보스웰리아 세라타 추출물을 포함하는 상승적인 항-염증 조성물{SYNERGISTIC ANTI-INFLAMMATORY COMPOSITIONS COMPRISING BOSWELLIA SERRATA EXTRACTS}

본 발명은 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 상승적인 영양학적, 약학적 및 식이 보조제 조성물을 제공한다. 상기 조성물(들)은 염증 및 천식, 관절염, 내피세포 기능이상 등을 포함하는 염증과 관련되거나 연관된 질환 상태를 예방, 조절, 및 치료하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 염증 질환 과정에서 발현/생성이 변화되는 전구-염증성 바이오마커 단백질 또는 분자의 경감을 포함한다.

보스웰리아 세라타( Boswellia serrata )(감람과( Burseraceae )) 식물의 고무 수지(gum resin)는 인도의 의학 시스템에서 아유르베다(Ayurvedic) 의약의 의사들에 의해 류마티스 관절염 및 통풍의 치료를 위해 오랫동안 사용되어 왔다. 고무 수지의 다양한 추출물은 실험동물에서 강력한 항-염증 및 항-동맥경화 활성을 나타내었다[Cuaz-Perolin et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol Feb 2008]. 분리된 보스웰리아 화합물인 인센솔 아세테이드(incensole acetate)는 NFκB 억제제이고 또한 항-염증 화합물로서 유용한 것으로 입증되었다[Moussaieff et al., Mol Pharmacol 72,1657-1664, 2007]. B. 세라타( B. serrata )의 고무 수지의 에탄올 추출물은 랫트 복막 호중구에서 류코트리엔 B4의 형성을 억제하는 것으로 과거에 관찰되었다. 류코트리엔 B4는 염증 반응의 중요한 매개체 중 하나이다[Ammon, HPT et al., Planta Medica, 57, 203 (1991)]. 보스웰리아의 추출물은 강력한 항-관절염제[Kimmatkar et al; Phytomedicine . 2003 Jan;10(l):3-7.], 및 면역조절제[Pungle et al; Indian J Exp Biol . 2003 Dec;41(12):1460-1462]인 것으로 밝혀졌다. 보스웰리아 세라타의 콜레스테롤 저하 작용이 또한 입증되었다[Zutshi U et al, Indian J Pharmac. 18, 182-183, 1986.]. 실제로, 무릎의 골관절염 환자들군에 대한 보스웰리아 추출물을 사용한 무작위적이고, 이중 맹검의 , 위약 조절된(placebo controlled), 교차 임상시험은 통증 감소, 부종 감소, 및 무릎 굽힘(knee flexion)의 증가에 있어서 통계적으로 유의성있는 개선을 나타내었다[Kimmatkar et al., Phytomedicine . 2003; 10:3-7]. 개방성 비-무작위적 동등성 시험에서, 만성 대장염 환자 30명에게 보스웰리아 고무(gum)(하루에 3회 300 mg) 또는 설파살라진(하루에 3회 1g)을 투여한 결과 보스웰리아에 의해 나타난 치료 효과는 설파살라진에 의해 나타난 것과 비교할만(comparable) 했다[Gupta I. et. al., Planta Med. 2001; 67: 391-395]. 다른 동등성 시험에서, 보스웰리아 표준 추출물은 활성 크론병 환자들에 대한 무작위적인 이중 맹검 시험에서 메살라진과 비교할만하거나 혹은 더욱 우수한 치료학적인 개선을 나타내었다[Gerhardt H, et. al., Z Gastroenterol 2001; 39: 11-17]. 보스웰리아 고무 수지는 또한 6주간의 이중 맹검, 위약 조절된 시험에서 기관지 천식 환자들에서 통계적으로 유의성있는 개선을 나타내었다[Gupta I. et. al., Eur J Med Res 1998; 3: 511-51].

특허들은 또한 보스웰리아의 다양한 활성을 기술하고 있다. 몇 가지를 인용하면 아래와 같다:

PCT 특허공개 WO03074063A1 및 등록된 인도특허 제205269호는 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산을 최대 100% 까지 풍부화된 분획물의 제조방법에 관한 것이다. 보스웰리아 종으로부터 고무 수지의 유기용매 추출물은 먼저 산화시킨 후 아세틸화시키거나 혹은 그 반대로 한다. 이것은 분획중에 존재하는 덜 강력한 보스웰산을 AKBA로 전환시킨다. 이렇게 처리된 분획물은 추가로 정제 및 크로마토그래피 분리 기술에 의해 분리하여, 순도를 향상시키고 오염물질을 제거한다. 상기 제조방법은, 치료학적인 적용을 위하여, 10% 내지 100%로 AKBA가 풍부화된 분획물에 대한 접근을 제공한다.

유럽 특허공개 EP1637153A1은 특히 염증 및 섬유증 진행(fibrotic courses)에 대한 약제로서 식물성 항섬유증제(plant antifibrotic agent)와 보스웰리아 세라타 추출물과의 복합제(association)에 관한 것이다. 상기 복합제에 있어서, 보스웰리아 세라타는 건조 추출물로서 5% 내지 50%의 양으로 존재하고, 식물성 항섬유증제는 건조 추출물로서 50% 내지 95%의 양으로 존재한다.

미국 특허 US5629351은 보스웰산의 혼합물을 포함하는 신규의 분획물에 관한 것이며, 상기 분획물은 항-염증 및 항-궤양유발 활성을 나타낸다. 또한 항-염증, 항-관절염 및 항-궤양유발 활성을 나타내는 신규의 보스웰산 화합물이 개시되어 있다. 또한, 보스웰산 분획물 및 이로부터 각각의 보스웰산을 분리하는 방법이 개시되어 있다.

미국 특허 US5720975는 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 인센스(incense)[유향(olibanum)], 인센스 추출물, 인센스에 함유된 성분, 이들의 생리학적으로 허용가능한 염, 이들의 유도체 및 이들의 생리학적 염, 순수한 보스웰산, 그의 생리학적으로 허용가능한 염, 그의 유도체, 상기 유도체의 염의 용도에 관한 것이다.

미국 특허 US5888514는 골 또는 관절 염증을 특징으로 하는 증상을 갖는 포유동물을 치료하기 위한 조성물에 관한 것이며, 여기에서 보스웰리아 세라타의 추출물이 성분들 중 하나로 사용된다.

PCT 특허공개 WO08036932A2는 독특하게 높은(uniquely elevated) 휘발성 오일, 보스웰산, 및 다당류 화합물을 함유하는, 보스웰리아 종[프랭크인센스(frankincense) 또는 유향(olibanum)]으로부터 유래된 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이며, 특히 인체 경구 투여 제제, 및 예를 들어 관절염, 염증 질환, 골관절염, 류마티스 질환 및 요통(low back pain)의 치료/예방에 유용한 상기 조성물의 사용방법에 관한 것이다.

그러나, 본 발명자들이 아는 한, 염증 질환의 예방, 조절 및 치료를 위한, 보스웰리아 추출물 특히 AKBA가 풍부화된 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 조성물에 관한 선행기술은 존재하지 않는다.

발명의 요약

본 발명의 주요 목적은 염증 및/또는 천식, 동맥경화증, 내피세포 기능이상(endothelial dysfunction), 골관절염, 류마티스 관절염 등을 포함하는 염증과 관련되거나 연관된 질환 상태를 예방, 조절 또는 치료하기 위한, 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 또는 분획물(fraction) 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)의 치료학적으로 유효한 조합을 포함하는, 상승적인 영양학적(nutraceutical), 약학적 및 식이 보조제(dietary supplement) 조성물을 제공하는 것이다.

다른 태양에서, 본 발명은, 포유동물에서, 하나 이상의 염증 요소 및 천식, 동맥경화증, 내피세포 기능이상, 골관절염, 류마티스 관절염, 알러지성 비염, 피부염, 건선, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 염증성 장질환, 다발성 경화증, 당뇨병, 인지, 신경계 질환, 콜라겐 합성, 항-노화, 대사성 질환, 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosis), 포도막염, 혈관형성술-후 재협착(post-angioplasty restenosis), 사구체 신염, 위장관 알러지, 신장염, 결막염, 만성 폐쇄성 폐질환, 직업성 천식(occupational asthma), 습진, 기관지염, 건초열, 두드러기, 알러지 질환 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증과 관련되거나 연관된 질환을 예방, 조절 및 치료하기 위한 AKBA가 풍부화된 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 상승적인 조성물을 제공하며, 또한 쌕쌕거림(wheezing), 호흡곤란, 마른기침(nonproductive cough), 흉부 압박감(chest tightness), 목 근육 압박감(neck muscle tightness), 빠른 심박(rapid heart rate), 흉통(chest pain), 관절 통증(joint pain)과 같은 증상 및 이와 연관된 몇몇의 다른 증상을 위한, AKBA가 풍부화된 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 상승적인 조성물을 제공한다.

또다른 태양에서, 본 발명은 관절염 또는 류마티스 관절염을 포함하는 다른 염증 질환의 하나 이상의 요소의 예방, 조절 및 치료를 위한, AKBA가 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 상승적인 조성물을 제공한다. 관절염의 비제한적인 예는 (연조직 류마티즘(soft-tissue rheumatism) 및 비-관절 류마티즘(non-articular rheumatism), 섬유근육통(fibromyalgia), 섬유염(fibrositis), 근육 류마티즘, 근육근막 통증(myofascial pain), 상완골 외상과염(humeral epicondylitis), 동결견(frozen shoulder), 티에체 증후군(Tietze's syndrome), 근막염(fascitis), 건염, 건초염, 윤활낭염과 같은) 류마티스 관절염, 소아 만성(juvenile chronic) 관절염, 관절 질환, 척추관절병증(spondyloarthropathies)(강직성 척추염), 골관절염, 고요산혈증 및 급성 통풍, 만성 통풍, 및 전신성 홍반성 낭창과 연관된 관절염, 및 퇴행성 관절염을 포함한다.

본 발명은 또다른 다른 목적은 포유동물에서 염증 및/또는 염증, 골관절염, 류마티스 관절염, 연골 분해(cartilage degradation)와 연관된 질환 증상과 관련된 생체분자(biomolecules) 또는 바이오마커(biomarkers)의 발현 및/또는 생성의 경감을 위한 상승적인 조성물을 제공하는 것이며, 상기 생체분자 또는 바이오마커는 5-리폭시게나아제(5-LOX), 5-리폭시게나아제 활성화 단백질(FLAP), 대식세포/지방세포 지방산 결합 단백질-2(aP2/FABP), 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-4(IL-4), 세포간 세포접착분자(ICAM)-1, 혈관세포접착분자(VCAM)-1, 매트릭스 메탈로프로티나아제(MMP)-3, TNF-α 및 IL-1β를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

도 1은 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)의 주요 화합물을 나타내는 구조식 1-9를 나타낸다.
도 2는 보스웰리아 세라타의 비산성 수지 추출물(BNRE)의 식물화학적(phytochemical) 프로파일을 도시한 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 인간 단핵구 THP-1 세포내에서 5-리폭시게나아제(A) 및 FLAP(B) 발현의 BE30%-유도된 억제를 나타내는 대표적인 면역 블롯(immuno blots)을 도시한다. 각각의 패널에서 막대 그래프는 정상화된 농도계측 값(임의의 단위)을 나타낸다. 막대 a, b, 및 c는 각각 대조군 세포, LPS 처리된 세포, 및 LPS+BE30% 로 처리된 세포를 나타낸다.
도 4는 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물[BE30%], 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 및 조성물-2의 5-리폭시게나아제 억제 활성 비교를 나타낸다. 막대는 25 ㎍/mL 농도에서의 BE30%, BNRE 및 조성물-2에 의해 나타난 5-리폭시게나아제 효소의 퍼센트 억제를 나타낸다.
도 5는 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물[BE30%], 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 및 조성물-2에 의한 매트릭스 메탈로프로티나아제-3(MMP-3) 생성의 억제를 나타낸다. 막대는 TNFα로 유도된 SW982 인간 윤활막 세포(synovial cells)에서의 BE30%, BNRE 및 조성물-2에 대한 50% 억제 농도(IC ₅₀ )를 나타낸다. 막대 상의 값은 대응하는 IC ₅₀ 값을 나타낸다.
도 6은 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 30%로 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%, 100 mg/kg), 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)(100 mg/kg), BE30% 및 BNRE를 각각 1:1 및 2:1의 비율로 함유하는 조성물-1(100 mg/kg), 및 조성물-2(100 mg/kg), 및 프레드니솔론(10 mg/kg)에 의한, 프로인트 완전 아주반트(Freund's complete adjuvant)로 유도시킨 스프라그 도울리 랫트에서의 발 부종 크기(paw edema volume)의 퍼센트 억제를 나타내는 막대 그래프를 나타낸다.
도 7은 상이한 군의 동물에서 혈청 TNFα(A) 및 IL-1β(B) 농도의 막대 그래프를 나타낸다. FCA 처리 14일 후, 혈청 TNFα 및 IL-1β를 효소-면역 분석키트(enzyme-immuno assay kit)(R&D 시스템, USA)로 정량적으로 측정하였다. 막대 a 내지 f는 각각 대조군, 프레드니솔론(10 mg/kg), BE30%(100 mg/kg), BNRE(100 mg/kg), 조성물-1(100 mg/kg) 및 조성물-2(100 mg/kg)로 처리된 군에서 사이토카인의 수준을 나타낸다. 각각의 막대는 평균±SD, N=6, * P<O.05 및 ** P<0.005 (대조군 대비)을 나타낸다.

염증은 체내로 들어오는 병원균, 손상된 세포 또는 알러지 물질과 같은 자극에 대한 혈관 조직의 반응이다. 이는 해로운 병원균 또는 물질을 제거하고 조직을 보호하기 위한 유기체에 의한 보호 기전이다. TNFα, IL-1β, IL-6, GM-CSF와 같은 전구-염증성 사이토카인 및 CD4+, Th2 계열(subset) 유래의 IL-4, IL-5 및 IL-13 림포카인은 염증 질환의 면역발병기전(immunopathogenesis)의 주요 인자로 간주되고 있다[Knight DA, et. al., J. Allergy Clin. Immunol . 2001; 108: 797-803]. 5-리폭시게나아제는, 염증 진행의 중요한 단계인, 아라키돈산으로부터 류코트리엔 합성을 위한 중요한 효소이다. 류코트리엔은 염증 질환의 주요 매개체이다.

5-리폭시게나아제(5-LOX)의 활성화 및 유전자 발현은 질병의 원인이 된다. 5-리폭시게나아제 활성화 단백질(FLAP)는 18kDa의 완전한 막 단백질로서, 아라키돈산에 특이적으로 결합하고 이를 상기 효소로 전달함으로써 5-리폭시게나아제를 활성화시킨다[Mancini et. al., 1993]. 그러므로 FLAP는 류코트리엔 생성을 담당한다. 따라서 5-LOX 및 FLAP를 차단하거나 낮게 조절하는 것은 염증 질환의 치료 및 조절을 위한 새로운 치료적 접근이다.

동맥경화증은 또한 수십년에 걸쳐 내피 세포 기능 이상 부위에서 동맥 병변(arterial lesions)의 형성을 특징으로 하는 염증 질환이다. 염증은 죽상경화판(atherosclerotic plaque) 생성의 많은 단계에서 중요한 역할을 한다[KK Berg et al., Scandinavian Journal of Immunology, 69, 36-42].

매트릭스 메탈로프로티나아제(MMPs)는 아연 의존성 엔도펩티다아제로서, 조직 중의 세포들 사이의 공간에서 통상 발견되는, 콜라겐과 같은 모든 종류의 세포외 매트릭스 단백질(extra cellular matrix proteins)을 파괴할 수 있다. MMPs는 콜라게나아제로 구성된 섬유아세포 콜라게나아제-1(MMP-1), 젤라티나아제 A(MMP-2) 및 젤라티나아제 B(MMP-9)를 포함한 젤라티나아제, 및 스트로멜리신-1(MMP-3) 및 매트릴리신(MMP-7)을 포함한 스트로멜리신의 3가지 중요한 군으로 주로 나누어진다. 메탈로프로티나아제의 과잉은 콜라겐, 프로테오글리콘 및 젤라틴과 같은 생체분자의 분해로 이어지며, 이는 표피에 치명적인 결과를 가져올 수 있고 또한 연골, 염증 등의 질환을 야기할 수 있다.

AKBA 가 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%):

보스웰리아 수지 및 추출물은 오랫동안 염증 질환의 치료를 위해 사용되어 왔다. 보스웰산은 보스웰리아 세라타에 유익한 효과를 나타내는 활성 화합물로 동정되었다. 미량 성분인 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)은 모든 보스웰산 중 가장 강력한 5-리폭시게나아제 저해제로 동정되었다[Sailer ER et. al., British J Pharmacology. 1966, 117(4): 615-18]. 이와 같이 AKBA 함량이 풍부화된 추출물 또는 분획물은 천연 추출물에 비하여 더욱 우수한 효능을 나타내는 것으로 추정되었다. 2005년 3월 7일자 PCT 출원 제PCT/IN05/000074호 및 PCT 특허 공개 제WO03074063A1호 및 등록된 인도특허 제205269호에서, 본 발명자들은 적정 분석법에 의할 때 약 85%의 총 보스웰산을 함유하고 HPLC 분석법에 의할 때 약 3%의 AKBA (BE3%)를 함유하는 상업용 보스웰리아 세라타 추출물로부터 30% 내지 100%로 AKBA가 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물의 제조방법을 기술한 바 있다. 상기 풍부화된 보스웰리아 추출물은, AKBA를 제외하고는, 통상의 보스웰리아 세라타 추출물에 공통적으로 존재하는 트리테르펜 성분의 양이 유의성있게 결여된 것을 특징으로 하는 독특한 조성물이며, 상기 AKBA는 통상의 보스웰리아 추출물에서는 미량 성분(3% 이하)이나 상기 풍부화된 추출물에서는 주요 성분이다. 통상의 보스웰리아 추출물에 존재하는 성분은 1) β-보스웰산, 2) 3-O-아세틸-β-보스웰산, 3) 11-케토-β-보스웰산, 4) 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산, 5) 9-엔-β-보스웰산, 6) 3α-히드록시우르스-9,11-디엔-24-오익산, 7) 2α,3α-히드록시우르스-12-엔-24-오익산이다. 본 발명의 조성물에 사용되는 AKBA가 풍부화된 독특한 보스웰리아 세라타 추출물의 주요 성분은 1) 3-O-아세틸-β-보스웰산, 2) 3-O-아세틸-9(11)-데히드로-β-보스웰산, 3)3-O-아세틸-11-케토-β-아미린, 4) 3-O-아세틸-11-케토-α-보스웰산이다.

30% AKBA를 함유하는 상기 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%)이 몇 가지 시험관내 분석에서 시험되었으며, 3% AKBA를 함유하는 상업용 보스웰리아 세라타 추출물(BE3%)에 비하여 우수한 것으로 밝혀졌다[Roy S. Kanna, et. al., DNA and Cell Biology, 2005, 24(4): 244-255]. 직접적인 비교 시험에서, 상기 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%)은 또한 3% AKBA를 함유하는 천연 보스웰리아 추출물에 비하여, 위스타 알비노 랫트에서, 아주반트-유도된 염증 반응에 대하여 유의성있게 더욱 높은 억제를 나타냈다[Roy S, et. al., Antioxidant & Redox Signaling, 8, 3 & 4, 2006]. 30% AKBA로 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%)이 본 발명을 입증하는데 사용된다.

보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물( BNRE ):

보스웰리아 세라타 수지는 산성 화합물, 비-산성 화합물 및 당류를 함유한다. 통상의 보스웰리아 세라타 추출물(85% 총 보스웰산, BE3%)을 위한 상업적 공정의 수행 과정에서, 보스웰산을 포함한 트리테르펜 산을 주로 함유하는 산성 분획물이 나머지 수지 성분들로부터 분리된다. 당류 및 다른 고분자 물질은 또한 총 보스웰산의 풍부화 과정에서 수상(aqueous phase)으로 분리된다. 남아있는 수-비혼화성 비-산성의 저극성 화합물은 보스웰리아 오일 분획물/추출물로서 분리된다. 이러한 비-산성 또는 중성의 저극성 화합물은 상업용 보스웰리아 추출물 및 AKBA가 풍부화된 보스웰리아 추출물 모두에서 결여되어 있거나 혹은 매우 낮은 농도로 존재한다. 이러한 비-산성 성분들의 존재는 AKBA 풍부화의 증가와 함께 더욱 더 낮아지게 된다.

상기 비-산성 보스웰리아 오일은 보스웰리아 세라타 고무 수지의 주요 성분이다. 그러나, 이는 매우 제한된 상업적 활용성을 가지며, 대부분 폐기물로서 버려진다. 상기 분획물의 잠재적인 활용은 오랫동안 지체되어 왔다. 본 발명자들은 상승적인 조성물을 제조하기 위하여 보스웰리아 세라타 오일에 대한 예기치 못한 활용성을 발견하였다. 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE), 즉 보스웰리아 세라타 오일로부터 휘발성 화합물을 제거한 후 얻어진 분획물이 본 발명에 사용되었다. 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)은 하기 방법으로 얻어졌다: a) 보스웰리아 세라타 고무 수지를 메틸 이소부틸 케톤(MIBK) 용매에 분산시키고, 비용해성 고무 물질을 여과에 의해 분리시켰다, b) 상기 MIBK 용액을 2% KOH 용액으로 반복적으로 추출하여 산성 화합물을 제거하였다, c) 이후 상기 MIBK 층을 물과 소금물(brine)로 연속해서 세척하였다, d) 상기 MIBK 층을 60-70℃에서 감압하에 증발시키고, 75-85℃에서 진공하에서 상기 오일성 잔사로부터 휘발성 성분을 제거하여 점성의 오일을 얻었으며, 상기 점성의 오일을 이하에서는 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물 또는 BNRE로 칭한다. 선택적으로, 상기 BNRE는 또한 a) 보스웰리아 세라타 수지의 알코올 추출물을 제조한 후, b) 수성 알칼리 용액 및 수-비혼화성 유기용매 사이에서 상기 알코올 추출물을 분획하고, c) 상기 유기용매 층을 분리한 후, 용매를 증발시켜 비-산성 보스웰리아 오일 추출물을 얻고, d) 고온 및 진공에서 휘발성 화합물을 제거하여 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)를 얻음으로써, 제조될 수 있다.

예기치 않게, 상기 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)은 독특한 조성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 반복된 컬럼 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 BNRE의 광범위한 분리를 수행하였으며, 몇가지 디테르페노이드 및 트리테르페노이드 화합물을 단리하였다. 상기 화합물들의 구조는 ¹ H NMR, ¹³ C NMR, DEPT, HSQC 및 HMBC, 질량 스펙트럼 데이터를 사용하여 정밀하게 특성분석하였다. 동정된 화합물은 도 1에 나타낸 바와 같이, 귀올(guiol)(1), 네프텐올(nephthenol)(2), 세라톨(serratol)(3), 디테르펜 X(diterpene X)(4), 루페올(lupeol)(5), 올린-12-엔-3β-올(olean-12-ene-3β-ol)(6), 올린-12-엔-3α-올(olean-12-ene-3α-ol)(7), 라노스타-8,24-디엔-3α-올(lanosta-8,24-diene-3α-ol)(8) 및 우르스-12-엔-3α-올(urs-12-ene-3α-ol)(9) 이다. 이렇게 얻어진 순수 화합물은 상기 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 표준화하기 위한 식물화학적(phytochemical) 마커로서 사용되었다. 상기 식물화학적 분석의 결과를 표 1에 요약하였고, BNRE의 식물화학적 프로파일을 나타내는 크로마토그램을 도 2에 나타낸다.

보스웰리아 추출물을 포함하는 상승적인 조성물:

본 발명자들은 광범위한 보스웰리아 추출물 및 AKBA가 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물에 대한 다양한 세포 기반의 시험관내 항-염증 연구를 수행하였다. 이들 시험결과, 예기치 않게도, 30% 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물[BE30%]이 시험관내에서(in vitro) THP-1 인간 단핵구-대식세포에서 LPS로 유도된 5-LOX 및 FLAP의 발현을 강력하게 억제조절(down-regulate)하는 것으로 나타났다(도 3).

상기 AKBA가 선택적으로 풍부화된 B. 세라타 추출물을 몇가지 선택된 성분과 조합하여 더욱 우수한 항-염증 활성을 갖는 조성물을 얻었다. 각각의 추출물 및 조성물에 대하여 5-리폭시게나아제 효소(5-LOX)를 억제하는 활성을 시험하였다. 놀랍게도, 30% AKBA가 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 고무 수지 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 조성물은 5-LOX의 상승적인 억제를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 2:1의 비율로 BE30% 및 BNRE를 포함하는 조성물-2는 25 ㎍/mL에서 37.7% 억제를 나타낸 데 비하여, 동일한 농도에서 BE 30% 및 BNRE에 의해 31.8% 및 20.6% 억제를 나타내었다. 조성물-2 및 각각의 성분에 의해 나타난 5-리폭시게나아제 저해 비교를 도 4에 나타낸다.

30% AKBA로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%), 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 및 조성물-2에 대하여 TNFα로 유도된 SW982 인간 윤활막 세포에서 매트릭스 메탈로프로티나아제-3(MMP-3)의 생성을 저해하는 효능을 시험하였다. 무-세포(cell free) 배양 상등액 중의 MMP-3 생성은 ELISA 전개 키트(ELISA development kit)(R&D System, Minneapolis, MN, USA)로 평가하였다. 놀랍게도, 조성물-2는 BE30% 및 BNRE 각각에 의해 나타낸 것에 비하여 윤활막 세포에서 MMP-3 생성에 대한 더욱 우수한 억제를 나타내었으며, 이는 5-LOX에 대한 상승적인 효과를 확인시켜 준다. 조성물-2, BE30% 및 BNRE는 각각 46.78, 58.75 및 119.32 ㎍/mL에서 50% 억제 농도(IC ₅₀ )를 나타내었다. 조성물-2에 의해 나타난 상승적인 MMP-3 억제를 BNRE 및 BE30% 각각의 성분에 의해 나타난 것과 비교하여 도 5에 요약한다.

시험관 내에서 조성물-2에 의해 나타난 상승적인 효과는 프로인트 완전 아주반트(Freund's complete adjuvant)로 유도된 스파라그 도울리 랫트의 관절염 모델에서의 생체 내 시험으로 이어졌다. 30%까지 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산이 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE 30%) 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 각각 1:1 및 2:1 비율로 포함하는 조성물-1 및 조성물-2의 항-염증 효능을 프로인트 완전 아주반트로 유도된 스파라그 도울리 랫트의 관절염 모델에서 생체 내 시험을 통하여 평가하였으며, 그 효능을 각각의 성분 즉 BE30% 및 BNRE에 의해 나타난 효능과 비교하였다. 처리군 랫트는 14일 동안 30% AKBA로 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 추출물(BE30%) 또는 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 또는 조성물-1 또는 조성물-2를 100 mg/kg체중으로 처리하였다. 양성 대조군은 프레드니솔론을 10 mg/kg체중으로 처리하였다. 14일째에, 프로인트 완전 아주반트(FCA)를 각각의 동물의 왼쪽 뒷발의 아래 발바닥 부위에 피하 주사하였다. 시험은 28일째에 종료했다. 혈액 샘플을 일정한 간격으로 각각의 동물로부터 채취하고, 발 체적을 FCA 주사 당일 및 FCA 접종 13일 후에 체적 변동 기록계(Plethysmography) 장치로 측정하였다. 발 부종의 체적 차이는 염증 반응으로 간주된다. BE30%, BNRE, 조성물-1, 조성물-2 및 프레드니솔론의 생체 내 항-염증 반응은 CMC 처리된 대조군과 비교하였을 때 발 부종 억제 퍼센트를 계산하여 평가하였다.

보스웰리아 세라타 추출물 30% AKBA(BE30%) 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 처리한 처리군은 각각 37% 및 10%의 발 부종 감소를 나타냈다. 그러나, 동일한 용량 수준으로 조성물-1 및 조성물-2를 처리한 처리군은 더욱 우수한 발 부종 감소를 나타내었으며, 각각 44% 및 54%의 발 부종 감소를 달성하였다. 프레드니솔론으로 처리한 양성 대조군은 10 mg/kg 용량 수준에서 53% 억제를 나타내었다. 도 6에 요약된 결과는 본 발명의 조성물-1 및 -2에 대한 시험관 내에서 관찰된 상승적인 효과를 확인시켜 준다.

또한, 처리군 및 대조군의 혈청에서 바이오마커 즉 종양괴사인자-알파(TNF-α) 및 인터루킨-1β(IL-1β)의 수준을 평가하였다. 도 7(A 및 B)에 나타낸 바와 같이, 조성물-1 및 조성물-2로 처리된 처리군은 BE30% 및 BNRE 각각의 성분으로 처리된 처리군에 의해 나타난 수준에 비하여, 혈청 바이오마커인 TNF-α, IL-1β에 있어서 유의성있게 더욱 우수한 감소를 나타내었다.

따라서, 상기 데이타는 AKBA가 풍부화된 보스웰리아 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 조성물이 동일한 용량 수준에서 각각의 성분으로 얻어진 효능에 비하여 항-염증제로서 더욱 강력하다는 것을 나타내며, 이는 이들 추출물 사이에 예기치 못한 상승적 연관성을 입증해 준다.

30% 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)을 함유하도록 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물이 본 발명을 설명하는데 사용된다. 그러나, 10 % 내지 100 중량%의 AKBA 함량으로 선택적으로 풍부화된 다른 보스웰리아 세라타 추출물이 또한 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)과 조합된 상승적인 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

10% 내지 100%의 AKBA 함량으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물은 하나 이상의 다음 제조방법을 사용하여 얻어질 수 있으며, 상기 제조방법은 하기 단계를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다: (1) 2005년 3월 7일자 PCT 출원 제 PCT/IN05/000074호 및 PCT 특허 공개 제WO03074063A1호 및 등록된 인도특허 제 205269호를 통하여 본 발명자들에 의해 보고된 선행 제조방법을 사용하여, 상업용 보스웰리아 세라타 추출물 중의 다른 β-보스웰산을 35 내지 45% AKBA 추출물로 전환, (2) 이후, 약학적으로 또는 식이적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 사용하여 상기 전환 생성물을 10 내지 45% AKBA 추출물로 희석, (3) 컬럼 크로마토그래피, 분획, 결정화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 단계들의 조합을 사용하여 상기 전환 생성물을 90 내지 99% AKBA로 정제한 후, 약학적으로 또는 식이적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 또는 저등급(low grade) 상업용 보스웰리아 세라타 추출물을 사용하여 상기 순수한 AKBA를 원하는 AKBA 농도(20-99%)로 희석, (4) 선택적으로, 추출, 컬럼 크로마토그래피, 분획, 결정화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 단계들의 조합을 이용하여, 상기 고무 수지중에 천연으로 존재하는 AKBA를 10 내지 99% 범위에서 원하는 농도로 정제한 후, 약학적으로 또는 식이적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 또는 저등급 상업용 보스웰리아 세라타 추출물을 사용하여 상기 더높은 퍼센트 분획물을 원하는 농도로 희석.

본 발명의 다른 구현예는 아래에 약술된 바와 같다:

일 태양에서, 본 발명은 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 상승적인 항-염증 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 염증 및/또는 염증과 관련되거나 연관된 하나 이상의 질환 상태의 예방 또는 치유 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 태양에서, 치료학적으로 유효한 양의 AKBA가 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)이 특정 비율로 조합될 때 상승적인 항염증 효과가 존재하며, 그 효과는 상기 성분들이 개별적으로 주어졌을 때 얻어진 효과보다 더욱 우수하며, 또한 전구-염증성 생체분자/단백질 마커의 발현 또는 생성의 상승적인 경감이 존재한다는 것이 발견되었다.

또다른 태양에서, 본 발명은, 필요로 하는 포유동물에서, 5-리폭시게나아제(5-LOX), 5-리폭시게나아제 활성화 단백질(FLAP), 대식세포/지방세포 지방산 결합 단백질(aP2/FABP), IFN-γ, IL-4, ICAM, VCAM, MMP-3 및 MMP-1과 같은 매트릭스 메탈로프로티나아제(MMPs), NFκB TNFα 및 IL-lβ를 포함하나 제한하지 않는 염증과 관련되거나 연관된 생체분자/바이오마커/특정 레독스-민감성(redox-sensitive) 전구-염증성 유전자의 발현 또는 생성을 경감시키기 위한, AKBA가 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 상승적인 조성물을 제공한다.

또다른 태양에서, 본 발명은, 포유동물에서, 천식, 동맥경화증, 내피세포 기능이상, 알러지성 비염, 피부염, 건선, 낭포성 섬유증, 염증성 장질환, 간질성 방광염, 편두통, 협심증, 만성 전립선염, 햇볕 화상(sun burn), 치주질환, 다발성 경화증, 포도막염, 혈관형성술-후 재협착, 사구체 신염, 위장관 알러지, 신장염, 결막염, 만성 폐쇄성 폐질환, 직업성 천식, 습진, 기관지염, 건초열, 두드러기, 알러지 질환 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증과 관련되거나 연관된 하나 이상의 질환 상태를 예방, 조절 및 치료하기 위한 AKBA가 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 상승적인 조성물을 제공하며, 또한 쌕쌕거림, 호흡곤란, 마른기침, 흉부 압박감, 목 근육 압박감, 빠른 심박, 흉통, 관절 통증, 자외선 조사에 의한 콜라겐 분해, 피부주름, 및 피부노화 및 이와 연관된 몇몇의 다른 증상을 위한, AKBA가 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 상승적인 조성물을 제공한다.

또다른 태양에서, 본 발명은 또한 염증, 관절염, 인지, 신경계 질환, 알츠하이머 질환, 콜라겐 분해, 피부의 노화, 콜레스테롤 저하, 대사성 질환 및 암 중 하나 이상의 요소의 예방, 조절 및 치료를 위한, AKBA가 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 포함하는 상승적인 조성물을 제공한다. 관절염의 비제한적인 예는 (연조직 류마티즘 및 비-관절 류마티즘, 섬유근육통, 섬유염, 근육 류마티즘, 근육근막 통증, 상완골 외상과염, 동결견, 티에체 증후군(Tietze's syndrome), 근막염, 건염, 건초염, 윤활낭염과 같은) 류마티스 관절염, 소아 만성(juvenile chronic) 관절염, 관절 질환, 척추관절병증(강직성 척추염), 골관절염, 고요산혈증, 및 급성 통풍, 만성 통풍, 및 전신성 홍반성 낭창과 연관된 관절염, 및 퇴행성 관절염을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 또한 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)의 제조방법을 제공하며, 상기 제조방법은 수-비혼화성 유기용매로 보스웰리아 세라타의 고무 수지를 추출하고, 상기 유기용매 추출물을 수성 수산화칼륨과 같은 수성 알칼리 용액으로 세척한 다음, 물 및 소금물로 세척한 후, 최종적으로 진공 하에서 상기 유기층을 증발시킨 다음, 고진공 및 고온 하에서 휘발성 화합물을 제거하여 BNRE을 얻는 단계를 포함한다. 상기 수-비혼화성 유기용매는 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 메틸 이소부틸 케톤 또는 다른 수-비혼화성 용매 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

또다른 구현예에서, 보스웰리아 세라타의 천연 오일(intact oil)이 또한 상기 상승적인 조성물을 제조하기 위하여 BNRE 대신 사용될 수 있다.

다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다:

(a) 수-비혼화성 유기용매로 보스웰리아 세라타의 고무 수지를 추출하고, 상기 추출물을 조심스럽게 여과하여 비용해된 수지 물질을 제거한 후, 상기 유기용매 추출물을 수성 수산화칼륨과 같은 수성 알칼리 용액으로 반복 세척한 다음, 물 및 소금물로 세척한 후, 최종적으로 진공 및 승온 하에서 상기 유기층을 증발시켜 상기 유기용매를 제거한 다음, 고진공 및 고온하에서 상기 오일성(oily) 잔사로부터 휘발성 화합물을 제거하여 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 얻는 단계,

(b) 보스웰리아 세라타 고무 수지의 산성 추출물을 선택적으로 풍부화시켜 10% 내지 100% AKBA로 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE)을 얻는 단계,

(c) 상기 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 및 AKBA가 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물을 원하는 비율(들)로 조합하여 본 발명의 조성물을 얻는 단계,

(d) 선택적으로(optionally), 생물학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 부형제(excipients), 희석제 및 첨가제로부터 선택된 하나 이상의 성분과 상기 조성물을 혼합하는 단계.

상기 제조방법에서, 상기 수-비혼화성 유기용매는 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 메틸이소부틸케톤, tert-부탄올 또는 다른 수-비혼화성 용매로부터 선택될 수 있다.

AKBA의 풍부화를 위해 사용되는 상기 보스웰리아 세라타 고무 수지의 산성 추출물은 공지의 방법을 사용하여 상기 고무 수지로부터 제조되거나 혹은 보스웰산으로 표준화된 상업적으로 이용가능한 보스웰리아 세라타 추출물들의 군, 바람직하게는 적정 분석법에 의해 약 85% 총 산으로 표준화된 추출물로부터 선택될 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)의 동정 방법을 제공한다:

a) 마커로서 BNRE의 주요 화합물들을 동정하고, 이를 > 98%의 순도로 분리한 다음, 스펙트럼 데이터를 사용하여 이들을 철저히 특징분석(characterising)하는 단계,

b) PDA 검출기를 구비한 HPLC 시스템에 장착된 페노메넥스 루나 페닐-헥실 분석 컬럼(4.6 x 250mm, 5μ)에 기지량의 각각의 마커 화합물들을 주입하고(여기에서, 상기 컬럼은 30℃에서 유지시키고, 0.1 %v/v 오르토인산(ortho phosphoric acid) 수용액 및 아세토니트릴을 각각 27% 및 73%로 포함하는 이성분 용매 혼합물로, 1.5 mL/min의 유속으로 용리시킨다), 210 nm 및 248 nm 에서의 자외선 검출을 이용하여 각각의 마커에 대한 체류시간(retention time) 및 피크 면적을 측정하는 단계; 및 이후

c) 유사한 조건하에서 기지량의 BNRE 샘플을 분석하고, 샘플 중의 피크들의 체류시간과 표준물질의 피크 체류시간과의 비교에 근거하여, 또한 선택적으로 각각의 마커와 함께 상기 샘플을 동시주입(co-injecting)하는 것에 의해 혼합물 중의 마커들을 동정한 다음, 기지농도에서의 표준물질에 대응하는 피크 면적과 마커의 피크 면적을 비교하여 샘플 중의 각각의 마커의 백분율을 측정하는 단계, 및 이후,

d) 네프텐올, 세라톨, 디테르펜 X, 루페올, 올린-12-엔-3β-올, 올린-12-엔-3α-올, 라노스타-8,24-디엔-3α-올, 우르스-12-엔-3α-올 및 귀올을 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 마커들의 백분율을 표시하여 BNRE의 조성을 얻은 후, BNRE의 다른 샘플과의 비교를 위해 상기 조성을 사용하는 단계.

본 발명의 또다른 태양에서, 상기 AKBA가 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)를 포함하는 상승적인 항-염증 조성물은, 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 또는 영양학적으로 또는 식이적으로 허용가능한 부형제(들) 또는 희석제 또는 염(들) 또는 첨가제(들)을 함유한다.

본 발명의 또 다른 구현예는 상기 상승적인 조성물의 사용방법을 제공하며, 이는 그대로 혹은 세분된 형태 및/또는 비-변형된 형태이거나, 과립 또는 분말 또는 페이스트이거나, 혹은 상기 활성성분들은 생물학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 염(들) 또는 첨가제(들) 또는 부형제(들)을 첨가하여 고체, 반-고체 또는 액체 투여 형태로 제제화된다.

다른 구현예에서, 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 신규의 조성물은 대상자 또는 환자에게 경구적으로, 국소적으로, 경피로, 비-경구적으로, 또는 키트의 형태와 같은, 특정 투여 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 제제화를 위한 특정 투여 형태는 정제, 연질 캡슐제, 경질 캡슐제, 환제, 과립제, 산제, 주입 용액제, 주사용액제, 크림, 겔, 과립제, 에멀젼, 연고제, 관장제, 약용팩, 식품 보조제, 에멀젼, 현탁제, 시럽, 펠렛, 흡입제, 구강 스프레이 등과 같은 경구용제; 및 주사제, 점적제(drops), 좌제 등과 같은 비경구용제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예는 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 추출물 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)의 조성물(들)을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 염증 및 천식, 관절염 및 동맥경화증을 포함하나 이에 제한하지 않는 염증 증상의 조절, 예방 및 치료를 위한 조성물(들)의 사용 설명서(instructions)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 조성물은 유효한 양의 하나 이상의 약학적 또는 영양학적 또는 식이적으로 허용가능한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 물질은 항산화제(들), 아답토겐(들)(adaptogen(s)), 항-염증제(들), 항-당뇨제(들), 항-비만제(들), 항-동맥경화제(들), 바이오-보호제 및/또는 생체이용율 증진제(들) 및 미량 금속 또는 부형제(들) 또는 약학적으로 허용가능한 염(들) 또는 첨가제(들)을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 또한 상기 조성물 또는 이들의 혼합물은 상기에서 기술된 방법을 사용하여 투여되는 제제(들)을 형성할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 약학적으로 허용가능한 항-염증제의 예는 프레드니솔론, 히드로코르티손, 메토트렉세이트, 설파살라진, 나프록센, 디클로페낙 및 이부프로펜을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 상기 생물학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 계면활성제, 부형제, 결합제, 희석제, 붕해제, 활택제, 보존제, 안정화제, 완충제, 현탁제 및 약물 송달 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

고체 담체 또는 희석제 또는 부형제의 바람직한 예는 글루코오즈, 프럭토오즈, 수크로오즈, 말토오즈, 황색 덱스트린, 백색 덱스트린, 에어로졸, 미결정 셀룰로오즈, 칼슘 스테아레이트, 마스네슘 스테아레이트, 소르비톨, 스테비오사이드, 옥수수 시럽, 락토오즈, 구연산, 타르타르산, 말산, 숙신산, 젖산, L-아스코르브산, dl-알파-토코페롤, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 글리세린 지방 에스테르, 폴리 글리세린 지방 에스테르, 수크로오즈 지방 에스테르, 소르비탄 지방 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방 에스테르, 아카시아, 카라기난, 카제인, 젤라틴, 펙틴, 아가, 비타민 B군, 니코틴아미드, 칼슘 판토테네이트, 아미노산, 칼슘염, 착색제(pigments), 향료(flavors), 및 보존제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

액체 담체(희석제)의 바람직한 예는 증류수, 식염수, 포도당 수용액, 알코올(예를 들어, 에탄올), 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜; 및 다양한 동물성 및 식물성 오일과 같은 오일성 담체, 백색 연질 파라핀(white soft paraffin), 파라핀, 및 왁스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또다른 태양에서, 본 발명의 조성물은 나노기술, 마이크로캡슐화, 콜로이드 담체 시스템 및 기타 공지의 약물 송달 시스템을 포함한 기술에 의해 방출 제어 고분자계 코팅을 사용하여 방출 제어 정제의 형태로 송달된다. 상기 제제는 1일 1회 투여 혹은 1일 다중 투여를 위하여 설계될 수 있다.

본 발명에 따라, 본 발명의 조성물은 또한 시리얼, 유아용 식품(들), 쵸콜렛 또는 영양 바와 같은 고형 식품, 크림 또는 잼, 또는 겔과 같은 반고형 식품, 청량 음료, 커피, 차, 우유-함유 음료, 유제품, 젖산 박테리아 음료, 스프, 드롭(drop), 사탕, 츄잉 껌, 쵸콜렛, 점착성 사탕, 요거트, 아이스크림, 푸딩, 소프트 팥 젤리, 젤리, 쿠키, 베이커리 제품 등과 같은 기존의 또는 새로운 식품 및 음료 형태(들)로 제제화되거나 첨가될 수 있다. 이러한 다양한 조성물 또는 제제 또는 식품 및 음료는 염증 및/또는 천식, 관절염, 염증성 장질환, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선 관절염, 골관절염, 불응성 류마티스 관절염, 만성 비-류마티스성 관절염, 골다공증/골 재흡수, 관상동맥질환(coronary heart disease), 동맥경화증, 맥관염, 궤양성 대장염, 건선, 성인 호흡 장애 증후군, 당뇨병, 대사성 질환, 피부 질환에서 지연형(delayed-type) 과민증, 알츠하이머 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않은 염증과 관련되거나 연관된 하나 이상의 질환 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 건강식품으로서 유용하다.

본 발명의 다양한 예시적인 구현예는, 인간 또는 포유동물에게 투여되거나 보조되는 본 발명의 상승적인 조성물의 양은 균일하지 않을 수 있고 제제의 성격에 따라 상이할 수 있으나, 상기 추출물 또는 분획물의 제안되는 인간 또는 동물 투여량은 바람직하게는 1일당 0.1 내지 750 mg/kg 체중의 범위, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 500 mg/kg 체중의 범위일 수 있다는 것을 제공한다.

본 발명의 또다른 구현예는, 상기에서 언급된 다양한 제제, 식품 및 음료 조성물 중에 본 발명의 조성물의 양은 균일하지 않을 수 있고 제제의 성격에 따라 상이할 수 있으나, 상기 조성물의 제안되는 인간 또는 동물 투여량은 예를 들어 약 0.001 % 내지 99 %, 더욱 바람직하게는 약 0.001 내지 90 wt%일 수 있다는 것을 제공한다.

중요한 구현예 중 하나에서, 상기 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 중의 AKBA의 농도는 10 중량% 내지 100 중량%의 범위이다.

또다른 구현예에서, 상기 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 중의 AKBA의 농도는 바람직하게는 25%-95%의 범위, 더욱 바람직하게는 25%-45%의 범위이다.

또다른 구현예에서, 상기 상승적인 조성물은 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 l0 중량% 내지 90 중량% 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 90 중량% 내지 10 중량% 를 포함할 수 있다.

또다른 구현예에서, 상기 상승적인 조성물은 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 30 중량% 내지 70 중량% 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 70 중량% 내지 30 중량% 를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 상기한 상승적인 조성물들의 어떠한 성분을 식품 또는 음료의 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 50 중량% 까지로 포함하는 건강 보조(health care) 식품 또는 음료이다.

본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 상승적인 조성물(들)의 양이 제제의 총 중량에 대하여 1 중량% 내지 100 중량%의 범위임을 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 염증 및 천식, 동맥경화증 및 관절염 등을 포함하는 몇 가지 염증과 연관되거나 관련된 질환의 치유(curing), 예방 또는 치료를 목적으로 하는 동물 사료에 사용되는 다양한 성분들과 본 발명의 조성물을 혼합하는 것을 추가로 포함한다.

동물 사료에 첨가되는 상기 조성물 또는 제제의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 그대로, 혹은 조성물(들)로서 다양한 조리 및 가공 식품에 첨가될 수 있다. 그 양은 식품의 경우 사용되는 양과 동일할 수 있다. 유사하게, 상기 성분은 또한 동물 사료를 제조하는 동안 또는 제조한 후에 첨가될 수 있다.

바람직한 구현예를 포함한 하기 실시예는 본 발명의 실시를 설명하기 위하여 제공된 것이고, 특정 사항들은 본 발명의 바람직한 구현예의 예시 및 설명적인 논의의 목적으로 나타낸 것이며, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

실시예 1

보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물( BNRE )의 제조:

보스웰리아 세라타 고무 수지(100 g)을 메틸 이소부틸 케톤(MIBK) 용매 600 mL에 분산시키고, 실온에서 60분 동안 교반하였다. 불용성 고무 물질을 여과에 의해 제거하였다. 상기 MIBK 용액을 2% KOH 용액으로 반복 추출하여(3 x 200 mL) 산성 화합물을 제거하였다. 상기 MIBK 층을 물(400 mL) 및 소금물(200 mL)로 연속하여 세척하였다. 상기 MIBK 층을 60 - 7O℃에서 감압하에 증발시키고, 75 - 85℃에서 진공하에서 오일성 잔사로부터 휘발성 성분을 제거하여 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물 즉 BNRE를 점성 오일로서 얻었다(12 g).

선택적으로, 보스웰리아 세라타로부터 채취한 상기 고무 수지(250 g)를 메탄올로 추출하고(300 mL x 3), 메탄올 추출물을 모아 농축하였다. 상기 잔사(50 g)를 에틸 아세테이트(400 mL)에 용해시키고, 2N KOH로 3회 추출하였다(3 x 100 mL). 유기층을 물(2 x 200 mL) 및 소금물(200 mL)로 세척하고, 증발시켜 보스웰리아 오일을 얻었다. 75 - 85℃에서 진공하에서 상기 오일로부터 휘발성 화합물을 증발시켜 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 22 g을 얻었다.

상기 BNRE에 대하여 정상(normal) 실리카 겔 상에서의 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. TLC에 근거하여 동일한 분획물들을 모으고, 모아진 분획물들을 각각 용리제로서 헥산/에틸 아세테이트 또는 헥산/아세톤의 혼합물을 사용하여 실리카 겔 상에서 반복적으로 컬럼하여 순수한 화합물들을 얻었다. 일부의 불순한(impure) 분획물들에 대하여 역상 C18 실리카 컬럼을 사용한 분취용(preparative) HPLC를 수행하여 순수한 화합물들을 얻었다. 구조는 ¹ H NMR, ¹³ C NMR, DEPT, HSQC 및 HMBC 및 질량 스펙트럼 데이타를 분석한 후 공지 화합물의 데이타와 비교하여, 결정하였다. 도 1에 도시한 바와 같이, 9개의 주요한(prominent) 화합물이 귀올(guiol)(1), 네프텐올(nephthenol)(2), 세라톨(serratol)(3), 디테르펜 X(diterpene X)(4), 루페올(lupeol)(5), 올린-12-엔-3β-올(olean-12-ene-3β-ol)(6), 올린-12-엔-3α-올(olean-12-ene-3α-ol)(7), 라노스타-8,24-디엔-3α-올(lanosta-8,24-diene-3α-ol)(8) 및 우르스-12-엔-3α-올(urs-12-ene-3α-ol)(9)로서 동정되었다. HPLC 방법을 사용하여 상기 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 표준화하기 위하여, 상기 순수한 화합물들을 사용하였다. HPLC 분석 방법 및 체류시간(retention times, R _t )에 근거하여 측정된 BNRE의 신규 조성을 표 1에 요약하고, HPLC 크로마토그램을 도 2에 도시하였다.

보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)의 분석을 위한 HPLC 방법

실시예 2

보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물( BNRE )의 동정 방법:

BNRE의 동정 방법은 하기의 HPLC 방법을 사용하여 BNRE의 주요 화합물들을 포함하는 그 조성의 측정을 포함한다. 용매 구배는 표 2에 요약된다. 각각의 마커 화합물들의 기지량을 개별적으로 분석하고, 각각의 표준 화합물에 대한 체류시간 및 피크 면적을 기록한다. 기지량의 BNRE 샘플을 유사한 조건에서 분석하고, 샘플 중의 피크의 체류시간을 표준물질의 체류시간과 비교하여 각각의 마커를 동정하고, 또한 상기 샘플을 각각의 마커와 함께 동시에 주입하여 동정하였다. 아래에 나타낸 바와 같이 기지 농도에서의 상기 표준 화합물에 대응하는 피크 면적과 샘플의 피크 면적을 비교하여, 샘플 중 각각의 마커의 백분율을 측정하였다. BNRE의 조성을 표 3에 요약한다.

HPLC 조건:

컬럼: 페노메넥스 루나 페닐-헥실(Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl), (4.6 x 250mm) 5μ

파장: 248 및 210 nm

유속: 1.50 mL/min

주입량: 20㎕

온도: 30 ℃

시스템: 구배(Gradient)

이동상 : 펌프 A: 0.1%v/v 오르토인산 수용액

펌프 B: 아세토니트릴

여기서, 0.1%v/v 오르토인산 수용액은 오르토인산(Ortho phosphoric acid) 1 mL를 물로 1000 ml까지 희석하여 조제한다.

표준물질: BNRE의 주요 화합물들을 마커로 선택하고, 분리 기술을 조합 사용하여 > 98% 순도로 이를 단리하였다. 이렇게 얻어진 순수한 표준물질들은 스펙트럼 데이터를 조합 사용하여, 귀올(1), 네프텐올(2), 세라톨(3), 디테르펜 X(4), 루페올(5), 올린-12-엔-3β-올(6), 올린-12-엔-3α-올(7), 라노스타-8,24-디엔-3α-올(8) 및 우르스-12-엔-3α-올(9)로 완전히 특징분석되었다.

표준물질 제조:

50 ml-용량 플라스크에 내부 표준 샘플(In house reference sample) 약 10.0 mg을 정확하게 칭량하여, 메탄올로 용해시켜 용량으로 제조한다.

샘플 제조:

50 ml-용량 플라스크에 샘플 약 250.0 mg을 정확하게 칭량하여, 메탄올로 용해시켜 용량으로 제조한다.

과정:

0.45μ 멤브레인 필터를 통해 상기 표준물질 및 샘플 용액을 여과하고, 주입한다.

계산:

실시예 3

10-100% AKBA로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물의 제조:

적정법에 의해 85% 총 보스웰산으로 표준화되고 3% 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)을 포함하는 상업적으로 이용가능한 보스웰리아 세라타 추출물을 10 내지 100% 까지 AKBA의 선택적인 풍부화를 위한 제조에 사용하였다. 상기 혼합물은 HPLC 분석방법에 의할 때 총 β-보스웰산[3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산, β-보스웰산, 3-O-아세틸-β-보스웰산, 11-케토-β-보스웰산, 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산]을 45 - 50% 범위로 함유한다. 2002년 3월 5일자로 출원된 PCT 출원 제PCT/IN02/00034호 및 2005년 3월 7일자로 출원된 PCT 출원 제PCT/IN05/000074호에 기술된 방법 중 하나를 사용하여, 상기 혼합물을 35-45% AKBA를 함유하도록 선택적으로 풍부화시켰다. 크로마토그래피 단계 또는 결정화 또는 이들 모두를 상기 풍부화 방법에 추가함으로써, 45 - 100% AKBA로 추가로 풍부화시켰다. 35-100% 범위로 AKBA를 갖는 풍부화된 추출물을 부형제, 바람직하게는 백색 덱스트린으로 희석하여 10-35%의 3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)을 함유하는 풍부화된 추출물을 제조하였다. 30% AKBA로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%)이 본 발명에서 사용된다.

실시예 4

조성물-1: 하기 성분들의 단위 용량을 혼합하여 조성물-1을 제조하였다: 30% AKBA로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%) 1 부(one part)(1 g) 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 1 부(1 g).

실시예 5

조성물-2: 하기 성분들의 단위 용량을 혼합하여 조성물-2를 제조하였다: 30% AKBA로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%) 2 부(two parts)(2 g) 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 1 부(1 g).

실시예 6

조성물-3: 하기 성분들의 단위 용량을 혼합하여 조성물-3을 제조하였다: 30% AKBA로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%) 1 부(1 g) 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 2 부(2 g).

실시예 7

조성물-4: 하기 성분들의 단위 용량을 혼합하여 조성물-4를 제조하였다: 40% AKBA로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE40%) 3 부(three parts)(3 g) 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 2 부(2 g), 및 백색 덱스트린 1부(1 g).

실시예 8

30% AKBA로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물(BE30%)에 의한 5-LOX 및 FLAP의 억제:

아라키돈산 매개 염증 경로의 핵심 중간 단백질들에 대한 BE30%의 효과를 LPS로 유도된-THP-1 인간-단핵구-대식세포 중에서 시험관 내로 평가하였다. 즉, THP-1 인간-단핵구 대식세포를 BE30% 10 μg/ml로 1 시간 동안 전처리한 후, 상기 세포를 LPS로 2시간 동안 처리하여 염증 반응을 유도하였다. 세포 단백질들은 세포 용해 완충액으로 추출하였고, 면역-웨스턴 블롯을 수행하여 5-리폭시게나아제(5-LOX) 및 FLAP 발현의 조절을 검출하였다. 도 3에 요약한 바와 같이, BE30%는 LPS로 유도된-THP-1 인간-단핵구-대식세포 중에서 5-LOX 및 FLAP 발현을 유의성 있게 억제하였다.

실시예 9:

보스웰리아 추출물 30% AKBA(BE30%), 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물( BNRE ) 및 조성물-2의 5- 리폭시게나아제 억제 활성:

레드다나 등(Reddanna et. al., Methods of Enzymology, Vol 187, 268-277, 1990)에 의해 변형시킨 셰웨(Schewe) 등의 방법(Adv Enzymol, Vol 58, 191-272, 1986)을 사용하여 5-리폭시게나아제 효소 억제 활성을 측정하였다. 상기 분석 혼합물은 50mM 인산 완충액(pH 6.3) 중 리놀레산 80 μM 및 충분한 양의 감자 5-리폭시게나아제를 함유하였다. 상기 반응은 효소 완충액 혼합물을 리놀레산에 첨가함으로써 개시시켰고, 효소 활성을 234nm에서 흡광도 증가로서 모니터하였다. 상기 반응은 120초 동안 모니터하였고, 상기 리놀레산 첨가 2분전에 다양한 농도의 시험 물질을 인큐베이션하여 시험 물질인 BE30%, BNRE 및 조성물-2의 억제 능력을 측정하였다. 모든 분석은 3회 수행하였다. 퍼센트 억제는 시험물질에 대하여 얻어진 커브의 기울기를 대조군의 커브의 기울기와 비교하여 계산하였다. BE30%, BNRE 및 조성물-1의 퍼센트 억제를 표 4에 요약하며, 도 4에 도시한다.

실시예 10

보스웰리아 세라타 추출물 30% AKBA(BE30%), 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물( BNRE ) 및 조성물-2에 의한 매트릭스 메탈로프로티나아제-3( MMP -3) 생성의 억제:

TNFα로 유도된 SW982 인간 윤활막 세포에서 MMP-3를 평가하였다. 즉, SW982 세포를 2mM 글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신 및 10% 우태아혈청(Hyclone, Logan, UT)과 함께 DMEM에서 배양하였다. 시험 하루 전에 웰당 5천개의 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트(Corning, USA)에 접종하였다. 배양 배지를 1% 우태아혈청을 함유하는 새로운 DMEM으로 교체하였다. 보스웰리아 추출물 30% AKBA(BE30%), 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 및 조성물-2를 5 내지 100 ng/ml의 범위로 차례로 배지에 희석하고 2 시간 동안 37℃에서 5% CO ₂ 에서 세포와 함께 전-배양한 후, 10 ng/ml 인간 재조합 TNFα(R&D System, Minneapolis, MN)로 24시간 동안 자극하였다. 배양 상등액을 수확하고, ELISA 전개 키트(ELISA development kit)(R&D System, Minneapolis, MN)로 MMP-3 생성을 측정하기 위하여 사용하였다. 기지 농도의 MMP-3로부터 얻어진 표준 곡선에 광학 밀도(optical densities)를 대입하여, 세포가 없는(cell free) 배양 상등액 중의 MMP-3 농도를 정량적으로 측정하였다. 농도에 대한 퍼센트 억제를 도시하여 구축된 곡선(plot)으로부터 MMP-3의 50% 억제를 위한 억제 농도(IC ₅₀ )를 계산하였다. BE30%, BNRE 및 조성물-2는 각각 58.75, 119.32, 및 46.78 ㎍/mL의 IC ₅₀ 값을 나타내었다. 이들의 억제 비교를 도 5에 도시한다.

실시예 11

3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 30%로 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 추출물 즉 BE30% 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물( BNRE )을 각각 1:1 및 2:1 비율로 포함하는 조성물-1 및 조성물-2의 상승적인 생체내 항-염증 활성:

3-O-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA)이 30%로 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 추출물(5-Loxin) 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)을 각각 1:1 및 2:1 비율로 포함하는 조성물-1 및 조성물-2의 항-염증 효능을 프로인트 완전 아주반트(Freund's complete adjuvant)로 유도된 스파라그 도울리 랫트의 관절염 모델에서 생체 내 시험으로 평가하였다. 랫트의 성별은 무작위적으로 선택하였고, 각 군에 5 마리씩 5개의 군으로 나누었다. 시험군의 랫트를 30% AKBA로 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 추출물(BE30%) 또는 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE) 또는 BE30% 및 BNRE를 각각 1:1 및 2:1로 함유하는 조성물-1 또는 조성물-2로, 100 mg/kg체중으로, 14일 동안 처리하였다. 양성 대조군은 프레드니솔론을 10 mg/kg체중으로 처리하였다. 모든 처리는 투여를 위하여 1% CMC 10 mL로 희석하였다. 대조군 동물은 동일한 용적의 1% CMC를 처리하였다. 14일 째에, 프로인트 완전 아주반트(FCA)를 각각의 동물의 왼쪽 뒷발의 아래 발바닥 부위에 피하 주사하였다. 시험 종료시에, 상기 동물을 치사시키고, 간 조직 샘플을 잘라내어 -8O ℃에서 분할하여(in aliquot) 보관하였다. 각각의 동물로부터 일정한 간격으로 혈액 샘플을 채취하고, 발 체적을 FCA 주사 당일 및 FCA 접종 13일 후에 체적 변동 기록계(Plethysmography) 장치로 측정하였다. FCA 주사 당일 및 FCA 접종 13일 후에서의 부종의 체적 차이는 염증 반응으로 간주된다. BE30%, BNRE, 조성물-1, 조성물-2 및 프레드니솔론의 생체 내 항-염증 반응은 CMC 처리된 대조군과 비교하였을 때 발 부종 억제 퍼센트를 계산하여 평가하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 프레드니솔론으로 처리된 시험군에 의해 나타난 53% 억제와 비교할 때, 30% AKBA로 선택적으로 풍부화된 보스웰리아 세라타 추출물 (BE30%) 및 보스웰리아 세라타의 비-산성 수지 추출물(BNRE)로 처리된 시험군은 각각 발 부종에 있어서 37% 및 10% 감소를 달성했다. 그러나, 동일한 용량 수준으로 조성물-1 및 조성물-2로 처리된 시험군은 도 6에 나타낸 바와 같이, 발 체적에 있어서 각각 44% 및 54% 감소를 나타냈다. 바이오마커인 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 및 인터루킨-1베타(IL-lβ)의 평가에 의해 상승적인 효능이 추가로 입증되었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 조성물-1 및 조성물-2로 처리된 시험군은 BE30% 및 BNRE 개개의 성분으로 처리된 시험군에 의해 나타난 수준에 비하여, 혈청 바이오 마커인 TNF-α 및 IL-lβ에 있어서 유의성 있게 우수한 감소를 나타냈다.

광범위한 본 발명의 개념으로부터 벗어남이 없이, 상술한 구현예에 변경이 가해질 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 그러므로, 본 발명은 특정 구현예 또는 개시된 실시예에 제한되지 않고, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 목적 및 범위 내에서의 변경을 포함하도록 의도되는 것으로 이해된다.