铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP的纯化方法
阅读：634发布：2020-05-08
专利汇可以提供铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP的纯化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 铜 绿假单胞菌 疫苗 重组蛋白reSBP的纯化方法的纯化方法，所述reSBP蛋白为铜绿假单胞菌 抗原 分子的活性功能 片段 重组融合，通过大肠杆菌基因工程菌表达获得。采用对基因工程菌进行高压破菌、SP FF层析、Phenyl HP层析、G 25层析等技术，获得高纯度的铜绿假单胞菌(PA)重组基因工程蛋白reSBP。与现有纯化方案相比，该发明纯化工艺简捷、避免使用GST亲和层析、大大降低成本、更加容易进行工业化放大、所获目标蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激 机体 产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。，下面是铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP的纯化方法专利的具体信息内容。
1.一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP的纯化方法的纯化方法，其特征在于，reSBP的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸的序列如SEQ ID NO:2所示，其制备方法包括步骤：
收集制备的所述抗原reSBP；按照高压破菌、离心；SP FF层析纯化；Phenyl HP层析；G 25层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述高压破菌的方法：将收集的reSBP菌体作为目标蛋白，用pH为5.0-5.2的50mM C6H8O7-C6H5Na3O缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；
所述高压匀浆破菌采用60-80MPa，高速离心获取破菌。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述SP FF层析纯化的方法：将权利要求2收集的上清，用A液平衡层析系统及SP FF层析柱，B液线性梯度洗脱，初步纯化目标蛋白。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于：所述SP HP层析柱的填料为SP Sepharose FF或SP Sepharose HP或Capto SP。
5.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于：所述A液为pH值5.0的50mM C6H8O7-C6H5Na3O7缓冲溶液，B液为pH 5.0的50mM C6H8O7-C6H5Na3O7,1M NaCl缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述Phenyl HP层析纯化的方法是：将权利要求3所述的初步纯化目标蛋白，用C液平衡层析系统及层析柱，A液线性梯度洗脱，得到进一步纯化的目标蛋白。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述C液的配制：取C6H8O7.H2O 1.6g,C6H5Na3O7.2H2O 3.6g,(NH4)2SO4 157g定容至1000ml,调pH值至5.0。
8.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于：所述Phenyl HP层析柱的填料为Phenyl Sepharose HP或Phenyl Sepharose FF。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述G 25层析纯化的方法是：用G25层析柱纯化，D液平衡层析系统及层析柱，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液，优选地，所述的G
25层析柱的填料为Sephadex G-25Coarse或Sephadex G-25Medium或Sephadex G-25Fine或Sephadex G-25Superfine。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述重组蛋白reSBP采用以下方法制备：
1)全基因合成获得铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗reSBP蛋白片段的核苷酸序列；
2)将步骤1)获得的核苷酸序列克隆表达至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；
3)诱导转换后的宿主菌表达重组蛋白。
铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP的纯化方法
技术领域
背景技术
[0002] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是烧伤、战创伤、机械通气患者等院内感染最常见的病原菌，可导致重症肺炎、肺功能衰竭、脓毒血症乃至死亡。WHO在2017年发布的《新抗生素研究、发现和全球抗生素耐药细菌优先性列表》中将PA列为第二，由此表明，PA感染流行导致的健康问题十分严重。由于PA对抗生素产生多重耐药或泛耐药性，临床治疗效果十分有限。数据显示，2016年PA总分离率为8.69％，特别是机械通气性肺炎中PA的分离率高达22.9％。PA对亚胺培南和美罗培南的年度耐药率已达到23.6％和20.9％。由于 PA在临床上的高感染率和耐药率的不断攀升，寻找新的“非抗生素疗法”迫在眉睫。
[0003] 由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。从免疫学角度入手，研制开发出安全有效的疫苗成为最为理想的选择，但目前还未见有上市的铜绿假单胞菌疫苗。综上所述，现有技术存在的问题是：研究疫苗的关键是寻找到免疫原性和免疫保护效果好的抗原。研发基因工程疫苗的关键是如何从成千上万的病原体蛋白质组中筛选到良好的保护性抗原分子。
[0004] PA的SBP蛋白全称为ABC transporter substrate-binding protein，已经有研究表明(国家发明专利201811382091.4)重组表达的SBP(reSBP)蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果，具体表现在reSBP免疫小鼠产生的抗体效价几何平均滴度为1:47200，抗体阳性率达到100％；此外，在致死性PA感染肺炎模型中reSBP免疫表现出的保护率高达73.3％。
[0005] 目前，本领域研究所面临的问题是：现有制备reSBP蛋白的纯化步骤依次为：GST亲和层析、PP酶酶切、SP HP层析、QHP层析技术。本领域公知，GST 亲和层析所需的生物活性填料非常昂贵，使用寿命短，大大增加了蛋白质生产和纯化的成本，此外该纯化步骤还需要PP酶的酶切，增加了生产辅料的成本和操作步骤，降低了目标蛋白的回收率，所以还未见将GST层析技术运用于疫苗蛋白及其它生物药的工业化生产中。因此，现有的reSBP蛋白的纯化方案因为含有GST亲和层析步骤，不能满足工业化应用需求，严重限制了reSBP作为疫苗候选抗原的应用。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP的纯化方法，该方法工艺简单，无需进行GST亲和层析步骤，大大降低了成本，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好，提高了reSBP的成药性。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] 铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP的纯化方法的纯化方法，所述reSBP的 DNA序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸的序列如SEQ ID NO:2所示，其制备方法包括步骤：收集制备的所述抗原reSBP；按照高压破菌、离心；SP FF层析纯化； Phenyl HP层析；G 25层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化。
[0009] 所述高压破菌的方法：将收集的reSBP菌体作为目标蛋白，用pH为5.0-5.2 的50mM C6H8O7-C6H5Na3O缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；
[0010] 所述高压匀浆破菌采用60-80MPa，高速离心获取破菌。
[0011] 所述SP FF层析纯化的方法：将权利要求2所述的上清，用A液平衡层析系统及SP FF层析柱，B液线性梯度洗脱，初步纯化目标蛋白，所述SP HP层析柱的填料为SP Sepharose FF或SP Sepharose HP或Capto SP。
[0012] 所述A液为pH值5.0的50mM C6H8O7-C6H5Na3O7缓冲溶液，B液为pH 5.0 的50mM C6H8O7-C6H5Na3O7,1M NaCl缓冲溶液。
[0013] 所述Phenyl HP层析纯化的方法是：将权利要求3所述的初步纯化目标蛋白，用C液平衡层析系统及层析柱，A液线性梯度洗脱，得到进一步纯化的目标蛋白，所述Phenyl HP层析柱的填料为Phenyl Sepharose HP或Phenyl Sepharose FF。
[0014] 所述C液的配制：取C6H8O7.H2O 1.6g,C6H5Na3O7.2H2O 3.6g,(NH4)2SO4 157g 定容至1000ml,调pH值至5.0。
[0015] 所述G 25层析纯化的方法是：用G25层析柱纯化，D液平衡层析系统及层析柱，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。
[0016] 所述的G 25层析柱的填料为Sephadex G-25Coarse或Sephadex G-25 Medium或Sephadex G-25Fine或Sephadex G-25Superfine。
[0017] 上述纯化方法的重组蛋白reSBP采用以下方法制备：
[0018] 1)全基因合成获得铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗reSBP蛋白片段的核苷酸序列；
[0019] 2)将步骤1)获得的核苷酸序列克隆表达至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；
[0020] 3)诱导转换后的宿主菌表达重组蛋白。
[0021] 发明效果
[0022] 本发明所述纯化方法，没有采用通常纯化方法的GST亲和层析，然而不采用GST亲和层析的难点在于：第一、目标蛋白表达方式由GST融合的reSBP更换为无标签reSBP，重组蛋白的表达水平和方式发生将发生巨大变化，需要寻找 reSBP最佳的表达载体和宿主菌；第二、不使用GST亲和层析后，杂质蛋白的组成和含量将发生变化，需要寻找新的纯化方案，才能获得高质量的reSBP蛋白。
[0023] 采用本发明所述的纯化方法，从表达铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白reSBP的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于98％，回收率大于50％的目的蛋白，通过氨基酸序列预测本发明人构建获得的蛋白reSBP分子质量约为 26kD，等电点在6.5左右。
[0024] 本发明所述的纯化方法主要有SP FF层析、Phenyl HP层析、G25层析，通过上述方法纯化的蛋白用12％SDS-PAGE检测，呈现出单一目标蛋白条带，分子质量约为26kD。HPLC C3柱分析目的蛋白纯度98.9％，优于现有技术方案的所纯化的蛋白的纯度98.5％。reSBP蛋白纯度的提高将有效降低杂质蛋白的含量，从而减少其作为疫苗抗原免疫时不良反应的发生概率。
[0025] 纯化后的reSBP与Al(OH)3佐剂共同注射免疫BalB/C小鼠，发现reSBP加免疫佐剂组血清中的IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)(P<0.01)，证明使用本发明人纯化方法获得的reSBP可有效刺激机体产生较高的免疫应答。使用临床株XN-1(CCTCC M 2015730)感染，发现reSBP加免疫佐剂组死亡率为26.7％，对照组(PBS组)感染率为90％，计算得出reSBP抗PA感染的保护率为70.3％。附图说明
[0026] 图1为蛋白reSBP SP FF层析结果；其中，泳道M：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、 25Kd、15Kd、10Kd；泳道1：经SP FF层析后流穿；泳道2：经SP FF层析后蛋白1；泳道3：经SP FF层析后目的蛋白2；泳道4、5、6、7、8、9：经SP FF层析后杂蛋白；
[0027] 图2为经Phenyl HP层析纯化后的蛋白reSBP SDS-PAGE电泳结果；其中，泳道M：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、 100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd；泳道1、2、3、 4、5：纯化的reSBP蛋白；泳道6：经Phenyl HP层析纯化后流穿；
[0028] 图3为SP FF层析图；
[0029] 图4为Phenyl HP层析图；
[0030] 图5为reSBP蛋白HPLC检测结果。
具体实施方式
[0031] 实施例1：基因的合成和亚克隆
[0032] 在reSBP编码序列的5‘引入Ndel酶切位点，3’引入终止密码子TGA和Xhol 酶切位点，将该序列通过Ndel和Xhol酶切位点与pET30a载体连接，将连接好的序列载体转化至大肠杆菌BL21中得到pET30a-reSBP/BL21。
[0033] reSBP的DNA序列的合成，序列与pET30a的连接由上海生工生物工程有限公司合成。
[0034] reSBP的DNA序列如SEQ ID NO:1所示：
[0035] GCCGAGTCCCTCACCGTCGCGGCCACCCCGGTGCCGCACGCGGAGATCCTCAACGTGGTCAA GCCGCTGCTGGCCAAGGAAGGCGTGGACCTGAAGATCAAGGAGTTCACCGACTACGTGCAGCCGAA CGTGCAGGTCTCGGAAAAGCGCCTGGACGCCAACTTCTTCCAGCACCAGCCGTACCTCGATGAGTT CAACAAGGCCAAGGGCACCGACCTGGTCGCCGTGACCGGCGTACACATCGAGCCGCTGGGCGCCTA CTCGAGCAAGTACAAGAAGCTCGACGAACTGCCTTCCGGCGCTACCGTGGTGATTCCCAACGACGC CACCAACGGCGGCCGCGCCCTGCTCCTGCTGGACAAGGCCGGGGTGATCAAGCTCAAGGACAACAA GAGCATCACCGCCACGCCGAAGGACATCGTCGACAATCCGAAGAACATCAAGATCCGCGAACTGGA AGCCGCGACCCTGCCGCGCGTGCTGACCCAGGTCGACATGGCGCTGATCAATACCAACTACGCCCT GGAAGCCAAGCTGAACCCAACCAAGGATGCGCTGGCCATCGAAGGCAGCGACTCGCCCTACGTGAA CATCCTCGTCGCGCGGCCGGACAACAAGGACAGCGACGCCATGCAGAAGCTGGCCAAGGCCCTGCA CAGCGCCGAGATCAAGCAGTTCATCCAGGAGAAGTACAAAGGCGCGGTGGTACCGGCGTTC
[0036] reSBP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：
[0037] AlaGluSerLeuThrValAlaAlaThrProValProHisAlaGluIleLeuAsnValValLysProLe uLeuAlaLys
[0038] GluGlyValAspLeuLysIleLysGluPheThrAspTyrValGlnProAsnValGlnValSerGluLy sArgLeuAsp
[0039] AlaAsnPhePheGlnHisGlnProTyrLeuAspGluPheAsnLysAlaLysGlyThrAspLeuValAl aValThrGlyValHisIleGluProLeuGlyAlaTyrSerSerLysTyrLysLysLeuAspGluLeuP roSerGlyAlaThrValVal
[0040] IleProAsnAspAlaThrAsnGlyGlyArgAlaLeuLeuLeuLeuAspLysAlaGlyValIleLysLe uLysAspAsnLysSerIleThrAlaThrProLysAspIleValAspAsnProLysAsnIleLysIleA rgGluLeuGluAlaAlaThr
[0041] LeuProArgValLeuThrGlnValAspMetAlaLeuIleAsnThrAsnTyrAlaLeuGluAlaLysLe uAsnProThrLysAspAlaLeuAlaIleGluGlySerAspSerProTyrValAsnIleLeuValAlaA rgProAspAsnLysAspSerAspAlaMetGlnLysLeuAlaLysAlaLeuHisSerAlaGluIleLys GlnPheIleGlnGluLysTyrLysGlyAla ValValProAlaPhe
[0042] 实施例2重组融合蛋白reSBP的纯化
[0043] 1.pET30a-reSBP/BL21的大规模培养
[0044] 取保存在4℃冰箱中备用的pET30a-reSBP/BL21菌液100μL加入到20mL 含Kan+抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养12h后，取10mL 一次活化的菌液加入到4000mL含Kan+抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为0.6～0.8，加入
200μL IPTG(终浓度为100μM)置于 16℃摇床中过夜诱导后，6000rpm离心10min收集菌体。
200μL IPTG(终浓度为100μM)置于 16℃摇床中过夜诱导后，6000rpm离心10min收集菌体。
[0045] 2.高压破菌、离心
[0046] 菌体20g左右以PBS(10mM，pH7.0-7.5)缓冲液(取1袋PBS干粉(1L/ 袋)加I级水1000ml溶解完全)，按重量：体积比1：10比例混匀悬浮，4度预冷。
[0048] 高速离心：破菌后的液体装入离心桶，10,000-15,000g离心10-20min，收集上清备用。
[0049] 3.SP FF层析纯化
[0050] 将实施例2获得的上清样品，采用A液平衡层析系统及SP FF层析柱，B液线性梯度洗脱；
[0051] 4.Phenyl HP层析纯化
[0052] 将经步骤3)纯化的标蛋白，采用C液平衡层析系统及层析柱，A液线性梯度洗脱；
[0053] 其中，A液为pH＝5.0的50mM C6H8O7-C6H5Na3O7缓冲溶液，B液为pH＝5.0的 50mM C6H8O7-C6H5Na3O7,1M NaCl缓冲溶液，C液为50mM C6H8O7-C6H5Na3O7, 1.25M(NH4)2SO4缓冲溶液。
[0054] 5.G25层析纯化
[0055] 将步骤4纯化获得的样品，使用Sephadex G-25Medium层析柱纯化，采用缓冲液(PBS(10mM，pH 7.0-7.5)缓冲液)平衡层析系统及层析柱，置换缓冲液，收集流穿下来的目的蛋白。
[0056] 6.HPLC检测
[0057] 使用C3(购自Agilent公司)对reSBP蛋白进行纯度检测，用0.1％TFA 水溶液平衡柱子，上样10μl样品，0.1％TFA乙腈溶液洗脱，设定柱温60溶，流速0.5ml/min。洗脱程序为：10％～100％B，30min，通过曲线测出reSBP蛋白的纯度为98.9％，层析结果如图4所示。
[0058] 其中，0.1％TFA水溶液的配制：1L I级水加1ml TFA混匀，0.22TF滤膜过滤。
[0059] 0.1％TFA乙腈溶液的配制：1L乙腈加1ml TFA混匀。
[0060] 纯化后的抗原，做以下实验：
[0061] 实施例3：动物的免疫
[0062] 1)SPF级BALB/C 6～8周龄雌性小鼠15只，分成实验组、佐剂对照组和阴性对照组，每组5只，购于北京华阜康公司。
[0063] 2)首次免疫，用PBS稀释reSBP抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)3；用 5号半型针头，双侧大腿肌肉注射。实验组每只BALB/C小鼠注射量为100μL，含有reSBP 50μg和Al(OH)3 100μg；佐剂对照组每只BALB/C小鼠注射量为 100μL，含有Al(OH)3 100μg；阴性对照组每只BALB/C小鼠注射量为100μL PBS,不含有蛋白和Al(OH)3佐剂。
[0064] 3)第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与首次免疫相同，免疫途径同上；
[0065] 4)第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与首次免疫相同，免疫途径同上；
[0066] 实施例4：抗体的检测
[0067] 第三次免疫后第7天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后抗原特异性IgG应答水平。
[0068] 1.制备液体
[0069] 1)包被液的配制：称取Na2CO31.6 g，NaHCO3 2.9g，溶于1L ddH2O，用 PH计将pH调至9.6；
[0071] 3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH2O，再加入500μL Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；
[0072] 4)洗涤液的制备：同抗体稀释液
[0073] 5)显色液(TMB)，为天根公司产品；
[0074] 6)终止液(2M H2SO4)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH2O 中。
[0075] 2.ELISA检测reSBP重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价
[0076] 1)用包被液将纯化后的reSBP重组蛋白稀释为：4μg/mL
[0077] 2)包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；
[0078] 3)封闭：酶标板加封闭液200μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3 遍；
[0079] 4)将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；
[0080] 5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱 1h，洗涤3遍，空干；
[0081] 6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1:5000，制成抗体工作液；
[0082] 7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱60min，洗涤三遍，空干；
[0083] 8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；
[0084] 9)加入终止液(2M H2SO4)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；
[0085] 10)结果判断：A样品/A阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释)。
[0086] 结果：检测reSBP蛋白+Al(OH)3免疫小鼠产生的抗体效价达到1:2048000；第三次免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，说明本发明构建的reSBP重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体.然而佐剂对照组和阴性对照组的抗体效价无明显变化。
[0087] 实施例5：reSBP重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价
[0088] 1)从北京华阜康公司SPF级BALB/C 4～6周龄雌性小鼠90只，随机分成实验组、佐剂对照组和阴性对照组，每组30只。小鼠免疫的蛋白组成、免疫时间点和部位同实施例3。
[0089] 2)reSBP重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价按照参考文献：Gao Chen等 ClinImmunol 2017,183,354-363进行。简要地说，reSBP末次免疫后10～14天，用生理盐水
10
将准备PA XN-1菌液并调节浓度至1.5×10 CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μL，。感染结束后每隔1 天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表1。
10
将准备PA XN-1菌液并调节浓度至1.5×10 CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μL，。感染结束后每隔1 天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表1。
[0090] 表1 reSBP重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果
[0091]
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