编码禽类细胞因子的减毒溶瘤性副粘病毒
阅读：830发布：2024-01-10
专利汇可以提供编码禽类细胞因子的减毒溶瘤性副粘病毒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于 治疗 增生性 疾病 的重组溶瘤性RNA新城疫病毒，其包含至少一种编码禽类细胞因子的转基因，其中该重组溶瘤性RNA新城疫病毒可从强毒 力 或中等 毒力 溶瘤性RNA新城疫病毒获得。病毒介导的该细胞因子在天然宿主细胞中的表达导致该病毒对禽类物种的致病性降低。另外，该病毒基因组可以编码结合蛋白、前体药物转化酶或/和蛋白酶。这些分子在病毒所感染的 肿瘤 细胞中的选择性表达增加该病毒的抗肿瘤作用。，下面是编码禽类细胞因子的减毒溶瘤性副粘病毒专利的具体信息内容。
1.重组溶瘤性RNA新城疫病毒，其包含至少一种编码禽类细胞因子的转基因，其中该重组溶瘤性RNA新城疫病毒可从强毒力或中等毒力溶瘤性RNA新城疫病毒获得。
2.权利要求1的病毒，包含至少一种其它转基因，所述至少一种其它转基因当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性。
3.权利要求2的病毒，其中所述至少一种其它转基因对宿主而言是部分同种异基因的或部分同基因的。
4.权利要求1至3任一项的病毒，其中该病毒对禽类物种的致病性是降低的。
5.权利要求4的病毒，其中该病毒对禽类物种的致病性相对于可自其获得该重组病毒的病毒而言是降低的。
6.权利要求4或5的病毒，其中禽类物种选自家禽。
7.权利要求4至6任一项的病毒，其中禽类物种是鸡。
8.权利要求1至7任一项的病毒，其为禽类病原体，尤其是家禽病原体，更具体是鸡病原体。
9.权利要求1至8任一项的病毒，其可从中等毒力毒株MTH6获得。
10.权利要求1至9任一项的病毒，其中所述至少一种其它转基因编码当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的结合蛋白。
11.权利要求10的病毒，其中所述结合蛋白选自以下由天然配体、遗传学修饰的配体、天然受体的重组可溶性结构域及其修饰形式、肽配体、多肽配体、抗体分子及其片段和衍生物和抗体样分子如锚蛋白重复区蛋白及其片段和衍生物组成的组。
12.权利要求10或11的病毒，其中结合蛋白来自哺乳动物例如人、鼠或密切相关来源或是嵌合蛋白。
13.权利要求10至12任一项的病毒，其中结合蛋白是单体、二聚体、三聚体、四聚体或多聚体蛋白。
14.权利要求10至13任一项的病毒，其中结合蛋白是单特异性、双特异性或多特异性的。
15.权利要求10至14任一项的病毒，其中结合蛋白是包含至少一个结合结构域和至少一个异源结构域的融合蛋白。
16.权利要求15的病毒，其中结合蛋白是包含毒素如人RNA酶(假单胞菌外毒素、白喉毒素)的融合蛋白或包含酶如β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、羧肽酶、β-内酰胺酶的融合蛋白或包含具有细胞因子活性的免疫刺激蛋白如IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-β或GM-CSF的融合蛋白。
17.权利要求10至16任一项的病毒，其中结合蛋白选自由以下蛋白组成的组：自主活性生长因子受体(例如EGFR、Met)的阻断蛋白、生长因子的竞争性结合蛋白(拮抗物)、Rb-磷酸化的阻断蛋白、E2F依赖性转录的阻断蛋白；p53的稳定蛋白；抗凋亡蛋白(例如Bcl-2)的拮抗性结合蛋白；细胞周期蛋白的拮抗性结合蛋白；Ras效应物(例如GEF)的拮抗性结合蛋白；低氧诱导蛋白(例如HIF1α)的拮抗性结合蛋白；干扰二聚化、DNA结合或/和辅因子结合的转录因子(例如Myc/Max)抑制物；分化诱导蛋白；smad信号传导/转位抑制物；细胞黏着相互作用(钙黏着蛋白、整联蛋白、例如α5β1、αvβ3)的抑制物；降解胞外基质的酶(例如MMP)的抑制物；促血管生成配体(例如可溶性VEGF-R)的拮抗性结合蛋白；针对促血管生成受体的拮抗性结合蛋白；支架复合体形成(例如KSR/Ras)的抑制物；翻译起始(例如eIF4E、EIF2a)的抑制物；和有丝分裂激酶(例如Plk-1)的抑制物。
18.权利要求1至9任一项的病毒，其中所述至少一种其它转基因编码当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的前体药物转化酶。
19.权利要求1至9任一项的病毒，其中所述至少一种其它转基因编码当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的蛋白酶。
20.前述权利要求任一项的病毒，其中所述编码禽类细胞因子的至少一种转基因选自鸡干扰素。
21.权利要求20的病毒，其中所述编码禽类细胞因子的至少一种转基因选自鸡I型干扰素。
22.权利要求5至21任一项的病毒，其中致病性降低是指病毒导致鸟细胞裂解的能力降低，这是在以MOI 0.01的病毒感染细胞后约48小时通过细胞活力的增加而测量到的，其中相对于自其可获得所述重组病毒的病毒而言，细胞活力增加到至少约25％直至约50％的存活细胞，更优选地到至少约50％直至约75％的存活细胞，和最优选地到至少约75％直至到100％的存活细胞。
23.权利要求5至21任一项的病毒，其中致病性降低是指通过测定平均死亡时间(MDT)而测量到的11日龄含胚卵中的被病毒感染的鸡胚的存活时间延长，其中与自其可获得所述重组病毒的病毒相比，MDT延长达至少约15小时直至约20小时，更优选地至少约20小时直至约30小时，和最优选地多于30小时。
24.权利要求1至23任一项的病毒，其中所述病毒对人肿瘤细胞的溶瘤活性基本上不降低。
25.权利要求1至23任一项的病毒，其中与自其可获得所述重组病毒的病毒相比，通过感染48小时后细胞活力而测量到的所述病毒对人肿瘤细胞的溶瘤活性降低不超过50％，并且更优选地，相对于自其可获得所述重组病毒的病毒而言，基本上不降低。
26.权利要求1-25任一项的重组溶瘤性RNA病毒的核衣壳。
27.权利要求1-25任一项的重组溶瘤性RNA病毒的基因组。
28.编码权利要求1-25任一项的重组溶瘤性RNA病毒的基因组和/或反基因组的DNA分子。
29.权利要求27的DNA分子，其与转录调控序列可操纵连接。
30.细胞，其包含权利要求1-25任一项的重组溶瘤性病毒、权利要求27的病毒基因组或/和权利要求28或29的DNA分子。
31.药物组合物，其包含权利要求1-25任一项的重组溶瘤性病毒、权利要求27的病毒基因组或/和权利要求28或29的DNA分子作为有效成分，任选地与可药用载体、稀释剂和/或辅药在一起。
32.权利要求31的药物组合物，还包含可以由至少一种其它转基因所编码的前体药物转化酶转化成治疗活性化合物的前体药物。
33.用于治疗增生性疾病的方法，包含给有需要的对象施用药物有效量的权利要求
1-25任一项的重组溶瘤性病毒、权利要求27的病毒基因组或/和权利要求28或29的DNA分子。
34.权利要求33的方法，包含给有需要的对象施用药物有效量的以下物质(i)包含至少一种编码前体药物转化酶的转基因的权利要求1-25任一项的重组溶瘤性病毒、权利要求27的病毒基因组或/和权利要求28或29的DNA分子，和
(ii)适合与该病毒联合治疗增生性疾病的前体药物，该前体药物可以由(i)的前体药物转化酶转化成药学活性化合物。
35.权利要求33至34任一项的方法，其中对象是人患者。
36.对家禽减毒的重组溶瘤性RNA病毒，其包含含有至少一种编码细胞因子的转基因的核酸。
37.权利要求36的病毒，其对鸡是减毒的。
编码禽类细胞因子的减毒溶瘤性副粘病毒
[0001] 简介
[0002] 本发明涉及包含至少一种编码禽类细胞因子的转基因的重组溶瘤性RNA新城疫病毒，其中该重组溶瘤性RNA新城疫病毒可从强毒力或中等毒力的溶瘤性RNA新城疫病毒获得。在天然宿主细胞中，病毒介导的细胞因子表达导致该病毒对禽类物种的致病性降低。
[0003] 本发明中的病毒适于治疗疾病，尤其适于溶瘤性肿瘤疗法。产生了编码禽类细胞因子的重组病毒，其中该病毒的致病性对禽类物种降低，从而导致该病毒的环境毒性降低。该病毒的溶瘤活性不因所述降低致病性的方法受损。病毒基因组可以编码额外的治疗性转基因，优选地是结合蛋白(抗体、锚蛋白重复序列分子、肽等)。这些结合蛋白、前体药物转化酶和/或蛋白酶的活性提高该病毒的抗肿瘤作用。另外，本发明公开了如此修饰的病毒的制备及其用于治疗癌症用途。
背景技术
[0004] 新城疫病毒
[0005] 在Chiocca(2002)中综述了通常用于治疗肿瘤的溶瘤性病毒。新城疫病毒(NDV)已经作为实验性治疗剂使用超过40年，见Sinkovics和Horvath(2000)综述。新城疫病毒通常在Alexander(1988)的书籍中描述。正在将NDV毒株PV701开发为针对成胶质细胞瘤的抗癌疗法(Lorence等人，2003)。NDV毒株MTH68已经作为实验性癌症疗法使用并且已经施用至人超过30年(Csatary等人，2004)。
[0006] 在Stojdl等人(2003)的论文中，描述了用水泡性口炎病毒(VSV)感染后，在80％全部所测试肿瘤细胞系的范围内存在干扰素应答缺陷。可以假定相似百分数的肿瘤细胞系将易感于NDV感染，因为VSV和NDV均是单股负链RNA病毒目的成员。也已经显示NDV在肿瘤细胞中的选择性复制机制基于针对病毒的细胞干扰素应答的缺陷(见例如US：
20030044384)。
20030044384)。
[0007] 副粘病毒含有负极性的单链RNA基因组，具有长度15-19kb的基因组(野生型)并且基因组含有6-10种基因。病毒包膜由表面糖蛋白和从宿主细胞衍生的膜部分形成。表面糖蛋白(F和HN或H或G)介导病毒进入和从宿主细胞离开。核衣壳位于包膜内并含有RNA基因组和负责细胞间病毒转录和复制的核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)。基质蛋白(M)连接病毒包膜和核衣壳。除了编码结构蛋白的这些基因，副粘病毒科病毒可以含有“附属”基因，所述附属基因可以是与上文所提及的基因一起分布的额外转录单位。所述附属基因大多是与P基因转录单位重叠的ORF。可以在(Lamb，2001)中找到对副粘病毒科的广泛描述。
[0008] NDV是属于单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)的副粘病毒科(Paramyxoviridae)中禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的原型成员。
[0009] 病毒基因组是编码以下6种主要蛋白质单链负股RNA：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(HN)和聚合酶蛋白(L)。通过P蛋白mRNA的编辑作用，翻译出一种或两种额外蛋白质V(和W)。
[0010] NDV在Alexander(1988)和Lamb(2001)中详细表征。
[0011] 作为禽类病原体的新城疫病毒
[0012] NDV毒株根据它们对鸡的致病性分类为导致全部年龄鸡急性致死性感染的强毒株(高度毒力)、仅在幼鸡中有致死性的中等毒力分离株(中间毒力)和表现为温和或不明显疾病形式的轻型毒株(无毒力)。NDV分离株的强毒、中毒和低毒分类由杀死胚的最小致死剂量接种后9日龄含胚卵中鸡胚的平均死亡时间(MDT)决定。NDV毒力的决定因素之一似乎是前体F蛋白的切割位点。
[0013] 1926年在英格兰泰恩河畔新城和在印度尼西亚爪哇观察到首次NDV暴发。自从本病首次首先以来已经描述了3次NDV大流行。
[0014] NDV主要通过易感鸟类所吸入的气溶胶或大液滴传播。感染期间，新的感染性病毒颗粒将从感染的呼吸道撒播或在粪便中分泌出来。新感染可以因健康鸟类摄取这种含病毒物质而建立并且可以维持从一只鸟至另一只鸟的病毒传播。
[0015] 在Alexander(1997)，Diseases of Poultry中详细描述了作为禽类病原体的NDV。
[0016] 新城疫免疫接种
[0017] 在上世纪伊始已经将NDV视为家禽场的威胁并且认识到需要免疫接种。Iyer和Dobson在二十世纪三十年代开展强毒NDV毒株减毒的研究，导致开发一些中等毒力NDV疫苗株。活疫苗开发因建立低毒力疫苗株Hitchner B1和LaSota而向前进展，所述疫苗株现在是广泛使用的NDV疫苗。其他免疫接种策略包括使用连同载体佐剂(氢氧化铝、油乳剂)一起给予的(例如通过福尔马林、β-丙内酯)灭活的NDV疫苗。
[0018] 在Alexander(1997)Diseases of Poultry中详细描述了NDV疫苗开发的历史和实际状态。
[0020] US 6,699,479B1描述了以降低的水平表达其V蛋白并且用于免疫接种孵化前胚的新城疫病毒(NDV)突变体。
[0021] US 2004/0043035涉及不能表达核蛋白(NP)的免疫优势表位并适合作为标记疫苗株的重组NDV突变体。
[0022] US 2003/0224017描述了用于产生重组NDV疫苗的NDV反向遗传系统。该系统允许表达转基因例如来自NDV基因组的禽类细胞因子(鸡IL-2、鸡IL-4)以产生NDV疫苗株。
[0023] EP 1 300 157涉及适合用于卵内(in ovo)免疫接种禽类物种的减毒突变新城疫病毒毒株，该毒株在编码HN和/或F糖蛋白的基因序列中包含突变。
[0024] US 6,719,979涉及用于完全从克隆的全长cDNA产生感染性新城疫病毒(NDV)的方法并涉及以该方法产生和从该方法衍生的疫苗及诊断测定法的用途。
[0025] WO 2007/025431描述了用于产生重组减毒的新城疫La Sota毒株的方法及其在制备用于预防由新城疫病毒(NDV)所致疾病的疫苗中的用途。
[0026] WO 2000/067786涉及用于制备减毒的感染性新城疫病毒(NDV)的cDNA。包含减毒感染性NDV的疫苗处在本发明的范围内。
[0027] 重组副粘病毒
[0028] EP-A-0 702 085涉及遗传学操作的感染性复制型不分节段的负链RNA病毒突变体，所述突变体包含在病毒基因组的可读框、假基因区或基因间区中的插入和/或缺失。
[0029] WO 99/66045涉及从病毒基因组全长cDNA分子获得的遗传修饰的NDV病毒。
[0030] WO 00/62735涉及肿瘤治疗方法，其包括施用干扰素敏感的有复制能力的克隆性RNA病毒，例如NDV。
[0031] 在WO 01/20989(PCT/US00/26116)中，描述了用重组溶瘤性副粘病毒治疗患有肿瘤的患者的方法。肿瘤因施用有复制能力的副粘病毒科病毒而缩小。描述了可以用来工程化病毒基因组以改善溶瘤属性的多种方法。
[0032] WO 03/005964涉及了包含编码细胞因子的核酸的重组VSV。
[0033] US 2004/0170607涉及通过施用病毒治疗黑素瘤，其中所述病毒不是常见的人病原体。
[0034] NDV的遗传学操作
[0035] NDV可以使用如例如EP-A-0 702 085中所述的反向遗传学技术进行遗传学操作。例如，已知产生了包含额外核酸的重组NDV构建体，其中所述的额外核酸编码分泌性碱性磷酸酶(Zhao和Peeters，2003)、绿色荧光蛋白(Engel-Herbert等人，2003)、传染性法氏囊病病毒VP2蛋白(Huang等人，2004)、流感病毒血凝素(Nakaya等人，2001)和霉素乙酰基转移酶(Huang等人，2001)(Krishnamurthy等人，2000)。这些重组NDV没有一个构建用于治疗人疾病。产生重组NDV以研究NDV的基础病毒学或开发家禽用疫苗株。NDV的轻型毒株充当亲代病毒毒株。这些毒株不具有明显的溶瘤属性。
[0036] 病毒的遗传学操作
[0037] 如上所述，用于遗传学操作RNA病毒的方法是熟知的。另外，溶瘤性病毒的遗传学操作例如在Bell等人(2002)中综述。在Russell(2002)中综述了作为病毒治疗剂的RNA病毒。这些文件中任意文件的内容通过引用的方式并入本文。
[0038] 禽类细胞因子
[0039] 禽类细胞因子在Staeheli等人(2001)中综述。在Kaiser等人(2005)中描述鸡细胞因子和趋化因子的基因组分析。
[0040] 发明简述
[0041] 自六十年代早期以来，已经将溶瘤性NDV毒株作为肿瘤治疗剂研究。用于溶瘤疗法的大部分病毒毒株属于被描述为家禽病原体的中等毒力病毒类型。为开发溶瘤性NDV作为抗肿瘤生物药物，应当降低存在的潜在环境毒性，对家禽的致病性。然而，对家禽减毒的NDV必须具有持续的裂解肿瘤细胞的能力并维持其溶瘤潜力。不能应用现有的疫苗开发策略，因为它们注重于通过采用完全灭活的病毒颗粒或非致病性低毒力病毒毒株刺激鸟免疫系统。两种疫苗类型均不再能够于癌细胞中复制并且因而已经丧失裂解肿瘤细胞的潜力。
[0042] 在本发明中，可以借助反向遗传学技术实现NDV对家禽减毒，同时不削弱该病毒的溶瘤活性。通过插入编码细胞因子、尤其抗病毒或免疫刺激性细胞因子的转基因产生重组减毒NDV。
[0043] 此外，NDV疫苗不适合这种方法，因为疫苗的目的是诱导伴有长期持续免疫力的强烈免疫应答以保护动物免遭继发感染。在本发明中，所描述的NDV减毒具有以下主要目标：使得动物控制(不希望的)原发感染并因而在治疗增生性疾病中应用时减少病毒的环境毒性和提高其安全性。
[0044] 本发明的主题是通过溶瘤性病毒裂解肿瘤细胞。这种溶瘤性病毒方法的适应证是人类中的癌症治疗。相反，如US 2003/0224017中公开的家禽用NDV疫苗应用于动物并且因而属于动物健康护理领域。
[0045] 因而，本发明的目的是包含至少一种编码禽类细胞因子的转基因的重组溶瘤性RNA新城疫病毒，其中该重组溶瘤性RNA新城疫病毒可从强毒力或中等毒力的溶瘤性RNA新城疫病毒获得。
[0046] 本发明的病毒可以包含当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的至少一种其它转基因。
[0047] 所述至少一种其它转基因对于宿主而言是部分同种异基因的或部分同基因的。
[0048] 在本发明的另一个方面，本发明的病毒可以是减毒病毒。
[0049] “减毒”或“减毒的”包括病毒对禽类物种的致病性降低和在对于禽类物种有预测性的生物测定系统中的致病性降低(见实施例5)。
[0050] 本发明的又一方面是对家禽减毒的重组溶瘤性RNA病毒，其包含含有至少一种编码细胞因子的转基因的核酸。具体地，该病毒对鸡是减毒的。“编码细胞因子的转基因”尤其是如本文中所述的“编码禽类细胞因子的转基因”。
[0051] 另外，本发明涉及包含与衣壳蛋白复合的病毒RNA的本发明重组病毒的核衣壳。另外，本发明涉及RNA，其为本发明病毒的RNA。本发明涉及与本发明病毒的RNA互补的RNA。
[0052] 另外，本发明涉及DNA，例如编码本发明RNA的cDNA和/或与本发明RNA互补的DNA。另外，本发明涉及预防或治疗肿瘤病、癌症或/和增生性疾病。
[0053] 本发明的RNA或/和DNA可以以分离的形式提供。
[0054] 在本发明中，如本文中描述的转基因所编码的细胞因子可以从本发明病毒感染的鸟细胞分泌，并且在结合至相邻细胞上的适宜干扰素受体后，可以在携带受体的细胞中诱导抗病毒状态。因此，可以至少部分地抑制本发明病毒在干扰素刺激的鸟细胞中复制。鸡I型干扰素与哺乳动物I型干扰素之间的相似性极低(在氨基酸水平的相同性＜25％)(Staeheli等人2001)。出于这个原因，在中显示这种抗病毒作用的细胞因子在人细胞中基本上不显示生物学活性并且可以基本上不影响人肿瘤细胞中的病毒复制。另外，预料这些细胞因子在人类生物中无不利作用。
[0055] 如本文中所述的编码细胞因子的转基因的表达导致该病毒对物种、尤其对家禽、尤其对鸡的致病性降低并且因而导致削弱的环境毒性。如本文中所述的编码细胞因子的转基因的活性对该病毒的治疗作用基本上无有害影响。
[0056] 优选实施方式详述
[0057] 病毒
[0058] 本发明总体上涉及RNA病毒，优选地涉及负链RNA病毒，更优选地涉及具有溶瘤属性和可以遗传工程化的此类病毒。此类病毒是：
[0059] -副粘病毒，优选地是新城疫病毒(NDV)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、仙台病毒；
[0060] -正粘病毒，优选地是流感病毒；
[0061] -弹状病毒，优选地是水泡性口炎病毒。
[0062] 优选地，本发明的病毒是禽类病原体，尤其是家禽的病原体，更具体是鸡的病原体。
[0063] 还优选地，本发明的病毒是负链RNA病毒。本发明的重组RNA病毒可以是副粘病毒，优选地是新城疫病毒(NDV)。NDV可以是中等毒力毒株或强毒株。优选地，该NDV是中等毒力的NDV。
[0064] 本发明的病毒可从强毒力或中等毒力的溶瘤性RNA新城疫病毒获得、尤其从毒株MTH68获得。
[0065] 本发明的病毒优选地有复制能力。
[0066] 本发明的病毒可以对禽类物种，尤其相对于自其可获得重组病毒的病毒而言，具有降低的致病性。
[0067] 优选地，在本发明的病毒中，致病性降低是指病毒导致鸟细胞裂解的能力降低，这是在以MOI0.01的病毒感染细胞后约48小时通过细胞活力的增加而测量到的，其中相对于自其可获得所述重组病毒的病毒而言，细胞活力增加到至少约25％(如至少约25％直至约50％)的存活细胞，更优选地到至少约50％(如至少约50％直至约75％)的存活细胞，和最优选地到至少约75％(如至少约75％直至100％)的存活细胞。
[0068] 还优选地，在本发明的病毒中，致病性降低是指通过测定平均死亡时间(MDT)而测量到的11日龄含胚卵中的被病毒感染的鸡胚的存活时间延长，其中与自其可获得所述重组病毒的病毒相比，MDT延长达至少约15小时(如至少15小时直至约20小时)、更优选地达至少约20小时(如至少20小时直至约30小时并且最优选地达多于30小时。
[0069] 在又一个实施方式中，本发明病毒对人肿瘤细胞的溶瘤活性基本上不降低。
[0070] 优选地，在本发明的病毒中，与自其可获得重组病毒的病毒相比，通过感染48小时后细胞活力测量到，所述病毒对人肿瘤细胞的溶瘤活性降低不超过50％，并且更优选地基本上不降低。
[0071] 细胞因子
[0072] 如本文中描述的至少一种转基因所编码的细胞因子可以是任何细胞因子。具体地，该细胞因子可以是能够至少部分地抑制鸟细胞中、尤其家禽类细胞中、更具体地在鸡细胞中的病毒复制的细胞因子。优选地，病毒复制基本上被完全抑制。
[0073] 细胞因子可以是在哺乳动物中、尤其在人类中基本上没有生物学活性的细胞因子。在本上下文中，“生物学活性”尤其指细胞因子至少部分地抑制病毒复制、尤其抑制本发明病毒复制的能力。“生物学活性”也指细胞因子的任何其他活性可以展现于非哺乳动物细胞中或/和非哺乳动物中。
[0074] 该细胞因子可以是能够至少部分地抑制鸟中、尤其家禽中、更具体地在鸡中病毒复制的细胞因子，并且可以在哺乳动物中、尤其在人类中基本上没有生物学活性。
[0075] 细胞因子可以选自禽类细胞因子，尤其选自家禽类细胞因子，更具体地选自鸡细胞因子。
[0076] 细胞因子可以选自禽干扰素，尤其选自禽干扰素，更具体地选自鸡干扰素，更具体地选自鸡I型干扰素。
[0077] 干扰素可以是干扰素-β或干扰素-α家族的成员。
[0078] 在优选的实施方式中，重组溶瘤性RNA病毒是包含核酸的NDV，其中所述核酸包括编码鸡干扰素-α或/和鸡干扰素-β的转基因。
[0079] 转基因
[0080] 转基因在NDV基因组的环境中定义为病毒基因组中导入的额外核酸。所述核酸可以选自不同的基因组来源(例如NDV基因组、不同的病毒类别、原核生物或真核生物来源、哺乳动物或非哺乳动物物种)。来自两个或多个不同基因组来源的融合转基因也是可能的。也可以构建基于核酸序列从头合成的转基因。所述核酸必须位于至少一个转录盒内。优选地，转基因在感染的细胞中翻译成蛋白质。出于此原因，该转基因序列应当包括翻译起始和终止密码子。
[0081] 本发明的重组溶瘤性病毒可以包含编码至少一种其它转基因的核酸，所述的至少一种其它转基因独立地选自编码结合蛋白、前体药物转化酶和蛋白酶的转基因。
[0082] 所述至少一种其它转基因优选地编码当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的结合蛋白。
[0083] 在另一个优选的实施方式中，所述至少一种其它转基因编码当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的前体药物转化酶。
[0084] 在又一个优选的实施方式中，所述至少一种其它转基因编码当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的蛋白酶。
[0085] 如果不另外说明，如本文中所用的“转基因”或“至少一种转基因”指编码禽类细胞因子的转基因，或所述至少一种其它转基因当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性，或其组合。如果不另外说明，如本文中所述，“转基因”的这个定义尤其适用于病毒基因组内部转基因的位置和数目。
[0086] 本发明的RNA病毒、基因组、反基因组、核衣壳和/或DNA分子可以包含如本文中所述的转基因，其中所述转基因可以位于如本文中所述的转录盒内部。
[0087] 本发明的重组溶瘤性病毒可以包含至少2种、至少3种、至少4种或至少5种核酸，每种核酸包含如本文中所述的转基因。本发明的重组溶瘤性病毒可以包含最多5种核酸，每种核酸包含如本文中所述的转基因。具体地，本发明的重组溶瘤性病毒可以包含2、3、4种或至少5种核酸，每种核酸包含如本文中所述的转基因。如果本发明的重组病毒包含至少2种转基因，则它们可以是相同或不同的。
[0088] 包含至少一种转基因的核酸可以位于病毒基因的可读框之间的任何位置。具体地，包含至少一种转基因的核酸可以位于N基因的5′、N与P基因之间、P与M基因之间、M与F基因之间、F与HN基因、HN与L基因之间或/和L基因的3′。优选地，该核酸位于更为5′的位置，如N基因的5′、N与P基因之间或/和P与M基因之间，因为这种位置与更为3′的位置相比导致改善的表达。
[0089] 优选地，本发明的病毒展现出引起如本文中所述转基因的肿瘤选择性表达的肿瘤选择性感染。
[0090] 本发明的重组RNA病毒可以包含总计直到5种转基因，直到4种转基因或直到3种转基因。
[0091] 在本发明中，编码禽类细胞因子的转基因或当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的至少一种其它转基因或其组合优选地对于作为本发明重组RNA病毒之基础的溶瘤性RNA病毒是异源的。如本文中所用的术语“异源的”指的是完整基因或其部分，所述部分可以是基因的编码区或其部分。
[0092] 异源核酸可以是人工核酸或可以从天然来源或通过重组至少两种核酸而获得，其中所述的至少两种核酸选自从天然来源和/或人工核酸获得的核酸。“天然来源”包括动物如哺乳动物、植物、真菌和微生物如细菌、原虫和病毒，所述病毒可以不同于本发明的溶瘤性RNA病毒。
[0093] 该转基因也可以编码融合蛋白。
[0094] 在本发明的另一个实施方式中，编码禽类细胞因子的转基因或当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的至少一种其它转基因可以位于至少两个分立的转录单位上。
[0095] 包含核酸的至少一个转录单位也可以在如本文中所述的肿瘤细胞中转录，其中所述核酸包含编码禽类细胞因子的至少一个转基因。
[0096] 包含核酸的至少一个转录单位也可以在如本文中所述的鸟细胞中转录，其中所述核酸包含当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的至少一个第二转基因。
[0097] 至少两个分立的转录单位各自可以在如本文中所述的肿瘤细胞中和在如本文中所述的鸟细胞中转录。
[0098] 在备选的优选实施方式中，编码禽类细胞因子的至少一个转基因或当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的至少一个其它转基因在如本文中所述的肿瘤细胞中和在如本文中所述的鸟细胞中翻译。
[0099] 结合蛋白
[0100] 在本发明的溶瘤重组RNA病毒，当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的至少一种其它转基因可以编码结合蛋白。
[0101] 因此，本发明的主题是药物组合物，其包含本发明的重组溶瘤性病毒、本发明的病毒基因组、本发明的病毒反基因组和/或本发明的DNA分子作为有效成分，任选地与可药用载体、稀释剂和/或辅药在一起，所述的病毒、病毒基因组、反基因组和/或DNA分子包含当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的编码结合蛋白的至少一个其他转基因。
[0102] 结合蛋白是在靶细胞中表达时能够与所述细胞和/或相邻细胞的组分结合的蛋白质。优选地，结合蛋白是与胞内组分结合的蛋白质。
[0103] 在优选的实施方式中，结合蛋白选自以下由天然配体、遗传学修饰的配体、天然受体的重组可溶性结构域及其修饰形式、肽配体、多肽配体、抗体分子及其片段和衍生物和抗体样分子如锚蛋白重复区蛋白及其片段和衍生物组成的组。
[0105] 如本文中所述的结合蛋白可能是人的、鼠的或密切相关源头的或嵌合形式，即一种蛋白质，其可以是包含来自不同物种(例如人和小鼠)的序列的融合蛋白。
[0106] 基于上文描述的重组结合分子可以是单体、二聚体、三聚体、四聚体或多聚体。基于上文描述的重组结合分子可以是单特异性、双特异性或多特异性的。
[0107] 优选的结合蛋白选自具有治疗活性的结合蛋白。
[0108] 如本文中所述的天然配体可以是生长因子或肽。遗传学修饰的配体可以是天然存在的生长因子或肽的类似物。
[0109] 天然受体或其修饰形式如本文中所述的重组可溶性结构域是细胞表面受体和/或其片段的重组表达的可溶性胞外结构域、细胞黏着分子和/或其片段的重组表达的可溶性胞外结构域。
[0110] 如上文提到的抗体分子可以是具有任何已知特异性和同种型的单克隆免疫球蛋白抗体、其片段和/或其与效应蛋白融合的片段。抗体分子可以是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体片段含有抗体的至少一个抗原结合结构域。已经在文献中广泛描述抗体片段(在例如通过引用方式并入本文的Allen(2002)中综述)。优选例子是单链Fv片段、Fab片段、F(ab2‘)、称作微型抗体的删除结构域的形式和其他免疫活性部分、片段、区段和其他更小或更大的部分抗体结构物，其中更大的部分抗体结构物拥有充足的靶向属性或免疫学刺激或抑制活性，从而治疗性地用于本发明方法中。
[0111] 此类抗体可以从使用转基因小鼠的杂交瘤克隆实验获得或从含有人抗体序列的抗体文库的噬菌体展示选择法、核糖体展示选择法或菌落滤器筛选法或相关方法学获得。
[0112] 具有如本文中所述抗体样属性的结合蛋白可以是遗传修饰的蛋白质或其结构域，其中在氨基酸水平上使一个或多个肽环以如此方式随机化从而具有高度特异性的高亲和力结合分子可以通过噬菌体展示选择法、核糖体展示选择法或菌落滤器筛选法对来自此类分子的文库中的任何反基因组富集。所选蛋白质通常具有高的热稳定性和热动力稳定性并且在重组表达系统如大肠杆菌(E.coli)、酵母、昆虫和哺乳动物表达系统中良好表达。此类具有抗体样属性的结合蛋白的例子是如Binz等人(2004)中所述的锚蛋白重复序列蛋白、如Skerra(2000)所述中的脂笼蛋白、如DE 199 32 688.6中所述的γ-晶体蛋白、如Hogbom等人(2003)或Nord等人(2000)中所述的修饰的蛋白A支架(亲和体(affibodies))或纤连蛋白框架和其他蛋白质。抗体样分子可以是构建为单链分子或多链分子的单体分子或重复分子其中抗体样分子拥有充足的靶向属性或免疫学刺激或抑制活性，从而治疗性地用于本发明方法中。
[0113] 本发明的另一个主题是用于治疗增生性疾病、尤其过度增生性疾病如肿瘤或癌症的方法，包括给有需要的对象施用药物有效量的包含至少一种其它转基因的本发明重组溶瘤性病毒、本发明病毒基因组、本发明病毒反基因组和/或本发明DNA分子，其中所述至少一种其它转基因当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性并编码如本文中所述的结合蛋白。
[0114] 具有额外功能的结合分子
[0115] 结合蛋白可以是包含(例如来自抗体的)至少一个结合结构域和至少一个异源结构域的融合蛋白。“异源的”具有如上文在异源基因的上下文中所讨论的意思。
[0116] 上文所述的结合蛋白能够作为所谓内部体或作为胞外可用结合蛋白递送有效负载至疾病特异性部分(例如肿瘤)。递送的有效负载可以是异源结构域，例如毒素如人RNA酶(De Lorenzo，2004)(Zewe，1997)、假单胞菌外毒素(Chaudhary，1989)(Kreitman和Pastan，1995)(Batra，1992)、白喉毒素(Kreitman，1993)(Chaudhary，1990)(Batra，1991)，或具有治疗效力的酶如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(Roffler，1991)(Wang，1992)(Bosslet，1992)、β-葡糖苷酶(Rowlinson-Busza，1992)、羧肽酶(Antoniw，1990)(Bagshawe，1988)、β-内酰胺酶，或具有细胞因子活性的免疫刺激蛋白如IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-β或GM-CSF(见例如Allen(2002)的综述)。
[0117] 在另一个例子中，上文所述的结合蛋白本身具有治疗上有用的拮抗或激动效力。拮抗/阻断性结合分子的例子是VEGF抑制抗体Avastin(Ferrara等人，2004)、HER2/neu受体阻断性抗体Herceptin(Noonberg和Benz，2000)或EGF受体阻断性抗体Erbitux(Herbst和Langer，2002)。激动性结合蛋白可以是诱导例如凋亡(Georgakis等人，2005)或对DNA、RNA或蛋白质具有调节活性(例如诱导转录、使蛋白质稳定)的结合蛋白。Adams和Weiner，
2005的综述描述了也可以并入溶瘤性病毒的多种治疗性抗体。
2005的综述描述了也可以并入溶瘤性病毒的多种治疗性抗体。
[0118] 前体药物转化酶
[0119] 在本发明的溶瘤重组RNA病毒，当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的至少一种其它转基因可以编码前体药物转化酶。
[0120] 前体药物是治疗活性化合物的衍生物或前体，其可以酶促地转化成该活性化合物。前体药物转化酶是能够将前体药物转化成治疗活性药物的酶。
[0121] 因此，本发明的主题是药物组合物，其包含本发明的重组溶瘤性病毒、本发明的病毒基因组、本发明的病毒反基因组和/或本发明的DNA分子作为有效成分，任选地与可药用载体、稀释剂和/或辅药在一起，所述的病毒、病毒基因组、反基因组和/或DNA分子包含当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的编码前体药物转化酶的至少一个其他转基因。
[0122] 药物组合物可以还包含可被前体药物转化酶转化成治疗活性化合物的前体药物，其中所述的前体药物转化酶由该病毒、病毒基因组、反基因组和/或DNA分子编码。药物组合物可以适用于治疗和/或减缓增生性疾病。
[0123] 前体药物可以连同作为有效成分的本发明重组溶瘤性病毒、本发明病毒基因组、本发明病毒反基因组和/或本发明DNA分子配制于单一组合物中，或可以配制在不同于溶瘤性病毒制剂的组合物中。
[0124] 如果本发明的溶瘤重组RNA病毒编码前体药物转化酶，则本发明的溶瘤性病毒引起前体药物转化酶在病毒感染的通常不表达或不充分表达该前体药物转化的靶细胞(尤其肿瘤细胞)中选择性表达。因此，在治疗有需要的对象期间，将前体药物特异性地在细胞中，尤其在肿瘤细胞中转化成药物活性化合物，不过可以在非靶细胞中、尤其在待治疗对象的健康细胞中基本上不转化成治疗活性化合物。因而，与单用治疗活性化合物的疗法相比，该治疗活性化合物的不受欢迎的副作用减少，
[0125] 在本发明的环境中，前体药物可以是适合治疗和/或减缓增生性疾病、肿瘤或/和癌症的治疗活性化合物的衍生物或前体，所述前体药物可以由前体药物转化酶转化。该前体药物可以是本领域技术人员已知的化合物。
[0126] 优选地，该前体药物是基本上无药物活性和/或无毒的。
[0127] 本发明前体药物转化酶的例子是β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、D-氨基酸氧化酶。其他例子是本领域技术人员已知的。
[0128] 优选地，该前体药物转化酶在非肿瘤细胞中基本上不表达。
[0129] 该前体药物转化酶可以从选自哺乳动物、植物、真菌和微生物如细菌、原虫和病毒的生物获得。
[0130] 前体药物转化酶与前体药物的最优选组合是大肠杆菌β-葡糖醛酸糖苷酶和可以由β-葡糖醛酸糖苷酶转化成活性细胞毒化合物的前体药物。一个例子是可以转化成多柔比星的HMR1826(多柔比星-葡糖苷酸)，其中所述多柔比星是用于治疗癌症的已知化合物。
[0131] 本发明的另一个主题是用于治疗增生性疾病、尤其过度增生性疾病如肿瘤或癌症的方法，包括给有需要的对象施用药物有效量的包含至少一种其它转基因的本发明重组溶瘤性病毒、本发明病毒基因组、本发明病毒反基因组和/或本发明DNA分子，其中所述至少一种其它转基因编码如本文中所述的前体药物转化酶。
[0132] 具体地，本发明的主题是用于治疗增生性疾病、尤其过度增生性疾病如癌症的方法，包括给有需要的对象施用药物有效量的
[0133] (i)包含编码前体药物转化酶的至少一种转基因的本发明重组溶瘤性病毒、本发明病毒基因组、本发明病毒反基因组和/或本发明DNA分子，和
[0134] (ii)适合治疗增生性疾病的前体药物，其中所述前体药物可以由(i)的前体药物转化酶转化成药物活性化合物。
[0135] 该方法可以包括使用包含两种组分(i)和(ii)的单一药物组合物或可以包括施用两种明显不同的药物组合物，所述药物组合物之一包含组分(i)并且另一种组合物包含(ii)。
[0136] 蛋白酶
[0137] 在本发明的溶瘤重组RNA病毒，当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的至少一种其它转基因可以编码蛋白酶。
[0138] 因此，本发明的主题是药物组合物，其包含本发明的重组溶瘤性病毒、本发明的病毒基因组、本发明的病毒反基因组和/或本发明的DNA分子作为有效成分，任选地与可药用载体、稀释剂和/或辅药在一起，所述的病毒、病毒基因组、反基因组和/或DNA分子包含当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的编码蛋白酶的至少一个其他转基因。药物组合物可以适用于治疗和/或减缓增生性疾病。
[0139] 如果本发明的溶瘤重组RNA病毒编码蛋白酶，则本发明的溶瘤性病毒可以引起该蛋白酶在病毒感染的通常不表达或不充分表达该蛋白酶的靶细胞(尤其肿瘤细胞)中选择性表达。因此，在治疗有需要的对象期间，该蛋白酶可以不可逆地在靶细胞中切割靶多肽，因而抑制靶细胞的增生和/或生长或杀死靶细胞，不过可以在非靶细胞中、尤其在待治疗对象的健康细胞中基本上不切割靶分子。通过这种策略，蛋白酶疗法的不良副作用减少。
[0140] 优选地，该蛋白酶是序列特异性蛋白酶。更优选特异性切割靶多肽的蛋白酶。该蛋白酶可以是天然来源的并且可以从任何物种衍生或它可以进行工程化。适合特异性切割预定靶多肽的氨基酸序列可以由本领域技术人员，例如基于公众可用的序列数据库确定。US2005-0175581和US2004-0072276描述了具有预定底物专一性的蛋白质工程化蛋白酶的产生。这两份文件通过引用的方式纳入本文。
[0141] 该蛋白酶的靶分子可以如下文对结合蛋白的靶所描述的任意靶分子。
[0142] 本发明的另一个主题是用于治疗增生性疾病、尤其过度增生性疾病如肿瘤或癌症的方法，包括给有需要的对象施用药物有效量的包含至少一种其它转基因的本发明重组溶瘤性病毒、本发明病毒基因组、本发明病毒反基因组和/或本发明DNA分子，其中所述至少一种其它转基因当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性并编码如本文中所述的蛋白酶。
[0143] 本发明的转基因可以编码如上文所定义前体药物转化酶、如上文所定义结合分子和/或如上文所定义蛋白酶的融合蛋白。特别优选前体药物转化酶与结合分子的融合蛋白或蛋白酶与结合分子的融合蛋白。
[0144] 治疗性应用
[0145] 本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含如本文中所述的病毒、该病毒的核衣壳、该病毒的基因组或编码该病毒的基因组或/和反基因组的DNA分子作为有效成分，它们任选地与可药用载体、稀释剂和/或辅药在一起。
[0146] 该药物组合物可以作为溶液剂、混悬剂、冻干剂或以任何其他适合形式提供。除有效成分外，该组合物还可以包含如本领域已知的载体、缓冲剂、表面活性剂和/或辅药。可以例如经口、局部、经鼻、经肺或通过局部或静脉内注射而施用该组合物。药物组合物以根9
据疾病类型、患者状况和体重、施用途径等的药物有效量施用。优选地，每次应用施用10 至
12 8 11 7 10 6 9
10 个病毒颗粒、10 至10 、10 至10 或10 至10 个病毒颗粒。溶瘤疗法可以任选地与其他肿瘤疗法如手术、放射疗法和/或化疗法如环磷酰胺疗法和/或高热治疗组合。
据疾病类型、患者状况和体重、施用途径等的药物有效量施用。优选地，每次应用施用10 至
12 8 11 7 10 6 9
10 个病毒颗粒、10 至10 、10 至10 或10 至10 个病毒颗粒。溶瘤疗法可以任选地与其他肿瘤疗法如手术、放射疗法和/或化疗法如环磷酰胺疗法和/或高热治疗组合。
[0147] 又一个方面是用于治疗增生性疾病或/和癌症的方法，包括给有需要的对象施用药物有效量的任选地与可药用载体、稀释剂和/或辅药在一起的如本文中所述的重组溶瘤性病毒、该病毒的基因组或编码该基因组或/和反基因组的DNA分子。
[0148] 根据本发明，重组溶瘤性副粘病毒可以表达可以留在感染的细胞中或可以被分泌的可溶性结合蛋白、前体药物转化酶和/或蛋白酶，如抗体、抗体片段、锚蛋白重复序列蛋白或如下文详述的另一种结合分子。
[0149] 作为示例NDV，在本申请中选择毒株MTH68，原因是它具有天生溶瘤属性，同时具有来自实验性临床治疗患者的有前景的数据(Sinkovics和Horvath，2000)。然而，原则上，可以使用具有多个基本融合蛋白切割位点的大部分NDV毒株作为治疗肿瘤的溶瘤剂。反向遗传学技术可应用于全部毒株。
[0150] 已经展示如本文中所述的结合蛋白是有高治疗潜力的。
[0151] 溶瘤性NDV与具有上述属性的治疗性结合蛋白、前体药物转化酶和/或蛋白酶的组合将产生两种治疗性原则的额外或甚至协同效力。溶瘤性自我复制型病毒将结合蛋白药物、前体药物转化酶和/或蛋白酶靶向其中所述病毒以高局部浓度原位表达的优选作用位点。此类蛋白质表达预期极具选择性并且具有相应作用模式的结合蛋白、前体药物转化酶和/或蛋白酶将加入NDV的固有治疗性溶瘤活性。基于所用病毒有复制能力的特征和在肿瘤细胞中选择性复制，所表达转基因(结合蛋白、前体药物转化酶和/或蛋白酶)的量预期大体上正比于肿瘤的量。
[0152] 抗体分子或抗体样分子或其衍生物是待与NDV系统使用的理想结合蛋白。抗体分子已经成为密切研究的主题并且现在可获得产生以下抗体分子的技术，所述抗体分子无免疫原性、极有选择性并具有高亲和性。与标准疗法相比，抗体分子以高浓度的局部表达产生极明显的激动或拮抗效力或效应分子的高效靶向，伴以降低的毒性谱。
[0153] 预期在NDV系统中使用抗体样分子甚至是优越的。与正常抗体相比，将这些分子设计用于选择性高亲和力结合作用，伴以极高的热稳定性和产率。在基于锚蛋白的抗体样分子的情况下，可以根据相应靶精细调节该分子的重复特质以优化靶向、结合、抑制或激活作用。利用在一个锚蛋白重复序列分子中联合具有不同结合专一性的几个单元的可能性，也可以在一个靶分子内部组合不同的结合专一性。这种模块式结构与抗体相比允许与更大的蛋白质表面发生多价结合，所述多价结合可能在阻断蛋白质-蛋白质相互作用中极端重要。也可以利用这种模块式结构来仅用一种单一阻断性锚蛋白重复序列蛋白阻断几种效应物。
[0154] 由于锚蛋白重复序列分子甚至在还原条件下极端稳定，因而这些分子可以设计成靶向细胞内部的蛋白质(“内部体”)。
[0155] 也可能使用结合蛋白编码序列的文库连同NDV用于体内靶鉴定。
[0156] 结合分子或/和蛋白酶的可能靶可以是靶细胞或包围靶细胞的胞外基质的全部结构物，所述的结构物可以由所述结合蛋白或/和蛋白酶识别并且与某个类型的病理学表型相关。这些结构物可以是结构蛋白、酶、生长因子、生长因子受体、整联蛋白、转录因子等。
[0157] 甚至可以通过本发明对付不可由小分子投药的靶(蛋白质-蛋白质相互作用、DNA结合等)。
[0159] 为治疗癌症，可以靶向有助于癌发展的全部途径。这些途径是：自我满足生长信号、对生长抑制(抗生长)信号不敏感、逃避凋亡、无限制复制潜能、持续的血管生成和组织入侵和转移。这些途径的总结在(Hanahan和Weinberg，2000)中给出。参与肿瘤发生过程并且可以被所述方法靶向的信号传导途径是受体酪氨酸激酶途径(RTK)、RB和p53途径、凋亡途径、APC途径、HIF1途径、GLI途径、PI3K途径和SMAD途径。在Vogelstein和Kinzler(2004)中给出这些信号传导途径的详细描述。
[0160] 所述结合蛋白可能对其干扰的其他信号传导途径是ras、Wnt和Hedgehog途径，其中可以例如阻断蛋白质-蛋白质相互作用。
[0161] 有益介入癌细胞中上述途径的结合蛋白的例子是：
[0162] -自主活性生长因子受体(例如EGFR，Met)的阻断蛋白
[0163] -生长因子的竞争性结合蛋白(拮抗物)
[0165] -E2F依赖性转录的阻断蛋白
[0166] -p53的稳定蛋白
[0167] -抗凋亡蛋白(例如Bcl-2)的拮抗性结合蛋白
[0168] -细胞周期蛋白的拮抗性结合蛋白
[0169] -Ras效应物(例如GEF)的拮抗性结合蛋白
[0170] -低氧诱导蛋白(例如HIF1α)的拮抗性结合蛋白
[0171] -干扰二聚化、DNA结合或/和辅因子结合的转录因子(例如Myc/Max)的抑制物[0172] -分化诱导蛋白
[0173] -smad信号传导/转位的抑制物
[0174] -细胞黏着相互作用(钙黏着蛋白、整联蛋白例如α5β1、αvβ3)的抑制物[0175] -降解胞外基质的酶(例如MMP)的抑制物
[0176] -促血管生成配体(例如可溶性VEGF-R)的拮抗性结合蛋白
[0177] -有丝分裂激酶(例如Plk-1)的抑制物
[0178] -促血管生成受体的拮抗性结合蛋白
[0179] -支架复合体形成(例如KSR/Ras)的抑制物
[0180] -翻译起始(eIF4E，EIF2a)抑制因子
[0181] 本发明的蛋白酶、前体药物转化酶和/或因前体药物转化酶从本发明的前体药物衍生的治疗活性化合物也可以有益地介入癌细胞的上述途径。
[0182] 重组病毒
[0183] 重组病毒意指在其基因组RNA序列中具有工程化所定义变更的病毒。这种变更可以是一个或多个插入、缺失、点突变或其组合。
[0184] 本发明的重组RNA病毒可以包含天然(未修饰)RNA病毒的全长基因组序列或从中衍生的序列并且可以额外地包含至少一个重组转录盒。所述至少一个转录盒可以位于病毒基因组的两个基因(转录单位)之间。在这种情况下，所述至少一个转录盒两侧分布有转录起始序列和终止序列。所述至少一个转录盒也可以位于病毒基因组的转录单位内部。在这种情况下，不需要额外的转录起始序列和终止序列。
[0185] 至少一个转录盒可以包含限制性位点，如PacI或/和AscI，所述限制性位点可以是单一的。如果两个转录盒存在，它们可以包含不同的限制性位点。
[0186] 优选地，本发明的RNA病毒包含一个或两个重组转录盒。
[0187] 在本发明的的至少一个转录盒中，存在可以编码如本文中所述的结合蛋白、前体药物转化酶和/或蛋白酶的转基因。
[0188] 病毒基因组的两个基因(转录单位)彼此之间的任何基因间区适合导入至少一个重组转录盒。如果存在多于一个重组转录盒，它们可以位于相同或不同的基因间区。优选地，至少一个重组转录盒位于病毒F基因和HN基因之间，尤其当本发明的RNA病毒是重组新城疫病毒时。
[0189] 不存在副粘病毒科病毒基因组尺寸的已知上限。因此，对于导入本发明重组RNA病毒的转基因的数目和尺寸不存在上限。优选地，转基因(如本文中所述，编码禽类细胞因子的转基因或当由病毒所感染的肿瘤细胞表达时具有治疗活性的至少一种其它转基因或其组合)独立地具有直至约10kb、更优选直至约5kb、最优选直至约2kb的尺寸。
[0190] 在如本文中所述转基因的表达(包括病毒RNA转录成mRNA和mRNA翻译)中，使用表达调控序列如转录起始序列与终止序列和控制翻译的序列。可以使用RNA病毒的表达调控序列，其中所述的RNA病毒可以是作为本发明重组RNA病毒的基础的RNA病毒。具体地，可以从RNA病毒获得转录起始序列和终止序列。也可以从靶细胞获得表达调控序列，尤其控制翻译和/或蛋白质运输的序列。
[0191] 鉴于副粘病毒科病毒的复制机制，基因组或反基因组RNA通常不作为裸露RNA出现。基因组或反基因组RNA与核蛋白装配。因此，本发明的又一方面是本发明的重组溶瘤性RNA病毒的核衣壳。核衣壳包含编码该RNA病毒的基因组或/和反基因组和核衣壳蛋白的RNA分子。核衣壳也可以包含聚合酶蛋白L或/和磷蛋白P。
[0192] 本发明的主题也是如本文中所述的本发明基因组的反基因组。
[0193] 本发明的又一个方面是编码本发明重组溶瘤性RNA病毒的基因组或/和反基因组的DNA分子。该DNA分子可以是质粒。本发明的DNA分子可以用于遗传地改造本发明的RNA病毒。另外，该DNA分子可以用于产生本发明的RNA病毒。因此，该DNA分子可以与转录调控序列例如原核或真核转录调控序列可操纵连接。
[0194] 本发明的另一个方面是用于产生从DNA分子表达的重组溶瘤性RNA病毒的方法，其中所述的DNA分子编码本发明重组溶瘤性病毒、尤其本发明重组溶瘤性NDV的基因组和/或反基因组。
[0195] 本发明的又一个方面是包含本发明重组溶瘤性病毒、本发明病毒基因组、本发明病毒反基因组和/或本发明DNA分子的细胞。该细胞可以是原核细胞或真核细胞。该细胞可以是细胞系、尤其哺乳动物细胞系，更具体是人或鼠细胞系。该细胞可以在本发明方法中用于产生本发明的RNA病毒。用于转录DNA分子的合适系统是本领域技术人员已知的，例如在原核系统如大肠杆菌或真核系统如HeLa或CHO中。
[0196] 又一个方面是溶瘤性RNA病毒、其基因组或反基因组或DNA分子，其包含其中至少一个基因或基因间区经过遗传修饰的副粘病毒科全套基因或副粘病毒科一组基因并且还包如本文中所述的含至少一个重组转录盒。这种病毒、基因组或反基因组或DNA分子可以用于制备药物和/或治疗癌症。这种RNA病毒、基因组或反基因组或DNA分子适合通过基因工程技术构建重组副粘病毒科病毒、尤其重组新城疫病毒，以便将重组序列导入转录盒。处于此目的，所述至少一个转录盒可以包含限制性位点。如果存在多于一个转录盒，转录盒的单一限制性位点可以是不同的。例子是WO2006/050984的图1的质粒pflMTH68_Asc_Pac，所述专利的内容通过引用的方式并入本文。另一个例子是如WO 2006/050984的图2中公开的pflMTH68小鼠IgG EDB，所述专利的内容通过引用的方式并入本文。
[0197] 疗效相关性
[0198] 癌症或/和肿瘤的治疗包括抑制肿瘤生长，优选地包括以一个时间间隔通过感染杀死肿瘤细胞或阻断增生。NDV选择性地在肿瘤细胞中复制。
[0199] 本发明的病毒可以用来治疗增生性疾病、尤其过度增生性疾病。优选地，可以用所述病毒治疗肿瘤，优选地可以治疗来自由肺癌、结肠癌、前列腺、乳腺癌和脑癌组成的组中的癌症。
[0200] 更优选地，可以治疗实体瘤。
[0201] 更优选地，可以治疗具有低增生速率的肿瘤。具有低增生速率的肿瘤的例子是前列腺癌或乳腺癌。
[0202] 更优选地，可以治疗脑肿瘤。
[0203] 更优选地，可以治疗实成胶质细胞瘤。
[0204] 哺乳动物包括人、小鼠和大鼠。
[0205] 重组RNA病毒的制备
[0206] 本发明的重组RNA病毒、尤其重组NDV可以如Romer-Oberdorfer等人(1999)中所述构建。(1999).新核酸序列的构建是在cDNA的水平上进行的，其中所述cDNA随后使用以下初始质粒：pCITE P、pCITE N、pCITE L、pX8δT flNDV在真核细胞内部翻译成RNA。
[0207] NDV可以是任意新城疫病毒毒株、更优选是以其野生型形式有溶瘤性的毒株。
[0208] 质粒pX8δT在EP 0 702 085(Conzelmann KK)中描述。
[0209] 本发明的重组RNA病毒、尤其重组NDV可以最初从表达T7聚合酶的细胞例如BHK T7细胞回收或用T7聚合酶转染的CHO细胞短暂地回收。该重组RNA病毒可以在细胞如293、CEC32、HT29或A431中扩增。它也可以在含胚鸡卵的尿囊液中扩增。
[0210] 在以下条件贮藏重组RNA病毒、尤其重组NDV。重组RNA病毒、尤其NDV在5％D-甘露醇/1％(w/v)L-赖氨酸/pH 8.0或标准细胞培养基中稳定。
[0211] 在-20℃持续直到1个月。
[0212] 在-80℃持续直到10年。
[0213] 可以使用野生型病毒或重组病毒作为原材料制备本发明的重组RNA病毒。也可以使用包含这种野生型或重组序列的核酸，如DNA。例如，可以使用如WO 2006/050984中所述的重组RNA病毒或/和DNA分子作为原材料。一个例子是WO 2006/050984的图1的质粒pflMTH68_Asc_Pac。另一个例子是如WO 2006/050984的图2的pflMTH68小鼠IgG EDB。WO2006/050984的内容通过引用的方式并入本文。具体地，本文中通过引用的方式包含涉及重组溶瘤性RNA病毒及其构建的WO 2006/050984的内容。
[0214] 重组NDV作为药物的用途
[0215] 本发明的重组RNA病毒、尤其纯化的本发明重组NDV可以作为药物使用，因为它显示药理学作用。
[0216] 本发明的重组RNA病毒、尤其重组NDV、本发明的病毒基因组、反基因组、核衣壳和/或DNA分子可以用于制备特别用于预防、减缓或/和治疗癌症(如肺癌、前列腺癌、脑癌、结肠癌、乳腺癌)的药物。
[0217] 本发明的药物组合物任选地包含可药用的载体和稀释剂。此类载体和稀释剂在第15版Remington′s Pharmaceutical Science中描述。药物组合物中所用或/和在本发明
9 12 8
治疗方法中应用的病毒滴度可以根据治疗的适应证在每剂量10 至10 pfu范围内、在10
11 7 10 6 9
至10 pfu范围内、在10 至10 pfu范围内或在10 至10pfu范围内。
9 12 8
治疗方法中应用的病毒滴度可以根据治疗的适应证在每剂量10 至10 pfu范围内、在10
11 7 10 6 9
至10 pfu范围内、在10 至10 pfu范围内或在10 至10pfu范围内。
[0218] 本发明的药物组合物可以用于预防或/和治疗增生性疾病如癌症。
[0219] 本发明的药物组合物可以包含本发明重组溶瘤性RNA病毒、尤其本发明NDV的乳剂并且可以通过吸入、静脉内输注、皮下注射、腹膜内注射或肿瘤内注射施用。
[0220] 在用于预防或/和治疗增生性疾病、尤其癌症的本发明方法中，药物有效量是本发明溶瘤性RNA病毒、尤其本发明NDV、本发明病毒基因组或本发明DNA分子的的滴度，其预防、减缓或/和抑制该疾病。
[0221] 对治疗作用而言，可接受的剂量可以取决于例如构建体、患者、施用途径和癌症类型。
[0222] 优选地，对象(患者)是哺乳动物，更优选地，是人患者。
[0223] 本发明通过以下图和实施例进一步说明。
[0225] 图1描述包含NDV全长基因组和一个包含鸡干扰素-α(ChIFN-α)转基因的转录盒的质粒pflMTH68ChIFN-α。
[0226] 图2描述包含NDV全长基因组和一个包含鸡干扰素-β(ChIFN-β)转基因的转录盒的质粒pflMTH68ChIFN-β。
[0227] 图3a表明禽CEC-32细胞系在感染NDV-ChIFN-α后48小时部分地免于裂解并且在感染NDV-ChIFN-β后受到强烈保护。用表达GFP的NDV感染完全摧毁CEC-32单层。相反，在感染致瘤性Hela细胞系后，未见三种病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN-α和NDV-ChIFN-β之间裂解的差异。与所用病毒无关，Hela细胞单层在感染后48小时被完全摧毁。
[0228] 图3b显示以病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN-α和NDV-ChIFN-β感染后48小时的CEC-32和Hela细胞的细胞存活量化。在用NDV-GFP感染后，观察到几乎完全杀死CEC-32细胞，仅3％的细胞是活的。鹌鹑细胞用NDV-ChIFN-α的感染使得26％的感染细胞活下来。在NDV-ChIFN-β病毒感染后观察到用最好的保护，96％的CEC-32细胞是活的。相反，在感染后48小时，致瘤性Hela细胞的活力降低到10％以下，与所用重组NDV无关。
[0229] 图4表明在用NDV-ChIFN-α和NDV-ChIFN-β感染肿瘤细胞和成纤维细胞后存在巨大的治疗窗。溶瘤性病毒NDV-ChIFN-α和NDV-ChIFN-β的增殖抑制作用在肿瘤细胞上很强烈，并且相反在感染原代成纤维细胞后，几乎观察不到生长抑制，尤其在低MOI如0.1和MOI 0.01时。
[0230] 图5a描述了以4种NDV病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN-α、NDV-ChIFN-β和非致病性毒株LaSota进行NDV感染的含胚鸡卵的存活曲线。用NDV-ChIFN-α或NDV-ChIFN-β感染的鸡胚比NDV-GFP感染的胚存活得更长。这些曲线清晰地朝低毒力NDV LaSota毒株的存活曲线方向移动。
[0231] 图5b：从存活曲线的结果对每个感染组计算MDT(平均死亡时间)。与NDV-GFP相比，病毒NDV-ChIFN-α和ChIFN-β的MDT增加。在非致病性毒株LaSota观察到最高MDT。
[0232] 实施例1
[0233] 产生具有引起鸡细胞因子表达的禽衍生性转基因的重组NDV
[0234] 使用NDV的溶瘤毒株MTH68来获得病毒RNA。使用RT-PCR，获得几个cDNA片段并且在多步骤克隆方法中，将它们装配成全长基因组cDNA，将后者克隆入载体pX8δT(Schnell等人，1994)，产生质粒pflMTH68。该载体可以用于转染以便从表达T7-聚合酶的细胞系拯救重组病毒。
[0235] 将一个额外转录盒克隆到NDV MTH68全长基因组质粒(pflMTH68)中编码F蛋白和HN蛋白的基因之间的单一SfiI限制性位点内。两种DNA寡核苷酸Sfi正向(5′-aggccttaattaaccgacaacttaagaaaaaatacgggtagaacggcctgag-3′，SEQ ID NO：1)和Sfi反向(5′-aggccgttctacccgtattttttcttaagttgtcggttaattaaggcctctc-3′，SEQ ID NO：2)复性并随后连接到入pflMTH68的SfiI位点。
[0236] 通过PCR扩增编码ChIFN-α(NM_205427)和ChIFN-β(NM_001024836)的两个DNA转基因。作为聚合酶链反应的模板，使用Schultz等人，1995和Sick等人，1996中所述的ChIFN-α和ChIFN-β表达构建体。为扩增ChIFN-α转基因，使用以下引物对：ChIFN-αfw(5′-ccttaattaagccaccatggctgtgcctgcaagccc-3′SEQ ID NO：3)和ChIFN-α-rev(5′-ccttaattaactaagtgcgcgtgttgcctgtg-3′SEQ ID NO：4)，并且为扩增ChIFN-β编码序列，使用两条引物PacI ChIFN-βfw(5′-ccttaattaacgcaccatgactgcaaaccatcagtctccagg-3′SEQ ID NO：5)和ChIFN-β-rev(5′-ccttaattaatcactgggtgttgagacgtttggatg-3′SEQ ID NO：6)。
[0237] 两个chIFN-转基因的每一个分别克隆到质粒pflMTH68Pac的PacI位点内。调节基因组的总长度至6的倍数以符合该病毒基因组长度的“6碱基规则”。ChIFN-β插入物的序列相同性由核苷酸测序证实。在ChIFN-α插入物中，与序列NM_205427相比，在第89位置检测到一个G至A核苷酸交换。从表达T7的细胞拯救重组病毒，其中所述细胞用含有ChIFN-α(图1)基因或ChIFN-β(图2)基因的全长病毒基因组质粒通过标准病毒拯救技术转染。所得表达ChIFN-α的病毒命名为NDV-ChIFN-α并且表达ChIFN-β的NDV命名为NDV-ChIFN-β。在组织培养中或在鸡卵的尿囊液中培养病毒以产生高滴度。
[0238] 实施例2
[0239] 从重组NDV表达的ChIFN-α和ChIFN-β是有生物学活性的
[0240] 材料与方法：
[0241] 将CEC-32细胞(禽鹌鹑细胞系)或Hela细胞(子宫颈癌细胞系)以1x105个细胞/孔铺种于6孔平板中。在细胞贴壁后，使用0.01的MOI，细胞用表达GFP的对照病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN-α、NDV-ChIFN-β或模拟病毒感染。在64小时后，收获上清液并通过UV照射失活感染性病毒颗粒。
[0242] 为显示病毒感染的细胞的上清液中ChIFN-α或ChIFN-β的生物学活性，使用鸡干扰素特异性生物测定法(Schwarz等人，JICR，2005)。该测定法基于稳定转染的鹌鹑细胞系CEC-511，其中该细胞系携带受IFN应答型鸡Mx启动子控制的萤光素酶基因。当CEC-511指示细胞与ChIFN-α或ChIFN-β孵育时，诱导出萤光素酶活性。为开展该测定法，将15.000个CEC-511细胞铺种于96-孔平板中。在铺种24小时后，细胞用病毒感染的Hela细胞或CEC-32细胞的UV处理的上清液处理。细胞与相应上清液的1∶100稀释物75μl孵育。作为阳性对照，细胞与来自293T-细胞的上清液的1∶1000稀释物或仅与培养基孵育，其中所述的293T-细胞用ChIFN-α或ChIFN-β的表达质粒(Sick等人，1996)转染。在6小时孵育时间后，按照制造商提供的方案开展Steady- 萤光素酶测定法(Promega)。为确定平均值，一式三份测量每个数据点。
[0243] 结果：
[0244] 在感染后64小时，NDV-ChIFN-α和NDV-ChIFN-β感染的CEC-32细胞和Hela细胞的上清液在CEC-511细胞上具有强烈的萤光素酶诱导活性，显示感染细胞中病毒介导的ChIFN-α和ChIFN-β表达。相反，模拟感染或用表达GFP的对照病毒感染的细胞的上清液在CEC-511指示细胞系上不显示萤光素酶诱导活性。上清液含有重组ChIFN-α或ChIFN-β的1∶1000稀释物也显示出ChIFN依赖性Mx启动子诱导活性。
[0245] 表1：用表达ChIFN-α或ChIFN-β的重组NDV所感染CEC-32和Hela细胞的上清液中的干扰素活性。在携带受Mx启动子控制的萤光素酶报道基因的指示细胞中测量IFN应答。测量值以相对萤光素酶计数给出。
[0246]
[0247]
[0248]ChIFN-α ChIFN-β 培养基
平均值 4849 2138 237
标准差 107 15 21
平均值 4849 2138 237
标准差 107 15 21
[0249] 实施例3
[0250] 以表达ChIFN-α或ChIFN-β的重组NDV感染的禽类细胞而非肿瘤细胞受到保护免遭病毒裂解
[0251] 材料与方法：
[0252] 3a.)将CEC-32细胞(禽鹌鹑细胞系)或Hela细胞(子宫颈癌细胞系)以1x105个细胞/孔铺种于6孔平板中。在变得贴壁后，细胞以0.01的MOI用对照病毒
NDV-GFP、NDV-ChIFN-α、NDV-ChIFN-β或模拟病毒感染。48小时后，细胞用4％甲醛溶液固定并且用吉姆萨溶液染色。随后用ZeissAxiophot成像系统进行后续的光记录(photodocumention)。
NDV-GFP、NDV-ChIFN-α、NDV-ChIFN-β或模拟病毒感染。48小时后，细胞用4％甲醛溶液固定并且用吉姆萨溶液染色。随后用ZeissAxiophot成像系统进行后续的光记录(photodocumention)。
[0253] 3b.)将CEC-32细胞(禽鹌鹑细胞系)或Hela细胞(子宫颈癌细胞系)以15,000个细胞/孔铺种于96孔平板中。在变得贴壁后，细胞以0.01的MOI用对照病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN-α、NDV-ChIFN-β或模拟病毒(＝无)感染。在48小时孵育时间后，按照制造商提供的方案开展CellTiter- 萤光素酶测定法(Promega)以测量细胞活力。为确定平均值，每个数据点从6个独立值生成。
[0254] 结果：
[0255] 图3.a.)在48小时后，禽CEC-32细胞被表达GFP的NDV(NDV-GFP)裂解。相反，用表达ChIFN-α的病毒感染的细胞受到部分保护免遭裂解。NDV-ChIFN-α感染的CEC-32单层保持25-50％完整。随表达ChIFN-β的NDV观察到甚至更强的保护作用。在48小时后，几乎90-100％的CEC-32单层是完整的并受到保护免遭病毒裂解。该单层的密度是与模拟感染的CEC-32细胞单层可比较的。
[0256] 这三种病毒在致瘤性Hela细胞系上的感染显示出病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN-α与NDV-ChIFN-β之间具有相当的溶瘤活性。48小时后，用NDV-GFP、NDV-ChIFN-α或NDV-ChIFN-β感染的Hela细胞单层几乎被完全摧毁。模拟感染的Hela细胞单层是完整的，如吉姆萨染色的细胞的蓝色所示。
[0257] 图3.b)在第二实验中，用表达ChIFN的NDV感染48小时后量化细胞活力。NDV-GFP感染的禽CEC-32细胞仅显示3％的剩余细胞活力。在NDV-ChIFN-α感染的CEC-32细胞中，26％的剩余细胞是完整的。NDV-ChIFN-β感染CEC-32鹌鹑细胞系48小时后，94％的细胞有活力并且受到保护免遭病毒裂解。
[0258] 相反，用3种病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN-α或NDV-ChIFN-β感染后，可以在致瘤性Hela细胞系上观察到细胞破坏的几乎任何差异。在48小时后，全部三种病毒的活细胞的该值在3％-9％之间，显示几乎完全的肿瘤细胞破坏。
[0259] 实施例4
[0260] 表达ChIFN-α或ChIFN-β的重组NDV对肿瘤细胞而非原代细胞的选择性溶瘤作用
[0261] 材料与方法：
[0262] 5000原代成纤维细胞或3000个Hela细胞铺种于96孔平板的每个孔内。 在 铺 种 16小 时 后，制 备NDV-GFP(NDV-GFP)、NDV-ChIFN-α(NDV-ChIFN-α) 和NDV-ChIFN-β(NDV-ChIFN-β)的病毒稀释物。成纤维细胞用所示的病毒浓度感染。作为阴性对照，模拟感染成纤维细胞。1小时后，移去接种物，将细胞用PBS洗涤并与细胞培养基在细胞培养孵箱中孵育4日。此后，剩余细胞用4％甲醛溶液固定并且用结晶紫染色。染料用
10％冰醋酸增溶并且在读数仪中在595nm处测量每孔的吸光。
10％冰醋酸增溶并且在读数仪中在595nm处测量每孔的吸光。
[0263] 结果：
[0264] 在 感染 4日 后，使 用MOI 0.001 直至 MOI 0.1之 间的 MOI，以 NDV-GFP、NDV-ChIFN-α和NDV-ChIFN-β感染的原代成纤维细胞显示几乎无增殖抑制(图4)。仅在以每个细胞1或10个病毒颗粒的MOI进行感染的情况中观察到增殖抑制作用的第一征兆。相反，用MOI 0.001与MOI 10之间的MOI感染的致瘤性Hela细胞显示极强烈的增殖抑制作用。该结果表明：重组NDV具有极好的治疗窗，尤其在低MOI如MOI 0.1和MOI 0.001时，在所述治疗窗上原代细胞中几乎测量不到裂解，而致瘤性Hela细胞中测量到极强的生长抑制作用。在对照病毒NDV-GFP与表达ChIFN的病毒NDV-ChIFN-α和NDV-ChIFN-β之间观察不到在肿瘤细胞和原代细胞上杀伤曲线形状的差异。
[0265] 实施例5
[0266] 用表达ChIFN-α或ChIFN-β的重组NDV感染的鸡胚的存活时间延长
[0267] 材料与方法：
[0268] 15枚11日龄含胚鸡卵组分别用NDV-ChIFN-α、NDV-ChIFN-β、NDV-GFP或非致病性NDV毒株LaSota感染。作为感染性材料，使用尿囊液中以无菌PBS稀释的卵生病毒。使用200μl总体积中的4000PFU感染剂量。将接种物注射到尿囊腔中。在感染后，卵在37℃和50％-60％湿度于蛋孵化箱(egg breader)内孵育。在(图5)所示的时间点一日两次照蛋并且检查胚的生命迹象。
[0269] 该测定法允许通过比较感染胚的存活时间而比较不同NDV毒株的致病性。该方法基于R.P.Hanson(1980)中所述的“平均死亡时间/最小致死剂量(MDT/MLD)”测定。对该方案进行了改良，不是将病毒原液的连续稀释物接种于卵内，而是使用了浓度高于最小致死剂量的一个确定的病毒注射剂量。出于伦理原因，该测定改良减少了用于该试验的胚数。MDT由以下公式确定：
[0270] MDT＝((X小时死亡的数量)x(X小时)+(Y小时死亡的数量)x(y小时)等等)/死亡总数
[0271] 结果：
[0272] 与NDV-GFP感染的胚相比，NDV-ChIFN-α和NDV-ChIFN-β感染的鸡胚的存活改善。NDV-GFP感染的含胚卵在24小时与62小时之间失去生命迹象，产生50小时的MDT(平均死亡时间)。NDV-ChIFN-β感染的胚存活直至96小时，计算的MDT为69小时。在NDV-ChIFN-β感染的胚中测量到可比较的存活时间，MDT为74小时。大部分NDV-ChIFN-β感染的胚在48小时与96小时之间死亡。该测定法的灵敏度由无致病性或轻型毒株LaSota显示。甚至用NDV LaSota毒株接种的含胚卵在62小时至115小时之间死亡，计算的MDT为85小时。该实验表明中等毒力的NDV MTH68的MDT向低毒力NDV毒株偏移。
[0273] 参考文献：
[0274] Adams，G.P.and Weiner，L.M.(2005)Monoclonal antibody therapy of cancer.NatBiotechnol，23，1147-1157.
[0275] Alexander，D.J.(1988)Newcastle disease.Kluwer Academic Publishers，Norwell，Massachusetts.
[0276] Allen，T.M.(2002)Ligand-targeted therapeutics in anticancer therapy.Nat Rev Cancer，2，750-763.
[0277] Amstutz，P.，Binz，H.K.，Parizek，P.，Stumpp，M.T.，Kohl，A.，Grutter，M.G.，Forrer，P.and Pluckthun，A.(2005)Intracellular kinase inhibitors selected from combinatorial librariesof designed ankyrin repeat proteins.J Biol Chem，280，24715-24722.
[0278] Antoniw，P.，Springer，C.J.，Bagshawe，K.D.，Searle，F.，Melton，R.G.，Rogers，G.T.，Burke，P.J.and Sherwood，R.F.(1990)Disposition of the prodrug4-(bis(2-chloroethyl)amino)benzoyl-L-glutamic acid and its active parent drug in mice.Br J Cancer，62，909-914.
[0279] Bagshawe，K.D.，Springer，C.J.，Searle，F.，Antoniw，P.，Sharma，S.K.，Melton，R.G.andSherwood，R.F.(1988)A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites.Br JCancer，58，700-703.
[0280] Batra，J.K.，Fitzgerald，D.J.，Chaudhary，V.K.and Pastan，I.(1991)Single-chainimmunotoxins directed at the human transferrin receptorcontaining Pseudomonas exotoxin Aor diphtheria toxin：anti-TFR(Fv)-PE40and DT388-anti-TFR(Fv).Mol Cell Biol，11，2200-2205.
[0281] Batra，J.K.，Kasprzyk，P.G.，Bird，R.E.，Pastan，I.and King，C.R.(1992)Recombinantanti-erbB2 immunotoxins containing Pseudomonas exotoxin.Proc Natl Acad Sci U S A，89，5867-5871.
[0282] Bell，J.C.，Garson，K.A.，Lichty，B.D.and Stojdl，D.F.(2002)Oncolytic viruses：programmable tumor hunters.Curr Gene Ther，2，243-254.
[0283] Binz，H.K.，Amstutz，P.，Kohl，A.，Stumpp，M.T.，Briand，C.，Forrer，P.，Grutter，M.G.andPluckthun，A.(2004)High-affinity binders selected from designed ankyrin repeat proteinlibraries.Nat Biotechnol，22，575-582.
[0284] Bosslet，K.，Czech，J.，Lorenz，P.，Sedlacek，H.H.，Schuermann，M.and Seemann，G.(1992)Molecular and functional characterisation of a fusion protein suited for tumor specificprodrng activation.Br J Cancer，65，234-238.
[0285] Carnemolla，B.，Borsi，L.，Balza，E.，Castellani，P.，Meazza，R.，Berndt，A.，Ferrini，S.，Kosmehl，H.，Neri，D.and Zardi，L.(2002)Enhancement of the antitumor properties ofinterleukin-2by its targeted delivery to the tumor blood vessel extracellular matrix.Blood，99，1659-1665.
[0286] Chaudhary，V.K.，Gallo，M.G.，FitzGerald，D.J.and Pastan，I.(1990)A recombinantsingle-chain immunotoxin composed of anti-Tac variable regions and a truncated diphtheriatoxin.Proc Natl Acad Sci U S A，87，9491-9494.
[0287] Chaudhary，V.K.，Queen，C.，Junghans，R.P.，Waldmann，T.A.，FitzGerald，D.J.andPastan，I.(1989)A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domainsfused to Pseudomonas exotoxin.Nature，339，394-397.
[0288] Chiocca，E.A.(2002)Oncolytic viruses.Nat Rev Cancer，2，938-950.[0289] Csatary，L.K.，Gosztonyi，G.，Szeberenyi，J.，Fabian，Z.，Liszka，V.，Bodey，B.andCsatary，C.M.(2004)MTH-68/H oncolytic viral treatment in human high-grade gliomas.JNeurooncol，67，83-93.
[0290] De Lorenzo，C.，Arciello，A.，Cozzolino，R.，Palmer，D.B.，Laccetti，P.，Piccoli，R.andD′Alessio，G.(2004)A fully human antitumor immunoRNase selective for ErbB-2-positivecarcinomas.Cancer Res，64，4870-4874.
[0291] Engel-Herbert，I.，Werner，O.，Teifke，J.P.，Mebatsion，T.，Mettenleiter，T.C.andRomer-Oberdorfer，A.(2003)Characterization of a recombinant Newcastle disease virusexpressing the green fluorescent protein.J Virol Methods，108，19-28.
[0292] Ferrara，N.，Hillan，K.J.，Gerber，H.P.and Novotny，W.(2004)Discovery anddevelopment of bevacizumab，an anti-VEGF antibody for treating cancer.Nat Rev DrugDiscov，3，391-400.
[0293] Ford，K.G.，Souberbielle，B.E.，Darling，D.and Farzaneh，F.(2001)Protein transduction：an alternative to genetic intervention？Gene Ther，8，1-4.[0294] Georgakis，G.V.，Li，Y.，Humphreys，R.，Andreeff，M.，O′Brien，S.，Younes，M.，Carbone，A.，Albert，V.and Younes，A.(2005)Activity of selective fully human agonistic antibodies tothe TRAIL death receptors TRAIL-R1and TRAIL-R2in primary and cultured lymphomacells：induction of apoptosis and enhancement of doxorubicin-and bortezomib-induced celldeath.Br J Haematol，130，501-510.[0295] Gerber，H.P.and Ferrara，N.(2005)Pharmacology and pharmacodynamics ofbevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies.Cancer Res，65，671-680.
[0296] Hanahan，D.and Weinberg，R.A.(2000)The hallmarks of cancer.Cell，100，57-70.
[0297] Hanson，R.P：(1980)Newcastle Disease.In Hitchner，S.B.(ed.).Isolation andidentification of avian pathogens.College Station，Tex：American Association of AvianPathologists.
[0298] Herbst，R.S.and Langer，C.J.(2002)Epidermal growth factor receptors as a target forcancer treatment：the emerging role of IMC-C225in the treatment of lung and head and neckcancers.Semin Oncol，29，27-36.
[0299] Hogbom，M.，Eklund，M.，Nygren，P.A.and Nordlund，P.(2003)Structural basis forrecognition by an in vitro evolved affibody.Proc Natl Acad Sci U S A，100，3191-3196.
[0300] Huang，Z.，Elankumaran，S.，Panda，A.and Samal，S.K.(2003)Recombinant Newcastledisease vifus as a vaccine vector.Poult Sci.82，899-906.
[0301] Huang，Z.，Elankumaran，S.，Yunus，A.S.and Samal，S.K.(2004)ArecombinantNewcastle disease virus(NDV)expressing VP2protein of infectious bursal disease virus(IBDV)protects against NDV and IBDV.J Virol，78，
10054-10063.
10054-10063.
[0302] Huang，Z.，Krishnamurthy，S.，Panda，A.and Samal，S.K.(2001)High-level expressionof a foreign gene from the most 3′-proximal locus of a recombinant Newcastle disease virus.JGen Virol，82，1729-1736.
[0303] Kreitman，R.J.，Chaudhary，V.K.，Waldmann，T.A.，Hanchard，B.，Cranston，B.，FitzGerald，D.J.and Pastan，I.(1993)Cytotoxic activities of recombinant immunotoxinscomposed of Pseudomonas toxin or diphtheria toxin towardlymphocytes from patients withadult T-cell leukemia.Leukemia，7，553-562.[0304] Kaiser，P，，Poh，T.Y.，Rothwell，L.，Avery，S.，Balu，S.，Pathania，U.S.，Hughes，S.，Goodchild，M.，Morrell，S.，Watson，M.，Bumstead，N.，Kaufman，J.and Young，J.R.(2005)Agenomic analysis of chicken cytokines and chemokines.J Interferon Cytokine Res.25：467-484.
[0305] Kreitman，R.J.and Pastan，I.(1995)Importance of the glutamate residue of KDEL inincreasing the cytotoxicity of Pseudomonas exotoxin derivatives and for increased binding tothe KDEL receptor.Biochem J，307(Pt 1)，29-37.
[0306] Krishnamurthy，S.，Huang，Z.and Samal，S.K.(2000)Recovery of a virulent strain ofnewcastle disease virus from cloned cDNA：expression of a foreign gene results in growthretardation and attenuation.Virology，278，168-182.
[0307] Kuan，S.F.，Byrd，J.C.，Basbaum，C.B.and Kim，Y.S.(1987)Characterization ofquantitative mucin variants from a human colon cancer cell line.Cancer Res，47，5715-5724.
[0308] Ladner，R.C.and Ley，A.C.(2001)Novel frameworks as a source of high-affinityligands.Curr Opin Biotechnol，12，406-410.
[0309] Lamb，R.A.，Kolakofsky，D.(2001)Paramyxoviridae：The Viruses And TheirReplication.In Fields，B.N.(ed.)，Virology.Lippincott Williams & Wilkins，pp.1305-1485.
[0310] Lorence，R.M.，Pecora，A.L.，Major，P.P.，Hotte，S.J.，Laurie，S.A.，Roberts，M.S.，Groene，W.S.and Bamat，M.K.(2003)Overview of phase I studies of intravenousadministration of PV701，an oncolytic virus.Curr Opin Mol Ther，5，618-624.
[0311] Mizukami，Y.，Jo，W.S.，Duerr，E.M.，Gala，M.，Li，J.，Zhang，X.，Zimmer，M.A.，Iliopoulos，O.，Zukerberg，L.R.，Kohgo，Y.，Lynch，M.P.，Rueda，B.R.and Chung，D.C.(2005)Induction of interleukin-8preserves the angiogenic response in HIF-1alpha-deficient coloncancer cells.Nat Med，11，992-997.
[0312] Nakaya，T.，Cros，J.，Park，M.S.，Nakaya，Y.，Zheng，H.，Sagrera，A.，Villar，E.，Garcia-Sastre，A.and Palese，P.(2001)Recombinant Newcastle disease virus as a vaccinevector.J Virol，75，11868-11873.
[0313] Noonberg，S.B.and Benz，C.C.(2000)Tyrosine kinase inhibitors targeted to theepidermal growth factor receptor subfamily：role as anticancer agents.Drugs，59，753-767.
[0314] Nord，K.，Gunneriusson，E.，Uhl inverted question marken，M.and Nygren，P.A.(2000)Ligands selected from combinatorial libraries of protein A for use in affinity capture ofapolipoprotein A-1M and taq DNA polymerase.J Biotechnol，80，45-54.
[0315] Roffler，S.R.，Wang，S.M.，Chern，J.W.，Yeh，M.Y.and Tung，E.(1991)Anti-neoplasticglucuronide prodrug treatment of human tumor cells targeted with a monoclonalantibody-enzyme conjugate.Biochem Pharmacol，42，2062-2065.[0316] Romer-Oberdorfer，A.，Mundt，E.，Mebatsion，T.，Buchholz，U.J.and Mettenleiter，T.C.(1999)Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.J GenVirol，80(Pt 11)，2987-2995.
[0317] Rowlinson-Busza，G.，Bamias，A.，Krausz，T.and Epenetos，A.A.(1992)Antibodyguided enzyme nitrile therapy(Agent)：in vitro cytotoxicity and in vivo tumor localisation.InEpenetos，a.(ed.)，Monoclonal Antibodies 2.Applications in Clinical Oncology.Chapmanand Hall，London，pp.111-118.
[0318] Russell，S.J.(2002)RNA viruses as virotherapy agents.Cancer Gene Ther，9，961-966.
[0319] Salgaller，M.L.(2003)Technology evaluation：bevacizumab，Genentech/Roche.CurrOpin Mol Ther，5，657-667.
[0320] Schnell，M.J.，Mebatsion，T.and Conzelmann，K.K.(1994)Infectious rabies virusesfrom cloned cDNA.Embo J，13，4195-4203.
[0321] Schultz，U.，Rinderle，C.，Sekellick，M.J.，Marcus，P.I.and Staeheli，P.(1995)Recombinant chicken interferon from Escherichia coli and transfected COS cells isbiologically active..Eur J Biochem.229：73-76.
[0322] Schwarz，H.，Harlin，O.，Ohnemus，A.，Kaspers，B.and Staeheli，P.(2004)Synthesis ofIFN-beta by virus-infected chicken embryo cells demonstrated with specific antisera and anew bioassay.J Interferon Cytokine Res.24：179-184.[0323] Sick，C.，Schultz，U.and Staeheli，P.(1996)A family of genes coding for twoserologically distinct chicken interferons.J Biol Chem.，271，7635-7639.[0324] Sinkovics，J.G.and Horvath，J.C.(2000)Newcastle disease virus(NDV)：brief history ofits oncolytic strains.J Clin Virol，16，1-15.
[0325] Skerra，A.(2000)Lipocalins as a scaffold.Biochim Biophys Acta，1482，337-350.
[0326] Staeheli，P.，Puehler，F.，Schneider，K.，Gobel，T.W.and Kaspers，B.(2001)[0327] Cytokines of birds：conserved functions--a largely different look.J Interferon CytokineRes.2001 21：993-1010.
[0328] Stojdl，D.F.，Lichty，B.D.，tenOever，B.R.，Paterson，J.M.，Power，A.T.，Knowles，S.，Marius，R.，Reynard，J.，Poliquin，L.，Atkins，H.，Brown，E.G.，Durbin，R.K.，Durbin，J.E.，Hiscott，J.and Bell，J.C.(2003)VSV strains with defects in their ability to shutdown innateimmunity are potent systemic anti-cancer agents.Cancer Cell，4，263-275.
[0329] Vogelstein，B.and Kinzler，K.W.(2004)Cancer genes and the pathways they control.Nat Med，10，789-799.
[0330] Waltenberger，J.，Claesson-Welsh，L.，Siegbahn，A.，Shibuya，M.and Heldin，C.H.(1994)Different signal transduction properties of KDR and Flt1，two receptors for vascularendothelial growth factor.J Biol Chem，269，26988-26995.[0331] Wang，S.M.，Chern，J.W.，Yeh，M.Y.，Ng，J.C.，Tung，E.and Roffler，S.R.(1992)Specificactivation of glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzyme conjugates for cancertherapy.Cancer Res，52，4484-4491.
[0332] Warren，R.S.，Yuan，H.，Matli，M.R.，Gillett，N.A.and Ferrara，N.(1995)Regulation byvascular endothelial growth factor of human colon cancertumorigenesis in a mouse model ofexperimental liver metastasis.J Clin Invest，
95，1789-1797.
95，1789-1797.
[0333] Zewe，M.，Rybak，S.M.，Dubel，S.，Coy，J.F.，Welschof，M.，Newton，D.L.and Little，M.(1997)Cloning and cytotoxicity of a human pancreatic RNaseimmunofusion.Immunotechnology，3，127-136.
[0334] Zhao，H.and Peeters，B.P.(2003)Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector：effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.J GenVirol，84，781-788
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 女性孕后期和哺乳期饮用的强化营养的酸羊乳及制备方法 | 2020-06-28 | 1 |
| 用于保护地下水环境的暗挖隧道止水结构及其施工方法 | 2020-08-28 | 1 |
| 一种七月红梨的栽培方法 | 2021-03-06 | 2 |
| 具有海量医疗分析的医疗处理计算机规划方法和系统 | 2020-05-20 | 0 |
| 一种石菖蒲种植方法 | 2022-05-31 | 0 |
| 二尖瓣假体 | 2023-01-05 | 0 |
| 一种泡沫喷雾干燥法制备雨生红球藻中虾青素微胶囊及其制备方法 | 2020-09-19 | 2 |
| 一种母猪分娩期与哺乳期的饲养方法 | 2020-10-27 | 1 |
| 一种驱除黔北麻羊体外寄生虫的方法 | 2021-05-15 | 2 |
| 一种集家居服和内衣于一体的孕产妇哺乳衣 | 2020-05-14 | 2 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈