目前临床肿瘤治疗的一个主要问题是，由于在手术切除原发性肿 瘤的部位仍然存在单个肿瘤细胞，新的肿瘤开始生长。术前或术后肿 瘤细胞的转移产生类似的问题。最近20年，大量实验或临床研究报 告证明，恶性肿瘤通过消化细胞外基质结构和基底膜侵入组织并发展 转移(综述：Dvorak，1986，Liotta，1986)。细胞外基质结构的消化由多 种肿瘤相关蛋白酶系统介导(Schmitt等人，1992)，如丝氨酸蛋白酶、 天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶 (Schmitt等人，1992)，它们通过启动和促进蛋白水解级联反应以及与 不同抑制剂相互作用，导致基质结构(如胶原蛋白或层粘连蛋白)降解。 因此，它们使得肿瘤细胞能够侵入相邻的结构以及血管系统。起作用 的酶的身份与生理上控制创伤愈合、炎症、胚胎发育或血管生成的酶 没有不同(Blasi，1988和1993，Dano等人，1985，Liotta，1986，Liotta等 人，1991，Markus，1988)。这些酶过量表达表征了恶性细胞的侵入表 型。
研究得最清楚的肿瘤相关蛋白酶系统之一是尿激酶(u-PA)系统。 55kDa的丝氨酸蛋白酶u-PA激活纤溶酶原成为纤溶酶，从而直接和 间接降解血纤蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、层粘连蛋白和IV型胶原 蛋白(后者是基底膜的成分(Andreasen等人，1994，Duffy，1992， Guenzler等人，1982a和1982b，Wun等人，1982a和1982b，Gronow 和Bliem，1993，Vassalli等人，1984)，从而有助于细胞侵入相邻结构 中。
u-PA的活性通过其它蛋白酶或抑制系统的各种相互作用调节。一 方面，这些因子是u-PA的激活剂或抑制剂(组织蛋白酶、α-1-抗胰蛋 白酶、抗凝血酶III)、u-PA的底物(纤溶酶原、MMP-2/72kD-胶原酶 IV)、u-PA对纤溶酶原激活系统的平行激活剂(t-PA)或拮抗剂(α-2-巨 球蛋白)和稳定细胞表面的特异性u-PA受体及跨细胞调节的辅因子 (α-1-抗胰凝乳蛋白酶、α-2-巨球蛋白(综述例如：Schmitt等人，1992， Allgayer等人，1997))。
通过与特异受体(u-PAR)结合，u-PA的比活性提高许多倍。U-PAR 是一种45-60kDa的糖基化细胞表面受体，由于它在膜中的高度柔性 集中了u-PA的蛋白水解作用，这是由于糖脂的锚定作用(Ellis等人， 1991，Behrendt等人，1990，Estreicher等人，1990，Ploug等人，1991a， Moller等人，1992)。受体结合的u-PA对于纤溶酶原的Km比游离酶低 40倍(Ellis等人，1991)。
u-PA/u-PAR复合物通过抑制剂PAI-1的特异结合以及与α-2-巨球 蛋白受体的相互作用，内化到细胞内。然后配体在溶酶体内降解，游 离u-PAR再循环到细胞表面，使其可用来与新的u-PA分子结合(Olson 等人，1992，Cubellis等人，1990，Conese等人，1994，Nykiaer等人， 1992，1994a，1994b)。这产生一种灵活、动态、高效的蛋白水解系统。
由于u-PAR、其配体u-PA以及抑制剂PAI-1或-2之间的密切相 互作用，整个体系可被称为“u-PA系统”(Blasi，1993)。
u-PAR含有3个相似的蛋白质结构域(每个均含有大约90个氨基 酸，Riittinen等人，1996)，在外周白细胞、激活的单核细胞和T淋巴 细胞、骨髓的成熟前白细胞中以及在内皮细胞和角质细胞的创伤愈合 过程中少量生理表达(Cubellis等人，1990，Min等人，1992，Vassalli等 人，1984，1985，Plesner等人，1994，Allgayer等人，1997b，Langer等人， 1993，Romer等人，1994a)。因此，u-PAR在例如趋化作用、迁移、粘 附和细胞骨架建立的信号转导的过程中起重要作用(May等人，1998， Dewerchin等人，1996，Pedersen等人，1996，Resnati等人，1996，Xue等 人，1997，Wie等人，1994，1996，Busso等人，1994，Tang等人，1998， Stahl和Müller，1995，Bohuslav等人，1995，Konakova等人，1998，Yebra 等人，1996)。
此外，与相同来源的非肿瘤细胞相比，u-PAR在多种上皮来源的 肿瘤中过量表达。首先应提到的是胃肠系统的肿瘤(胃癌或结肠癌)、 前列腺癌或支气管癌和卵巢癌(Jankun等人，1993，Sier等人，1993， Pyke等人，1991，Heiss等人，1995b，Allgayer等人，1998b，Cantero等人， 1997，Romer等人，1994b，Morita等人1998，Jnicke等人，1993， Nekarda等人，1994)。
例如，在结肠癌中，内源u-PAR的含量与肿瘤细胞的侵袭力之间 有明确的相关性(Hollas等人，1991，Schlechte等人，1989)。抗u-PAR 抗体能够使HT29细胞中细胞外基质的破坏减少约80％(Reiter等人， 1993)。Pyke等人(1991a，1991b)假定，在结肠癌中，围绕肿瘤的基质 细胞具有旁分泌相互作用，因为他们观察到u-PAR只在肿瘤细胞中表 达，在周围的基质细胞中分泌u-PA和PAI-1。
根据有些报告，u-PAR的表达量因此是细胞侵袭力或恶性表型的 一个标准(Wang等人，1994，Bianchi等人，1994，Hollas等人，1991， Sliutz等人，1996)。
另外，多种体外侵入模型显示，用u-PAR表达载体转染肿瘤细胞 系导致对matrigel膜或尿囊绒膜的侵袭力提高。与之相反，也显示 u-PAR基因表达的抑制减少了细胞的侵入(Kariko等人，1993， Ossowski等人，1988，Kook等人，1994，Quattrone等人，1995)。
此外也显示，增强的u-PAR表达刺激肿瘤生长。人们认为，u-PAR 与u-PA组合在外部支持细胞的侵入，而同时组合的u-PAR/u-PA向 内部发出MAP-激酶信号，它刺激肿瘤细胞的增殖(Aguirre-Ghiso等 人，1999)。
总之，u-PA系统似乎是潜在肿瘤治疗的一个理想出发点。例如， 抑制u-PA活性被看作是一种有前途的治疗策略，不仅在抗侵入治疗 方面(Quattrone等人，1995，Cavallaro等人，1993)，而且在防止最少残 留的肿瘤细胞发展为转移的方面(Osborne和Rosen，1994，Riethmüller 等人，1992，Schlimok等人，1990)。
例如，US 5,519,120描述了一种治疗策略，即利用抗游离u-PAR 的单克隆或多克隆抗体以及u-PA与u-PAR的复合物抑制u-PA系统。 该策略的一个缺点是，与u-PA结合的u-PAR，以及被单克隆抗体结 合的u-PAR，将被有规律地内化，并且被替换为一种新合成的u-PAR。 仅仅这一点就已经是抗体治疗几乎不能导致持续成功的一个原因。
另一种策略是利用反义RNA抑制u-PAR的转录，从而抑制u-PAR 的合成(US 5,872,106；WO 96/03414)。
最后，在WO 98/46731、US 5,891,664或EP 975743中公开了可 抑制u-PA与u-PAR结合的肽和多肽。
然而，所有这些治疗策略都还没有最终成功。因此，本发明的一 个目的在于提供一种治疗策略，该策略可以长期抑制u-PA系统，从 而治疗复发性肿瘤或肿瘤转移。
发明详述
本发明提出一种可用于激活治疗性基因的组织特异性表达的分 子方法。组织特异性表达由来源于天然存在的调节元件的合成调节元 件介导，在特定组织中显示明显较高的活性。
本发明提供一种合成调节元件，即启动子聚合物(PP)，它含有调 节性DNA序列的一个或多个重复。该调节性DNA含有至少一个转录 因子结合位点。
术语“调节性DNA序列”是不编码任何蛋白质，但是通过一种特 定序列(转录因子结合位点)介导与因子(例如蛋白质、肽、RNA分子、 其它DNA分子或更概括地称为转录因子)结合的核苷酸序列。这种结 合导致所谓的反式激活，并导致基因表达的诱导。反式激活的具体特 征在于各种因子不需直接结合起始位点即对转录产生影响。此外，也 存在通过反式激活抑制基因表达的因子(Lewin B.，《基因》：第29章， Cell Press，Cambridge，1990)。
如下文所用的术语“启动子聚合物”(PP)描述一种核苷酸序列，其 含有一种启动子和/或调节序列或其部分的至少1个、优选地3-7个或 更多重复。优选地，根据靶组织中转录因子的选择，调节本发明的 PP。这意味着，本发明的调节性DNA序列含有转录因子结合位点的 一个或多个重复，它们与靶组织中基因表达的增强有关。
本领域技术人员公知如何在具体靶组织中鉴定上调的基因，以及 如何使用转录因子结合位点的共有序列或天然序列，通过应用迁移率 分析，进一步鉴定和确定组织特异性转录因子。因此，本发明扩展到 对如下疾病的应用和/或治疗，该疾病的特征在于反式激活的基因表达 增强。具体而言，本发明可用于治疗多种肿瘤或炎症过程。
本发明的合成PP当导入目的靶组织内时，通过转录因子结合位 点的重复，诱导增强的基因表达。
通过本发明的PP，这种基因表达对于目的组织而言是高特异性 的，而在周围组织中没有导入实质性基因表达。在本发明的PP控制 治疗性基因表达的情况下，该基因基本上只在目的组织中表达，而不 在周围组织中表达。
本发明的另一个优点是，本发明的PP自由结合存在的转录因子， 特别是与肿瘤细胞特异的、上调的基因表达有关的因子。这导致本发 明的PP与天然启动子之间的竞争，从而下调正常组织特异的基因表 达。
根据其它实施方案，本发明特别地(但不限于)使用下列因子的 结合位点：转录因子AP1，以及AP1家族成员c-Fos、c-Jun、JunD 或Fra-1，其它AP-2，特别是AP-2α或可以清楚辨别的AP-2-similar (Allgayer等人，1999a)，Sp1、Sp3或Sp4(关于转录因子及其功能的一 般信息见：Lewin，《基因》VII，Cell Press，Cambridge，Mass.，2001)。
在另一个实施方案中，本发明的PP含有一个或多个来源于编码 人尿激酶受体(u-PAR)启动子之基因的转录元件。
u-PAR基因含有7个外显子，位于染色体19q13上(Borglum等人， 1992，Vagnarelli等人，1992，Casey等人，1994)。该基因的转录产生1.4 kb的mRNA或另外一种剪接变体，它不含膜定位信号，因此被分泌 (Roland等人，1990，Pyke等人，1993)。与其它管家基因相比，u-PAR 基因不含TATA盒或CAAT基序(Soravia等人，1995)。而是在靠近主 要转录起点处有多个Sp1共有元件(Soravia等人，1995)。这些多个Sp1 元件负责基本的启动子活性。结肠癌模型显示，利用DNAse-1-足迹 法，除了含有Sp1元件的近端调节区(3区，-99/-70)之外，另外两个 启动区被RKO细胞系(一种结肠癌细胞系，具有高u-PAR表达)的核 提取物的杂交保护，这表明其它转录因子的结合：
存在一个远端区(-190/-171，1区)，它含有一个AP-1共有基序(被 Jun/Fos-原癌基因激活)，在组成型和PMA诱导型u-PAR启动子活性 中起作用。该区的结合进一步介导k-ras癌基因对u-PAR的诱导，k-ras 癌基因在所有结肠癌的大约70％中突变(Allgayer等人，1999c)。
第二个区(-148/-124，2区)含有一个潜在的AP-2和Sp1元件。对 于结肠癌模型再次显示，该区能够被转录因子AP-2α的以及来自Sp1 和Sp3的一种潜在的新同工型(AP-2-similar)结合。AP-2-similar蛋白 质的结合介导组成型以及佛波酯(PMA)诱导的u-PAR基因表达。Sp1 转录因子组的结合主要介导PMA诱导的基因表达。Sp1进一步介导 src-癌基因对u-PAR的诱导，src-癌基因在所有结肠癌或胃癌的几乎 80％中过度激活。
在一个实施方案中，本发明的合成PP含有u-PAR启动子调节区 的序列区-152/-128、-152/-130、-152/-135、-154/-128、-154/-130或 -154/-135(相对于转录起始位点)的一个或多个重复。在另一个实施方 案中，每种本发明的PP含有u-PAR启动子调节元件的序列区-99/-70、 -148/-124和/或-190/-171(相对于转录起始位点)的一个或多个重复。 在另一个实施方案中，本发明的合成PP含有选自下列序列区的两个 或多个重复：-190/-171、-148/-124、-152/-128、-152/-130、-152/-135、 -154/-128、-154/-130、-154/-135和/或-99/-70。
根据本发明的另一个实施方案，将DNA间隔序列导入调节性 DNA序列的重复之间，以提高聚合程度。这些间隔序列的大小可以 是2-20个核苷酸，防止转录结合位点与非特异性因子的作用。
为了进一步确定基于其他启动区的启动子聚合物，可以按如下鉴 定有关转录因子结合位点：筛查现有的数据库，随后使用2个代表性 细胞系的核提取物，通过迁移率分析证实希望的转录因子实际上结合 该聚合物。另外，在所用启动子的原始基因过量表达或下调的细胞系 中试验该聚合物。
根据另一个实施方案，本发明提供一种载体，其含有在本发明的 PP调控下的一种治疗性基因和/或标记或报道基因。
术语“载体”通常描述一种环形DNA载体，例如质粒、粘粒或人 工染色体，除了希望的DNA之外，它还含有调节序列、选择或标记 基因和复制起点。
本发明的治疗性基因是在表达时能够破坏肿瘤细胞的基因。特别 有用的是诱导肿瘤细胞凋亡的基因，例如p53基因。只在加入某种激 活剂之后才诱导细胞死亡的基因(单纯疱疹胸苷激酶基因，细胞色素 p450基因)也是有用的。本发明的治疗性基因或标记和报道基因是能 够将颜色标记导入肿瘤细胞内的基因(LacZ-β-半乳糖苷酶基因或 EGFP-绿色荧光蛋白基因)，或通过表达细胞因子、治疗性抗体的特定 抗原或表位，为免疫系统的防御细胞标记肿瘤细胞的基因。
根据本发明的载体，其含有在本发明的PP调控下的治疗性基因， 适于对患者施用进行直接治疗，例如用作DNA疫苗。此外，本发明 的载体也可以作为乳膏局部施用。
在本发明的另一个实施方案中，所述载体可以用于重组病毒的生 产。可用于生产重组病毒的载体还含有病毒特异性序列，该序列介导 载体与选择的病毒之间的同源重组。为了这种重组，载体和选择的用 于治疗的病毒一起被导入一个适合的细胞表达系统中，在适当温育时 间后，可以用适当的筛选方法分离并纯化重组病毒。
本发明优选的病毒是能够将处于本发明的PP转录控制下的治疗 性基因整合到肿瘤细胞基因组内的病毒。向肿瘤细胞基因组内的稳定 插入确保长期的表达。优选地，但不是唯一地，本发明使用腺伴随病 毒或逆转录病毒。
根据人们希望感染的组织，本发明有用的病毒包括痘苗病毒、腺 病毒，它们特别感染眼睛、呼吸组织和结肠组织，或慢病毒，如MMTV， 它对乳腺组织有高亲和力。通过选择不同的病毒，不同组织(如肺癌 或乳腺癌)可以直接被感染并分别治疗。
在另一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其含有本发 明的载体或重组病毒和一种或多种药学可接受的载体、添加剂、抗生 素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。这些添加剂可以是：水、盐 水、甘油、乙醇、pH缓冲物等。适合的载体是通常较大且代谢缓慢 的分子，如蛋白质、多糖、聚合氨基酸、脂类聚集体等。
在另一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其含有治疗有效浓 度的含合成PP的重组病毒以及任选的添加剂，如适于体内施用的甘 露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、抗氧化剂或重 组蛋白(白蛋白)。本领域技术人员公知典型给药途径，例如局部、腹 膜内或全身给药，以及肿瘤内给药。
附图简述
图1显示迁移率变动实验，以证实转录因子AP-1-similar蛋白质、 Sp1和Sp3与u-PAR的-152/-130区的结合。1道和2道是阴性对照(无)。 3道显示转录因子AP-2-similar蛋白质、Sp1和Sp3(箭头)的结合，它 们存在于标准化结肠癌细胞系(RKO)的规定量的核提取物中。这些转 录因子的结合在癌患者的正常组织(N)和肿瘤组织(T)的细胞中高度特 异，因为显示200倍过量的未标记的共有寡核苷酸才能够与这些转录 因子竞争。4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28 道用“+”标记，以引起对消失的转录因子带的注意。
图2显示超级迁移变动(supershift)实验，证明转录因子 AP-2-similar蛋白质、Sp1和Sp3与-152/-130区的结合。1道和2道 是阴性对照(无)。3道显示转录因子AP-2-similar蛋白质、Sp1和Sp3 的结合(箭头)，它们存在于标准化结肠癌细胞系(RKO)的规定量的核 提取物中。利用200倍过量的未标记的AP-2共有寡核苷酸，证实了 来自几种肿瘤制品(T)和一种正常组织制品(N)的核提取物的AP-2带 的特异性(28道)。Sp3带的特异性利用针对Sp3的DNA结合域的抗 体证实(19道)。Sp1带的特异性用抗Sp1抗体证实(11道和17道)。
图3显示多种合成启动子聚合物的序列，其含有人u-PAR启动子 的-154/-128区，含有AP-2和Sp1转录因子结合位点。对这些序列在 PCR扩增过程中发生碱基对交换的位置处用星号标记。
图4显示人u-PAR启动子的启动区-154/-128在RKO细胞中的转 录活性。pSVOCAT代表一种对照质粒，其含有一个氯霉素基因，不 含转录控制元件。Pu-PAR CAT代表一种对照质粒，其含有一个氯霉 素基因，处于天然存在的人u-PAR启动子的转录控制下。pCAT basic 5xu-PAR代表一种载体质粒，其含有处于启动子聚合物转录控制下的 氯霉素基因，所述启动子聚合物含有u-PAR启动子的-154/-128区的5 个重复。2道显示RKO细胞中天然启动子下的CAT表达。3-9道显 示含有启动子聚合物的载体浓度依赖方式的CAT表达。
图5显示人u-PAR启动子的启动区-154/-128在GEO细胞中的转 录活性。pSVOCAT代表一种对照质粒，其含有一个氯霉素基因，不 含转录控制元件。Pu-PAR CAT代表对照质粒，其含有一个氯霉素基 因，处于天然存在的人u-PAR启动子的转录控制下。pCAT basic 5x u-PAR代表一种载体质粒，其含有在启动子聚合物转录控制下的氯霉 素基因，所述启动子聚合物含有u-PAR启动子的-154/-128区的5个 重复。清楚地显示，这些构建体在所使用的细胞系中都不能诱导CAT 活性。
图6显示在β-半乳糖苷酶测定中人u-PAR启动子的启动区 -154/-128的不同启动子聚合物在PKO细胞中的转录活性。 PβGalBasic-empty代表一种不含任何启动子的载体。利用2x、5x、7x 的附加标记，标出了不同载体中PP的聚合程度。
实施例
实施例1：u-PAR启动区的分析
尿激酶受体基因(u-PAR)对各种肿瘤的侵入和转移有实质性贡献。 与正常组织相比，肿瘤细胞中u-PAR的表达被调节到平均值以上。
对u-PAR启动区的研究导致对几个独立区的详细表征，多种因子 与这些区结合，它们实质上参与u-PAR表达调控中的转录。所有这些 研究都在体外用肿瘤细胞系进行的，然而，该启动区的调控也在体内 得到证实。因此，用迁移率试验检测了145名患者的胃肠道肿瘤组织， 以检测可结合AP-2/Sp1的启动区对u-PAR表达的调节。
迁移率分析或电泳迁移率变动测定(EMSA)以及核提取物的提取 如以前Lengyel等人(1996)和Dignam等人(1983)所述进行。为了从患 者组织中分离核提取物，分离一名患者的一片肿瘤组织和一片正常组 织以及非肿瘤患者的对照组织，并在液氮中冷冻。机械研磨冷冻的组 织，悬浮于1M PBS缓冲液中，如下所述提取核提取物：
为了分离核提取物，离心组织片以及对照细胞系RKO的细胞， 在10mM HEPES pH7.9，10mM KCl，1.5mM MgCl2，0.5mM DTT，0.2 mM PMSF和2mg/ml抑酶肽(Sigma，St.Louis，MO，USA)的缓冲液中， 在冰上温育10分钟，振摇并再次离心。将含有核的沉淀重悬浮于20 mM HEPES，pH7.9，0.45M NaCl，1.5mM MgCl2，25％甘油，0.2mM EDTA，0.5mM DTT，0.5mM PMSF和2mg/ml抑酶肽的缓冲液中，在 4℃下振摇30分钟。将核提取物于-80℃保存。
每个反应25μg核提取物和20.000cpm γ32P-ATP末端标记的对应 于u-PAR启动子-152/-135区(5′-CCA GCC GGC CGC GCC CCG GGA AGG GA-3′；SEQ ID No.：9)的寡核苷酸(T4-噬菌体寡核苷酸激酶， Boehringer Mannheim)在25mM HEPES，pH7.9，0.5mM EDTA，0.5 mM DTT，0.5M NaCl缓冲液中温育15分钟，其中含有或不含200倍 过量的未标记的寡核苷酸作为竞争剂。每个反应还含有0.5μg Poly(dIdC)，用于阻断非特异性反应。反应物在室温下在5％聚丙烯酰 胺凝胶(5％甘油)中分离，在-80℃下在Kodak MR胶片上曝光24小时。
结果，迁移率分析显示转录因子AP-2α和AP-2-similar有强烈结 合。Sp1和Sp3在60％以上的肿瘤中实质上参与u-PAR表达的调节(图 1)。超级迁移变动实验证实，在患者组织以及对照细胞系中实际上是 相同的转录因子负责迁移变动(图2)。
对于这种超级迁移变动分析，在温育10分钟后，向核提取物和 寡核苷酸中加入1μg抗转录因子的特异性抗体(例如，抗-Sp1、-Sp2、 -Sp3、-Sp4和兔IgG对照，Santa Cruz Biotechnology目录号sc-59、 sc-643、sc-644、sc-645、sc-2338)，在冰上进一步温育60分钟。在4℃ 下进行电泳，稳定出现的复合物。加入具有序列5′-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3′，SEQ ID No.：10的AP-2共有寡核苷 酸(目录号sc-2513，Santa Cruz Biotechnology)后取代了AP-2类似因子 的结合。每次迁移率变动测定使用一种不含核提取物的阴性对照，和 不含核提取物和poly(dIdC)的第二种对照。
迁移率变动的结果显示，在117名结肠直肠癌患者的68人中 (58.1％)，与正常组织中低和不存在的结合相比，检测到强烈的Sp1 的转录因子结合。在28名胃癌患者中的15人中(53.6％)，Sp1的结合 同样如此。AP-2α-similar因子的结合能够在117名结肠癌患者的69 人(59.0％)中和28名胃癌患者的18人中(64.3％)检测到。在117名结 肠癌患者的61人(52.1％)和28名胃癌患者的11人中(39.3％)显示这两 种检测的因子即AP-2α和Sp1的结合。AP-2α-similar蛋白质及Sp1 因子的结合与肿瘤组织中u-PAR蛋白的含量(ELISA)之间有显著相关 性(p＜0.0001，p＝0.0003，线性回归)。然而，在正常组织中没有这种 相关性。从这些结果可以得出如下结论，在体内使用这种启动区或本 发明的PP反式激活u-PAR的表达只与肿瘤组织有关。
这些结果进一步提示，对于所有胃肠肿瘤患者的大约60％，其中 与正常组织相比，肿瘤中u-PAR基因区的反式激活受-152/-135区影 响，利用本发明的PP分子靶向该区是可能的。
此外，为了分子细胞靶，向也能够将该策略与另外一种途径抑制 结合使用，这些途径也被该启动区激活(如Src-抑制，其由该启动区的 Sp1结合位点介导)。
另外，也可能使用利用额外聚合启动子元件(如AP-1区(-190/-171) 的聚合物)的治疗策略，特别是在具体情况下，这两种启动子元件均 被鉴定与肿瘤特异调节有关时。
实施例2：含启动子聚合物的载体的构建
为了检测何种聚合程度能导致最佳基因表达，构建了几种载体， 其含有启动区的1-10个重复以及一个适于体外检测的报道基因。优 选地，β-半乳糖苷酶基因(lacZ)或氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)用于体 外检测。
为了构建含有2区启动子聚合物的CAT报道基因，合成了对应 于u-PAR启动子的碱基对-154/-128的寡核苷酸。向该寡核苷酸的有 义链的5′端(位点-154)添加核苷酸C和A，在非编码链的5′端(位点-128) 添加核苷酸G和T。产生的合成寡核苷酸(oligo)含有序列
5′-CAC CAG CCG GCC GCG CCC CGG GAA GGG AA -3′
    3-G GTC GGC CGG CGC GGG GCC CTT CCC TTG T-5′
(5′->3′：SEQ ID No.：2)(3′->5′SEQ ID No.：3)
利用PAGE纯化，重悬浮于Aq dest中，终浓度为1μg/μl。
将这些单链在90℃下退火2分钟(4μl编码链、4μl非编码链和 64μl Aq dest)，退火后立即加入8μl 1N NaCl稳定产生的双链。产生 的oligo浓度为100ng/μl。
为了连接各oligo形成不同长度的聚合物，使用：15μl连接酶 (Biolabs 202S，400.000U/ml)、20μl oligo(2μg)、7μl连接酶缓冲液 (Biolabs T4 DNA连接酶缓冲液，含10mM ATP)和28μl Aq dest。连 接在16℃下进行14小时。产生的连接产物用酚/氯仿法纯化，其中使 用3M NaCOOH/100％乙醇，-70℃30分钟，用70％乙醇洗涤，真空 干燥，重悬浮于10μl TE缓冲液中。
CAT载体(Promega pCAT载体)用SalI消化线性化，如上所述纯 化，最终重悬浮于20μl Aq dest中。将这些寡核苷酸以及线性化的 pCAT载体用Klenow酶和dNTPs形成平端，再次如上所述纯化、沉 淀、干燥、重悬浮(oligos重悬浮于20μl TE中，达到50ng/μl的终浓 度，载体重悬浮于40μl Aq dest中)。pCATbasic载体进一步用碱性磷 酸酶去磷酸化，以防止自体连接，并再次进行酚/氯仿纯化，如上所述 沉淀，重悬浮于Aq dest中，达到约100μg/μl的终浓度。聚合物用 TE稀释，达到25μg/μl的终浓度。
以不同的聚合物/载体比开始不同的反应，以将聚合物克隆到 pCAT内： 反应：# 0  1  2  3  4  5  6  7 PCAT(μl) 2  1  1  1  1  1  1  1 聚合物(μl) 0  1  2  3  4  5  6  0.5 10倍连接酶缓冲液(μl， Biolab) 1  1  1  1  1  1  1  1 Aq dest 5  5  4  3  2  1  0  5.5 T4连接酶(μl，Biolab) 2  2  2  2  2  2  2  2
连接反应在4℃下进行24小时。向每个反应中加入20μl TE缓冲 液终止反应。
用连接产物转化大肠杆菌，增殖并测序。这样就形成了有义方向 不同聚合程度的各种载体。
为了进行功能测定，选择含有上述寡核苷酸序列的2个、5个和 7个重复的3种构建体。此外，也检测了在PCR扩增中引入碱基对交 换的含有5个和7个重复的2种启动子聚合物(图3)。然而，未能显 示功能差异。
这些聚合物被放射性标记的迁移率变动分析显示，已知的转录因 子能够结合这些聚合物。
在迁移率变动分析中不能直接和定量地比较不同构建体彼此之 间的转录因子结合，与简单的启动子元件相比，由于不同构建体的长 度不同，产生的DNA/蛋白质复合物由于在凝胶中的相对重量不同而 显示不同的行为。然而，迁移率变动分析显示，AP-2similar和Sp1 转录因子能够结合这些聚合物。
实施例3：不同聚合物的迁移率变动
利用PstI/XbaI从pCATBasic上切下聚合物，粘端利用T4-DNA- 聚合酶(New England Biolabs)以dNTPs补平，使用T4多核苷酸激酶 以γ-32P-ATP(ICN)放射性标记。一个迁移率变动反应使用20.000cpm 放射性标记的聚合物。如上所述，每个反应中使用15μg RKO细胞系 的核提取物和0.2μg poly(dIdC)进行迁移率变动分析。反应物在4％聚 丙烯酰胺凝胶(5％甘油)中分离。100倍过量的AP-2共有序列以及Sp1 共有序列消除了AP-2以及Sp1带。
不同聚合物的功能性在报道试验中得到证实。
实施例4：CAT(氯霉素乙酰转移酶)试验
使用一种质粒作为对照，其携带天然存在的u-PAR基因的启动 区。该质粒如下产生：一种长449个碱基对的序列(Wang等人，1995)， 相对于u-PAR基因的主要转录起始位点，其含有位点-398到+51，将 其克隆到CAT以及萤光酶报道质粒中(pCAT basic载体(Promega， Madison，WI，USA)在XbaI限制酶切位点酶切；PGL3载体(Promega) 在SmaI位点酶切)。
这些质粒载体含有一个具有5个重复的2区(碱基对-154/-128)的 启动子聚合物，在2种不同的细胞系中检测其表达。第一种是轻微分 化的结肠癌细胞系RKO(ATCC：CRL-2577)，其具有高内源性u-PAR 表达。第二种细胞系也是一种结肠癌系，GEO，它天然显示没有或只 有极低的u-PAR表达(Brattain等人，1984)。此外也使用一种转化的人 肾细胞系293(ATCC：CRL-1573)，其具有低u-PAR表达。
使各种细胞生长到60％汇集，按照Nead和McCance(1995)的方 法用聚-L-鸟氨酸(Boehringer)转染。在无血清培养基中使用比例为 0.47的聚鸟氨酸/DNA以及0.1-10μg的有关质粒转染6小时。另外， 在CAT试验中，用CAT报道基因进行共转染。在萤光素酶试验中， 用一种RSV引导的萤光素酶报道基因(每个反应4μg)共转染，随后对 转染率标准化。25％甘油/10％FBS培养基休克使细胞摄取DNA增加， 随后，将细胞在37C下温育48小时，直到在报道子-裂解缓冲液 (Promega)中进行报道子试验和裂解。在开始CAT试验之前，用发光 计(Fa.Pharmingen)检查裂解物的萤光素酶活性(转染率)，并在BCA试 验(Fa.BioRad，Hercules，CA，USA)中对蛋白质浓度标准化。
萤光素酶试验按照双萤光素酶报道子试验试剂盒(Promega)手册 进行，但是使用u-PAR启动子-萤光素酶报道基因。为了转染率的标 准化，使用以Promega的花虫-萤光素酶-质粒共转染的细胞。
为了分析CAT活性，裂解物与作为底物的C14-氯霉素(4μM，Fa. ICN)和1mg/ml乙酰辅酶A在37℃下温育4-6小时。疏水性氯霉素 然后用乙酸乙酯提取，利用薄层层析分离(氯仿/甲醇95∶5作为流动 相)。1次或2次乙酰化氯霉素的程度代表CAT活性，因此代表报道 构建体中启动子的活性。为了结果的定量，使用Storm 840磷成像仪 (Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA，USA)。
已经显示，本发明的PP显然在RKO细胞中诱导CAT活性，而 在GEO细胞中未检测到CAT活性(图4和图5)。
实施例5：β-半乳糖苷酶载体
传统上，各种启动子聚合物在RKO细胞中的表达也用β-半乳糖苷 酶试验(β-Gal)检测。因此制备了含有不同启动子聚合物的β-Gal载体。 载体β-GalBasic(Clontech)用BglII消化，有关聚合物用PstI和XbaI 消化，所有产物以及载体用T4-DNA-聚合酶形成平端。为了避免自体 连接，Gal-载体用牛小肠磷酸酶去磷酸化，随后聚合物与载体以不同 比例在16℃下连接16小时。含有聚合物的产物通过用XhoI/HindIII 进行分析性消化来鉴定，合适的产物在小量制备中转化并克隆，随后 测序，以鉴定正确的方向。
此外，也制备了萤光素酶载体。聚合物如关于Gal-载体所述进行 检测，克隆到用SmaI酶切、如上所述形成平端并去磷酸化的GL3 (Promega)中。
实施例6：β-半乳糖苷酶试验
在将含有u-PAR-启动子AP-2/Sp1区的聚合物再克隆到一种不同 的报道系统中后，用另一种报道系统证实如上所述的CAT试验的结 果。在β-半乳糖苷酶试验中，与不含聚合物的空对照载体相比，证实 了所有3种聚合物在RKO细胞(一种高表达的细胞系)中的激活。在 GEO细胞(通常显示极少u-PAR表达)中，未显示可检测的β-GAL值 所代表的构建体激活(图6)。
实施例7：治疗性载体的克隆策略
在CAT基因由启动子聚合物调节的前述制备的载体中，将该CAT 基因替换为一种治疗性基因，例如疱疹-TK或一种凋亡基因。根据 CAT试验的数据显示，该治疗性基因在转移性RKO细胞中的表达导 致自杀，但是在GEO细胞中不会如此。利用疱疹TK基因，该结果 还可被更昔洛韦的控制施用所诱导。
实施例8：β-GAL表达性病毒载体的克隆策略
为了进行肿瘤特异性表达的体内检测，利用引物 5′-GGAGGTACCGAGCTCTTACG-3′(有义)(SEQ ID No.：4)和5′- GCTCTAGAGCACTAGTGGTGACTTC-3′(反义)(SEQ ID No.：5)， PCR扩增已经导入pCATbasic载体中的聚合物，使得该聚合物的5′ 有另外一个KpnI限制酶切位点，3’有一个新的SpeI限制酶切位点、 一个XbaI限制酶切位点。克隆载体PUC 19(Amersham Pharmacia Biotech)和扩增的聚合物都用KpnI和XbaI消化，并在16℃下连接16 小时。产生的PUC 19构建体在以前存在的KpnI和XbaI位点 (PUC-Poly)处含有该聚合物，另外在该聚合物的3′侧含有新导入的 SpeI限制酶切位点。在新导入的SpeI位点的3′侧有一个来自原始质 粒的多克隆位点的PstI位点。为了分离适于病毒载体的LacZ基因， 将pZnl载体(Girod等人，Nature Medicine 5(9)，pp 1052-56，(1999)用 BamHI线性化，然后形成平端，再用SpeI消化，产生一个3.7kb的 片段(Lac片段)，该片段在5′端含有一个SpeI位点，随后是LacZ基 因，其3′是一个平端化的BamHI序列。
为了将LacZ基因导入PUC 19质粒中启动子聚合物的3′侧，该 PUC 19质粒(PUC-Poly)用PstI消化，形成平端，之后再用SpeI消化。 可向位于该聚合物3’侧的该开放SpeI位点内以有义方向导入Lac-片 段，方法是将该片段与PUC-Poly质粒在16℃下连接16小时。产生 的载体(Poly-Lac-PUC)含有该聚合物，随后是LacZ基因，之后是仍含 有限制酶切位点SphI和HindIII的原始PUC-19-质粒的一个多克隆位 点(MCS)。
由于据报道病毒载体的插入不应低于一定的大小，因此将约300 个碱基对(bp)的额外非编码DNA序列导入该载体内。因此，pGL2质 粒(Promega)的330bp的每个片段通过BsGI和HpAI消化分离，随后 形成平端。载体Poly-Lac-PUC用SphI线性化，形成平端，330bp的 非编码DNA片段与LacZ基因的3’侧连接。产生的载体被称为 Poly-Lac-PUC-Füll。在插入片段的3′侧有一个完整的HindIII位点。
将该聚合物以及LacZ和非编码DNA再克隆到一种AAV-2型质 粒psub201+内(Samulski等人，1989)。Psub201+用XbaI消化，并形成 平端。可以使用其它任何病毒载体代替该载体。前述产生的载体 Poly-Lac-PUC-Füll用KpnI/HindIII消化，形成平端，与XbaI消化的 psub201再连接。以有义方向含有Poly-Lac-Füll插入片段的Psub201 构建体通过测序鉴定。病毒的产生和包装按Samulski等人早先发表的 方法进行。
构建病毒的第二个策略是通过连接将Poly-Lac-Füll片段插入 SnaBI和XhoI消化的psub201+载体中。该载体仍含有ITR区。然后 该载体与一种表达AAV结构基因的质粒以及一种腺辅助质粒一起转 染293细胞(WO 00/47757描述)。该方法可确保在产生重组AAV病毒 时不产生腺病毒。
实施例9：含有单纯疱疹胸苷激酶(HSV-TK)基因的重组病毒的产 生
治疗性病毒的构建按照上述策略进行，为此，用一种限制性内切 酶消化或者用PCR扩增含有HSV-TK基因的质粒，例如质粒 pAD-CM-TK，分离HSV-TK基因(Mueller等人，Hamburg)。然后使该 基因成为平端，与所述启动子聚合物一起导入用PstI消化并形成平端 的PUC-19质粒(Puc-Poly，Promega)内。含有正确方向插入片段的构建 体可以通过测序鉴定。
重组病毒的产生按照所述的方法进行。
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<223>人工序列描述：寡核苷酸
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