强化老年人免疫系统的唾液酸
阅读：63发布：2024-01-26
专利汇可以提供强化老年人免疫系统的唾液酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 大体上涉及免疫系统领域，特别是涉及强化老年人的免疫系统。本发明的一个实施方案涉及富含唾液酸的食物产品在制备强化免疫系统的组合物中的用途。，下面是强化老年人免疫系统的唾液酸专利的具体信息内容。
1.用于治疗或预防与免疫系统改变相关疾病的组合物，所述组合物包含蛋白质部分，所述蛋白质部分包含与富含苏氨酸的肽/蛋白质骨架结合的N-乙酰神经氨酸。
2.根据权利要求1的组合物，其中蛋白质部分包含约7至25％以质量计的N-乙酰神经氨酸和在氨基酸总数中约8和22％之间量的苏氨酸。
3.根据前面权利要求之一的组合物，用于治疗或预防与受损的细胞介导免疫反应相关的疾病。
4.根据权利要求5的用途，其中免疫系统的改变选自感染，特别是细菌、病毒、真菌和/或寄生虫感染；自身免疫类疾病；先天防御疾病，例如NK细胞缺陷、巨噬细胞缺陷，例如白细胞粘附缺陷、周期性中性白细胞减少；及其组合。
5.根据前面权利要求之一的组合物，用于产生刺激疫苗应答作用。
6.根据前面权利要求之一的组合物，用于治疗或预防感染性疾病。
7.根据前面权利要求之一的组合物，其中组合物为药物组合物，或食物产品。
8.根据前面权利要求之一的组合物，其中组合物还包含另一种免疫促进剂；和/或益生菌，所述益生菌优选的选自乳杆菌、双歧杆菌和/或酵母。
9.根据前面权利要求之一的组合物，其中组合物包含脂肪部分和/或碳水化合物部分。
10.根据前面权利要求之一的组合物，其中组合物还包含止痛剂、稳定剂、调味剂、着色剂、润滑剂和/或益生素例如寡聚果糖、寡聚半乳糖(galactosyloligosaccharides)、果胶和/或其水解产物。
11.根据前面权利要求之一的组合物，其中组合物旨在用于人或宠物。
12.根据前面权利要求之一的组合物，其中N-乙酰神经氨酸以每克组合物干质量
1mg-250mg的量存在于组合物中。
13.根据前面权利要求之一的组合物，其中N-乙酰神经氨酸以1mg-2g/kg待治疗者体重的每日量施用，优选的0.025g至0.8g/kg体重。
14.根据前面权利要求之一的组合物，其中组合物选自基于奶粉的产品、方便饮料、可立即饮用的制剂、营养粉、营养液、基于奶的产品特别是酸奶或冰激凌、谷物产品、饮料、水、咖啡、热牛奶咖啡、麦芽饮料、巧克力口味饮料、烹饪产品、汤、外用霜、栓剂、片剂、糖浆和经皮给药的制剂。
15.根据前面权利要求之一的组合物，用于对老年人施用。
强化老年人免疫系统的唾液酸
[0001] 本发明大体上涉及免疫系统领域，特别是涉及强化老年人的免疫系统。本发明的一个实施方案涉及富含唾液酸的食物产品在制备强化老年人免疫系统的组合物中的用途。
[0002] 在衰老过程中免疫功能下降，此现象影响每个人和动物。这表现为对感染的易感性增加和提高的发病率和死亡率。
[0003] 例如，免疫系统中的衰老相关变化包括T细胞亚群的变化，未致敏T细胞的减少和记忆T细胞的积聚，导致T细胞功能的下降。类似的，老年人的初次抗体应答经常是微弱和短暂的，并具有较低的亲和力。因此，一般老年人的免疫系统保护身体对抗外部攻击的能力较弱。
[0006] 然而，在本领域内仍然需要替代方法以强化身体的免疫防御。
[0007] 本发明者已论述了此需要。
[0008] 因此，本发明的目的是为本领域提供以下组合物，所述组合物可应用于所有人，可施用而不具有害副作用，不昂贵，可用于强化老年人的免疫系统。
[0010] 唾液酸(SiAc)是神经氨酸(NeuAc)衍生的带电荷的9碳单糖家族，包括NeuAc。NeuAc是通常在人中形成的唯一唾液酸。在其他脊椎动物也存在例如N-乙醇酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid，NeuGc)。
[0011] 目前，唾液酸经常用于婴儿营养领域。例如，Wang概述了SiAc可能涉及婴儿的认知发育(Wang，B.和Brand-Miller，J.(2003)Eur.J.Clin.Nutr.Nov；57(11)：1351-69)。简言之，比较母乳喂养和配方奶喂养婴儿的研究证明，与普通婴儿配方奶相比母乳中较高的NeuAc含量与婴儿唾液和大脑中增加的NeuAc有相关性。然而，无法观察到在人中补充NeuAc的行为效应。尽管如此，人们猜测在牛奶中补充NeuAc可以为牛奶提供人奶品质，这可能对儿童的大脑发育有影响。
[0012] 富含NeuAc的天然来源为，例如，人奶、象奶、印度水牛奶、肉、蛋和鱼。
[0013] 本发明者已经发现，唾液酸不仅可成功施用于婴儿，而且在强化老年人的免疫系统中特别有效。
[0014] 将本发明的组合物施用于老年动物导致改善的细胞介导的免疫反应，通过迟发型超敏反应测量。同时，在用本发明组合物喂养的动物肝脏中，和对照组相比，编码抗炎症分子或涉及防御氧化损伤的分子的基因表达提高了。
[0015] 不希望受理论限制，发明者现在猜测，改善的免疫反应可能通过在肝脏中发现的炎症和氧化损伤的减少来解释，所述炎症和氧化损伤似乎随年龄而增多，并在施用所述富含唾液酸的组合物后可减少。
[0016] 如果N-乙酰神经氨酸可用于此目的将是优选的，因为这也是在人中天然形成的唯一唾液酸。
[0017] P. 等人描述了唾液酸的抗炎症作用(Agents and Actions，卷8，第5册，1987，543-545)。
[0018] WO 2005/056047描述了唾液酸及其类似物作为抗炎症剂的用途。
[0019] JP2048529A公开了N-乙酰神经氨酸(I)具有抑制I-型过敏的作用。
[0020] 然而，这样施用N-乙酰神经氨酸导致非常快的“急性”摄取，N-乙酰神经氨酸的系统增加通过更高的尿排泄，触发循环N-乙酰神经氨酸水平的重建。
[0021] 因此期望提供下述形式的N-乙酰神经氨酸，即此形式可避免N-乙酰神经氨酸高峰的形成和由此提高的N-乙酰神经氨酸排泄。
[0025] 本发明还涉及组合物在制备用于治疗或预防与免疫系统改变相关疾病的组合物中的用途，所述组合物包含蛋白质部分，所述蛋白质部分包含与富含苏氨酸的肽/蛋白质骨架结合的N-乙酰神经氨酸。
[0026] 富含苏氨酸的意思是苏氨酸含量高于人蛋白质质量的平均苏氨酸丰度。例如，苏氨酸含量与人蛋白质质量的平均苏氨酸丰度的相比提高至少10％。
[0027] 因此苏氨酸在蛋白质部分的氨基酸中至少占6.3摩尔-％。
[0028] 例如，苏氨酸可在氨基酸总数中占约8到22％之间的量。
[0029] 蛋白质部分可进一步包含以质量计约7至25％的N-乙酰神经氨酸。
[0030] N-乙酰神经氨酸可以结合多糖的形式提供。例如N-乙酰神经氨酸可以结合糖蛋白和/或蛋白聚糖的形式提供。
[0031] 根据本发明特别优选的实施方案，蛋白质部分包含N-乙酰神经氨酸(NeuAc)，其特征在于富含苏氨酸的肽/蛋白质骨架(在氨基酸总数中约8到22％之间)和7至25％以质量计的NeuAc含量。
[0032] N-乙酰神经氨酸可以寡糖组分的形式提供，例如，其包含糖基化的氨基酸和具有通式RnSacm的肽，其中R为氨基酸残基，Sac为选自N-乙酰神经氨酸、N-乙酰半乳糖胺和半乳糖的单糖，n为1和10之间的值，附带条件是如果n的值为1，则R为苏氨酸残基或丝氨酸残基，如果n的值在2和10之间，则肽包含至少1个苏氨酸或丝氨酸残基，m的值在2和4之间则至少15摩尔％的组分为N-乙酰神经氨酸。
[0033] 优选的n的值在1和3之间，m的值为3或4。
[0034] 组分包含至少15摩尔％的唾液酸作为连接在苏氨酸或丝氨酸羟基上的糖链部分。唾液酸可组成链的一部分或其本身作为链中的单糖单元的取代基。
[0035] 优选的，寡糖组分包含以下单糖：-
[0036]化合物 摩尔％
N-乙酰半乳糖胺(GalNAc) 20-25
半乳糖(Gal) 20-25
N-乙酰神经氨酸(NeuAc) 40-17.5
N-乙酰半乳糖胺(GalNAc) 20-25
半乳糖(Gal) 20-25
N-乙酰神经氨酸(NeuAc) 40-17.5
[0037] 寡糖组分可包含20至25摩尔％的丝氨酸和苏氨酸混合物。
[0038] 寡糖组分可包含以下糖基化氨基酸或肽：-
[0039] NeuAc-α-2，3-Gal-β-1，3-(NeuAc-α-2，6-)-GalNAc-Rn
[0040] NeuAc-α-2，3-Gal-β-1，3-GalNAc-Rn
[0041] Gal-β-1，3-(NeuAc-α-2，6-)-GalNAc-Rn
[0042] Gal-β-1，3-GalNAc-Rn
[0043] 本发明的寡糖组分可通过CGMP水解制备，同时或相继使用外切蛋白酶和内切蛋白酶以得到游离氨基酸和链长在2和10之间的肽的混合物，将水解混合物经纳米过滤以保留分子量在1000和2000道尔顿之间的部分。
[0044] CGMP本身是制造奶酪的副产品，其中全脂奶通过凝乳酶处理以析出酪蛋白。在此过程中，CGMP从κ酪蛋白上切除并和乳清蛋白保留在溶液中。此产品被称为甜乳清。可使用任意本领域已知方法将CGMP从乳清蛋白中分离。合适的方法描述于欧洲专利号986312中。
[0045] 不受理论限制，基于以下原因，发明者认为包含与富含苏氨酸的肽/蛋白质骨架结合的N-乙酰神经氨酸(例如结合多糖的N-乙酰神经氨酸)的蛋白质部分比游离的N-乙酰神经氨酸有优势。游离N-乙酰神经氨酸导致非常快的“急性”摄取，N-乙酰神经氨酸的系统增加通过更高的尿排泄触发循环N-乙酰神经氨酸水平的重建。包含与富含苏氨酸的肽/蛋白质骨架结合的N-乙酰神经氨酸的蛋白质部分能够避免这一现象。例如，结合多糖的N-乙酰神经氨酸可到达所有的肠部分，(i)在包括小肠下部和结肠的整个肠内导致缓慢的“慢性”N-乙酰神经氨酸摄取，和(ii)刺激有益的肠微生物群。有益肠微生物群例如一些双歧杆菌，将N-乙酰神经氨酸从骨架(例如多糖骨架)上切割下来，在肠下部帮助N-乙酰神经氨酸摄取，之后自身能够从骨架(例如多糖骨架)中获益，这可通过有益微生物群对宿主的额外免疫促进作用观察到。因此可观察到与富含苏氨酸的肽/蛋白质骨架结合的N-乙酰神经氨酸(例如结合多糖的N-乙酰神经氨酸)相比游离N-乙酰神经氨酸的协同益处。
[0046] 组合物可对老年人施用。
[0047] 本发明还涉及N-乙酰神经氨酸在制备用于强化老年人免疫系统的组合物中的用途。
[0048] 本发明还涉及N-乙酰神经氨酸在制备用于治疗或预防与免疫系统改变相关疾病的组合物中的用途。
[0049] 免疫系统改变可为免疫系统失调，例如细胞介导的免疫反应的显著下降伴随体液免疫功能障碍的增加，正如在老年人中经常发生的。
[0050] 这可导致对疫苗的较低应答。本发明的组合物可用于引发刺激疫苗应答的作用。因此，其可用于提高接种的效果。
[0051] 可通过本发明组合物提高效果的一般接种为例如流感、肺炎、乙肝、肺结核、白喉和破伤风的接种。
[0052] 因此本发明的组合物可与疫苗共同施用。共同施用包括为了本发明的目的，在接种期前3个月至接种期后3个月施用本发明组合物。
[0053] 优选的，在接种期施用本发明的组合物。
[0054] 本发明因此还涉及分别与流感、乙肝、肺结核、白喉或破伤风疫苗共同施用的组合物以预防流感、乙肝、肺结核、白喉或破伤风，所述组合物包含蛋白质部分，所述蛋白质部分包含与富含苏氨酸的肽/蛋白质骨架结合的N-乙酰神经氨酸。
[0055] 如果个体已经超过其原籍国平均预期寿命的前1/2，优选的，如果个体已经超过其原籍国平均预期寿命的前2/3，更优选的，如果个体已经超过其原籍国平均预期寿命的前3/4，最优选的，如果个体已经超过其原籍国平均预期寿命的前4/5，则认为个体是“老年人”。
[0056] 组合物可对人或动物施用，特别是宠物、伴侣动物和/或家畜。
[0057] 本发明还涉及富含N-乙酰神经氨酸的组合物。
[0058] N-乙酰神经氨酸具有以下同义词和缩写：o-唾液酸；5-Acetamido-3，5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid；5-Acetamido-3，5-dideoxy-D-glycero-D-galactonulosonic acid；醋纽拉酸；N-乙酰-神经氨酸(N-acetyl-neuraminate)；N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic acid)；NANA和Neu5Ac。
[0059] 本发明的组合物可为营养组合物、营养食品、饮料、食物添加剂或药物。食物添加剂或药物可为例如片剂、胶囊、锭剂或液体形式。食物添加剂或药物优选的以持续释放制剂提供，以得到延长时间的持续N-乙酰神经氨酸供给。
[0060] 组合物优选的选自基于奶粉的产品、方便饮料、可立即饮用的制剂、营养粉、营养液、基于奶的产品特别是酸奶或冰激凌、谷物产品、饮料、水、咖啡、热牛奶咖啡、麦芽饮料、巧克力口味饮料、烹饪产品、汤、外用霜、栓剂、片剂、糖浆和经皮给药的制剂。
[0062] 除了奶以外，可使用来源于奶的蛋白质部分或初乳。
[0063] 组合物可进一步包含保护性水状胶质(例如树胶、蛋白质、变性淀粉)、粘合物、成膜剂、成胶囊剂/材料、囊/外壳材料、基质化合物、涂料、乳化剂、表面活性剂、加溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等等)、吸附剂、载体、填料、共化合物(co-compound)、分散剂、湿润剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、掩味剂、增重剂、胶凝剂(jellifying agents)、胶凝剂(gel formingagents)、抗氧化剂和抗菌剂。其还可包含传统药物添加剂和佐剂、赋形剂和稀释剂，包括但不局限于水、任意来源的明胶、植物胶、木素磺酸盐、滑石、糖、淀粉、阿拉伯树胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲液、润滑剂、着色剂、湿润剂、填料，等等。此外，其可包含适于口或肠施用的有机或无机载体材料及维生素、微量矿物质元素和符合政府机关推荐的例如美国推荐的日摄食量(USRDA)的其他微量营养素。
[0064] 例如，组合物可包含每日1次或多次剂量在给定范围内的下述微营养素：-300至500mg钙、50至100mg镁、150至250mg磷、5至20mg铁、1至7mg锌、0.1至0.3mg铜、50至
200μg碘、5至15μg硒、1000至3000μgβ-胡萝卜素、10至80mg维生素C、1至2mg维生素B1、0.5至1.5mg维生素B6、0.5至2mg维生素B2、5至18mg烟酸、0.5至2.0μg维生素B12、100至800μg叶酸、30至70μg生物素、1至5μg维生素D、3至10μg维生素E。
200μg碘、5至15μg硒、1000至3000μgβ-胡萝卜素、10至80mg维生素C、1至2mg维生素B1、0.5至1.5mg维生素B6、0.5至2mg维生素B2、5至18mg烟酸、0.5至2.0μg维生素B12、100至800μg叶酸、30至70μg生物素、1至5μg维生素D、3至10μg维生素E。
[0065] 本发明的组合物可包含蛋白质来源、碳水化合物来源和/或脂来源。
[0066] 可使用任意合适的膳食蛋白质，例如动物性蛋白质(例如奶蛋白、肉蛋白和卵蛋白)；植物性蛋白质(例如大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)；游离氨基酸的混合物；或其组合。奶蛋白例如酪蛋白和乳清和大豆蛋白是特别优选的。当蛋白质部分包含的苏氨酸为蛋白质部分氨基酸总数的约8和22％之间的量时，可以得到本发明目的的非常阳性的结果。
[0069] 本发明的组合物可用于治疗或预防免疫系统改变和/或改善改变的细胞介导的和体液免疫反应。
[0070] 免疫系统的改变可选自感染，特别是细菌、病毒、真菌和/或寄生虫感染；自身免疫类疾病；先天防御疾病，例如NK细胞缺陷、巨噬细胞缺陷，例如白细胞粘附缺陷、周期性中性白细胞减少；及其组合。自身免疫类疾病包括自身免疫疾病。
[0071] 本发明的组合物可用于治疗或预防感染性疾病。N-乙酰神经氨酸可帮助例如强化身体的免疫系统从而帮助对抗感染。
[0072] 可通过加入至少一种其他免疫促进剂进一步增强组合物的免疫促进作用。
[0073] 组合物还可包含益生菌微生物和/或益生素例如寡聚果糖、寡聚半乳糖(galactosyloligosaccharides)、果胶和/或其水解产物。
[0074] “益生菌”是指对宿主健康或身心健康具有益作用的微生物细胞制备物或微生物细胞组分。(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics：how should they be defined”Trends Food Sci.Technol.1999：10 107-10)。
[0075] 根据本发明可使用所有益生菌微生物。优选的，它们可选自双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)和酵母属(Saccharomyces)或其混合物，特别选自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、胚芽乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)和罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)或其混合物，优选的选自约氏乳杆菌(NCC533；CNCM I-1225)、长双歧杆菌(NCC490；CNCM I-2170)、长双歧杆菌(NCC2705；CNCM I-2618)、乳双歧杆菌(2818；CNCM I-3446)、副干酪乳杆菌(NCC2461；CNCM I-2116)、鼠李糖乳杆菌GG(ATCC53103)、鼠李糖乳杆菌(NCC4007；CGMCC 1.3724)、屎肠球菌SF 68(NCIMB101415)，和其混合物。
[0076] 本发明的组合物还可包含止痛剂、稳定剂、调味剂、着色剂、润滑剂和/或益生素。
[0077] 如果组合物包含益生菌，由于益生菌和益生素的存在产生协同效应，益生素是特别优选的。
[0078] “益生素”的意思是在肠中促进益生菌生长的食物成分。它们不在消化其的人胃和/或肠上部被分解或在肠胃道被吸收，但被胃肠微生物群和/或益生菌发酵。在例如Glenn R.Gibson和Marcel B.Roberfroid，Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota：Introducing the Concept of Prebiotics，J.Nutr.1995125：1401-1412中定义了益生素。
[0079] 根据本发明可使用的益生素没有特别限制，包括所有在肠中促进益生菌生长的食物成分。优选的，它们可选自寡糖，任选的包含果糖、半乳糖、甘露糖；膳食纤维，特别是可溶纤维、大豆纤维；菊粉；或其混合物。优选的益生素为寡聚果糖、寡聚半乳糖(galacto-oligosaccharides)、寡聚异麦芽糖、寡聚木糖、大豆寡糖、糖基蔗糖、乳蔗糖、乳果糖、寡聚异麦芽酮糖、寡聚麦芽糖、树胶和/或其水解产物、果胶和/或其水解产物。
[0080] 发现本发明组合物中N-乙酰神经氨酸的效果基本上是剂量依赖性的。小剂量将产生较小的效果，大剂量可能过大以致身体无法利用所有提供的N-乙酰神经氨酸。需要提供的N-乙酰神经氨酸的确切量将取决于例如待治疗者及其病症。
[0081] 尽管一般来说N-乙酰神经氨酸的每种剂量都会产生有益的效果，发现如果N-乙酰神经氨酸以每克组合物干质量1mg-250mg的量存在于组合物中时是特别优选的。
[0082] N-乙酰神经氨酸可以1mg-2g/kg待治疗者体重的每日量施用，优选的0.025g至0.8g/kg体重。
[0083] 本领域技术人员应当理解，在不背离公开的发明范围内，他们可以自由组合此处描述的本发明的所有特征。特别的，可将用于描述本发明用途的特征应用于本发明的组合物，反之亦然。
[0084] 通过以下实施例和图，本发明的其他优势和特征是显而易见的。
[0085] 图
[0086] 图1显示了在未添加(AIN-93，n＝10)和添加SiAc(SiAc，n＝10)的老年小鼠中的细胞介导的迟发型超敏(DTH)免疫反应。
[0087] 图2显示了在未添加(AIN-93，n＝8)和添加SiAc(SiAc，n＝8)42天的老年小鼠的肝中编码涉及抗炎症过程的分子(TGF-β2)和在防御氧化损伤中发挥作用的分子(HO-1和SOD-2)的mRNA表达。实施例
[0088] 衰老与免疫系统失调相关，所述免疫系统失调为例如细胞介导的免疫反应的显著下降伴随体液免疫功能障碍的增加(例如对疫苗的较低应答)。衰老还经常伴随着轻度炎症和提高的氧化应激。因此，特别是很多老年个体处于增高的感染性和非感染性疾病风险下，导致发病和死亡。
[0089] 在老年小鼠中评估免疫调节的研究设计
[0090] 无特异性病原体的雄性C57BL/6J小鼠(4周大)购自Janvier(France)。在传统环境下(12小时光/暗周期，温度22℃，湿度56％)饲养小鼠，随意食用水和半合成Kliba3436饮食。保持每笼5只小鼠直到5个月大，之后每笼单独饲养。所有条件和动物的操作由雀巢公司(Nestlé)和国家伦理委员会(state ethical committees)认可和瑞士联邦兽医顾问(Swiss Federal Veterinary Advisor)同意。19个月的老年小鼠随机分为2组，每组10只动物，使用未添加(对照组AIN-93，n＝10)或添加SiAc(饮食中含0.8重量-％的N-乙酰神经氨酸)(SiAc组，n＝10)的半合成AIN-93饮食喂食。在试验的42天中，所有小鼠可随意饮水和进食。
[0091] 使用DTH反应作为细胞免疫的体内量度。在试验前和试验后24小时至6天测量耳厚度(耳肿胀)，通过诱导可测定产生DTH反应的能力。简言之，在试验的第15天，将小鼠经皮下注射(100μl)免疫，使用100μg在1％Alum(Brenntag Biosector，Frederikssund，Denmark)中的惰性抗体Keyhole Limpet Haemocyanin(KLH，Sigma)。免疫7天后，通过将回忆抗原KLH(10μl，0.5μg/ml)注射至每只小鼠的右耳诱导DTH反应。用单独的载体(盐水＝PBS)注射左耳作为每只动物的内部对照。在诱导后24小时和之后的5天中测量未诱导(左耳)和诱导的(右耳)耳二者。用耳肿胀的大小表示DTH反应(KLH-PBS)，即使用以下公式表示耳厚度的变化：Δ耳厚度＝[诱导耳(右，KLH)耳厚度-非诱导耳(左，PBS)耳厚度]，其中Δ耳厚度＝[诱导后-诱导前的耳厚度]。
[0092] 在试验第42天处死小鼠。测量添加或未添加SiAc 42天的老年小鼠肝中涉及炎症过程的基因表达。
[0093] 在尸体解剖中，移除肝并将一片肝立即在液氮中冷冻，之后贮存于-80℃直至进一步分析。
[0094] 肝样品转移至1ml RNA裂解缓冲液(Macherey-Nagel，D üren，Germany)，使用Ribolyzer(Hybaid，Waltham，MA，USA)以如下设置匀浆：强度6，20秒。使用市售的试剂盒(NucleoSpin RNA II试剂盒；Macherey-Nagel，Düren，Germany)进行RNA提取。使用Ribogreen RNA定量试剂盒(Molecular Probes；Eugene，Oregon USA)进行RNA定量，使用Agilent RNA 6000 Nano LabChip试剂盒(Agilent Technologies，PaloAlto，USA)测定RNA的质量。使用Multiscribe逆转录酶按照制造商的说明书(Applied biosystems，Biosystems；Rokreutz，Switzerland)逆转录总RNA(2μg)。
[0095] 定制的具有TaqMan探针的低密度芯片购自Applied Biosystems(Foster City，USA)，根据制造商的说明书使用。使用相对定量法ΔΔCt法使用SDS 2.2.2软件(Applied Biosystems)计算基因表达。得到的循环阈值(Ct)导出至MS Excel(Microsoft，USA)用于进一步分析。简言之，首先计算ΔCt值(即靶基因的Ct值-GAPDH看家基因的Ct值)，之后-ΔCt 6使用以下公式测量相对mRNA表达：2 x10。通过平均值+/-标准误和适当的Student′s T检验(不成对)或双因素方差分析(two-way ANOVA)分析数据。认为小于5％的概率值是显著的。
[0096] 结果：
[0097] 在老年小鼠中添加SiAc的免疫增强作用
[0098] 在饮食中添加SiAc(饮食中加入0.8重量-％的N-乙酰神经氨酸)在老年小鼠中改善了细胞介导的免疫反应(图1)。此添加减轻了年龄相关的轻度炎症和氧化损伤(图2)，正如观察到的编码抗炎症分子(例如TGF-β2)或涉及对抗氧化损伤的防御分子(例如HO-1和SOD2)的基因表达的提高。
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