合欢皮中抑制血管生成的一种高效低毒的有效部位的制备和应用
阅读：97发布：2024-02-21
专利汇可以提供合欢皮中抑制血管生成的一种高效低毒的有效部位的制备和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及合欢皮中抑制血管生成的有效部位的制备方法及实际应用。其制备方法为：合欢皮用70％ 乙醇 加热提取，提取物经 水 饱和正丁醇萃取，得到合欢皮中抑制血管生成的有效部位，其药效较高且毒性较小。本发明以血管生成作为 治疗 疾病 的靶点，研究并阐明合欢皮有效部位的药用疗效和机制，为其新用途开发和发现药物作用新的靶点提供科学依据和重要信息。本发明的有效部位可与药学上适用载体混合制成各种制剂。它可用于治疗或 预防 与血管生成相关的疾病，还可用于 肿瘤 化疗和/或辅助化疗方面的治疗。，下面是合欢皮中抑制血管生成的一种高效低毒的有效部位的制备和应用专利的具体信息内容。
1.一种权利要求合欢皮中具有抑制血管生成作用的一种高效低毒的有效部位。
2.根据权利要求1所述的有效部位，其特征是所述有效部位来源于合欢皮Albizzia Julibrissin Durazz。
3.权利要求1或2所述有效部位的提取方法，其特征是，用有机溶剂、含水有机溶剂或水来提取合欢皮的干燥树皮、茎皮、叶、花、种子、豆荚或根，并将提取液过滤、浓缩成浸膏。
4.权利要求1或2所述有效部位的制备方法，其特征是将权利要求3所得的浸膏经水饱和正丁醇萃取，收集有效部位，回收溶剂成浸膏，冷冻干燥制成干粉。
5.一种权利要求3，4所述的有效部位在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征是该抑制血管生成药物中含有有效剂量的几种合欢皮有效部位和/或有效成分，以及常规药用载体和/或赋形剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物被制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂等剂型。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物是用于预防和/或治疗至少一种选自下述之一的疾病：癌症和/或癌症转移，血管瘤，血管纤维瘤，新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞，视网膜变性，晶体后纤维组织增生，颗粒性结膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黄斑和黄斑变性，牛皮癣，老年盘状斑变性及风湿性关节炎，银屑病，毛细管扩张，脓性肉芽肿，伤口愈合中抑制斑痕形成，动脉粥样硬化，脂溢性皮炎和痤疮。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征是该药物有抗肿瘤血管生成及其它与血管生成有关疾病治疗、预防的用途。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征是该药用组合物还有用于肿瘤化疗和/或辅助化疗的用途。
10.一种权利要求3，4所述的一种有效部位体在制备抑制血管生成的保健食品中的应用，其特征是该有效部位用于抑制血管生成的保健食品组合物。
合欢皮中抑制血管生成的一种高效低毒的有效部位的制备
和应用
技术领域
背景技术
[0002] 恶性肿瘤直径大于1毫米呈肿瘤转移趋势时，必需先形成新的肿瘤血管。抑制肿瘤内部和周围新血管形成便可有效减少，甚至消除肿瘤。近年来，肿瘤血管生成已成为肿瘤治疗中一个很有吸引力的热点。目前开发出许多血管生成抑制剂在进行I～III期临床试验研究，例如血管生成抑素(Angiostatin)、内皮抑素(Endostatin)、烟曲霉素类似物及金属蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素-12、血小板因子、Bufotanine等20多种。美国Genentech公司以血管内皮生长因子(vessel endothelial growth factor，VEGF)为靶标的抗新生血管形成药Avastin近年用于治疗晚期转移的直肠癌和乳腺癌等，延长病人生命4-6个月。2007年Avastin的年销售量已超过24.5亿美元，2009年第一季度销售额达到13亿美元。Avasitin成为近年抗癌新药的一枝独秀。此外，几种针对不同靶标的抗新生血管形成的药物已进入II、III期临床试验[1、Ellis LM，Hicklin DJ.VEGF-targeted therapy：
mechanisms of anti-tumour activity.Nat Rev Cancer.2008，8：579-591.]。 [0003] 但目前上市的抑制肿瘤血管新生的药物只能静脉给药，且用药剂量较大、治疗时间长。因此开发口服、高效低毒、价廉的血管生成抑制剂成为该领域的热点。 [0004] “多成分、多靶点、多途径”是中药治疗疾病的特点，发挥祖国医学特色，从多途径、多层次、多环节，研究中药直接地或间接地影响血管新生，有着重要的临床意义和应用前景。通过建立体内、体外血管生成筛选模型，寻找到目的中药合欢皮等，并对其进行提取分离，获得若干有效部位。进一步通过药效与毒性评价，得到一高效低毒有效部位。 [0005] 合欢皮是中国药典一部收录的一味常用中药，为豆科植物合欢Albizia julibrissin Durazz.的干燥树皮，具有解郁安神，活血消肿的功能，用于心神不安，忧郁失眠，肺痈疮肿，跌扑伤痛等症[2、国家药典委员会。中国药典第一部，中国医药科技出版社，北京，pp34]。合欢属植物树皮、茎皮、叶、花、种子的主要的化学成分有三萜及其苷类化合物、黄酮及其苷类化合物、生物碱、有机酸、甾醇类化合物、木脂素、鞣质及挥发性成分等。现代药理实验表明，合欢属植物具有广泛的抗癌、镇静、抗生育、PAF受体拮抗和抗炎等作用[3、乔善义，蔚冬红，郭继芬。组合LC2MS2MS鉴定技术的生物活性导向研究合欢皮抗炎活性部位。中国中药杂志，2007，32(19)：2021-2024]。也有研究发现合欢皮提取物具有广泛的体内、体外抑制肿瘤细胞增殖的活性，但由于其抗癌作用机制还不明确，限制了其抗癌作用的临床应用[4、Tsuyoshi Ikeda，Tetsuya Kajimoto，Toshihiro Nohara，Jun-ei Kinjo，Chi-Huey Wong.Preparation of a neoglycolipid carrying theoligosaccharide component of saponin from Albizzia julibrissin.Tetrahedron Letters.1995，36(9)：
1509-1510.5、Kun Zou，Yuying Zhao，Guangzhong Tu，Jingrong Cui，Zhonghua Jia and Ruyi Zhang.Two diastereomericsaponins with cytotoxic activity from Albizia julibrissin.Carbohydrate Research.2000，324(3)：182-188.6、KunZou，Yuying Zhao，Guangzhong Tu，Junhua Zheng，Ruyi Zhang.A New Isomer of Julibroside J2 from Albiziajulibrissin.J Asian Natural Products Research.1998，1(1)：59-66.7、邹坤，赵玉英，李德宇，徐锋，郑俊华，张如意.合欢皮的脂溶性成分.北京医科大学学报，1999，
31(1)：32-34.]
mechanisms of anti-tumour activity.Nat Rev Cancer.2008，8：579-591.]。 [0003] 但目前上市的抑制肿瘤血管新生的药物只能静脉给药，且用药剂量较大、治疗时间长。因此开发口服、高效低毒、价廉的血管生成抑制剂成为该领域的热点。 [0004] “多成分、多靶点、多途径”是中药治疗疾病的特点，发挥祖国医学特色，从多途径、多层次、多环节，研究中药直接地或间接地影响血管新生，有着重要的临床意义和应用前景。通过建立体内、体外血管生成筛选模型，寻找到目的中药合欢皮等，并对其进行提取分离，获得若干有效部位。进一步通过药效与毒性评价，得到一高效低毒有效部位。 [0005] 合欢皮是中国药典一部收录的一味常用中药，为豆科植物合欢Albizia julibrissin Durazz.的干燥树皮，具有解郁安神，活血消肿的功能，用于心神不安，忧郁失眠，肺痈疮肿，跌扑伤痛等症[2、国家药典委员会。中国药典第一部，中国医药科技出版社，北京，pp34]。合欢属植物树皮、茎皮、叶、花、种子的主要的化学成分有三萜及其苷类化合物、黄酮及其苷类化合物、生物碱、有机酸、甾醇类化合物、木脂素、鞣质及挥发性成分等。现代药理实验表明，合欢属植物具有广泛的抗癌、镇静、抗生育、PAF受体拮抗和抗炎等作用[3、乔善义，蔚冬红，郭继芬。组合LC2MS2MS鉴定技术的生物活性导向研究合欢皮抗炎活性部位。中国中药杂志，2007，32(19)：2021-2024]。也有研究发现合欢皮提取物具有广泛的体内、体外抑制肿瘤细胞增殖的活性，但由于其抗癌作用机制还不明确，限制了其抗癌作用的临床应用[4、Tsuyoshi Ikeda，Tetsuya Kajimoto，Toshihiro Nohara，Jun-ei Kinjo，Chi-Huey Wong.Preparation of a neoglycolipid carrying theoligosaccharide component of saponin from Albizzia julibrissin.Tetrahedron Letters.1995，36(9)：
1509-1510.5、Kun Zou，Yuying Zhao，Guangzhong Tu，Jingrong Cui，Zhonghua Jia and Ruyi Zhang.Two diastereomericsaponins with cytotoxic activity from Albizia julibrissin.Carbohydrate Research.2000，324(3)：182-188.6、KunZou，Yuying Zhao，Guangzhong Tu，Junhua Zheng，Ruyi Zhang.A New Isomer of Julibroside J2 from Albiziajulibrissin.J Asian Natural Products Research.1998，1(1)：59-66.7、邹坤，赵玉英，李德宇，徐锋，郑俊华，张如意.合欢皮的脂溶性成分.北京医科大学学报，1999，
31(1)：32-34.]
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种从合欢皮中提取分离得到的高效低毒的有效部位，具有抑制血管生成的作用。
[0007] 本发明的技术方案：
[0008] 一种用于抑制血管生成的高效低毒的合欢皮有效部位。
[0009] 所述有效部位的制备方法，用70％乙醇加热回流提取合欢皮的干燥树皮、茎皮、叶、花、种子、豆荚或根，并将提取液过滤、浓缩成浸膏。所得的浸膏用水饱和正丁醇萃取，收集萃取相有效部位，回收溶剂成浸膏，冷冻干燥制成干粉。
[0010] 所述有效部位，体内、体外均有抑制血管生成的作用。
[0011] 所述有效部位经Molish反应、Libermann-Buchard反应、三氯化锑反应均呈阳性，说明上述这些有效部位均含有至少一种以上苷类成分。
[0012] 所述合欢皮有效部位在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征是该抑制血管生成药物中含有几种有效剂量的合欢皮有效部位，以及常规药用载体和/或赋形剂。 [0013] 所述合欢皮有效部位在制成抑制血管生成药物时，可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂，赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
[0014] 所述合欢皮有效部位在制成抑制血管生成药物时，可以按常规的制剂工艺，单独使用或与其它药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，例如注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂等多种形式。
[0015] 所述的应用，为所述有效部位是用于预防和/或治疗至少一种选自下述之一的疾病：癌症和/或癌症转移，血管瘤，血管纤维瘤，新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞，视网膜变性，晶体后纤维组织增生，颗粒性结膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黄斑和黄斑变性，牛皮癣，老年盘状斑变性及风湿性关节炎，银屑病，毛细管扩张，脓性肉芽肿，伤口愈合中抑制斑痕形成，动脉粥样便化，脂溢性皮炎和痤疮。
[0016] 所述的应用，为所述有效部位有抗肿瘤血管生成及其它与血管生成有关疾病治疗、预防的用途。
[0017] 所述的应用，为所述有效部位还有用于肿瘤化疗和/或辅助化疗的用途。 [0018] 所述有效部位在制备抑制血管生成的保健食品中的应用，是上述有效部位用于抑制血管生成的保健食品组合物。
[0019] 所述有效部位在制备抑制血管生成的化妆品中的应用，是上述有效部位用于抑制血管生成的化妆品组合物。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] 本发明以血管生成作为治疗疾病的靶点，首次明确合欢皮中具有抑制血管生成活性的高效低毒有效部位的制备工艺方法，并将其作为用于肿瘤血管生成及其它与血管生成有关的疾病预防、治疗的药物，其特点是剂量小，疗效高，副作用小。且以血管生成理论为研究背景，为今后阐述中药有效部位的作用机制，发展中医药理论新的方向，发现新的药物作用靶点提供重要的科学依据。附图说明
[0022] 图1合欢皮有效部位对HMEC和3B11细胞体外增殖的抑制作用
[0023] 图2合欢皮有效部位对体外HMEC细胞迁移的抑制作用
[0024] 图3合欢皮有效部位对体外3B11细胞迁移的抑制作用
[0025] 图4合欢皮有效部位对体外HMEC成管的抑制作用
[0026] 图5合欢皮有效部位对体外3B11成管的抑制作用
[0027] 图6合欢皮有效部位对小鼠H22体内肿瘤的抑制作用
[0028] 图7合欢皮有效部位对小鼠H22实体瘤的病理改变图注：A模型组，B高剂量组，C中剂量组，D低剂量组
[0029] 图8致毒剂量合欢皮有效部位对小鼠主要脏器的损伤图注：AB心肌，CD肺，EF肝，GH脾，IJ肾
具体实施方式
[0030] 实施例1：合欢皮的有效部位提取分离工艺与理化性质的鉴定
[0032] 所得正丁醇组分旋转蒸发至浸膏状，水复溶，冷冻干燥，得率为原药材的1.25％。有效部位的Molish反应呈紫红色，Libermann-Buchard反应呈紫红色，三氯化锑显色为红色。此结果说明这一有效部位含有至少一种以上苷类化合物。
[0033] 实施例2：合欢皮的有效部位对HMEC和3B11细胞增殖的抑制作用
[0034] 将HMEC用含1mmol/L谷氨酰胺、1mg/L氢化可的松、10μg/L EGF和150ml/L小牛血清的MCDB-131培养液，于37℃，50ml/L CO2培养箱中传代培养。取对数生长期HMEC细胞，按每孔8000个细胞接种于96孔板中，放置于37℃、50ml/LCO2的培养箱中培养24h，加入不同浓度药物作用时间48h，以不加药组为阴性对照组，每组同时设3个复孔，每批样品重复3次试验。加药后培养至72h，去上清液，每孔轻轻加入100g/L三氯醋酸100μl固定，静置5min后移到4℃再放置至40min，倾掉固定液，用去离子水洗5遍，空气干燥。每孔加入4g/L SRB 100μl室温放置30min，用10ml/L醋酸液洗5遍，加入150μl10mmol/L Tris碱液(pH 10.5)溶解，用MK3型酶标仪在波长A540处测定每孔A值。计算抑制率(％)，求出半数细胞抑制浓度(IC50)。抑制率＝[(对照组的A值-药物组的A值)/(对照组的A值-空白组的A值)]×100％。3B11细胞用含1mmol/L谷氨酰胺、1mg/L青霉素/链霉素双抗和100ml/L胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，50ml/L CO2培养箱中传代培养，其余同HMEC。
[0035] 根据所得的结果计算，对HEMC和3B11细胞半数抑制量IC50分别为4.181±0.37μg/ml和7.74±0.54μg/ml。图1所示。
[0036] 3B11细胞是来源于恶性淋巴瘤的一株血管内皮细胞，本有效部位对其有明显的抑制作用IC50＝12.83μg/ml。图1所示。
[0037] 实施例3：合欢皮的有效部位对体外HMEC和3B11迁移的抑制作用
[0038] 分别取对数生长期HMEC和3B11细胞，用划线灼伤法研究细胞迁移。将常规培养4
的HMEC或3B11消化悬浮，以每孔6×10 个细胞加到24孔板中，置37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中孵育24h，待细胞贴壁后用移液塑料枪头于每孔中心位置划一条1mm宽的灼伤带，然后用PBS洗去脱落细胞，并加入含不同药物浓度的细胞培养基以及对照组。然后在100×显微镜下拍照，此刻为0h细胞迁移图，接着在12h、24h、48h分别于同一视野处拍，所得图片用图象软件进行处理，测量灼伤带距离，每个视野随机取6个位点，所得数据进行统计处理，并计算其迁移率[8、Eun-Sun H，Gun-Hee K.Allyl isothiocyanateinfluences in vitro invasion，adhesion and gene expression in SK-Hep1 cells.Journal of NutritionalBiochemistry，2006，10(4)：105-111.]。阴性对照组细胞的空白带的宽度较小，说明细胞迁移数量较高，而加入药物加以干预后，细胞迁移数明显减少。结果说明有效部位有抑制内皮细胞迁移的作用。它们可能通过抑制血管内皮细胞的迁移而抑制新生血管的生成。结果见图2、3所示。
的HMEC或3B11消化悬浮，以每孔6×10 个细胞加到24孔板中，置37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中孵育24h，待细胞贴壁后用移液塑料枪头于每孔中心位置划一条1mm宽的灼伤带，然后用PBS洗去脱落细胞，并加入含不同药物浓度的细胞培养基以及对照组。然后在100×显微镜下拍照，此刻为0h细胞迁移图，接着在12h、24h、48h分别于同一视野处拍，所得图片用图象软件进行处理，测量灼伤带距离，每个视野随机取6个位点，所得数据进行统计处理，并计算其迁移率[8、Eun-Sun H，Gun-Hee K.Allyl isothiocyanateinfluences in vitro invasion，adhesion and gene expression in SK-Hep1 cells.Journal of NutritionalBiochemistry，2006，10(4)：105-111.]。阴性对照组细胞的空白带的宽度较小，说明细胞迁移数量较高，而加入药物加以干预后，细胞迁移数明显减少。结果说明有效部位有抑制内皮细胞迁移的作用。它们可能通过抑制血管内皮细胞的迁移而抑制新生血管的生成。结果见图2、3所示。
[0039] 实施例4：合欢皮的有效部位对体外HMEC和3B11成管的抑制作用
[0040] 参照文献方法进行[9、Thaloor D，Singh AK，Sidhu GS，et al.Inhibition of angiogenic differenti-ation ofhuman umbilical vein endothelial cells by curcumin[J].CellGrowth Diff，1998，9：305-312.10、Zhou Q， Kiosses，WB，Liu J，et al.Tumor endothelial cell tube formation model for determining anti-angiogenic activity ofa tRNA synthetase cytokine[J].2008，44：190-195]。于4℃下在24孔培养板的底部，加入150μL/孔Matrigel，铺平合于37℃5％CO2培养箱30min。将药物按不同浓度与细胞悬液等体积混匀，每孔体积为200μl总悬液，并设置对照组，37℃，5％CO2，4-16h，在倒置显微镜下，每隔一段时间进行拍照。结果显示此有效部位对HMEC-1和3B11细胞体外Matrigel小管的形成均有明显的抑制作用。结果见图4、5所示。
[0041] 实施例5：合欢皮的有效部位对小鼠体内H22实体瘤的抑制作用
[0042] 取对数生长期H22细胞，消化，用0.9％生理盐水稀释调整浓度至镜下瘤细胞7
1×10 个/ml，将细胞悬液置于冰上，用1ml无菌注射器分别于每只小鼠右腋皮下接种
0.2ml，整个过程在半小时内完成。动物造模右腋下接种作为实体瘤小鼠。接种后的实体瘤小鼠随机分为四组，模型组及给药高剂量组8mg/kg、中剂量组4mg/kg、低剂量组2mg/kg三个剂量组，每组各10只。于24小时合准时给药，灌胃1/日，连续10天。结果表明：各剂量组明显抑制肿瘤生长，抑制率在30-70％之间，有明显的量效关系。HE染色病理镜下观：治疗组新生血管密度减少，有不同程度的坏死区。图6、7所示。
1×10 个/ml，将细胞悬液置于冰上，用1ml无菌注射器分别于每只小鼠右腋皮下接种
0.2ml，整个过程在半小时内完成。动物造模右腋下接种作为实体瘤小鼠。接种后的实体瘤小鼠随机分为四组，模型组及给药高剂量组8mg/kg、中剂量组4mg/kg、低剂量组2mg/kg三个剂量组，每组各10只。于24小时合准时给药，灌胃1/日，连续10天。结果表明：各剂量组明显抑制肿瘤生长，抑制率在30-70％之间，有明显的量效关系。HE染色病理镜下观：治疗组新生血管密度减少，有不同程度的坏死区。图6、7所示。
[0043] 实施例6：合欢皮有效部位小鼠急性毒性
[0044] ICR小鼠，雌雄各半，体重18-25g。禁食4h后一次性灌胃给药，给药后再禁食2h，连续观察14d。
[0045] 6.1近似致死量和最小致毒量的探究
[0046] 以临床人用原药的最大剂量为依据，折算有效部位含量，折算后相当于小鼠用量3.75mg/kg，并以此量(3.75mg/kg)高于其4倍(15mg/kg)、10倍(37.5mg/kg)、20倍(75mg/kg)、50倍(187.5mg/kg)、100倍375mg/kg)、200倍(750mg/kg)、500倍(1875mg/kg)、1000倍(3750mg/kg)剂量分组给药，每组动物3只，同时设生理盐水对照组。随剂量增至100mg/kg时，出现毒性反应。其一般表现轻度饮食减少、体重减轻。病理报告：肝、肾均有轻度变性样损伤。4000mg/kg时出现小鼠死亡，尸解情况：心、肺、肝、脾均有明显淤血征，心肌松弛，肺片状出血，肝质脆、边缘变钝、表面颗粒粗大，胃内少量软食糜，膀胱无充盈，其余肉眼观无明显异常。病理报告：心肌大片变性坏死灶，肝弥漫性损伤，脾淤血，肾小管上皮细胞变性坏死，部分肠粘膜脱落。
[0047] 6.2重要脏器形态学观察
[0048] 小鼠灌胃14天时，脱颈致死，速取心、脑、肺、肝、脾、肾新鲜组织，于10％福尔马林固定，常规浸蜡包埋，5μm切片。切片脱水脱蜡，苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色。心：淤血、变性、坏死。肺：片状出血。肝：呈弥漫性变性损伤。脾：淤血且有大量巨噬细胞浸润。肾：肾小管上皮细胞水样变性。图8所示。
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