉浸膏5 g/L，酵母膏5 g/L，七水硫酸镁0.3 g/L，磷酸氢二钾1.4 g/L，磷酸氢二钠1 g/L，氯化钾0.4 g/L，氯化锌1 g/L）的1500L发酵罐中培养24h，发酵过程中的温度控制在 36℃，搅拌速度为300rpm，压力控制在0.1Mpa，pH值控制在7.1，通过搅拌和通风控制溶氧在15%，流加200g/L的葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量为20g/L；
（1）发酵过程中，分别于10、15和20h注入10L的H2O2；
（2）在培养至6h时，于每升发酵液中以4ml/h的流速往发酵罐中流加2%（w/v）Na5P3O10溶液，直至发酵结束；
（3）在培养至6h时，于每升发酵液中以3ml/h的流速往发酵罐中流加5%（v/v）草酸溶液，直至发酵结束；
2) 粗提溶解：往步骤1）所得透明质酸发酵液添加无水乙醇，待有沉淀析出时停止添加，并且停止搅拌，5h后观察没有大量胶体颗粒沉降时，收集所得沉淀；
3) 盐析：将步骤2）所得沉淀加入纯水，待完全溶解后，加入2%的（w/v，即100L溶液中添加2kg过滤介质）过滤介质（活性炭、硅藻土及珍珠岩的质量比为2:1:1），并用盐酸调节pH值至4.8，搅拌1小时，再加入2%（w/v，即100L溶液中添加1kg氯化钠）的氯化钠进行一次过滤，得到晶体A；往晶体A中加入纯水再次溶解，利用氢氧化钠调节PH值至11，然后加入1%（w/v，即100L溶液中添加1kg氯化钠）的氯化钠进行二次过滤，收集晶体B；将晶体B加入纯水再次溶解，通过陶瓷膜进行过滤，得到滤液C；
4) 乙醇沉淀：将步骤3）所得滤液C中加入浓度为95%、体积为滤液C体积2倍的乙醇，搅拌均匀，静置，弃去上清液，收集沉淀。
[0025] 5) 离心干燥：将步骤4）所得沉淀脱水、离心、烘干，得透明质酸成品。
[0026] 实施例2一种采用盐醇法制备透明质酸的方法，其包括如下步骤 ：
1）发酵：以兽疫链球菌ATCC39920为试验菌株，将兽疫链球菌种子液（密度OD620=4.5）按照8％的接种量接种于含有1000L发酵培养基（组分为：葡萄糖70 g/L，蛋白胨15 g/L，牛肉浸膏5 g/L，酵母膏5 g/L，七水硫酸镁0.3 g/L，磷酸氢二钾1.4 g/L，磷酸氢二钠1 g/L，氯化钾0.4 g/L，氯化锌1 g/L）的1500L发酵罐中培养24h，发酵过程中的温度控制在 36℃，搅拌速度为300rpm，压力控制在0.1Mpa，pH值控制在7.0，通过搅拌和通风控制溶氧在15%，流加200g/L的葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量为20g/L；
（1）发酵过程中，分别于10、15和20h注入15L的H2O2；
（2）在培养至6h时，于每升发酵液中以6ml/h的流速往发酵罐中流加2%（w/v）Na5P3O10溶液，直至发酵结束；
（3）在培养至6h时，于每升发酵液中以4ml/h的流速往发酵罐中流加5%（v/v）草酸溶液，直至发酵结束；
2) 粗提溶解：往步骤1）所得透明质酸发酵液添加无水乙醇，待有沉淀析出时停止添加，并且停止搅拌，4.5h后观察没有大量胶体颗粒沉降时，收集所得沉淀；
3) 盐析：将步骤2）所得沉淀加入纯水，待完全溶解后，加入2%的（w/v，即100L溶液中添加2kg过滤介质）过滤介质（活性炭、硅藻土及珍珠岩的质量比为2:1:1），并用盐酸调节pH值至4.6，搅拌1小时，再加入2%（w/v，即100L溶液中添加1kg氯化钠）的氯化钠进行一次过滤，得到晶体A；往晶体A中加入纯水再次溶解，利用氢氧化钠调节PH值至11，然后加入1%（w/v，即100L溶液中添加1kg氯化钠）的氯化钠进行二次过滤，收集晶体B；将晶体B加入纯水再次溶解，通过陶瓷膜进行过滤，得到滤液C；
4) 乙醇沉淀：将步骤3）所得滤液C中加入浓度为95%、体积为滤液C体积4倍的乙醇，搅拌均匀，静置，弃去上清液，收集沉淀。
1）发酵：以兽疫链球菌ATCC39920为试验菌株，将兽疫链球菌种子液（密度OD620=4.5）按照8％的接种量接种于含有1000L发酵培养基（组分为：葡萄糖70 g/L，蛋白胨15 g/L，牛肉浸膏5 g/L，酵母膏5 g/L，七水硫酸镁0.3 g/L，磷酸氢二钾1.4 g/L，磷酸氢二钠1 g/L，氯化钾0.4 g/L，氯化锌1 g/L）的1500L发酵罐中培养24h，发酵过程中的温度控制在 36℃，搅拌速度为300rpm，压力控制在0.1Mpa，pH值控制在7.0，通过搅拌和通风控制溶氧在15%，流加200g/L的葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量为20g/L；
（1）发酵过程中，分别于10、15和20h注入15L的H2O2；
（2）在培养至6h时，于每升发酵液中以6ml/h的流速往发酵罐中流加2%（w/v）Na5P3O10溶液，直至发酵结束；
（3）在培养至6h时，于每升发酵液中以4ml/h的流速往发酵罐中流加5%（v/v）草酸溶液，直至发酵结束；
2) 粗提溶解：往步骤1）所得透明质酸发酵液添加无水乙醇，待有沉淀析出时停止添加，并且停止搅拌，4.5h后观察没有大量胶体颗粒沉降时，收集所得沉淀；
3) 盐析：将步骤2）所得沉淀加入纯水，待完全溶解后，加入2%的（w/v，即100L溶液中添加2kg过滤介质）过滤介质（活性炭、硅藻土及珍珠岩的质量比为2:1:1），并用盐酸调节pH值至4.6，搅拌1小时，再加入2%（w/v，即100L溶液中添加1kg氯化钠）的氯化钠进行一次过滤，得到晶体A；往晶体A中加入纯水再次溶解，利用氢氧化钠调节PH值至11，然后加入1%（w/v，即100L溶液中添加1kg氯化钠）的氯化钠进行二次过滤，收集晶体B；将晶体B加入纯水再次溶解，通过陶瓷膜进行过滤，得到滤液C；
4) 乙醇沉淀：将步骤3）所得滤液C中加入浓度为95%、体积为滤液C体积4倍的乙醇，搅拌均匀，静置，弃去上清液，收集沉淀。
[0027] 5) 离心干燥：将步骤4）所得沉淀脱水、离心、烘干，得透明质酸成品。
[0028] 对比例1发酵方式：以兽疫链球菌ATCC39920为试验菌株，将兽疫链球菌种子液（密度OD620=4.0）按照10％的接种量接种于含有1000L发酵培养基（组分为：葡萄糖70 g/L，蛋白胨15 g/L，牛肉浸膏5 g/L，酵母膏5 g/L，七水硫酸镁0.3 g/L，磷酸氢二钾1.4 g/L，磷酸氢二钠1 g/L，氯化钾0.4 g/L，氯化锌1g/L）的1500L发酵罐中培养24h，发酵过程中的温度控制在 36℃，搅拌速度为300rpm，压力控制在0.1Mpa，pH值控制在7.1，通过搅拌和通风控制溶氧在15%，流加200g/L的葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量为20g/L。
[0029] 实施例3一、各因素对发酵液中透明质酸含量的影响。
[0030] 1、H2O2对发酵液中透明质酸含量的影响。
[0031] 在对比例1的基础上，添加不同量的H2O2对发酵液中透明质酸含量的影响，组1：不添加H2O2；组2：分别于10、15和20h注入5L的H2O2；组3：分别于10、15和20h注入10L的H2O2；组4：分别于10、15和20h注入15L的H2O2；组5：分别于10、15和20h注入20L的H2O2；组6：于10h一次性添加45L的H2O2。如图1所示，与不添加H2O2的组1相比较，组2-6添加H2O2可以明显提高透明质酸的产量，随着添加量的增大，透明质酸的产量也随之增加，组4达到峰值，继续增大添加量或一次性添加，均导致透明质酸的产量有所下滑，过大量的H2O2可能会对透明质酸产生降解。
[0032] 2、Na5P3O10溶液添加量对透明质酸含量的影响。
[0033] 选择分别于10、15和20h注入15L的H2O2；验证Na5P3O10溶液添加量对透明质酸产量的影响。设置添加速率分别为：1ml/h，2ml/h，4ml/h，6ml/h，8ml/h，10ml/h（每升发酵液添加量）。如图2所示，随着流加速度的增加，HA含量逐步提升，流速为4ml/h时，接近峰值，继续增大流速，对HA含量影响并不大，Na5P3O10含有高能磷酸键，兽疫链球菌具有高能磷酸转移酶，可以在机体内将高能磷酸键转移生成ATP分子，提升能量供给水平，从而导致透明质酸产量提高；选择6h开始添加，是因为随着透明质酸产量增大，能量消耗提高，此时添加Na5P3O10最为合适，但是，发酵起始时开始流加Na5P3O10对HA没有明显影响。
[0034] 3、草酸溶液添加量对透明质酸含量的影响。
[0035] 选择分别于10、15和20h注入15L的H2O2；在培养至6h时，于每升发酵液中以4ml/h的流速往发酵罐中流加2%（w/v）Na5P3O10溶液，直至发酵结束；设置添加速率分别为：1ml/h，2ml/h，3ml/h，4ml/h，5ml/h，6ml/h（每升发酵液添加量）。如图3所示，随着流加速度的增加，HA含量逐步提升，流速为3ml/h时，达到峰值，继续增大流速，对HA含量没有提升，反而有所下降。适量的草酸对菌株增殖不会产生影响，但能够抑制乳酸脱氢酶的活力，从而降低乳酸的产生量，使得代谢流更多地流向透明质酸途径，但是草酸添加量过大会对菌株产生一定的毒副作用，从而抑制菌株增殖，造成透明质酸含量下降。
[0036] 二、提取工艺对透明质酸收率和纯度的影响。
[0037] 采用传统的全盐法提取透明质酸，最高收率为87%，纯度为94%；而采用此盐醇法提取透明质酸，收率为90%以上，纯度为99%以上。通过对比，本发明的方法明显提高了透明质酸的产率，在微生物发酵行业具有广阔的推广应用价值。
[0038] 以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不仅限于以上实施例，还可以有多种变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到所有的变形，均应认为是本发明的保护范围。
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