温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及干细胞再生医学技术领域，尤其涉及一种温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法。
背景技术
[0002] 心
力衰竭是各种心脏病终末期的临床综合征，也是一种全球性
疾病，急性心肌梗死和心衰导致的死亡占心血管病总死亡人数的50％以上，社会的老龄化也促使这一问题更加严重，多年来临床
治疗心衰的药物研究未见重大进展，未来心
血管疾病的治疗领域还有很多挑战。
[0003] 当前，干细胞治疗技术是被认为最有希望和最具前景价值的理想治疗手段，目前临床多采用：
[0004] 1、干细胞注射到患处或经动静脉输注干细胞。注射过程中会造成大量干细胞丢失，部分干细胞随血液循环到达其它
位置,而真正能够达到损伤部位的很少。
[0005] 2、将干细胞先附着在
生物支架上生长，然后移植到患处。植入体内的支架可能会引起
生物相容性的炎性反应，支架降解造成组织
纤维化等的
副作用。
[0006] 另外，在细胞的输注方式和应用细胞的选择上各不相同，如何使移植至体内的细胞能够聚集在病灶发挥更大作用也成为目前急需解决的问题。
[0007] 1993年日本学者okano等率先报道细胞膜性贴片技术，该技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌形成致密膜性贴片组织，能有效地修复组织缺损和改善器官功能，本发明是基于该技术，提出利用温度敏感型培养皿获得人心肌球源性干细胞膜性贴片，为解决上述问题提供了有效手段。
发明内容
[0008] 本发明为解决上述技术问题提供了一种温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法，具体为：包括以下步骤：
[0009] 步骤a、心脏组织处理：
[0010] 心脏组织在无菌条件下剪切并用胰蛋白酶消化，将消化后的心脏组织再次进行无菌剪切后接种于细胞培养皿中，加入少量CEM培养基，细胞
培养箱中培养24小时后补充CEM培养基，之后每两天进行换液；
[0011] 步骤b、心肌球培养：
[0012] 将步骤a中的心脏组织进行7-10天的培养，用胰蛋白酶消化心脏组织来源原代细胞，将细胞
密度调整为1×105/ml后接种于24孔板中，每孔300uL，培养3-7天得到心肌球；
[0013] 步骤c、心肌球的收集与接种：
[0014] 用培养基反复轻轻吹打使心肌球悬浮，收集于离心管中离心，将
收获的心肌球接种于细胞培养瓶中；
[0015] 步骤d、CDC细胞的收集与保存：
[0016] 接种于细胞培养瓶中的心肌球贴壁后会逐渐向周围爬出大量的CDC细胞，当CDC细胞生长达到80％-90％融合率后即可进行细胞传代，传代后的CDC细胞(P1)冻存于液氮中；
[0017] 步骤e、CDC心脏膜性贴片制备：
[0018] 将步骤d收集到的CDC细胞经消化酶消化，按照2×106个-3×108个/ml细胞的浓度将CDC细胞接种于温度敏感培养皿，在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养；
[0019] 步骤f、CDC心脏膜性贴片获取：
[0020] 将步骤e培养得到的接种CDC细胞的温度敏感培养皿，在超净
工作台中吸弃培养基，加入4℃预冷的膜性贴片清洗液a，将完全剥离温度敏感培养皿的CDC细胞膜性贴片移至普通培养皿中；
[0021] 步骤g、CDC心脏膜性贴片再培养：
[0022] 将步骤f中得到的CDC细胞膜性贴片在普通培养皿中滴加200μl-500μl细胞完全培养液，放入培养箱中继续培养，取出后加入膜性贴片清洗液b洗膜性贴片n次，n≥2；
[0023] 优选的，在步骤a中，所述细胞培养皿用纤维粘连蛋白包被过
[0024] 优选的，在步骤b中，所述24孔板用多聚赖
氨酸包被过
[0025] 优选的，在步骤c中，所述细胞培养瓶用纤维粘连蛋白包被过；
[0026] 进一步的，在步骤e中，预先对温度敏感培养皿进行包被处理：温度敏感培养皿中加入包被液，在37℃，5％CO2的培养箱中进行无菌包被；
[0028] 优选的，包被液为细胞完全培养基；
[0029] 进一步的，细胞完全培养基包括IMDM、FBS、L-谷氨酰胺、双抗、BME；
[0030] 进一步的，步骤e中的CDC细胞培养时间为8-24小时；
[0031] 进一步的，步骤f中的膜性贴片清洗液a为HBSS+液或PBS液；
[0032] 进一步的，步骤f中的膜性贴片清洗液b为HBSS-液或PBS液。
[0033] 本发明通过细胞膜性贴片技术，将人心肌球源性干细胞按照特定的细胞浓度接种培养在具有温度应答的培养皿中，能够有效解决以下技术问题：
[0034] 1、避免了细胞收获时消化胰酶及分散酶对细胞进行消化时细胞膜蛋白的损伤，使细胞发生功能障碍或功能缺失，减弱干细胞在治疗医学上的应用潜能；
[0035] 2、采用这种通过降温回收细胞的方式，可以使细胞与细胞外基质蛋白无损共同脱附培养皿，从而有效的保护了细胞膜蛋白和其相关受体，保证了细胞的生理功能和更强的功能特性。
[0036] 将通过本发明得到的细胞膜性贴片直接贴敷于心梗的病灶部位，使细胞100％保留在病灶处，通过细胞旁分泌的作用，促进新生血管生成，改善缺血，提高心脏功能。
附图说明
[0037] 图1为细胞在37℃时疏
水状，贴壁生长示意图；
[0038] 图2为细胞在20℃时亲水状，细胞解离悬浮示意图；
[0039] 图3为CDC细胞贴片示意图；
[0040] 图4为CDC细胞膜性贴片示意图；
[0041] 图5为CDC细胞培养示意图；
[0043] 图7为
显微镜下的CDC细胞培养图片图；
具体实施方式
[0044] 为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将列举具体
实施例进行详细描述。
[0045] 本发明制备的人心肌球源性干细胞cardiosphere-derived cells(CDCs)是将心肌球转移至经过纤维粘连蛋白包被预处理的培养瓶或培养皿中再进行贴壁培养而形成的
单层细胞。CDC细胞经流式细胞仪细胞表面标记检测，大多数的细胞表达CD105、CD166、CD90、c-kit、CD34、CD31、而不表达CD45、CD133、造血特异表达蛋白；
[0046] 细胞膜性贴片技术，是用特殊处理过的培养皿，将扩增融合的细胞通过温度的改变从培养皿底壁分离而获得完整膜性贴片状细胞结构的一种技术。与传统酶消化收集细胞的方法相比，用膜性贴片技术收集到的细胞保留了体外培养过程中分泌的胞外基质、建立的细胞-基质连接以及细胞间连接等结构。细胞膜性贴片技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌形成致密细胞膜性贴片组织，能100％将细胞保留在病灶组织部位，有效地修复组织缺损和改善器官功能；
[0047] 温度敏感型培养皿主要由温度敏感材料聚N-异丙基丙烯酰胺(poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm)经过特殊处理后使其结合在培养皿底面，由于其表面分子链上同时具有亲水性基团酰胺基(-CONH-)和疏水性的异丙基[-CH(CH3)2-]，当温度敏感培养皿在37℃细胞培养时皿中的材料为疏水性，细胞处于正常贴壁状态(如图1所示)，当温度敏感培养皿离开37℃培养温度至20℃时(如图2所示)，温度敏感培养皿中的敏感材料变为亲水性，温度变化时贴附于培养皿底部的细胞即可自动脱壁卷起，并依靠其细胞自身分泌的细胞外基质extracellular matrix(ECM)而形成具有二维结构的完整的膜性细胞片。
[0048] 实施例一：
[0049] 心脏细胞培养组织处理：
[0050] 心脏组织无菌剪成小块37℃消化5分钟，消化后再次剪切心脏组织，接种于层黏连蛋白包被过的细胞培养皿中；
[0051] 心肌球培养：
[0052] 7天后组织块爬出两种细胞，心脏组织块周围并贴敷于扁平细胞之上的小圆细胞，胰蛋白酶消化细胞，1×105/ml种于用多聚赖氨酸包被的24孔板中，3天可见细胞形成球样结构--心肌球；
[0053] 心肌球的收集与接种：
[0054] 用培养基反复轻轻吹打心肌球，收集于离心管中离心，离心条件为1000rmp、5min，将心肌球细胞接种于用纤维粘连蛋白包被过的细胞培养瓶中；
[0055] CDC细胞的收集与保存：
[0056] 接种于细胞培养瓶中的心肌球贴壁后会逐渐向周围爬出大量的细胞即CDC细胞，当培养瓶细胞长满后即可进行细胞传代，传代后的CDC细胞可冻存与液氮中，常规细胞复苏后可用于后续步骤及相关实验。
[0057] 温度敏感培养皿的包被预处理：
[0058] 温度敏感培养皿可用100％胎牛血清包被，添加量为1ml，37℃、5％CO2的培养箱中无菌包被8h；
[0059] CDC心脏膜性贴片制备：
[0060] 消化酶消化CDC细胞，显微镜下计数细胞浓度，培养箱中取出包被的温度敏感培养皿，吸弃包被液，按照2×106个/ml浓度细胞接种于相关规格的温度敏感培养皿中，37℃、5％CO2培养箱继续培养8h；
[0061] CDC心脏膜性贴片获取：
[0062] 将温度敏感培养皿在超净工作台中加入4℃预冷的pH为7.2的HBSS+液，15分钟后可见细胞从温度敏感培养皿边缘开始脱离并向皿中央呈兜状卷曲，若细胞不能完全脱离温度敏感培养皿时，用1ml移液枪轻轻沿卷起的细胞边缘吹打使细胞向中心卷起；
[0063] CDC心脏细胞膜性贴片转移：
[0064] 将CDC心脏膜性贴片和温度敏感培养皿中的液体快速倒入普通培养皿中，将膜性贴片转移纸膜贴附在膜性贴片上转移CDC心脏膜性贴片至普通培养中，加入pH为7.2的HBSS-液洗CDC心脏膜性贴片2-3次，轻轻晃动普通培养皿使CDC心脏膜性贴片完全舒展，转移时细胞贴片始终
正面向上(边缘向上卷起的为正面)；
[0065] CDC心脏膜性贴片再培养：
[0066] 将制备完成的膜性贴片普通培养皿中滴加200μl细胞完全培养液，放入培养箱中继续培养10分钟，培养箱取出膜性贴片再次用pH7.2的HBSS-液洗膜性贴片2-3次。
[0067] 实施例二：
[0068] 心脏细胞培养组织处理：
[0069] 心脏组织无菌剪成小块37℃消化5分钟，消化后再次剪切心脏组织，接种于层黏连蛋白包被过的细胞培养皿中；
[0070] 心肌球培养：
[0071] 7天后组织块爬出两种细胞，心脏组织块周围并贴敷于扁平细胞之上的小圆细胞，胰蛋白酶消化细胞，1×105/ml种于用多聚赖氨酸包被的24孔板中，7天可见细胞形成球样结构--心肌球；
[0072] 心肌球的收集与接种：
[0073] 用培养基反复轻轻吹打心肌球，收集于离心管中离心，将心肌球细胞接种于用纤维粘连蛋白包被过的细胞培养瓶中；
[0074] CDC细胞的收集与保存：
[0075] 接种于细胞培养瓶中的心肌球贴壁后会逐渐向周围爬出大量的细胞即CDC细胞，当培养瓶细胞长满后即可进行细胞传代，传代后的CDC细胞可冻存与液氮中，常规细胞复苏后可用于后续步骤及相关实验。
[0076] 温度敏感培养皿的包被预处理：
[0077] 温度敏感培养皿可用细胞完全培养基包被，培养皿中添加量为10ml，37℃、5％CO2的培养箱中无菌包被12h；
[0078] CDC心脏膜性贴片制备：
[0079] 消化酶消化CDC细胞，显微镜下计数细胞浓度，培养箱中取出包被的温度敏感培养皿，吸弃包被液，按照3×108个/ml浓度细胞接种于相关规格的温度敏感培养皿中，37℃、5％CO2培养箱继续培养24h；
[0080] CDC心脏膜性贴片获取：
[0081] 将温度敏感培养皿在超净工作台中加入4℃预冷的pH为7.2的PBS，15分钟后可见细胞从温度敏感培养皿边缘开始脱离并向皿中央呈兜状卷曲，若细胞不能完全脱离温度敏感培养皿时，用1ml移液枪轻轻沿卷起的细胞边缘吹打使细胞向中心卷起；
[0082] CDC心脏细胞膜性贴片转移：
[0083] 将CDC心脏膜性贴片和温度敏感培养皿中的液体快速倒入普通培养皿中，将膜性贴片转移纸膜贴附在膜性贴片上转移CDC心脏膜性贴片至普通培养中，加入pH7.2的PBS洗CDC心脏膜性贴片2-3次，轻轻晃动普通培养皿使CDC心脏膜性贴片完全舒展，转移时细胞贴片始终正面向上(边缘向上卷起的为正面)；
[0084] CDC心脏膜性贴片再培养：
[0085] 将制备完成的膜性贴片普通培养皿中滴加500μl细胞完全培养液，放入培养箱中继续培养60分钟，培养箱取出膜性贴片再次用pH7.2的PBS洗膜性贴片2-3次。
[0086] 本发明的温度敏感培养皿制备人心肌球源性干细胞膜性贴片的方法，具有以下技术优势：
[0087] 1、培养过程不需要使用生物支架和胰酶或其他分离酶对细胞进行消化处理，并以膜性贴片收获辅助手段就可以得到完整的心脏细胞膜性膜性贴片；
[0088] 2、心脏细胞膜性贴片具有丰富的天然细胞外基质，并且可以保留大部分纤维连接蛋白和层黏连蛋白，在体内移植时可不用缝合，
[0089] 3、膜性贴片中的粘附分子和细胞外基质可直接黏附于病变心梗部位的组织上，使细胞百分之百的作用于心脏受损的部位。
[0090] 4、从而提高细胞移植治疗对心脏组织的再生修复效果和使移植的细胞更好保留其活性。
[0091] 以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
