一种用于鼓膜修复的生物补片及其制备方法
阅读：558发布：2024-02-03
专利汇可以提供一种用于鼓膜修复的生物补片及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 耳 科修复材料领域，涉及一种用于鼓膜修复的 生物 补片 及其制备方法。本发明的耳科修复补片，克服了现有补片因去细胞工艺不当且工艺繁杂，并导致ECM中有效活性成份严重流失的缺点；本发明采用了 植物 源皂素作为去细胞 试剂 ，一来避免了化学试剂的残留及毒性，二来这种温和的去细胞试剂，针对性强，主要结合细胞膜脂质；而对ECM立体三维结构和其中的有效成份破坏很小；能保留更多的生物活性成份，如糖胺聚糖（包括透明质酸）等；本发明的补片有较完好的ECM 支架 结构和更多活性成份，具有更强诱导细胞趋化和增殖能 力 ，有利于鼓膜更快更好地修复；还具有一定抗感染功效；同时本发明的方法操作简单且方便，对ECM几无损伤。，下面是一种用于鼓膜修复的生物补片及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种用于鼓膜修复的生物补片，其特征在于，
所述补片，以去细胞的哺乳动物结缔组织为原料；
所述去细胞的去细胞试剂，主要由皂素组成。
2.根据权利要求1所述的补片，其特征在于，所述哺乳动物为猪、牛、羊、马。
3.根据权利要求1所述的补片，其特征在于，所述哺乳动物为猪。
4.根据权利要求1所述的补片，其特征在于，所述结缔组织是指小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜的一种或多种组合。
5.根据权利要求1所述的补片，其特征在于，所述哺乳动物结缔组织指猪小肠粘膜下层。
6.一种用于鼓膜修复的生物补片的制备方法，其特征在于，去细胞工艺中去细胞试剂主要由植物源非离子表面活性剂组成。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述去细胞试剂，是植物源五环三萜烯皂素、类固醇皂素两者之一或其组合物。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述去细胞试剂，是Quil-A、茶皂素两者之一或其组合物。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述去细胞试剂的有效工作浓度重量比为
0.05-1%，与补片原料作用时间为每次10-60分钟，作用温度为4-15℃。
一种用于鼓膜修复的生物补片及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 成人鼓膜的长约9毫米，宽约8毫米，厚0.1毫米；鼓膜虽很薄，但它的解剖结构有三层(紧张部)：外层是上皮层，与外耳道皮肤相连续，本质上就属于皮肤上皮细胞，主要成分为胶原蛋白和皮肤细胞；中间层由放射形和环状纤毛构成，有一定弹性和张力，也统称为纤维层(外侧为放射状，内侧为轮状)；内层是粘膜层，与鼓室粘膜相连接，由其延续而成，Ⅵ型胶原蛋白以网状结构，构成鼓膜内粘膜层的基质层，对鼓膜基质的有序排列、粘膜细胞生长起着重要作用。
[0003] 鼓膜穿孔是一种常见病，会导致听力下降或完全丧失，甚至会经常反复感染。通常可分为急性(较小)鼓膜穿孔(其在大多数情况下自发闭合)和慢性鼓膜穿孔（较大）；鼓膜穿孔往往由外伤或感染引起，例如：突发性的爆炸、头颅骨折、尖锐异物插进耳道、热液或酸进入耳道以及其它原因引起的创伤；有时中耳感染也会引起鼓膜自发性破裂(撕裂)，导致鼓膜穿孔；耳部可能会有感染液或血流出，也称为伴有鼓膜穿孔的中耳炎；不管什么原因导致的鼓膜穿孔，患者都希望能尽快将鼓膜修复；鼓膜穿孔的修复有手术修补法和贴补搭桥法两种。
[0004] 手术修补鼓膜疗效比较确切，但需要用颞肌筋膜或乳突骨膜等修补，创伤较大，手术费较贵；而贴补搭桥材料有多种，如鸡蛋衣、淀粉海绵、羊胎膜等，但这些传统的材料，只是作为一种普通支架来发挥作用，并无明显促进细胞生长的功能，其促进鼓膜穿孔愈合的能力较弱。较成熟的鼓膜修补材料有，可吸收的蛋白海绵、异种胶原生物膜；如辉瑞(Pfizer)生产的Gelfoam，以及美敦力(Medtronic)生产的EpiDisc TM，一种用于修复鼓膜的多孔透明质酸贴剂,其为生物可降解的，宣称能够同时诱导鼓膜的上皮细胞生长和血管向内生长；但这类产品，既没有细胞外基质的天然立体结构或仿天然三维结构，也没有源自ECM的多样且丰富的活性成份和细胞生长因子；这些都不是真正意义上的去细胞支架，其实际诱导细胞生长的能力通常都较弱。
[0005] 目前研究较多的耳鼓膜修补材料主要是异种去细胞基质，可称为生物补片，也可称为去细胞组织补片，初始原料主要来源于动物小肠粘膜下层、真皮等组织；通过一系列加工处理，包括去细胞、去DNA，去α-Gal抗原等免疫原成分。这种方法获得的去细胞基质材料，一方面能保留三维立体结构，同时也含有一些重要活性成份。由去细胞基质制备而成的理想生物补片，应具有良好的生物适应性，可降解性、可吸收性；无免疫性；能够为细胞的趋化、附着、增殖、分化提供理想的空间支架和适宜的微环境，有利于损伤组织的结构修复和功能重建。
[0006] 关于耳科或鼓膜修复用的去细胞补片，查到的相关专利文献如下：一：CN 105233343 B 专利名称为：去细胞真皮基质鼓膜及外耳组织修复材料的制备方法；公开的步骤为：步骤A：选取动哺乳物体或人体的真皮组织；步骤B：通过对比所述真皮组织和鼓膜组织的结构，确定所述真皮组织结构中与所述鼓膜组织的结构相近且相邻3层的真皮组织α层结构；步骤C：去除所述真皮组织中除真皮组织α层结构以外的其他层，获得真皮组织α层初级原料。其发明点在于：根据真皮特点及鼓膜组织结构的特殊性，进行研制改进，制备出了与人体鼓膜结构、组织特点极为相近的鼓膜修复材料。
[0007] 该方法有如下缺点：1：工艺步骤繁杂，使用试剂众多。具体步骤是，先去细胞，然后使用特定酶和化学试剂制备固定制剂，还要再使用平衡还原液。例如，去细胞处理后的原料，于平衡还原液中混摇4～24小时，在平衡还原液中，加入相应的还原酶和中和试剂，还原I，III，VI胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β、纤维连接蛋白等的生物活性，使其可以在植入体内后一定条件下被激活。
[0008] 2：所用组织原料是真皮，生物活性成份少；虽然结构上与鼓膜组织结构相近，但在专利文献CN105920669B中，以及在刘文博发表的文章“可重塑生物补片在疝及腹壁外科的应用和展望”《海军医学杂志》2016，37(4):378-381，将真皮、心包、腹膜等原料归为惰性原料或半惰性材质，其成分主要是结构蛋白(胶原纤维和弹力纤维)，几乎没有粘连蛋白、生长因子和蛋白聚糖类等生物活性成分；即使有的话量也很少，在去细胞过程中也很容易流失。
[0009] 3：另外真皮原料制备的补片，其中含有大量降解缓慢，且人体25岁后不能再生的弹性纤维蛋白，这导致修复区域远期不稳定，易失弹性。
[0010] 二：CN 106983909B 专利名称为：一种耳科修复材料、制备方法及应用，该发明采用的修复材料，是由经免疫原去除处理的小肠粘膜下层基质材料制成，所述修复材料包括基层和设置在所述基层上的一个或多个凸起部；该修复材料可诱导患者自身细胞长入,为细胞重建受损组织提供模板，修复为功能化的组织或器官，并且免疫原去除基质会逐步降解，与重建组织再生过程基本同步。
[0011] 该专利说明书中的方法，有如下明显的缺点：1：采用了胰蛋白酶去细胞，且浓度较高；胰蛋白酶为动物源酶，是一种丝氨酸蛋白水解酶，为肽链内切酶，胰蛋白酶对各类蛋白质都具有普适性的消化和降解作用，不受蛋白质的品种类型和来源所限，对蛋白质本身也不具有针对性和选择性，胰蛋白酶对各类蛋白质上的相应酶切位点也具有普适性；因此在使用胰蛋白酶去细胞时，不可避免地会降解破坏组织中的胶原蛋白、弹性蛋白，粘蛋白以及其他蛋白类成份如纤连蛋白和层连蛋白等，正是由于胰蛋白酶对细胞外基质中的结构蛋白和功能蛋白有降解和破坏作用，包括对由胶原蛋白构建的ECM立体结构也有损伤和破坏，所以胰蛋白酶在去细胞的过程中，应该慎之又慎的使用；要严格控制胰蛋白酶的工作浓度和作用时间。而该专利中使用的胰蛋白酶工作浓度是
0.1%，是胰蛋白酶用于猪小肠粘膜下层去细胞工作浓度（0.02%）的五倍；即使是采用0.02%胰蛋白酶来对薄薄（约0.1mm）猪小肠粘膜下层（SIS）的去细胞20多分钟，也会不同程度地破坏ECM立体结构和降低ECM中活性成份的保留量。
0.1%，是胰蛋白酶用于猪小肠粘膜下层去细胞工作浓度（0.02%）的五倍；即使是采用0.02%胰蛋白酶来对薄薄（约0.1mm）猪小肠粘膜下层（SIS）的去细胞20多分钟，也会不同程度地破坏ECM立体结构和降低ECM中活性成份的保留量。
[0012] 2：该专利的技术方案中，对基层（基质）材料的干燥，是先压5--10公斤的压块，使得材料平整、水分从四周溢出，使材料上下层之间紧密接触，然后放入预热至40℃烘箱中，且保持时间约16小时。这种相对较高的外部压力（5--10公斤压块）和较长时间（达14个小时）的相对高温处理（40度），在这二个环节中的二个特定物理因素都可能会严重损坏ECM三维结构和破坏ECM中活性成份。
[0013] 3：浆料的制备，向破碎后的小肠粘膜下层基质材料加入0.3％醋酸溶液；形成小肠粘膜下层基质材料浆料，小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:60；通过酸液的处理，并且要直至形成浆状，这步操作会直接导致ECM立体结构彻底破坏，同时会不同程度地导致有效活性成份的流失或功能活性完全遭受损坏。
[0014] 从其实施例的检测结果可知（详见其说明书0072段），采用该技术方案以SIS为原料，制备的耳科补片中透明质酸（HA）的含量只有296微克/克，而根据专利文献CN 102256609 B第0190段，SIS去细胞补片/支架中的透明质酸（HA）含量约为0.2%，即2000微克/克，是其七倍左右；这正好印证了上面所提到的三个技术缺点，这三个缺点都会不同程度地导致有效活性成份如糖胺聚糖（GAGs）、包括透明质酸在内的流失。
[0015] 三：CN 101879098 B专利名称为：使用丝蛋白的人工鼓膜及其制造方法；该发明提供使用丝蛋白的人工鼓膜和其制造方法；所述人工鼓膜是通过将从蚕茧或蚕丝纤维去除丝胶后获得的丝蛋白 ( 或丝素蛋白 ) 或丝蛋白复合物溶液脱盐并干燥而以丝素膜的形式制成。虽然这类人工鼓膜是完全可以降解，也可以复合一些生物活性成份，但其缺乏天然来源的ECM立体结构和包含在其中的有效活性成分；很难有效达到对损伤的耳科鼓膜在结构上的完全修复和功能上彻底恢复。
[0016] 理想鼓膜补片应具备下列条件：1、具有安全性，无毒性，无感染性。2、组织相容性好，无免疫排斥反应。3、能防止过度疤痕组织的形成。4、能促使耳鼓膜再生，不发生粘连。5、使用方便，手术简单，易于消毒灭菌。6、厚度合适，介于0.05--0.2mm之间，且容易在三周内完全降解吸收。7、取材广泛，价格低廉。
[0017] 因为涉及到不同的去细胞方式（机械法、化学法、酶法）以及使用不同的去细胞试剂，在补片中保留的有效活性成份差异很大，Thomas W. Gilbert et al在杂志《Biomaterials》27(2006)第3677中表1对不同去细胞方法和去细胞试剂做了详细比较。除了有酶、酸碱之外，还会用去污剂（也称表面活性剂）作为去细胞试剂，现作简要介绍如下：1. Triton X-100和-200，化学名是聚乙二醇辛基苯基醚，是一种化工合成的去污剂；
2. SDS，化学名称为十二烷基硫酸钠，一种常用的离子型去垢剂，HLB为40，属于亲水基表面活性剂；可使细胞膜崩解，但其能与膜蛋白疏水部分结合，并使其与膜分离，但SDS低浓度会限制组织中对细胞的去除效率；较高浓度的SDS可破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键，造成对组织ECM三维多孔结构的破坏及对蛋白质类成份构象的损伤；
3. CHAPS中文名为[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，其主要是作为蛋白质裂解液，用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用；
4. 甜菜碱型表面活性剂是由季铵盐型阳离子部分和羧酸盐型阴离子部分所构成；常见的是烷基（硫代）甜菜碱，代表性产物是N-十烷基-N，N-二甲基-N-羧甲基甜菜碱(BS-10)，对天然状态膜蛋白具有增溶作用。
2. SDS，化学名称为十二烷基硫酸钠，一种常用的离子型去垢剂，HLB为40，属于亲水基表面活性剂；可使细胞膜崩解，但其能与膜蛋白疏水部分结合，并使其与膜分离，但SDS低浓度会限制组织中对细胞的去除效率；较高浓度的SDS可破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键，造成对组织ECM三维多孔结构的破坏及对蛋白质类成份构象的损伤；
3. CHAPS中文名为[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，其主要是作为蛋白质裂解液，用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用；
4. 甜菜碱型表面活性剂是由季铵盐型阳离子部分和羧酸盐型阴离子部分所构成；常见的是烷基（硫代）甜菜碱，代表性产物是N-十烷基-N，N-二甲基-N-羧甲基甜菜碱(BS-10)，对天然状态膜蛋白具有增溶作用。
[0018] 上述去污剂都是化工合成或半合成的，去污力强，去细胞效果好；但是易导致ECM中有效成份如GAGs的流失，以及对ECM天然立体结构破坏。采用这类去细胞试剂制备的生物补片，其保留的有效活性成份少，ECM立体结构损伤大，因此其诱导细胞和组织再生的能力较差。
发明内容
[0019] 本发明的目的在于，针对现有真皮来源的鼓膜生物补片，工艺复杂，降解慢，且留有较多弹性蛋白的缺点，活性成份少，诱导能力弱；以及现有SIS来源的耳科修复材料，去细胞工艺苛刻，导致补片中活性成份流失严重，ECM结构受损，诱导细胞生长能力弱的缺点，不能有效满足临床上的实际需要；针对前述耳科补片的一些不足和缺陷；发明人围绕从补片原料的选择，以及对去细胞试剂的精选，工艺的优化，从这些关键技术特征出发；通过阅读国内外大量的相关文献，结合本公司两位海归博士的深厚学术造诣，以及扎实的理论基础，加之研发团队其他成员的仔细分析研判和多年工作经验，将前沿理论与具体实践需求紧密结合，简单且方便地克服了现有耳科鼓膜生物补片的不足，巧妙地解决了现有的技术问题。
[0020] 为了实现本发明的目的，一方面本发明提供一种用于鼓膜修复的生物补片，其特征在于，所述补片，含有去细胞的哺乳动物结缔组织，去细胞试剂主要由皂素组成；进一步的，所述哺乳动物为猪、牛、羊、马；
进一步的，所述哺乳动物为猪；
进一步的，所述结缔组织是指小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜的一种或多种组合；
进一步的，所述哺乳动物结缔组织指猪小肠粘膜下层；
另一方面本发明提供一种用于鼓膜修复的生物补片的制备方法，其特征在于，去细胞工艺中去细胞试剂主要由植物源非离子表面活性剂组成；
进一步的，所述去细胞试剂，是植物源五环三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；
进一步的，所述去细胞试剂，是Quil-A、茶皂素之一或其组合物；
进一步的，所述去细胞试剂的有效工作浓度重量比为0.05-1%，与补片原料作用时间为每次10-60分钟，作用温度为4-15℃。
进一步的，所述哺乳动物为猪；
进一步的，所述结缔组织是指小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜的一种或多种组合；
进一步的，所述哺乳动物结缔组织指猪小肠粘膜下层；
另一方面本发明提供一种用于鼓膜修复的生物补片的制备方法，其特征在于，去细胞工艺中去细胞试剂主要由植物源非离子表面活性剂组成；
进一步的，所述去细胞试剂，是植物源五环三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；
进一步的，所述去细胞试剂，是Quil-A、茶皂素之一或其组合物；
进一步的，所述去细胞试剂的有效工作浓度重量比为0.05-1%，与补片原料作用时间为每次10-60分钟，作用温度为4-15℃。
[0021] 本发明的主要创新点在于，在制备耳科鼓膜补片的去细胞过程中，没有使用化工合成类的去细胞试剂，也没有使用胰蛋白酶类消化能力很强的试剂；而是使用了一种植物源去细胞试剂，这种天然的非离子型表面活性剂（如植物皂素），能有效地去除组织中的细胞；并且这种去细胞的方式，针对性很强，主要是通过破坏脂质细胞膜和细胞器的膜，去细胞效果不仅彻底，而且作用方式温和，既不对ECM结构有明显损伤，也不会引起ECM中有效活性成份（如葡胺聚糖GAGs, 包括透明质酸HA等）的明显流失；能保留ECM中更多的有效活性成份，包括透明质酸等，更有利于诱导细胞趋化、生长和组织修复再生；在低温条件下去细胞即破坏细胞，可以大大减少并减缓，因细胞破碎后释放出来的内源酶可能会产生的对ECM所产生的一些降解、破坏作用。
[0022] 所述植物源去细胞试剂皂素（Saponin）是某些植物中发现的一类次级代谢产物，因在水溶液中振荡时产生肥皂样泡沫而闻名；一个皂素分子结构中，同时含有亲水基团和亲油基团；亲水基团为一或多个亲水糖链，亲油基团也称为亲脂母核，母核可以分为两类即三萜类(triterpene)或类固醇类（甾体类）。
[0023] 可以选用商业化的皂素产品有来自南美洲树种QuillajaSaponariaMolina和墨西哥植物MohaveYucca(也称Yuccaschidigera)的树皮中分离出来的，中国本土的皂素产品来自无患子、油科植物（如茶皂素）。本发明优选的皂素是QuillajaSaponariaMolina植物精取物，也称为Quil-A，CAS号8047-15-2，其临界胶束浓度（CMC, Critical micelle concentration）>0 .03%，可从多种商业化渠道购得，包括Sigma公司，BerghausenCorporation，SergeantChemical公司(Clifton，NJ)，Superfosa/s(Vedbaek，Denmark)，以及BrenntagBiosector(Frederikssund，Denmark)；Quil-A理化特性可参见Superfos的题为PurifiedSaponinAdjuvantQuil-A的商业出版物；在本发明中皂素做为去细胞试剂时的用量，以纯皂素（saponin）为有效成分来计算，去细胞的工作浓度为0.05%--
1%，优选0.25—0.5%。
1%，优选0.25—0.5%。
[0024] 另外由于皂素作用的方式是温和的，可能存在与细胞膜脂质结合的部分可逆性；若后续的冲洗液或浸泡液因皂素含量低或无皂素，则可能会使去细胞及其碎片效果降低；
所以去细胞后的下一步洗液或泡液中也需要使用含有皂素的溶液；可选择原浓度的皂素溶液进行是可洗或浸泡，以利更彻底地去除细胞及其细胞碎片。
所以去细胞后的下一步洗液或泡液中也需要使用含有皂素的溶液；可选择原浓度的皂素溶液进行是可洗或浸泡，以利更彻底地去除细胞及其细胞碎片。
[0025] 本发明的另一个改进点在于，充分认识到猪小肠粘膜下层（SIS）的优越性能，选择SIS做为去细胞原料，而不是其他组织部位；猪SIS作为耳科补片的原料，其优势体现在以下几个方面：一：SIS中含有丰富的动静脉血管，SIS源补片中含有少量，但很重要的IV型胶原蛋白，这对耳科鼓膜损伤后的新血管和基膜的形成具有明显的促进作用；无论是什么原因造成的耳科鼓膜穿孔或破损，都能够更好地促进鼓膜受损处的修复。
[0026] 二：依据美国STEPHEN F. BADYLAK博士发表的多篇文章表明SIS补片的降解产物具有较强的抗菌活性，有类似于猪防御素（porcine defensin, pBD-1）的功能，因为SIS源补片具有一定的防止植入部位继发感染的功能，这会更有利于伴有慢性中耳炎的鼓膜修复患者的早日康复。
[0027] 三：根据George S.Hussey 2018年的文章《Extracellular Matrix Bioscaffolds for Building Gastrointestinal Tissue》的学术报道，SIS补片降解产物还具有诱导细胞趋化和有丝分裂的作用；能有效增强鼓膜里包括上皮细胞在内的各类细胞的增殖速度，有利于鼓膜的尽早修复。
[0028] 发明原理：本发明中，去细胞试剂之所以选用植物源皂素，主要是因为这是一类天然的非离子型表面活性剂，其去细胞的方式针对性强，主要是通过破坏脂质细胞膜和细胞器膜，正因为作用方式针对性强，对其他成份几无破坏，不会影响功能蛋白的活性发挥和结构蛋白的稳定性，对ECM结构无损伤无破坏；这对鼓膜结构的良好修复非常关键；在各类鼓膜穿孔损伤后，无论是急性的，还是慢性的，其鼓膜修复再生，遇到的主要问题就是，缺乏用于上皮细胞迁移的载体，以及有利于形成鼓膜内部三层膜（上皮细胞层、致密纤维层、内皮粘膜细胞层）的细胞支架；而SIS原料在采用植物皂素去细胞后，所留下来的ECM立体结构，正好可以成为鼓膜修复所期盼的支架；同时采用温和的植物源皂素去细胞，不会引起ECM中有效成份（如葡胺聚糖GAGs, 包括透明质酸HA等）和细胞生长因子（如成纤维细胞生长因子FGF）等的流失和破坏；相比于其他化工类或半合成类去污剂而言，同样都能达到有效地去净细胞及细胞残留物的效果，但植物源皂素作用方式独特且温和，使用这类植物源皂素去细胞，能保留更多EC M中有效成份，例如透明质酸；如采用本发明方法制备的补片，与化工类去污剂去细胞制备的补片相比，其补片中透明质酸（HA）含量要明显高。
[0029] 在本发明里，之所以选用猪小肠粘膜下层（SIS）作为去细胞的原料，相较于真皮组织，首先，SIS去细胞补片具有更加丰富的细胞生长因子和生物活性成份，根据JASON P. HODDE1996年在《TISSUE ENGINEERING》Volume 2, Number 3和Janet E. Reing 2010年在《Biomaterials》November ; 31(33): 8626–8633上发表的文章等技术文章材料比较可知，GAGs在SIS组织中的含量要比真皮补片中的要高；本发明制备的SIS补片其GAG含量达到6.2ug/mg也验证了这一点；其次，SIS含有更多样的胶原蛋白类型，包括I、III型，IV型和IV型胶原蛋白；SIS胶原蛋白含量可达到80%左右；再者，SIS补片ECM呈网状结构，能缓慢释放细胞生长因子和活性成份，具有天然长效诱导新细胞分化和促细胞生长的作用；进一步的，SIS在体内降解后的二级产物，如隐窝肽类物质，具有天然抗菌、消炎、抗氧化等功效；最后，猪SIS原料相对真皮而言，其相对较薄，单层仅有约0.1mm，而猪真皮原料厚度是SIS的数倍，因此更易于各类溶液及试剂的有效处理；SIS单层补片的厚度为0.05--0.08mm，二层SIS补片的厚度约为0.1-0.16mm；耳科鼓膜厚度约在0.1mm左右；因此使用2-4层SIS补片（厚度为
0.1—0.2mm）即可制成耳科鼓膜补片成品；使用SIS去细胞补片能促进靶组织细胞的趋化分化和增殖，更好地促进新胶原蛋白分泌和新细胞外基质的形成；不仅能实现新组织在结构上的完全恢复；而且能达到功能上的全面康复。
0.1—0.2mm）即可制成耳科鼓膜补片成品；使用SIS去细胞补片能促进靶组织细胞的趋化分化和增殖，更好地促进新胶原蛋白分泌和新细胞外基质的形成；不仅能实现新组织在结构上的完全恢复；而且能达到功能上的全面康复。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：1)本发明采用植物源皂素作为去细胞试剂，不使用合成类试剂去细胞，无化学残留，安全无副作用；
2)本发明的耳科鼓膜修复用SIS源补片产品，能够保留较完整的细胞外基质ECM三维立体结构；没有消化酶及化工去污剂，对ECM中胶原蛋白结构的损伤和破坏；
3）本发明的耳科鼓膜修复用SIS源补片产品，比使用化工类去污剂，含有更多的细胞生长因子和有效活性成份（如葡胺聚糖GAGs，其中的透明质酸HA含量达到0.2%以上），具有良好诱导组织再生功能，能加快术后耳鼓膜组织的生长和功能的重建；
4） 本发明的耳科鼓膜修复用SIS源补片产品，其ECM三维结构具有更好的诱导细胞和血管长入功能，且在新组织长入的同时，补片自身会逐渐降解；
5） 本发明的耳科鼓膜修复用SIS源补片产品，在靶组织部位使用后，其降解产物多肽成分具有抗菌性能，可降低植入后炎症和感染的发生；
6） 本发明的耳科鼓膜修复用SIS源补片，其厚度合适0.1—0.2mm，由原始的2--4片叠加，补片完全降解吸收与鼓膜全面再生康复，基本能达到同步。
2)本发明的耳科鼓膜修复用SIS源补片产品，能够保留较完整的细胞外基质ECM三维立体结构；没有消化酶及化工去污剂，对ECM中胶原蛋白结构的损伤和破坏；
3）本发明的耳科鼓膜修复用SIS源补片产品，比使用化工类去污剂，含有更多的细胞生长因子和有效活性成份（如葡胺聚糖GAGs，其中的透明质酸HA含量达到0.2%以上），具有良好诱导组织再生功能，能加快术后耳鼓膜组织的生长和功能的重建；
4） 本发明的耳科鼓膜修复用SIS源补片产品，其ECM三维结构具有更好的诱导细胞和血管长入功能，且在新组织长入的同时，补片自身会逐渐降解；
5） 本发明的耳科鼓膜修复用SIS源补片产品，在靶组织部位使用后，其降解产物多肽成分具有抗菌性能，可降低植入后炎症和感染的发生；
6） 本发明的耳科鼓膜修复用SIS源补片，其厚度合适0.1—0.2mm，由原始的2--4片叠加，补片完全降解吸收与鼓膜全面再生康复，基本能达到同步。
[0031] 本发明的目的在于，提供一种鼓膜修复用SIS源去细胞生物补片及其制备方法；要实现本发明的目的，是通过以下技术方案来实现的：第一步是：组织原料的选择；所述耳鼓膜修复用的去细胞补片，最初原料选用的结缔组织是哺乳动物的小肠粘膜下层；优选的动物结缔组织原料为猪的小肠粘膜下层，优选的是源自屠宰场的商品肉猪。
[0032] 第二步是：组织的去细胞等加工工艺，包括且不限于，清洗、消毒、脱脂、去细胞、去DNA和去α-Gal抗原、定型、干燥、灭菌而成。
[0033] 进一步，耳科鼓膜修复用去细胞补片的加工步骤如下：1)预处理：取猪小肠，机械刮除粘膜层、肌层、浆膜层等非结缔组织，并扔弃；留下猪小肠粘膜下层（SIS）；洗净、并置于弱酸溶液中浸泡，得到预处理待用的补片原料；
2)预消毒：用含有过氧乙酸和乙醇的混合溶液，在超声及室温条件下，浸泡补片原料，进行消毒；再用纯化水超声进行清洗；
3)去脂：使用乙醇溶液，在超声、常温条件下浸泡补片原料，之后用注射用水超声清洗；
4)去细胞：用含植物源皂素的溶液，在低温和超声下浸泡补片原料；接着用新的同浓度植物源皂素溶液对补片原料进行浸泡; 补片原料与溶液的比例为1:10（W/V）；再用PBS-EDTA超声清洗补片原料，补片原料与溶液的比例为1:10（W/V）；按实际情况可重复去细胞1-
3次；
5)去DNA和去α-Gal抗原：含DNA酶的水溶液浸泡补片原料，浸泡温度为36℃，浸泡时间为15--40分钟；清洗后再用含α-半乳糖苷酶的水溶液，浸泡补片原料，浸泡时间为15--40分钟；接着使用低浓度NaOH水溶液，常温、超声条件下，浸泡补片原料；再用PBS超声清洗直至中性；
6)将片状半成品补片，重叠固定于模具上，干燥，包装、辐照灭菌可得耳鼓膜修复用补片成品。
2)预消毒：用含有过氧乙酸和乙醇的混合溶液，在超声及室温条件下，浸泡补片原料，进行消毒；再用纯化水超声进行清洗；
3)去脂：使用乙醇溶液，在超声、常温条件下浸泡补片原料，之后用注射用水超声清洗；
4)去细胞：用含植物源皂素的溶液，在低温和超声下浸泡补片原料；接着用新的同浓度植物源皂素溶液对补片原料进行浸泡; 补片原料与溶液的比例为1:10（W/V）；再用PBS-EDTA超声清洗补片原料，补片原料与溶液的比例为1:10（W/V）；按实际情况可重复去细胞1-
3次；
5)去DNA和去α-Gal抗原：含DNA酶的水溶液浸泡补片原料，浸泡温度为36℃，浸泡时间为15--40分钟；清洗后再用含α-半乳糖苷酶的水溶液，浸泡补片原料，浸泡时间为15--40分钟；接着使用低浓度NaOH水溶液，常温、超声条件下，浸泡补片原料；再用PBS超声清洗直至中性；
6)将片状半成品补片，重叠固定于模具上，干燥，包装、辐照灭菌可得耳鼓膜修复用补片成品。
[0034] 进一步的具体操作方法是：4).去细胞：使用含植物源皂素溶液，在4--15℃和超声下浸泡补片原料10—60分钟；补片原料与溶液的比例为1:10（W/V）；之后用同浓度新鲜皂素溶液对补片原料浸泡5--60分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--60分钟；重复去细胞1-3次；
5).去DNA和去α-Gal抗原：含DNA酶的水溶液浸泡补片原料，浸泡温度为36℃，浸泡时间为15--40分钟；清洗后再用含α-半乳糖苷酶的水溶液，浸泡补片原料，浸泡时间为15--40分钟；接着使用10mM NaOH水溶液，常温、超声条件下，浸泡补片原料；再用PBS超声清洗直至中性；
6).将片状半成品补片制成需要的大小，2—4片交叉重叠固定于模具上，冷冻干燥，包装、灭菌可得鼓膜补片成品。
5).去DNA和去α-Gal抗原：含DNA酶的水溶液浸泡补片原料，浸泡温度为36℃，浸泡时间为15--40分钟；清洗后再用含α-半乳糖苷酶的水溶液，浸泡补片原料，浸泡时间为15--40分钟；接着使用10mM NaOH水溶液，常温、超声条件下，浸泡补片原料；再用PBS超声清洗直至中性；
6).将片状半成品补片制成需要的大小，2—4片交叉重叠固定于模具上，冷冻干燥，包装、灭菌可得鼓膜补片成品。
[0035] 进一步的，在去细胞工艺（步骤4）中，优选以下技术参数：皂素溶液中有效皂素的含量为0.05---1%，补片原料与植物源皂素溶液的比例为1:
5---1:10，在超声条件下，于低温4—15℃条件下浸泡20--45分钟；然后用同浓度的新鲜皂素溶液对再补片原料浸泡5--30分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--30分钟；重复去细胞1次。
5---1:10，在超声条件下，于低温4—15℃条件下浸泡20--45分钟；然后用同浓度的新鲜皂素溶液对再补片原料浸泡5--30分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--30分钟；重复去细胞1次。
[0036] 进一步的，在去细胞工艺（步骤4）中，更优选，以下技术参数：皂素溶液中有效皂素的含量为0.25--0.5%，补片原料与植物源皂素溶液的比例为1:
10，在超声条件下，于低温4℃条件下浸泡20分钟；
进一步的，植物源表面活性剂是指植物源三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；
进一步的，植物源三萜烯皂素是Quil-A、茶皂素之一或其组合物；
进一步的，植物源三萜烯皂素是Quil-A；
进一步的，Quil-A中皂素的工作浓度为0.25%；
进一步的，Quil-A溶液的浸泡作用时间为20分钟，作用温度都是4°C。
10，在超声条件下，于低温4℃条件下浸泡20分钟；
进一步的，植物源表面活性剂是指植物源三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；
进一步的，植物源三萜烯皂素是Quil-A、茶皂素之一或其组合物；
进一步的，植物源三萜烯皂素是Quil-A；
进一步的，Quil-A中皂素的工作浓度为0.25%；
进一步的，Quil-A溶液的浸泡作用时间为20分钟，作用温度都是4°C。
[0037] 中英文术语/名词首选按下列文字说明来理解，另有详细说明的除非；其他术语按本领域普通技术人员水平来理解其含义。
[0038] 1.组织修复材料、组织再生材料、生物补片（膜）、生物修补片、生物支架、可降解补片、可吸收补片Bio-Mesh、Bio-Patch、Patch、Bioscaffold，这些个中英文名词或术语，表面上虽有不同，但其目的和用途基本是一样的；除非有特殊的具体说明，否则上述几个名词的内涵，在实质上是等同的。
[0039] 2.小肠粘膜下层SIS（Small Intestinal Submucosa)，小肠组织包括空肠和回肠部分，在除去小肠粘膜层、肌层、浆膜层后所剩余的部分，以胶原蛋白为主要成份，约占80%以上。
[0040] 3.细胞外基质ECM（Extracellular Matrix）：是存在于所有组织和器官中的非细胞成分，其不仅对细胞组织提供必需的物理支撑，为各种细胞的正常生理活动，提供适宜的场所及微环境；而且对组织的形态发生、细胞的趋化和分化，以及重要的生理生化和生物力学等方面，起到重要的杠杆调节作用，从而影响或调控组织和器官的功能。细胞50%的功能是由细胞外基质所营造的外部微环境所决定的。
[0041] 4.细胞外基质的物质组成：是以结构蛋白，如胶原蛋白（Collagen）、弹性蛋白(elastins)、纤丝蛋白等大分子成份为主要框架结构，并附着了一些功能蛋白如纤连蛋白FN(fibronectins)、层连蛋白LN (laminins)等；同时其中还携带有各类细胞生长因子(如成纤维细胞因子FGF、转化生长因子TGF、血管内皮生长因子VEGF；可能也含有极少量但很重要的表皮生长因子EGF和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)另外细胞外基质中还含有糖胺聚糖（GAGs）类、蛋白聚糖等活性成分。
[0042] 5.糖胺聚糖GAGs（Glycosaminoglycan），也称粘多糖，为杂多糖的一种，主要存在于动物结缔组织中，是参与组织正常生理活动以及组织损伤修复再生的重要原料；是ECM中的重要组成成份；按单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置，糖胺聚糖可分为5个主要类别，透明质酸（HA)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS) 、硫酸乙酰肝素和肝素(HP)。
[0043] 6.透明质酸（Hyaluronic acid，HA），是细胞外基质（ECM）的主要成分之一，参与组织的重建、扩增细胞间隙、炎症反应和等许多细胞生理以及组织修复过程；研究表明ＨＡ的细胞效应，是通过细胞表面ＨＡ结合蛋白与ＨＡ结合后发生的，粘附分子CD44是ＨＡ的细胞表面受体，是一类分布极为广泛的细胞表面糖蛋白，它参与细胞一细胞之间以及细胞一基质之间的特异性粘连；Ru-MingLiu,et al.等在《Experimental Cell Research》Volume 345, Issue 2, 15 July 2016, Pages 218-229上发表文章，表明，透明质酸通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，可促进间充质干细胞增殖。
[0044] 7.去细胞基质ACTM（Acellular Tissue Matrix）或无细胞组织基质：是指采用特定的试剂和处理方式，将动物器官或组织中的细胞、病毒、DNA等会产生免疫排斥反应的成分充分地去除或灭活，最大限度地保留原有天然立体结构的完整性，以及尽量保留原有基质中的细胞生长因子和活性功能成份；去细胞基质由于其天然立体三维（3-D）结构、含有生物活性因子、能够被受体降解、易诱导受体干细胞移（易）位分化等特点，被广泛应用于临床中，用于组织的修复和再生（先天缺损和后天创伤）；去细胞基质是新型的组织再生修复材料，具有良好的生物支架性能。
[0045] 8鼓膜生物补片，是指专用于鼓膜损伤（包括各种原因导致的穿孔）修复，是动物结缔组织，经去细胞工艺等加工后所剩下的ECM立体结构，组织原料可以来源于SIS、真皮、软骨或其他组织。
[0046] 除非上下文有清楚的说明，本说明书和所附权利要求中用到的单数形式“一个”和“该”包括复数含义。因此，例如，“该方法”包括一或多种方法，和/或步骤，它们属于本文所述类型和/或是本领域技术人员阅读了本文后很明显能认识到的。术语“约”或“接近”是指统计学意义上的范围值，范围可以是在一个数量级之内，通常在指定数值或范围的50％以内，进一步指在20％以内，还更通常在10％以内，甚至更通常在5％以内。术语“约”或“接近”所涵盖的能允许的变化取决于研究的具体体系，是本领域技术人员可以很容易地认识到的。
[0047] 下面结合具体实施例，以进一步描述本发明的原理和方案；应当理解，这些实施例只是为了举例说明和方便理解本发明的思想，但不能局限于此；实施例并非以任何方式来限制本发明范围，以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
具体实施方式
[0048] 实施例一（ 去细胞试剂 0.25% Saponin）耳鼓膜修复用，源自猪小肠粘膜下层去细胞补片的制备，具体步骤如下：
1)取材、洗净、预处理：预处理：选取源自屠宰场的商品肉猪，取其新鲜小肠组织清洗洁净；使用物理刮除法，除去猪小肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结，分离出粘膜下层，置于
0.5%醋酸溶液浸泡30分钟，猪小肠与醋酸溶液的比例为1:5，再使用纯化水浸泡3 遍，得到生物补片原料，即小肠粘膜下层，下述简称为SIS材料；
2)消毒：使用含有1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合水溶液，SIS材料与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡100分钟，进行消毒。之后使用纯化水超声清洗3遍；
3)脱脂：使用浓度为90%的乙醇，SIS材料与乙醇的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡
2h；之后使用注射用水超声清洗3遍；
4)去细胞：使用含0.25%皂素的溶液（源自Quil-A，以纯皂素的含量来计算工作浓度），在4℃和超声条件下浸泡补片原料30分钟；之后用同样浓度0.25%皂素溶液对补片原料进行冲洗10分钟；接着再用PBS-EDTA溶液对补片浸泡20分钟；重复前述去细胞步骤一次；
5)去DNA和去α-Gal抗原：使用含5U/ml DNA 酶的水溶液，SIS材料与DNA酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡20分钟；之后使用PBS冲洗3遍；使用含5U/ml α-半乳糖苷酶的水溶液，SIS材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于30℃条件下浸泡20分钟；之后使用PBS溶液冲洗；接着使用浓度为10mM 的NaOH水溶液，SIS材料与NaOH溶液的比例为1:20，超声条件下，常温浸泡50分钟；之后使用PBS超声清洗直至中性；
6)定型、冻干、灭菌：将去细胞后的片状原料，三片纵横交叉，重叠固定于模具上，冷冻干燥后，包装，最后进行辐照灭菌。
1)取材、洗净、预处理：预处理：选取源自屠宰场的商品肉猪，取其新鲜小肠组织清洗洁净；使用物理刮除法，除去猪小肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结，分离出粘膜下层，置于
0.5%醋酸溶液浸泡30分钟，猪小肠与醋酸溶液的比例为1:5，再使用纯化水浸泡3 遍，得到生物补片原料，即小肠粘膜下层，下述简称为SIS材料；
2)消毒：使用含有1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合水溶液，SIS材料与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡100分钟，进行消毒。之后使用纯化水超声清洗3遍；
3)脱脂：使用浓度为90%的乙醇，SIS材料与乙醇的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡
2h；之后使用注射用水超声清洗3遍；
4)去细胞：使用含0.25%皂素的溶液（源自Quil-A，以纯皂素的含量来计算工作浓度），在4℃和超声条件下浸泡补片原料30分钟；之后用同样浓度0.25%皂素溶液对补片原料进行冲洗10分钟；接着再用PBS-EDTA溶液对补片浸泡20分钟；重复前述去细胞步骤一次；
5)去DNA和去α-Gal抗原：使用含5U/ml DNA 酶的水溶液，SIS材料与DNA酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡20分钟；之后使用PBS冲洗3遍；使用含5U/ml α-半乳糖苷酶的水溶液，SIS材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于30℃条件下浸泡20分钟；之后使用PBS溶液冲洗；接着使用浓度为10mM 的NaOH水溶液，SIS材料与NaOH溶液的比例为1:20，超声条件下，常温浸泡50分钟；之后使用PBS超声清洗直至中性；
6)定型、冻干、灭菌：将去细胞后的片状原料，三片纵横交叉，重叠固定于模具上，冷冻干燥后，包装，最后进行辐照灭菌。
[0049] 实施例二 （去细胞试剂 0.25% SDS ）组织原料选取、预处理，消毒、脱脂、去细胞、去DNA和去α-Gal抗原、冻干、灭菌等步骤，完全同实施例一；区别只是在第四步去细胞试剂的选择上，本实施例选用0.25% SDS取代实施例一中的Quil-A溶液。
[0050] 实施例三：鼓膜修复去细胞补片厚度检测、光学观察及有效成份检测。
[0051] 鼓膜生物补片，由三层SIS去细胞组成，实测厚度为0.16mm。
[0053] 结果：二个实施例中所有的去细胞补片，都没有观察到细胞及其碎片残留；能看到胶原纤维连续，粗细不一，但均无明显地断裂。
[0054] 对二个实施例制备得到的鼓膜生物补片样品,采用商业化ELISA试剂盒对重要活性成份糖胺聚糖（GAGs）和透明质酸（HA）的含量进行检测；预处理方式是采用低温研磨法对补片进行预处理，再按试剂盒说明书，进行检测，具体结果如下表1：本领域中普通技术人员可根据上述说明，对本发明做出多种简单的变化或调整或组合；因而，在不违反本发明的权利要求宗旨的前提下，实施例中的某些细节，不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书来界定的范围作为保护范围。
[0055] 另外，需要强调的是，尽管权利要求中指出了以下展示和描述的本发明的某些新的特征，但并没有试图；将本发明限定于特定的细节，因为相关领域的普通技术人员能够理解，可在不以任何方式偏离本发明精神的前提下，对所示出的本发明的形式和细节及其执行做出各种省略、修改、替换和改变。本法明的特征并不是“关键”或“必要”的，除非明确限定为“关键”或“必要”。
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