人蛋白质的重组生产一般是通过培养稳定转染的真核(优选哺乳动 物)细胞系并从培养液中分离所述蛋白质来进行。当所述重组蛋白旨在用 于药物应用时，长期以来的一般实践是使用非人细胞系，以避免共纯化可 能被人细胞接纳并表达的传染原的风险。
在一些人蛋白质如人凝血因子VIII的生产中，发现使用非人细胞系 具有某些缺点，例如所表达蛋白质进入培养基的分泌水平不够理想。相信 这是由于不同哺乳动物细胞类型之间有关细胞内蛋白质翻译和修饰途径 的微小差别，这也可能影响所表达多肽的生物活性。除此之外，还存在这 种担心：从非人表达系统中纯化的治疗性蛋白质被可在患者中引起抗原反 应的细胞成分污染。另一个担心是在非人表达系统中重组生产的人蛋白质 上发现的非人糖基化模式。人们认为这增加了患者中发生抗原反应的可能 性。另外，血液蛋白质(例如凝血因子)的生物稳定性和效力受其N-糖基 化模式的显著影响。尤其是外周及末端单糖是很重要的，因为它们被负责 降解它们的细胞的特定受体所检测。例如，凝血因子带有唾液酸残基作为 末端单糖。对糖蛋白触角(antennae)中唾液酸组成的修饰可导致异源糖 基化模式。因此，修饰的发生与生物稳定性和效力高度相关。因此，在重 组凝血因子的生产中，评估非人生产细胞系与人细胞系相比糖基化的影响 是重要的考虑因素。另一方面，用于所需基因高水平蛋白质表达的一般方 法是可用的，其包括表达病毒转录激活子蛋白的永生化稳定转染哺乳动物 细胞系(例如，美国专利5,712,119)。这些细胞系可使用载体构建体转化， 其中合适的病毒转录启动子与定义目的基因的DNA序列有效连接，由细 胞系提供的转录激活子蛋白激活病毒转录启动子，由此起始目的基因的表 达。
与细胞系同样重要的是用于将重组基因引入固定的生产细胞系中的 载体。许多种载体用于翻译哺乳动物蛋白质，(例如，Witsch-Baumgartner， M等Am.J.Genet(2000).66，402-412将DHCR7 cDNA克隆进pCI-neo 哺乳动物表达载体，并在HEK 293细胞中表达；McGarvey，T.W.等 Oncogene(2001)20，1041-1051将TEREl基因克隆进pTARGET哺乳动物 表达载体，并在人膀胱移行细胞癌中表达；Lin Lin等J Biol Chem(2002) 277(44)41872-8将AchR基因克隆进哺乳动物表达载体pEF6/myc-His载 体，并在293细胞中表达)。最近开发的极具潜力的载体是Invitrogen的名 为pcDNATM3.1的载体，它已证明能够过表达重组蛋白。Li J.等，Life Sci. 2004Apr 16；74(22)：2693-705已经成功地使用pcDNA 3.1在HEK293细 胞中过表达了组蛋白脱乙酰基酶。稳定转染了所述细胞并在血清存在下进 行培养。Yuan-Gen Fu.等，World J Gastroenterol 2003已经在胃癌细胞系 SGC7901中使用基于pcDNA 3.1(+)的真核载体生产了重组胱天蛋白酶 -3(Caspase-3)，所述细胞系瞬时转染了所述载体并且在血清存在下进行 培养。Ma H.等，Invest Ophthalmol Vis Sci.2000 Dec；41(13)：4232-9使用 COS-7作为细胞系检查了亚克隆进pcDNA 3.1载体的Lp82及Lp82相关 蛋白中稳定蛋白质的缺乏以及酶活性的丧失。所述细胞经瞬时转染并在培 养基中存在血清的情况下培养。硫氧还蛋白过表达阻止了在肺内皮细胞中 NO诱导的NO合酶活性的下降。Zhang J.等，Am J Physiol.1998Aug； 275(2 Pt 1)：L288-93公开了通过使用pcDNA 3.1载体瞬时转染培养的猪肺 动脉内皮细胞来子这些细胞中过表达硫氧还蛋白。所述转染细胞在补充了 血清的培养基中培养。Shinki T.等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 1997 Nov 25； 94(24)：12920-5将大鼠肾线粒体细胞色素P450混合功能氧化酶、25-羟基 维生素D3-1α-羟化酶的全长cDNA与维生素D缺乏大鼠的cDNA进行了 比较，将其亚克隆进哺乳动物表达载体pcDNA 3.1(+)，并将所述载体瞬 时转染进COS-7转化猴肾细胞。所述转染细胞在补充了血清的培养基中培 养。Zhang等，Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2004，36(10)：707-712 公开了使用pcDNA转染人胚肾293细胞，所述pcDNA含有编码人源化 520C9单链Fv抗体/人白介素-2融合蛋白的基因。在无血清SFM II培养 基中培养所述细胞三天后，收取上清液。所得融合蛋白具有针对p185(用 于乳腺癌抗体治疗的有希望的靶标)的结合特异性，并且保留了重要的 IL-2免疫激活活性。Chen，J.Z.等，Int J Biochem Cell Biol.2004Aug；36(8)： 1554-61使用转染了pcDNA-Bimα3的HEK293细胞过表达凋亡的必要因 子Bim蛋白。
提高重组蛋白药物应用安全性的另一个措施是在培养过程中使用无 血清培养基，因为血清的使用代表了安全性风险以及不想要的污染的来 源。这样的无血清培养的缺点是生产过程的产量通常显著降低。另一个安 全性担心是转染宿主细胞时使用血清作为常规方法，因为在转染过程中应 用血清可造成不想要的生物材料整合进细胞，这些材料随后污染生产过程 中细胞表达的产物。尽管一些可用的生产重组蛋白的方法(包含上文提到 的那些)允许无血清培养，但是人细胞的无血清稳定转染仍然未知。在第 19届ESACT会议，Harrogate，2005年6月5日-8日上，Kuchenbecker 等提出了CHO细胞的无血清转染。因此，期望开发一种有效且安全的生 产人重组蛋白的方法。

意想不到的是，我们发现可以从在无血清条件下稳定转染了编码目 的蛋白质的核酸的永生化人细胞系中以良好的产率获得无污染的人蛋白 质(即不含不想要的蛋白质副产物的蛋白质制备物)。更详细地，本发明 提供：
(1)制备稳定转染了核酸序列的永生化人细胞系的方法，所述核酸 序列包含编码人靶蛋白质或其衍生物或其突变体的基因、启动子和牛生长 激素多聚腺苷酸化(多聚A)信号，所述启动子和多聚A信号分别与所述 编码人靶蛋白质的基因的5’和3’末端连接，所述方法包括使用包含所述核 酸序列和复制起点的转染载体在无血清条件下转染永生化人宿主细胞系；
(2)上述(1)的方法，其中转染载体来源于含有序列SEQ ID NO：4 或5的pcDNA 3.1载体；
(3)上述(1)或(2)的方法，其中所述人细胞系是选自293细胞 (ATCC CRL-1573；DSM ACC 305)、FreeStyle 293细胞(下文的“293F” 细胞；Invitrogen R79007)、和293T细胞(ATCC CRL 11268；DSM ACC 2494)的人胚肾细胞；
(4)上述(1)-(3)的方法，其中所述人蛋白质是凝血因子IX， (例如，如SEQ ID NO：1的939位至2324位碱基对所编码的)、α-1-抗胰 蛋白酶(下文的“A1AT”；例如，如SEQ ID NO：2的913位至2259位碱 基对所编码的)、凝血因子VIII(包括如SEQ ID NO：8中所示的野生型因 子VIII，或者如SEQ ID NO：3的783位至5162位碱基对所编码的B结构 域缺失的因子VIII突变体，)、因子VII/VIIa(包括其a型和b型，由SEQ ID NO：13和14所编码)、G-CSF(包括G-CSF a、b和c型，分别示于 SEQ ID NO：15、16和17)或者血友病因子(von Willebrand factor，vWF)；
(5)转染载体，其包含复制起点和编码如上述(1)和(2)中所定 义的人蛋白质的基因，优选所述转染载体为包含编码如上文(4)中所定义 的人蛋白质的基因的pcDNA3.1载体；
(6)可通过上文(1)-(5)中所定义的方法获得的永生化人细胞 系，优选所述人细胞系如上文(3)或(4)中所定义；和
(7)重组生产人靶蛋白质或其衍生物或突变体的方法，其包括培养 如上文(6)中所定义的永生化人细胞系，优选在无血清条件下进行培养。
附图说明
图1：野生型人凝血因子IX(FIX)蛋白。带有其5’非翻译(5’UTR) 区和3’UTR区的FIX基因的示意图。标出了含461个氨基酸的未加工蛋 白质的8个结构域：S：信号肽；P：前肽；Gla结构域：γ-羧基谷氨酰结 构域；H结构域：疏水序列；EGF结构域：表皮生长因子样结构域；L： 连接序列；AP：激活肽；催化结构域。FIX成熟蛋白质长度为415个氨基 酸，近似分子量为55kDa。
图2：pcDNA3.1-FIX载体。该环状DNA载体包含6,960个碱基对， 其确切序列在SEQ ID NO：1中给出。在示意图中标出了CMV启动子 (CMV)、人FIX基因(hFIX)、f1起点(f1)、SV40启动子(SV40)控 制下的潮霉素(Hyg)基因、多聚A区(SV40多聚A)、pUC起点和氨苄 青霉素(Amp)抗性基因以及大量限制性位点。此载体来源于SEQ ID NO：5 的经重测序的pcDNA3.1载体pcDNA3.1Hygro(+)-zz。
图3：pcDNA3.1-A1AT载体。该环状DNA载体包含6,914碱基对， 其确切序列在SEQ ID NO：2中给出。在示意图中标出了CMV增强子启动 子、A1AT cDNA、包含转录终止序列以增强mRNA稳定性的牛生长激素 多聚腺苷酸化(多聚A)信号、f1起点(f1)、SV40启动子(SV40)控制 下的潮霉素(Hyg)基因、SV40多聚A区(SV40多聚A)、pUC起点和 氨苄青霉素(Amp)抗性基因以及大量限制性位点。此载体来源于SEQ ID NO：5的pcDNA3.1Hygro(+)-zz载体。
图4：使用编码α-1-抗胰蛋白酶的载体瞬时转染不同的人胚肾细胞。 显示在瞬时转染研究中的细胞系比较。显示了每106个293、293T和293F 细胞中α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)的表达量(％)。将瞬时转染了 pcDNA3.1-A1AT的293F细胞中A1AT的表达量设置为100％。
图5：使用编码α-1-抗胰蛋白酶的不同载体瞬时转染293F细胞。显 示了使用瞬时转染的freestyle 293F细胞由不同载体表达的A1AT浓度的比 较。pcDNA3.1-A1AT的A1AT表达水平设置为100％。还测试了带有A1AT 基因的多种其它载体：将自制载体(in-house vector)pTG1-A1AT(用于 生产图10所示人重组A1AT的自制载体，)、pCMVA1AT (Stratagene)和pcl neo-A1AT(Promega)与pcDNA3.1-A1AT(pcDNA3.1) 进行了比较。这些其它载体均未接近使用pcDNA3.1-A1AT时观察到的高 表达水平。
图6：细胞培养上清液的SDS-PAGE和Western印迹。通过 SDS-PAGE和western印迹分析瞬时转染pcDNA3.1-A1AT(1-3道和6-8 道)或GFP表达对照质粒(4和8道)的freestyle293F细胞上清液的等分 试样。1道含有大小标记，5道为空白。A1AT的条带使用箭头标出。还可 见4和8道中对应于GFP的27kDa条带。
图7显示pcDNA3.1-F.VIII。所述载体包含9,975个碱基对，其确切 序列在SEQ ID NO：3中显示。783-5162位碱基对编码的因子VIII蛋白是 WO 01/70968中公开的B结构域缺失的因子VIII突变体。此载体也来源 于SEQ ID NO：5的pcDNA3.1Hygro(+)-zz载体。
图8：对使用pcDNA3.1-FVIII和自制载体pTGF8-2hyg-s(其确切 序列在SEQ ID NO：7中显示)转染的293和293F细胞中，最好的三个稳 定转染克隆中因子VIII平均生产量的比较。
图9显示pTG1-A1AT载体。所述载体包含5,610个碱基对，其确切 序列在SEQ ID NO：6中显示。
图10显示pCR2.1d2-GCSFb载体。所述载体包含4,542个碱基对， 其确切序列在SEQ ID NO：21中显示。
图11显示pDNA3.1-GCSFb载体。所述载体包含6,237个碱基对， 其确切序列在SEQ ID NO：22中显示。
图12显示pCINeo-GCSFb载体。所述载体包含6,101个碱基对，其 确切序列在SEQ ID NO：23中显示。
图13显示pCMVScript-GCSFb载体。所述载体包含4,920个碱基 对，其确切序列在SEQ ID NO：24中显示。
图14显示pTG2-GCSFb-hyg-as载体。所述载体包含6,917个碱基 对，其确切序列在SEQ ID NO：25中显示。
图15比较根据实施例9通过不同表达构建体产生的rhG-CSF的量。
图16显示根据实施例9产生的rhG-CSF的western印迹。
发明详述
本发明提供在完全无血清和无蛋白质条件下在人永生化细胞系中转 染和生产人重组蛋白的改进方法。它允许无血清地转染和生产人蛋白质。 所述方法可包括一种或多种纯化步骤，包括病毒灭活操作，其降低了人类 病原体污染重组蛋白的风险。由于人细胞系中产生的人重组蛋白带有人糖 基化模式，因此它们与缺乏其天然糖基化模式的人蛋白质相比也较为不易 降解。总之，本发明的方法提供超越现有技术的多种优点。
具体地，本发明实施方案(7)的方法提供了生产安全、高活性的人 重组凝血因子(例如，用于人血友病B和A的治疗用途的因子IX和FVIII) 的有效系统。所述方法适于表达野生型蛋白质，但是也可用于这些蛋白质 如因子VIII的突变体，其对于蛋白水解失活异常稳定，从而允许接受激烈 的病毒灭活方案。
本发明实施方案(7)方法的优选模式包括无血清培养带有载体的永 生化细胞系，所述载体含有与编码所述人血液蛋白的DNA序列5’末端连 接的启动子。编码所述人血液蛋白的DNA序列的3’末端与牛生长激素多 聚A信号有效连接。根据本发明，使用所述载体稳定转染永生化人细胞系。 为检测稳定转染，除了人血液蛋白基因以外，所述载体还可包含至少一种 与启动子有效连接的用于选择标记系统的基因。
合适的启动子包含病毒启动子、看家基因启动子、组织特异性启动 子等。对于启动子为病毒启动子的情况，所述细胞系不包含与所述启动子 相匹配的病毒转录激活子蛋白。然而，所述细胞可包含与另一病毒启动子 互补的病毒转录激活子蛋白(例如T抗原)，所述另一个病毒启动子没有 与编码人血液蛋白的基因有效连接。优选的，所述启动子是SV40启动子、 CMV启动子、EF-1α启动子、HSV TK启动子等，最优选地，启动子是 CMV启动子，即巨细胞病毒的组成型主要中间早期启动子。
表述“转染”或“转染的”指在允许所述蛋白质表达的条件下将核 酸引入到细胞中。通常，所述核酸是DNA序列，特别的是携带合适启动 子控制下的目的基因的载体或质粒，所述基因的表达受到所述启动子的控 制。但是，术语转染也包括RNA转染。技术人员熟悉多种转染方法，例 如使用载体分子，例如阳离子脂类如DOTAP(Roche)、DOSPER(Roche)、 Fugene(Roche)、(Promega)、TransFastTM(Promega)和 TfxTM(Promega)、脂转染胺(Lipofectamine)(Invitrogene)和293fectinTM (Invitrogene)的方法，或者使用磷酸钙和DEAE葡聚糖的方法。技术人 员也熟悉强力转染技术。它们包括电穿孔、使用核酸包被的载体颗粒进行 轰击(基因枪)和显微注射。最后，技术人员也熟悉使用病毒载体的核酸 转染。
“瞬时转染的”或“瞬时转染”指由于所引入核酸的附加体性质而 瞬时(即非永久性)表达目的基因。根据其这种性质，RNA转染或细胞溶 解性病毒只可用于瞬时表达。附加体核酸，包括DNA(质粒或载体)，在 2到4天后被细胞降解，因此目的基因的表达此时终止。
“稳定转染的”或“稳定转染”指由于转染的DNA整合进细胞基因 组而永久性表达目的基因。多数(如果不是所有)细胞具有将附加体DNA 整合进其基因组的潜力，虽然整合率非常低。但是，使用复杂的选择策略 以扩增那些已整合了转染DNA的细胞。为此，所述载体必需含有至少一 个选择标记(例如潮霉素)基因。
术语“稳定转染”或“稳定转染的”在本文中也用于指携带可自主 复制的质粒并因而可用于长期表达外源基因的细胞。可用于“稳定转染” 细胞的一个具体的基因转移系统是基于重组逆转录病毒。由于前病毒DNA 的整合是在逆转录病毒复制周期中必需的步骤，因此使用重组逆转录病毒 感染细胞使很高比例的细胞带有整合的目的基因并因而稳定转染。
术语“培养”指体外在容器中维持细胞/细胞系，所述容器中含有支 持其增殖和基因表达的培养基。因此所述培养造成所表达的可分泌蛋白在 培养基中积累。培养基通常含有稳定pH值的补充剂以及氨基酸、脂类、 微量元素、维生素和其它生长促进成分。
术语“无血清”、“无血清转染”或“无血清培养”指细胞的转染和 培养在含有除任何种类血清之外的合适补充剂的培养基中进行。补充剂选 自氨基酸、脂类、微量元素、维生素和其它生长促进成分。所述“无血清” 培养条件经常更加严格，并且如果不加入外源蛋白质，培养基中也不含有 外源蛋白质，则所述培养基被称作“无蛋白质”。
术语“永生化人细胞系”指不是直接取自生物体的原代细胞的人细 胞。特别地，它指永久建立的细胞培养物，其在给予合适的新鲜培养基和 空间时将无限增殖，因而已脱离了海弗利克极限。
术语“浓缩”指从培养基中浓缩所生产的重组蛋白。它必然也导致 了蛋白质的浓缩。本领域技术人员熟悉浓缩技术，例如过滤，其包括超滤、 离心、沉淀等。浓缩不一定得到纯的蛋白质，所分离的蛋白质可仍然包含 非蛋白质及蛋白质的污染物。经常需要其他纯化步骤。
术语“纯化”指应用于所分离的蛋白质的步骤，用于获得基本上纯 (至少60％纯、优选至少75％纯、更优选超过90％纯、最优选超过99.9％ 纯)的人重组蛋白。纯度可通过合适的方法测量。本领域技术人员熟悉可 用于纯化重组蛋白的技术，例如免疫亲和层析、亲和层析、蛋白质沉淀、 缓冲液交换、离子交换层析、疏水相互作用层析、尺寸排阻层析、电泳。 另外，所述纯化可包含病毒灭活步骤，例如在干燥或液体状态下、在存在 或不存在化学物质(包括蛋白酶抑制剂)的情况下进行热处理和/或溶剂去 污剂(SD)处理。另外，所述纯化可包括一个或多个除去朊病毒的步骤， 例如蛋白沉淀、过滤、层析步骤，特别是亲和层析步骤(参阅如“Partitioning of TSE infectivity during ethanol fractionation of human plasma”，Gregori， L等，Biologicals 321-10；2(2004)；以及“Removal of TSE agents from blood products”，Foster，P.R.Vax Sanguinis 87(Suppl.2)，S7-S10(2004))。在病 毒灭活之后，选自上述任何一种的额外纯化步骤可能是除去用于病毒失活 的化学物质所必需的。
术语“载体”指与适当的控制元件连接时能够复制的任何基因构建 体，例如质粒、噬菌体、粘粒等，DNA片段可插入或克隆到其中。载体 包含独特的限制性位点，并且可能能够在宿主细胞中自主复制。该术语包 括克隆和表达载体。“载体”还可带有一个或多个其他调节元件，所述调 节元件优选选自剪切位点、重组位点、多聚A位点、增强子、多克隆位点 和原核质粒序列。
术语“有效连接”指载体的构型，其中启动子以能够激活编码目的 蛋白质(特别是人血液蛋白)的DNA序列转录的形式位于所述载体中。
术语“成熟”指给定蛋白质的经加工蛋白质的分子结构，即缺少了 N端输出信号的蛋白质。
术语“启动子”指在转录的起始中结合RNA聚合酶和转录因子的调 节性DNA序列区。
术语“增强子”指提高真核启动子利用、并能在相对于启动子的任 何取向和任何位置上(上游或下游)发挥功能的顺式作用序列。
术语“多聚腺苷酸化(多聚A)信号”指专门的终止序列。它给出 在mRNA末端添加使mRNA输出到胞质的腺苷酸“尾”的信号。到达胞 质以后，mRNA的多聚A尾在蛋白质翻译过程中一直存在，并在蛋白质表 达过程中稳定所述mRNA。
术语“编码”或“编码的”指置于适当调控序列的控制下时，核酸 序列在体外或体内可转录(DNA的情况)或翻译(mRNA的情况)成多 肽(蛋白质)的特性。
就本申请目的而言，术语“表达”指编码蛋白质的基因的转录和翻 译。
本发明的“人蛋白质”包括但不仅限于人的蛋白质、多肽、其突变 和修饰。具体的，人蛋白质包括重组血浆蛋白质例如凝血因子(例如因子 VIII、因子VII/VIIa、因子V、因子IX、因子XI、血友病因子等)、生长 因子(例如红细胞生成素等)、集落刺激因子(CSF)(例如粒细胞刺激因 子(G-CSF)、巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF))、 细胞因子(例如白介素包括白介素3等)、蛋白酶抑制剂(如α-1-抗胰蛋白 酶(A1AT)、胰凝乳蛋白酶等)、转运蛋白(例如激素等)、抑制或调节作用 蛋白等等。另外，包括这些蛋白质或多肽的突变和修饰，特别是提供了所 述重组蛋白更好的稳定性、延长的半衰期、或更好回收率的突变或修饰， 分别包括缺失、替换或插入突变和功能性基团的化学突变。可通过本发明 方法生产的特别优选的蛋白质是人因子VIII(包含缺失B结构域的或野生 型的)、人因子IX、人G-CSF、人A1AT、人因子VII/VIIa和血友病因子。
因子VIII和IX的重组生产是本领域已知的(EP-A-160457； WO-A-86/01961，美国专利4,770,999，5,521,070和5,521,070)。对于因子 VIII，重组表达亚基以生产显示促凝剂活性的复合物是本领域公知的(例 如EP-A-150735，EP-A-232112，EP-A-0500734，WO-91/07490，WO-95/ 13300 U.S.专利5,045,455和5,789,203)。此外，已描述了部分或全部缺失 编码高度糖基化B结构域之序列的截短cDNA形式的表达(例如 WO-86/06101，WO-87/04187，WO-87/07144，WO-88/00381，EP-A-251843， EP-A-253455，EP-A-254076，U.S.专利4,868,112和4,980,456，EP-A-294910， EP-A-265778，EP-A-303540和WO-91/09122中)。WO 01/70968中公开了 一种具体的因子VIII突变体，其中Arg740和Glu1649位置之间的B结构 域被至少含有3个Arg残基且包含10-25个氨基酸残基的富含Arg接头肽 取代(其中所述因子VIII编号是相对于SEQ ID NO：9所示的成熟野生型 因子VIII序列而言)，所述文献以其整体并入本文。特别地，所述富含Arg 接头肽含有14-20个氨基酸残基，特别优选包含以下序列的接头：
氨基酸序列SFSQNSRH(SEQ ID NO：10)，和/或
氨基酸序列QAYRYRRG(SEQ ID NO：11)，和/或
氨基酸序列SFSQNSRHQAYRYRRG(SEQ ID NO：12)。
这样的B结构域因子VIII突变体蛋白由SEQ ID NO：3的783-5162位碱基 所编码。
G-CSF是人血液中的谱系特异性小分子，其刺激从骨髓中产生一类 白细胞，称为嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞在身体免疫系统和抵御感染中 起中心作用。G-CSF(其a、b和c形式的具体cDNA序列在SEQ ID NO： 15、16和17中分别给出；G-CSF b形式蛋白(下文的“G-CSFb”蛋白) 示于SEQ ID NO：27)由单核细胞、成纤维细胞、和内皮细胞天然产生。 正常情况下，健康人体血液中的浓度是约40pg/ml。在患者血浆中，G-CSF 的水平可降低10倍以上。G-CSF也在癌细胞系(如5637细胞)中产生， 其分泌约70ng/ml。对于治疗，Amgen Inc.在大肠杆菌中以N端甲基化的 非糖基化形式生产重组人G-CSF(Filgrastim/其也以PEG 化产物提供(Pegfilgranstim/另一种药物由Chugai Pharmaceuticals Co.在CHO细胞中生产，其产生糖基化产物 (Lenograstim/G-CSF作为药物用于治疗遗传的或者由化疗 (癌症)、AIDS或骨髓移植造成的嗜中性粒细胞减少症。为此，典型剂量 是5μg/(kg·天)。
适于本发明的特定A1AT cDNA序列在SEQ ID NO：2的973-2259 位碱基对中给出。特定的因子VII/VIIa cDNA序列在SEQ ID NO：13和 14中给出，对应于其a和b形式。特定的vWF cDNA在SEQ ID NO：18 中给出。
选择标记系统包括潮霉素抗性、嘌呤霉素抗性、新霉素抗性、腺苷 脱氨酶(ADA)抗性、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)抗性、 博来霉素(phleo、bleo、zeocin)抗性、胞嘧啶脱氨酶(CDA、CD)抗性、 胞嘧啶脱氨酶(CDA、CD)抗性、二氢叶酸还原酶(DHFR)抗性、组氨 醇脱氢酶(hisD)抗性、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)抗性、嘌呤霉素-N- 乙酰转移酶(PAC、puro)抗性、胸苷激酶(TK)抗性和黄嘌呤-鸟嘌呤 磷酸核糖转移酶(XGPRT、gpt)抗性。特别优选的是潮霉素抗性基因。 选择标记基因也可与多聚A信号有效连接，例如来源于牛生长激素(BGH) 的多聚A信号或SV40多聚腺苷酸化信号。
在选择期中，转染细胞在其培养基中持续接触选择标记系统的蛋白 质，例如潮霉素，导致只有携带载体的细胞生存下来。本领域技术人员熟 悉适于建立稳定转染细胞的其他选择性标记以及需要应用的所选选择剂 浓度。
本发明特别优选的载体带有CMV启动子、潮霉素基因、多聚A序 列和目的基因，优选是具有SEQ ID NO：4序列的Invitrogen的pcDNA 3.1 载体，其中重测序所述载体发现实际具有SEQ ID NO：5中所示序列。
适于本发明方法的永生化细胞系选自肾、膀胱、肝、肺、心肌、平 滑肌、卵巢或胃肠细胞。这些细胞可在其基因组中携带腺病毒DNA序列， 特别是Ad5序列的前4344个核苷酸。优选的是人胚肾细胞(HEK)，其选 自293细胞(ATCC CRL-1573；DSM ACC 305；ECACC ref.85120602)、 293T细胞(DSM ACC 2494；ECACC：tsa21，ref.96121229)、和freestyle293 细胞(293F细胞；Invitrogen R79007)。最优选的是293F细胞。携带所述 载体的永生化细胞系在允许重组基因表达的条件下培养。它们基本上是本 领域技术人员已知的标准培养条件，但是在细胞携带人因子IX基因的情 况下，培养基中应该包含维生素K。
本发明的特定实施方案是在稳定的永生化细胞(其也在无血清条件 下进行转染)的无血清培养物中无血清生产重组蛋白。为此，在无血清条 件下转染和培养上述任一永生化人细胞系，优选293F细胞系。所述细胞 在无血清的悬浮培养中稳定转染，接着适应于贴壁细胞生长以选择单细胞 克隆。一旦获得个体克隆，将其贴壁扩增。在选择了最佳生产克隆之后， 将细胞转移到悬浮培养。在整个稳定细胞系操作以及在为了生产进行的规 模扩大中，细胞在无血清培养基培养，从不接触血清或者人类或动物蛋白 质。从培养液中分离重组血液蛋白质(例如任一凝血因子)或蛋白酶抑制 剂(例如A1AT)或生长因子(例如G-CSF和GM-CSF)，其后进行标准 纯化步骤。更详细地，无血清生产重组人血液蛋白质(特别是人因子VIII 或因子IX或A1AT或G-CSFb)的特定实施方案包括如下步骤：
(1)在无血清悬浮培养中转染人永生化细胞，优选293F细胞。细 胞在一次性无菌聚碳酸酯锥形瓶中培养。细胞使用转染试剂(优选阳离子 转染试剂，更优选脂转染胺2000CD试剂(Invitrogen)或者磷酸钙转染 法的试剂以例如每毫升1×106个活细胞的密度进行转染；转染编码人血液 蛋白质的载体，优选所述载体为pcDNA3.1-FIX、pcDNA3.1-FVIII、 pcDNA3.1-A1AT或pcDNA3.1-GCSFb；
(2)转染后24-120小时，优选36-96小时，更优选48小时，将合 适数量的细胞(103-1010个；优选105-108个，最优选106个细胞)转移到 平板培养皿中，使之沉降以建立贴壁生长。优选地，所述培养皿是10cm 培养皿，并且细胞在无血清、无蛋白培养基中培养，优选FreeStyle 293表 达培养基(12338-018，Invitrogen)或者无血清自制培养基(Octapharma Stockholm)。
(3)选择压力开始于转移进平板培养皿之后2-50小时，优选48小 时。在培养基中补充合适的选择剂，其选自选择标记例如潮霉素、新霉素、 G418和Zeocin。优选的选择剂是潮霉素，浓度为10-300μg/ml，优选 50-200μg/ml，最优选50μg/ml。所述压力保持至少10-20天，优选14天， 其中每隔一天更换一次补充了潮霉素的培养基。只有稳定转染的细胞在这 些选择性条件下存活，并且形成可单独挑取的贴壁细胞克隆。另外可使用 粘附因子以将细胞粘附在培养皿上，避免细胞从一个克隆漂浮到另一个细 胞克隆。例如，此粘附因子可以是例如聚-D-赖氨酸、不含人或动物蛋白质 的合成培养基补充剂或者其它物质。或者，可以使用克隆环(cloning ring) 挑取克隆。
(4)挑取各个细胞克隆并转移到独立的培养容器中，以在没有选择 压力的情况下无血清扩增细胞(规模扩大)。任何培养容器都是合适的， 但是优选首先将各个克隆转移到含有足量培养基的96孔板中，接着转移到 48孔板、24孔板、12孔板以及6孔板中，然后转移到离心管中。在离心 管阶段，所述细胞在轻微摇动的无血清培养基中培养，以将细胞带回悬浮 培养。一旦所述细胞到达6孔板或离心管阶段，任选地根据一些选择标准 (即细胞生长速率(优选生长较快的细胞)以及其生产重组蛋白的量)来 选择最佳细胞克隆。但是，所述选择也可在任何以后的阶段进行。
(5)将得自离心管培养的细胞接种到含有足够量无血清培养基的锥 形培养瓶中。在悬浮生长的无血清、无蛋白质细胞克隆中用于规模扩大的 其它选择标准如下：生存力、细胞形态、无聚集、与离心有关的健壮性以 及无细胞碎片。
如果载体是pcDNA3.1-hygro(+)-zz，则本发明方法特别有效。优选 将编码人蛋白质(特别是人FIX、FVIII、A1AT或G-CSFb)的基因以在 CMV启动子控制之下的方式插入，分别如图2、3、7和11所示。优选插 入所述基因的野生型序列，使得重组表达蛋白质不带有任何突变，并且结 构上与从血浆中分离出的蛋白质相同。野生型人因子IX的示意图在图1 中显示。SEQ ID NO：1、2、3和22分别提供pcDNA3.1-FIX、 pcDNA3.1-A1AT、pcDNA3.1-FVIII和pcDNA3.1-GCSFb的核酸序列。各 个蛋白质分别由939至2224位、913至2259位、679至5055位和970至 1584位核苷酸编码。
本发明因此提供重组生产人因子IX、A1AT、因子VIII和G-CSFb 的方法，它们被克隆到pcDNA3.1TM中，分别产生pcDNA3.1-FIX、 pcDNA3.1-A1AT、pcDNA3.1-FVIII、和pcDNA3.1-GCSFb，其整合进入 永生化人细胞的基因组，所述细胞优选人胚肾细胞，例如293细胞(ATCC CRL-1573；DSM ACC 305；ECACC ref.85120602)、Freestyle 293细胞 (293F细胞；Invitrogen R79007)或293T细胞(DSM ACC 2494； ECACC：tsa21，ref.96121229)。
这些携带pcDNA3.1-FIX、pcDNA3.1-A1AT、pcDNA3.1-FVIII、或 pcDNA3.1-GCSFb的细胞在使得基因表达的标准条件下在培养基中培养， 或者它们在无血清条件下培养以使得人类病原体污染的风险最小化。可包 括一个或多个除去朊病毒的步骤，例如蛋白沉淀、过滤、层析步骤，特别 是亲和层析步骤。作为替代/补充，可使用敲除朊病毒的细胞系作为表达细 胞。这可通过完全的基因组敲除或反义技术来获得。对于生产人因子IX 的情况，所述细胞优选在维生素K存在下进行培养。从培养上清液中分离 人血液蛋白质，并接受本领域已知的后续纯化步骤，以使得纯净、稳定并 且高活性的产物的产量最大化，所述纯化步骤选自免疫亲和层析、阴离子 交换层析、尺寸排阻层析等及其组合。容易使其适应分离重组因子IX、 G-CSFb或A1AT的特定需要。在纯化过程之中及之后，所纯化蛋白质的 量和活性可通过ELISA和/或一期凝血时间测定(aPTT)来监控。
为克服纯化的蛋白质样品或直接得自含有分泌的所选重组蛋白的细 胞培养上清液的产物中可能存在的感染性污染的问题，可使用病毒灭活步 骤处理培养上清液，所述步骤包括热处理和/或SD-处理(干燥或液态下， 加入或不加入包含蛋白酶抑制剂的化学物质)。本领域技术人员熟悉纯化 操作。例如，通过阴离子交换层析从血浆中分离、纯化和回收高纯度病毒 灭活的因子VIII描述于WO93/15105。另外，若干从血浆或其它生物学来 源中产生高纯度、无感染性凝血因子的方法已经有过报道。通过使用形成 两相系统的疏水相处理潜在的感染性物质并接着由此除去不溶于水的部 分，脂类包被的病毒被有效灭活。已证实同时或依次使用非离子型生物相 容性洗涤剂和二烷基或三烷基磷酸酯(WO 96/36369，EP 0131740，US 6,007,979)补充疏水相处理可提供其他优点。非脂质包被的病毒需要由非 离子型洗涤剂及其后加热数小时(60-65℃)的步骤组成的失活方案(WO 94/17834)。在病毒灭活之后，用于除去所述化学物质的其他纯化步骤可能 是必需的。总之，本发明提供有效的蛋白质生产方法，其基于人细胞系与 已经认可的蛋白质纯化方法以及失活潜在危险性传染原的方法的结合。已 经建立了安全易用的生产重组蛋白(例如凝血因子IX或VIII、A1AT和 G-CSFb)的应用系统。重组生产的蛋白质的活性可使用标准测试进行检 测。例如，对于人因子IX的情况，使用活化部分促凝血酶原激酶时间测 定，其中使用采取手动凝血设备的Dapptin TC (Kaolin/Sulfatid-Phospholipid目录号5035090，Technoclone GmbH)活 化。最后，这样获得的重组蛋白(例如上文所述的血液蛋白质，特别是人 因子IX)可用于药用组合物。
在下述实施例中进一步描述本发明。但是，所述实施例不应解释为 对本发明的限制。
实施例
材料和方法
用于蛋白质表达的人细胞系：优选的细胞系是HEK293(ECACC Ref：85120602)、FreeStyle 293(293F；Invitrogen R79007)和293T细胞 (tsA201，ECACC ref.96121229)，它是稳定表达SV40温度敏感性T抗 原的转化人胚肾细胞系。这些上皮样细胞系已经用于许多功能性表达测 定，并且已有报道产生高水平的重组蛋白。在以下实施例中优选使用来自 293细胞系的293F细胞系(Invitrogen)。母细胞系293是从转化了经剪切 人腺病毒5型DNA(Graham等，1977；Harrison等，1977)的原代人胚 肾细胞建立的永久细胞系。293F细胞系是293细胞系的变体，其适于在 FreeStyleTM 293(293F)表达培养基(12338-018，Invitrogen)中悬浮生 长。293F细胞系从Pharmacopeia的Robert Horlick处获得。293F细胞系 最初从低代数母细胞库(Master Cell Bank)培养物中制得，所述培养物 来源于通过限制性稀释再次克隆的母293F细胞。在本发明开发期间，细 胞在无血清FreeStyle 293表达培养基或无血清培养基(Octapharma Stockholm)中以良好的生存力和良好的形态持续生长一年以上。
为了高效生产人因子IX，可通过添加维生素K来改造所述培养基。 这些细胞系能够在含有合适补充物的无血清和/或无蛋白质培养基中培养。
靶蛋白质的测定和测量
通过ELISA测定人因子IX的浓度：根据标准操作，使用山羊抗人 FIX(GAFIX-AP，Affinity Biologicals)作为捕获抗体通过ELISA测定上 清液中人重组因子IX水平。所有孵育在室温下的潮湿容器中进行。 Octanyne(血浆来源的FIX，Octapharma)和BeneFIX(重组FIX，Genetics Institute)均作为标准品使用。检测抗体是过氧化物酶缀合的山羊抗人FIX (GAFIX-AP，Affinity Biologicals)。ABTS(目录号1682008，Roche Diagnostics)作为底物加入每个孔中，在15分钟内在405nm处检测显色 反应。通过标准浓度与标准吸光度的线性回归计算浓度。
检测人凝血因子IX活性：上清液中人重组因子IX的凝血活性按照 如下进行测定：基于活化部分促凝血酶原激酶时间测定来测定凝血活性， 其中使用采取手动凝血设备(Amelung KC 4A micro，Amelung GmbH)的 Dapptin TC活化(Kaolin/Sulfatid-Phospholipid目录号5035090， Technoclone GmbH)。就该研究而言，将来自转染细胞的50μl上清液、 50μl缺乏FIX的血浆(Progen)和50μl Dapptin TC在37℃孵育2分钟。 通过加入50μl CaCl2(目录号84687-22F，Instumentation Laboratory)起 始凝血。将样品凝血时间与Octanyne或/和BeneFIX进行比较。
使用COAMATIC：FVIII测定(Chromogenix)来测定BDDrhFVIII： 商品生色测定试剂盒COAMATIC：FVIII(Chromogenix，目录号82 25 85) 含有FIX、FX以及可通过FXa切割转化成黄色水溶性染料的生色团。含 有样品的FVIII完成了此系统：FVIII通过络合激活FIX，此络合物通过 蛋白水解切割激活FX，使之变成FXa。FXa将生色团转化为染料，其接 着在405nm处进行光度测定。此测试设计用于测定来自患者血浆的FVIII。 建立以下操作以使此测试可用于稀释培养基中因子VIII的测定。使用全长 重组人凝血因子VIII(NIBSC，订货号57814F)和正常对照血浆 (Instrumentation Laboratory Company)作为对照标准品。
样品制备：使用与COAMATIC试剂一起递送的稀释缓冲液稀释样 品至预计FVIII最终活性在2到20mIU/ml之间，并且与WHO No.6标准 曲线进行比较。
方法：在置于thermobloc上的96孔阵列上，标准品和样品各测量 三次。
操作方案(每孔)：
 试剂  体积   孵育(37℃)  稀释的标准和样品  50μl   4分钟  因子试剂(37℃)  50μl   置于96孔光度计设备中，在37℃孵   箱中孵育2分钟  S-2765+1-2581(37℃)  50μl   置于96孔光度计设备中，在37℃孵   箱中孵育2分钟  20％乙酸  50μl   置于96孔光度计设备中，在96孔光   度计上摇动15s   立刻在405nm处测定吸光度
使用弹性蛋白酶活性测试测定A1AT活性：在转染A1AT的cDNA 之后，A1AT表达并分泌进入细胞培养基。通过离心(5分钟，1000rpm) 除去细胞之后，在培养上清液中测定A1AT活性。在此活性测试中，通过 A1AT对弹性蛋白酶的抑制效应测定其活性。弹性蛋白酶从底物N-琥珀酰 -(Ala)3-pNA上切割pNA。在405nm处用光度法测定pNA释放。通过与 具有确定A1AT活性的标准样品进行比较来测定各个样品的活性。如其它 实验中所证实的，该测试在无血清Freestyle培养基中有效。为确认 Freestyle培养基不影响所述测试，制备了两条标准曲线：在T+缓冲液或 Freestyle培养基中稀释的标准人血浆。
稀释样品：以未稀释、1∶10稀释和1∶50稀释在Freestyle培养基 中测试所有样品，并与人血浆标准品稀释液进行比较。
方法：分别将50μl每种标准品稀释液和样品稀释液移入96孔微孔 板的孔中。在每个孔中加入150μl弹性蛋白酶工作溶液之后，在ELISA 读数器上摇动96孔板1分钟，然后在37℃孵育30分钟。用多道移液器在 每个孔中加入100μl底物工作溶液。在加入底物溶液后以及在黑暗处37 ℃孵育7分钟后，在405nm处测定吸光度。第一个值代表未发生弹性蛋 白酶催化反应的基本吸光度，从代表弹性蛋白酶从底物上切割pNA之后的 吸光度的第二个值中减去第一个值。使用相减之后的结果，根据标准曲线 计算所述样品的A1AT活性。
通过ELISA确定G-CSF活性：根据标准方法，使用小鼠抗人G-CSF 抗体(MAB-214，R&D System)作为捕获抗体通过ELISA测定细胞培养 上清液中的人重组G-CSF水平。所有孵育均在室温下的潮湿容器中进行。 使用G-CSF标准品(重组hG-CSF，大肠杆菌，214-CS-025，R&D Systems)。 检测抗体为生物素化的山羊抗人G-CSF(BAF-214，R&D Systems)。链 霉抗生物素蛋白缀合到与检测抗体连接的辣根过氧化物酶(DY998，R&D Systems)上。在每个孔中加入QuantaBluTM荧光过氧化物酶底物(15169， Piece)作为底物，在60分钟内，在消光320nm/发射光420nm处检测荧 光反应。通过标准品浓度与标准品相对荧光单位(RFU)的线性回归来计 算结果。
实施例1：克隆靶蛋白质。
A.克隆人因子IX：通过HindIII和NotI的双消化从如WO01/70968 中公开的pTG36载体中切下含有人凝血因子IX开放读码框的1.4kb片段。 将此片段连接进载体pcDNA3.1Hygro(+)-zz(来自V870-20，Invitrogen) 经HindIII和NotI双消化的的5.6kb片段，得到图2所示的pcDNA3.1-FIX。 pcDNA3.1-FIX的DNA序列在SEQ ID NO.1中显示。相比于Invitrogen 公开的序列(如SEQ ID NO：4中所示)，在pcDNA3.1Hygro(+)-zz(见 SEQ ID NO：5)中发现了载体骨架中的三个其他核苷酸插入。载体 pcDNA3.1-FIX含有潮霉素抗性基因盒，以允许进行用于稳定转染细胞克 隆的选择方法(见图2、3和7)。所述载体允许通过磷酸钙转染或其它方 法建立稳定表达细胞系，接着选择潮霉素抗性。
B.克隆人因子VIII：使用NotI+XhoI消化从载体pTGF8-2hyg-s (SEQ ID NO：7；其生产在WO01/70968中公开)上分离含有缺失B结构域 的人凝血因子VIII开放读码框的4380bp FVIII cDNA，并与使用 XhoI+PspOMI线性化的pcDNA3.1Hygro(+)-zz连接，得到如图7所示的 pcDNA3.1-FVIII载体。
C.克隆人A1AT：使用mRNA Miniprep试剂盒(Sigma，目录号 MRN-10)直接从HepG-2细胞(DSMZ#ACC 180)中分离A1AT mRNA。 在后面的步骤中，将mRNA捕获在寡聚(dT)珠子上。之后，使用禽成 髓细胞性白血病病毒逆转录酶(AMV RT，Promega，目录号M5101)将 mRNA转录成双链cDNA，接着进行RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)。 使用PCR反应扩增A1AT cDNA。将PCR产物上样到琼脂糖凝胶上。分 离合适的DNA条带，然后使用Qiaquik凝胶提取试剂盒(Qiagen，目录 号28704)进行纯化。接着将A1AT片段亚克隆到商品载体上 Invitrogen，目录号K4650-01)。为了克隆pCMV-Script：使用EcoRI消 化PCR II TOPO-A1AT，将A1AT的1370bp片段连接进用EcoRI线性化 的pCMV-Script上。
为克隆pCI-neo-A1AT，使用EcoRI消化PCR II TOPO-A1AT，将 A1AT的1370bp片段连接到用EcoRI线性化的pCI-neo上
为克隆pcDNA3.1-FVIII，使用XhoI+HindIII消化PCR II TOPO-A1AT，分离出1370bp的A1AT，并与XhoI+HindIII线性化的 pcDNA3.1连接。所得载体在图3中显示。
为克隆pTG1-A1AT，使用HindIII和NotI消化PCR II TOPO-A1AT。将1370bp的A1AT与使用HindIII和NotI线性化的pTG1 (无PRE)连接。所得载体在图9中显示。
D.克隆G-CSF cDNA：使用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN，目录 号74104)直接从天然5637人膀胱癌细胞中分离总RNA。之后，将分离 的总RNA与DNase I一起孵育，以消化可能混入的5637细胞基因组DNA。 为得到无DNase的总RNA，使用RNeasy clean-up试剂盒(QIAGEN，目 录号74204)处理反应混合物。使用寡聚(dT)12-18引物(Invitrogen，目 录号18418-012)和SuperscriptTM II RNase H-逆转录酶(Invitrogen，目录 号18064-022)，在RNase抑制剂(Roche，目录号799-017)存在下以总 RNA作为模板进行RT-PCR，以合成来自5637细胞的ds cDNA库。接着 使用PCR反应扩增G-CSF cDNA。使用QIAquick凝胶提取试剂盒 (QIAGEN，目录号28704)从琼脂糖凝胶中分离G-CSF cDNA，然后使 用下述G-CSF PCR引物进行测序：
-G-CSF正向：5′-ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC-3′(SEQ ID NO：19)
-G-CSF反向：5′-TCA GGG CTG GGC AAG GTG GCG TAG-3′(SEQ ID NO：20)
通过测序分析确认从5637细胞合成的DNA序列为GCSF-b型(含 有SEQ ID NO：26所示序列)。
接着，直接将如上所述分离的GCSF-b型cDNA连接进商品载体 pCR2.1(Invitrogen)。所得质粒命名为pCR2.1d2-GCSFb，在图10中显 示。
使用HindIII和NotI消化pCR2.1d2-GCSFb，分离出705bp的 GCSFb cDNA片段并将其连接进使用HindIII和NotI线性化的 pcDNA3.1Hygro(+)-zz载体。所得pDNA3.1-GCSFb载体在图11中显示。
使用EcoRI消化pCR2.1d2-GCSFb，分离出629bp的GCSFb cDNA 片段并将其连接进使用EcoRI线性化的pCINeo载体。所得 pCINeo-GCSFb载体在图12中显示。
使用BamHI和XhoI消化pCR2.1d2-GCSFb，分离出693bp的 GCSFb cDNA片段并将其连接进使用BamHI和XhoI线性化的 pCMVScript载体。所得pCMVScript-GCSFb载体在图13中显示。
使用HindIII和NotI消化pCR2.1d2-GCSFb，分离出705bp的 GCSFb cDNA片段并将其连接进使用HindIII和NotI线性化的 pTG2-hyg-as载体。所得pTG2-GCSFb-hyg-as载体在图14中显示。
实施例2：在不同细胞系和不同载体中表达靶蛋白质：在优化用于 生产重组蛋白的本发明方法时，测试了不同细胞系(均携带包含α-1-抗胰 蛋白酶(A1AT)重组基因的载体)进行高水平表达的能力。发现与293T 细胞系相比，CHO、BHK和其它细胞系在瞬时转染测定中生产的重组蛋 白较少。因此，检查了其它人胚肾细胞系的衍生细胞系。结果在图4-6中 显示。
实施例3：将在含血清培养基中瞬时转染的293T和293细胞与在无 血清条件下转染和培养的293F细胞进行比较：将0.1-0.2×106个293T或 293细胞的活细胞置于6孔板中。第二天使用磷酸钙法(Biotechniques 6： 7632-638(1988))转染细胞：在0.1×TE缓冲液(加入200μl转染混合 物)中稀释4μg质粒DNA，轻轻混匀，将20μl 2.5M CaCl2和100μl 2× HBS加入转染样品。转染样品在室温孵育20分钟。6小时孵育后更换培养 基，接着孵育细胞48小时。
实施例4：在无血清培养基中的293F细胞中进行无血清转染并表达 靶蛋白质：制备细胞密度为106个活293F细胞的28ml悬浮培养物(在转 染实验的同一天)。通过在I(Invitrogen)中稀释30μg质粒 DNA至总体积为1ml，并在I中稀释40μl至总体 积为1ml制得脂质-DNA复合物。室温孵育5分钟后，将稀释DNA加入 到中，使得总体积为2ml。转染样品在黑暗中室温孵育20分钟。 将2ml的转染混合物加入28ml 293F悬浮培养物(终细胞密度为1×106 细胞/ml)中。在37℃/8％CO2加湿空气中，在以125rpm旋转的轨道摇 动混合器上将转染的293F细胞孵育72小时。
A：转染和表达A1AT：这些将293F与293和293T进行比较的实验 结果在图4中显示。在所有实验中使用pcDNA3.1-A1At转染确定量的细胞 (106个细胞)。比较这些不同细胞系中表达的A1AT的量。293F细胞中表 达的A1AT的量设置为100％。从图4中可见，293和293T细胞只生产293F 细胞A1AT量的12-13％。
另外，测试不同的载体骨架是否影响293F细胞中产生重组蛋白的 量。将人α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)的编码序列插入到pTG(自制载体)、 pCMV(Stratagene)、pcl neo(Promega)以及pcDNA3.1TM载体 中。
pcDNA3.1-A1AT中A1AT的表达水平设置为100％。其它载体均未 接近pcDNATM3.1-A1AT中观察到的高表达。如ELISA所检测的，发现 pcDNA3.1-A1AT产生最大量的A1AT(见图5)。相比于pcDNA3.1表达 的A1AT量，自制载体只表达20％的量，其它商品载体在15-30％的范围 内。因此，选择pcDNA3.1进行所有其它的实验。
总之，用带有A1AT基因的pcDNATM3.1转染不同细胞系。显示无 血清293F细胞系每106个细胞表达的A1AT是293T和293细胞的7倍。 因此，选择freestyle 293F细胞系进行稳定转染实验。
瞬时转染实验的结果在图6中显示。上图(A)显示使用不同转染 载体的6个不同转染实验上清液的SDS-PAGE分析。从分析图中可得出结 论，所分析的细胞培养上清液中存在的α1-抗胰蛋白酶质量良好，这可从 抗原活性比为1(数据未显示)中推出。测试结果的有效性可从阴性对照 不显示α1-抗胰蛋白酶活性也不显示抗原活性中推出。
通过SDS-PAGE分析分子质量分布显示与三个含α1-抗胰蛋白酶的 样品极其相似的图像。在阴性对照中，除了不存在代表α1-抗胰蛋白酶的 条带之外，可见分子质量为27kD的额外条带，与预期一致。
通过使用western印迹(使用抗人α1-抗胰蛋白酶一抗)的分析，在 还原条件下可以在预计的分子量区中鉴定到所述蛋白质。断裂产物不可 见。
黑箭头指向主要条带，其对应于52kDa重组蛋白α-1-抗胰蛋白酶。 在4和8道，还可见对应于27kDa GFP蛋白的条带，其在freestyle 293F 细胞系中作为对照瞬时表达。在1、2、3和5、6、7道中，另外的条带是 宿主细胞蛋白质(来自freestyle 293F细胞)。下图(B)显示western印迹 分析。结果是一致的，只是由于该测定更加严格，因此结果看来更干净， 只有对应于A1AT的条带是可见的。
B：转染和表达FVIII：在图8中显示三个最佳的稳定转染克隆的因 子VIII平均量。使用pcDNA-FVIII载体的三个最佳克隆所表达的因子VIII 平均量设置为生产力100％。与自制载体pTGF8-2hyg-s的比较显示在293F 细胞中使用pcDNA3.1-FVIII的因子VIII生产力的几乎高3倍。
C：转染和表达FIX：在使用pcDNA3.1-FIX和表达因子IX的基于 pUC 19/X的pTGF36载体(见WO 01/70968)稳定转染的293F细胞中， 在293F细胞中使用pcDNA3.1载体显示出几乎高3倍的生产力，如下文 表1所见。
表1：稳定转染了pcDNA3.1和pTG2载体之后，293和293F细胞中FIX 生产力

实施例5：生产G-CSFb
A.在无血清培养基中转染293F细胞，瞬时转染：在转染实验的同 一天制备细胞密度为1.1×106个活293F细胞/ml的28ml悬浮培养物。通 过在I(Invitrogen)中稀释30μg质粒DNA (pcDAN3.1-G-CSFb)至总体积为1ml，并在I中稀释30μl脂 转染胺2000CD至总体积为1ml制得脂质-DNA复合物。室温孵育5分钟 后，将稀释DNA加入到脂转染胺2000CD中，使得总体积为2ml。转染 样品在黑暗中室温孵育20分钟。将2ml的转染混合物加入28ml 293F悬 浮培养物(终细胞密度为1×106细胞/ml)中。在37℃/8％CO2加湿空气 中，在以125rpm旋转的轨道摇动混合器上将转染的293F细胞孵育72小 时。
B.稳定转染：如上文A中所述瞬时转染后72小时，将合适数量的 细胞(105和106个细胞)转移进平板培养皿中，沉降以建立贴壁生长。转 移进平板培养皿2-50小时(优选48小时)之后开始选择压力。优选的选 择剂是浓度75μg/ml的潮霉素。保持压力至少10-20天，优选14天，其 中每2-3天更换补充了潮霉素的培养基。
C.使用分析及挑取机器人ClonePixFL(Genetix)挑选最佳G-CSF 生产克隆：将如上文B中所述稳定转染的Freestyle 293F细胞接种到基于 甲基纤维素的半固体培养基上，所述培养基含有合适的抗生素，以在约两 天后选择克隆，还含有标记的抗体，以通过荧光检测最高的生产克隆。使 用ClonePixFL(Genetix)分析大量(数千)克隆的细胞数和G-CSF分泌， 以使得接下来只挑取几百个G-CSF最佳生产克隆。与其它已知方法(其中， 非生产克隆和混合克隆也被随机挑取)相反，ClonePixFL的应用允许挑选 来源于单个细胞的快速生长的克隆，其仅仅挑选高生产者。所挑取的细胞 在微滴定板以及随后在离心管、细胞培养瓶和发酵器中扩增，其所有操作 都在无血清条件下。
同样，所有稳定转染操作均在无血清条件下进行。另外，在其后的 所有扩增和细胞培养操作中，细胞不接触任何血清或动物来源的蛋白质。 在扩增过程中，选择健壮性、高生长速率、生存力和生产活性G-SCF(如 在ELISA形式中所测量的)方面的最佳克隆。在此选择过程结束后，所挑 取的克隆在不添加抗生素的无血清条件下培养。293F细胞在整个过程中完 全无血清培养，每隔一天更换一次培养基。在完全无血清条件下从库勒振 荡器(kühner shaker)里的锥形瓶放大到wave反应器(Wave Biotech Europe)中的较大体积。在这种选择中，数量再次减少到只有几个最佳生 产克隆。正确的cDNA序列、mRNA含量和发酵行为是鉴定用于亚克隆的 最佳克隆的标准。为此，使用ClonePixFL将所选择克隆的细胞置于板中、 分析并挑取，然后如前所述进行扩增和选择。为了再次选择最佳生产克隆， 亚克隆是消除在所培养的克隆亚群中可能的遗传改变的必要步骤。亚克隆 之后，选择的克隆在无血清条件下再次保存。更详细的鉴定所表达的重组 人G-CSF蛋白的生化特征。
D.通过ELISA测定人G-CSF浓度：通过ELISA测定这样获得的 FeeStyle 293F细胞系所表达的rhG-CSF量，并且对使用不同载体转染的 细胞所获得的蛋白质量进行比较(见图15)。如从实施例2和3中使用FIX 和A1AT的表达实验中所预期的，载体pcDNA3.1-GCSFb与293F细胞系 的组合在这里再次显示最高的生产力，因此被用于生产重组人G-CSFb。
E.还原SDS PAGE中的rhG-CSF的western印迹：从HEK293和 HEK293F细胞的上清液中生产的10μl G-CSF在15％SDS PAGE和 western印迹中进行分析。通过BAF214-bio/SA-HRP/DAB检测G-CSF(见 图16)。箭头指示具有正确分子量的rhG-CSF的单条带。
序列表，文本

区域    1       655     CMV启动子
基因    783     3082    人FVIII结构域A1和A2
基因    3083    3104    B结构域剩余部分及其他碱基
基因    3105    5162    人因子FVIII结构域A3，C1，C2
区域    5188    5402    BGH pA
区域    5465    5878    f1起点
区域    5943    6267    SV40启动子
基因    6285    7308    HygR
区域    7321    7693    SV40pA
区域    8626    7953    C PUC起点
基因    9631    8771    C AmpR(互补链)
SEQ ID NO：4：Invitrogen公开的pcDNA 3.1序列
分子：  5597bps DNA，环状
类型    起始    终止    名称/说明
区域    209     863     CMV启动子
区域    895     1010    MCS
区域    1021    1235    BGH pA
区域    1298    1711    f1起点
区域    1776    2100    SV40启动子
基因    2118    3141    HygR
区域    3154    3526    SV40pA
区域    4456    3786    C PUC起点
基因    5461    4601    C AmpR(互补链)
SEQ ID NO：5：pcDNA3.1Hygro(+)-zz，与SEQ ID NO：4相比，在4380位点具有3个 另外的碱基″GGT″
分子：  5600bps DNA，环状
类型    起始    终止    名称/说明
区域    209     863     CMV启动子
区域    895     1010    MCS
区域    1021    1235    BGH pA
区域    1298    1711    f1起点
区域    1776    2100    SV40启动子
基因    2118    3141    HygR
区域    3154    3526    SV40pA
区域    4459    3786    C PUC起点
基因    5464    4604    C AmpR(互补链)
SEQ ID NO：6：载体pTG1-A1AT
SEQ ID NO：7：载体pFGF8-hyg-s
分子：  10705bps DNA，circular
类型    起始    终止    名称/说明
区域    1       586     CMV启动子
基因    676     2975    hFVIII结构域A1和A2
基因    2976    2997    B结构域的铰链剩余部分及其他碱基
基因    2998    5055    hFVIII结构域A3，C1，C2
区域    5067    5916    来源于SV40的多聚A内含子和多聚A位点
基因    5928    7910    潮霉素抗性
区域    8346    8423    孕酮应答元件
基因    8681    9469    氨苄青霉素抗性
SEQ ID NO：8：人野生型因子VIII cDNA
SEQ ID NO：9：人野生型因子VIII
SEQ ID NOs：10-12：接头肽
SEQ ID NO：13：a型hFVII的cDNA
SEQ ID NO：14：b型hFVII的cDNA
SEQ ID NO：15：人a型GCSF的cDNA，CDS：41-661
SEQ ID NO：16：人b型GCSF的cDNA，CDS：41-652
SEQ ID NO：17：人c型GCSF的cDNA，CDS：229-828
SEQ ID NO：18：hvWF的cDNA
SEQ ID NOs：19和20：G-CSF上游和下游引物
SEQ ID NO：21：载体PCR2.1d2-GCSFb
分子：4542bps DNA；环状
起始    终止    特征/名称
293     907     GCSFb
1159    1596    f1起点
1930    2724    KanR
2742    3602    AmpR
3747    4420    pUC起点
SEQ ID NO：22：载体pcDNA3.1-hyg(+)-GCSFb
分子：6237bps DNA，环状
起始    终止    特征/名称
209     863     CMV启动子
970     1584    GCSFb
1658    1872    BGH pA
1935    2348    f1起点
2413    2737    SV40启动子
2755    3778    HygR
3791    4163    SV40pA
5096    4423C   PUC起点
6101    5241    C AmpR
SEQ ID NO：23：载体pCINeo-GCSFb
分子：  6101bps DNA，环状
起始    终止    特征/名称
1       1022    CMV启动子/内含子
1106    1720    GCSFb
1796    2017    SV40多聚A
2112    2567    fi起点
2629    3047    SV40增强子/启动子
3092    3886    NeoR
3950    3998    多聚A
4409    5269    AmpR
SEQ ID NO：24：载体pCMVScript_GCSFb，
分子：4920bps DNA，环状
起始     终止       特征/名称
1        602        CMV启动子
728      1342       GCSFb
1453     1836       SV40多聚A
1974     2280       f1起点
2449     2787       SV40启动子
2822     3613       NeoR
3614     4063       HSV-TK多聚A
SEQ ID NO：25：pTG2-GCSFb-hyg-as
分子：6917bps DNA，环状
起始     终止       特征/名称
5        591        CMV启动子
722      1336       GCSFb
1383     2228       SV40内含子+pA
2767     2255       C HSV TK多聚A
3782     2745       C HygR
4044     3796       C HSV TK启动子
4916     5704       AmpR
SEQ ID NO：26：人b型GCSF的cDNA
SEQ ID NO：27：人b型GCSF蛋白
序列表
<110>奥克塔法马股份有限公司
<120>人细胞系中重组人蛋白质的无血清稳定转染和生产
<130>060523wo/JH
<150>EP05105965.7
<151>2005-06-30
<160>27
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>6960
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>载体pcDNA3.1-FIX
<400>1
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttgcat gccaattccg caaaggttat gcagcgcgtg aacatgatca 960
tggcagaatc accaggcctc atcaccatct gccttttagg atatctactc agtgctgaat 1020
gtacagtttt tcttgatcat gaaaacgcca acaaaattct gaatcggcca aagaggtata 1080
attcaggtaa attggaagag tttgttcaag ggaaccttga gagagaatgt atggaagaaa 1140
agtgtagttt tgaagaagca cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt 1200
ggaagcagta tgttgatgga gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt 1260
gcaaggatga cattaattcc tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact 1320
gtgaattaga tgtaacatgt aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata 1380
gtgctgataa caaggtggtt tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga 1440
agtcctgtga accagcagtg ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta 1500
agctcacccg tgctgagact gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg 1560
aaaccatttt ggataacatc actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgggttg 1620
ttggtggaga agatgccaaa ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag 1680
ttgatgcatt ctgtggaggc tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact 1740
gtgttgaaac tggtgttaaa attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag 1800
aacatacaga gcaaaagcga aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag 1860
ctattaataa gtacaaccat gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa 1920
acagctacgt tacacctatt tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat 1980
ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag 2040
ttcttcagta ccttagagtt ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt 2100
tcaccatcta taacaacatg ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc 2160
aaggagatag tgggggaccc catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa 2220
ttattagctg gggtgaagag tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtat 2280
cccggtatgt caactggatt aaggaaaaaa caaagctcac ttaatgggat cggtcgagcg 2340
gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag 2400
ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 2460
tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 2520
ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 2580
caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 2640
ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 2700
tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 2760
cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 2820
tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 2880
tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 2940
cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 3000
ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 3060
gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 3120
aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 3180
accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 3240
aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 3300
agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 3360
gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 3420
ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg gatctgatca gcacgtgatg 3480
aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc 3540
gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta 3600
ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt 3660
tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg 3720
gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa 3780
gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg tcgcggaggc catggatgcg 3840
atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc 3900
ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac 3960
tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg 4020
atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc 4080
aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg 4140
ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt 4200
atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg atcgccgcgg 4260
ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct atcagagctt ggttgacggc 4320
aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc 4380
gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt 4440
gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag ggcaaaggaa 4500
tagcacgtgc tacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga 4560
atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc 4620
ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc 4680
acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc 4740
atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca 4800
tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 4860
gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 4920
gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 4980
atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 5040
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 5100
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 5160
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 5220
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 5280
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 5340
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 5400
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 5460
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 5520
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 5580
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 5640
agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 5700
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 5760
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 5820
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 5880
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 5940
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 6000
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 6060
cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 6120
gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 6180
gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 6240
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 6300
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 6360
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 6420
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 6480
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 6540
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 6600
catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 6660
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 6720
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 6780
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa  6840
tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt  6900
tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc  6960
<210>2
<211>6914
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>载体pcDNA3.1-A1AT
<400>2
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg  60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg  120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc  180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt  240
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tggtacttca ctgaaaatat ggaaagaaac tgcagggctc cctgcaatat ccagatggaa 3780
gatcccactt ttaaagagaa ttatcgcttc catgcaatca atggctacat aatggataca 3840
ctacctggct tagtaatggc tcaggatcaa aggattcgat ggtatctgct cagcatgggc 3900
agcaatgaaa acatccattc tattcatttc agtggacatg tgttcactgt acgaaaaaaa 3960
gaggagtata aaatggcact gtacaatctc tatccaggtg tttttgagac agtggaaatg 4020
ttaccatcca aagctggaat ttggcgggtg gaatgcctta ttggcgagca tctacatgct 4080
gggatgagca cactttttct ggtgtacagc aataagtgtc agactcccct gggaatggct 4140
tctggacaca ttagagattt tcagattaca gcttcaggac aatatggaca gtgggcccca 4200
aagctggcca gacttcatta ttccggatca atcaatgcct ggagcaccaa ggagcccttt 4260
tcttggatca aggtggatct gttggcacca atgattattc acggcatcaa gacccagggt 4320
gcccgtcaga agttctccag cctctacatc tctcagttta tcatcatgta tagtcttgat 4380
gggaagaagt ggcagactta tcgaggaaat tccactggaa ccttaatggt cttctttggc 4440
aatgtggatt catctgggat aaaacacaat atttttaacc ctccaattat tgctcgatac 4500
atccgtttgc acccaactca ttatagcatt cgcagcactc ttcgcatgga gttgatgggc 4560
tgtgatttaa atagttgcag catgccattg ggaatggaga gtaaagcaat atcagatgca 4620
cagattactg cttcatccta ctttaccaat atgtttgcca cctggtctcc ttcaaaagct 4680
cgacttcacc tccaagggag gagtaatgcc tggagacctc aggtgaataa tccaaaagag 4740
tggctgcaag tggacttcca gaagacaatg aaagtcacag gagtaactac tcagggagta 4800
aaatctctgc ttaccagcat gtatgtgaag gagttcctca tctccagcag tcaagatggc 4860
catcagtgga ccctcttttt tcagaatggc aaagtaaagg tttttcaggg aaatcaagac 4920
tccttcacac ctgtggtgaa ctctctagac ccaccgttac tgactcgcta ccttcgaatt 4980
cacccccaga gttgggtgca ccagattgcc ctgaggatgg aggttctggg ctgcgaggca 5040
caggacctct actgagcggc cgcgactcta ctagaggatc tttgtgaagg aaccttactt 5100
ctgtggtgtg acataattgg acaaactacc tacagagatt taaagctcta aggtaaatat 5160
aaaattttta agtgtataat gtgttaaact actgattcta attgtttgtg tattttagat 5220
tccaacctat ggaactgatg aatgggagca gtggtggaat gcctttaatg aggaaaacct 5280
gttttgctca gaagaaatgc catctagtga tgatgaggct actgctgact ctcaacattc 5340
tactcctcca aaaaagaaga gaaaggtaga agaccccaag gactttcctt cagaattgct 5400
aagttttttg agtcatgctg tgtttagtaa tagaactctt gcttgctttg ctatttacac 5460
cacaaaggaa aaagctgcac tgctatacaa gaaaattatg gaaaaatatt ctgtaacctt 5520
tataagtagg cataacagtt ataatcataa catactgttt tttcttactc cacacaggca 5580
tagagtgtct gctattaata actatgctca aaaattgtgt acctttagct ttttaatttg 5640
taaaggggtt aataaggaat atttgatgta tagtgccttg actagagatc ataatcagcc 5700
ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc 5760
tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt 5820
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 5880
gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatcccc cgaacgccag 5940
caagacgtag cccagcgcgt cggccccgag atgcgccgcg tgcggctgct ggagatggcg 6000
gacgcgatgg atatgttctg ccaagggttg gtttgcgcat tcacagttct ccgcaagaat 6060
tgattggctc caattcttgg agtggtgaat ccgttagcga ggtgccgccg ggctgcttca 6120
tccccgtggc ccgttgctcg cgtttgctgg cggtgtcccc ggaagaaata tatttgcatg 6180
tctttagttc tatgatgaca caaaccccgc ccagcgtctt gtcattggcg aattcgaaca 6240
cgcagatgca gtcggggcgg cgcggtccca ggtccacttc gcatattaag gtgacgcgtg 6300
tggcctcgaa caccgagcga ccctgcagcg acccgcttaa cagcgtcaac agcgtgccgc 6360
aagatcagct tgatatgaaa aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga 6420
tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg 6480
ctttcagctt cgatgtagga gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg 6540
gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg 6600
aagtgcttga cattggggaa ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac 6660
agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg 6720
cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat 6780
tcggaccgca aggaatcggt caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg 6840
atccccatgt gtatcactgg caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc 6900
aggctctcga tgagctgatg ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc 6960
acgcggattt cggctccaac aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg 7020
actggagcga ggcgatgttc ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga 7080
ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc 7140
ttgcaggatc gccgcggctc cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc 7200
agagcttggt tgacggcaat ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa 7260
tcgtccgatc cggagccggg actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg 7320
tctggaccga tggctgtgta gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc 7380
gtggggatcg ggagatgggg gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga 7440
acccgcgcta tgacggcaat aaaaagacag aataaaacgc acgggtgttg ggtcgtttgt 7500
tcataaacgc ggggttcggt cccagggctg gcactctgtc gataccccac cgagacccca 7560
ttggggccaa tacgcccgcg tttcttcctt ttccccaccc caacccccaa gttcgggtga 7620
aggcccaggg ctcgcagcca acgtcggggc ggcaagcccg ccatagccac gggccccgtg 7680
ggttagggac ggggtccccc atggggaatg gtttatggtt cgtgggggtt attcttttgg 7740
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gcctgggcat ggaccgcatg tactggcgcg acacgaacac cgggcgtctg tggctgccaa 7860
acacccccga cccccaaaaa ccaccgcgcg gatttctggc gccagtgcca agctgggtac 7920
cctctagagc gaattaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 7980
ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcataatagc 8040
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ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 8160
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aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 8820
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<210>8
<211>6996
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(6996)
<400>8
gcc acc aga aga tac tac ctg ggt gca gtg gaa ctg tca tgg gac tat   48
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
 1             5               10               15
atg caa agt gat ctc ggt gag ctg cct gtg gac gca aga ttt cct cct   96
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
           20               25               30
aga gtg cca aaa tct ttt cca ttc aac acc tca gtc gtg tac aaa aag   144
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
       35               40               45
act ctg ttt gta gaa ttc acg gtt cac ctt ttc aac atc gct aag cca   192
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
    50               55               60
agg cca ccc tgg atg ggt ctg cta ggt cct acc atc cag gct gag gtt   240
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
 65               70               75               80
tat gat aca gtg gtc att aca ctt aag aac atg gct tcc cat cct gtc   288
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
              85               90               95
agt ctt cat gct gtt ggt gta tcc tac tgg aaa gct tct gag gga gct   336
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
          100              105              110
gaa tat gat gat cag acc agt caa agg gag aaa gaa gat gat aaa gtc    384
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
       115              120              125
ttc cct ggt gga agc cat aca tat gtc tgg cag gtc ctg aaa gag aat    432
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
   130               135              140
ggt cca atg gcc tct gac cca ctg tgc ctt acc tac tca tat ctt tct    480
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145              150              155              160
cat gtg gac ctg gta aaa gac ttg aat tca ggc ctc att gga gcc cta    528
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
             165               170              175
cta gta tgt aga gaa ggg agt ctg gcc aag gaa aag aca cag acc ttg    576
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
          180              185               190
cac aaa ttt ata cta ctt ttt gct gta ttt gat gaa ggg aaa agt tgg    624
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
       195              200              205
cac tca gaa aca aag aac tcc ttg atg cag gat agg gat gct gca tct    672
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
   210               215              220
gct cgg gcc tgg cct aaa atg cac aca gtc aat ggt tat gta aac agg    720
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225              230              235               240
tct ctg cca ggt ctg att gga tgc cac agg aaa tca gtc tat tgg cat    768
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
             245               250              255
gtg att gga atg ggc acc act cct gaa gtg cac tca ata ttc ctc gaa    816
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
          260              265              270
ggt cac aca ttt ctt gtg agg aac cat cgc cag gcg tcc ttg gaa atc    864
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
       275              280              285
tcg cca ata act ttc ctt act gct caa aca ctc ttg atg gac ctt gga    912
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
   290              295              300
cag ttt cta ctg ttt tgt cat atc tct tcc cac caa cat gat ggc atg    960
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305              310              315              320
gaa gct tat gtc aaa gta gac agc tgt cca gag gaa ccc caa cta cga    1008
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
             325              330              335
atg aaa aat aat gaa gaa gcg gaa gac tat gat gat gat ctt act gat    1056
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
          340              345              350
tct gaa atg gat gtg gtc agg ttt gat gat gac aac tct cct tcc ttt    1104
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
      355              360              365
atc caa att cgc tca gtt gcc aag aag cat cct aaa act tgg gta cat    1152
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
   370              375              380
tac att gct gct gaa gag gag gac tgg gac tat gct ccc tta gtc ctc    1200
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385              390              395              400
gcc ccc gat gac aga agt tat aaa agt caa tat ttg aac aat ggc cct    1248
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
              405              410              415
cag cgg att ggt agg aag tac aaa aaa gtc cga ttt atg gca tac aca    1296
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
          420              425              430
gat gaa acc ttt aag act cgt gaa gct att cag cat gaa tca gga atc    1344
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
      435               440              445
ttg gga cct tta ctt tat ggg gaa gtt gga gac aca ctg ttg att ata    1392
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
  450                455              460
ttt aag aat caa gca agc aga cca tat aac atc tac cct cac gga atc    1440
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465              470               475              480
act gat gtc cgt cct ttg tat tca agg aga tta cca aaa ggt gta aaa    1488
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
             485              490               495
cat ttg aag gat ttt cca att ctg cca gga gaa ata ttc aaa tat aaa    1536
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
          500              505              510
tgg aca gtg act gta gaa gat ggg cca act aaa tca gat cct cgg tgc    1584
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
       515              520              525
ctg acc cgc tat tac tct agt ttc gtt aat atg gag aga gat cta gct    1632
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
   530              535              540
tca gga ctc att ggc cct ctc ctc atc tgc tac aaa gaa tct gta gat    1680
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545              550              555              560
caa aga gga aac cag ata atg tca gac aag agg aat gtc atc ctg ttt    1728
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
             565              570              575
tct gta ttt gat gag aac cga agc tgg tac ctc aca gag aat ata caa    1776
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
          580              585              590
cgc ttt ctc ccc aat cca gct gga gtg cag ctt gag gat cca gag ttc    1824
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
       595              600              605
caa gcc tcc aac atc atg cac agc atc aat ggc tat gtt ttt gat agt    1872
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
   610              615              620
ttg cag ttg tca gtt tgt ttg cat gag gtg gca tac tgg tac att cta    1920
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625              630              635              640
agc att gga gca cag act gac ttc ctt tct gtc ttc ttc tct gga tat    1968
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
             645               650              655
acc ttc aaa cac aaa atg gtc tat gaa gac aca ctc acc cta ttc cca    2016
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
          660              665              670
ttc tca gga gaa act gtc ttc atg tcg atg gaa aac cca ggt cta tgg    2064
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
      675              680               685
att ctg ggg tgc cac aac tca gac ttt cgg aac aga ggc atg acc gcc    2112
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
   690              695              700
tta ctg aag gtt tct agt tgt gac aag aac act ggt gat tat tac gag    2160
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705              710              715              720
gac agt tat gaa gat att tca gca tac ttg ctg agt aaa aac aat gcc    2208
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
             725              730               735
att gaa cca aga agc ttc tcc cag aat tca aga cac cct agc act agg    2256
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
          740              745              750
caa aag caa ttt aat gcc acc aca att cca gaa aat gac ata gag aag    2304
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
      755               760              765
act gac cct tgg ttt gca cac aga aca cct atg cct aaa ata caa aat    2352
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
   770              775              780
gtc tcc tct agt gat ttg ttg atg ctc ttg cga cag agt cct act cca    2400
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785              790              795              800
cat ggg cta tcc tta tct gat ctc caa gaa gcc aaa tat gag act ttt    2448
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
             805              810               815
tct gat gat cca tca cct gga gca ata gac agt aat aac agc ctg tct    2496
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
          820              825              830
gaa atg aca cac ttc agg cca cag ctc cat cac agt ggg gac atg gta    2544
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
      835               840              845
ttt acc cct gag tca ggc ctc caa tta aga tta aat gag aaa ctg ggg    2592
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
   850              855               860
aca act gca gca aca gag ttg aag aaa ctt gat ttc aaa gtt tct agt    2640
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865              870              875               880
aca tca aat aat ctg att tca aca att cca tca gac aat ttg gca gca    2688
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
             885               890              895
ggt act gat aat aca agt tcc tta gga ccc cca agt atg cca gtt cat    2736
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
          900              905               910
tat gat agt caa tta gat acc act cta ttt ggc aaa aag tca tct ccc    2784
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
       915              920              925
ctt act gag tct ggt gga cct ctg agc ttg agt gaa gaa aat aat gat    2832
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
   930               935              940
tca aag ttg tta gaa tca ggt tta atg aat agc caa gaa agt tca tgg    2880
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945               950             955               960
gga aaa aat gta tcg tca aca gag agt ggt agg tta ttt aaa ggg aaa    2928
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
              965              970              975
aga gct cat gga cct gct ttg ttg act aaa gat aat gcc tta ttc aaa    2976
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
          980              985               990
gtt agc atc tct ttg tta aag aca aac aaa act tcc aat aat tca gca    3024
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala
       995             1000             1005
act aat aga aag act cac att gat ggc cca tca tta tta att gag aat    3072
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu Asn
   1010             1015             1020
agt cca tca gtc tgg caa aat ata tta gaa agt gac act gag ttt aaa    3120
Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys
1025             1030             1035             1040
aaa gtg aca cct ttg att cat gac aga atg ctt atg gac aaa aat gct    3168
Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala
            1045              1050             1055
aca gct ttg agg cta aat cat atg tca aat aaa act act tca tca aaa    3216
Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys
         1060              1065             1070
aac atg gaa atg gtc caa cag aaa aaa gag ggc ccc att cca cca gat    3264
Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp
      1075             1080             1085
gca caa aat cca gat atg tcg ttc ttt aag atg cta ttc ttg cca gaa    3312
Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu
  1090              1095             1100
tca gca agg tgg ata caa agg act cat gga aag aac tct ctg aac tct    3360
Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser
1105             1110             1115             1120
ggg caa ggc ccc agt cca aag caa tta gta tcc tta gga cca gaa aaa    3408
Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys
            1125              1130             1135
tct gtg gaa ggt cag aat ttc ttg tct gag aaa aac aaa gtg gta gta    3456
Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val
         1140             1145              1150
gga aag ggt gaa ttt aca aag gac gta gga ctc aaa gag atg gtt ttt    3504
Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe
      1155             1160              1165
cca agc agc aga aac cta ttt ctt act aac ttg gat aat tta cat gaa    3552
Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu
  1170              1175             1180
aat aat aca cac aat caa gaa aaa aaa att cag gaa gaa ata gaa aag    3600
Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys
1185            1190              1195              1200
aag gaa aca tta atc caa gag aat gta gtt ttg cct cag ata cat aca    3648
Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr
            1205              1210             1215
gtg act ggc act aag aat ttc atg aag aac ctt ttc tta ctg agc act    3696
Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr
         1220             1225              1230
agg caa aat gta gaa ggt tca tat gag ggg gca tat gct cca gta ctt    3744
Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu
      1235             1240              1245
caa gat ttt agg tca tta aat gat tca aca aat aga aca aag aaa cac    3792
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys His
  1250              1255             1260
aca gct cat ttc tca aaa aaa ggg gag gaa gaa aac ttg gaa ggc ttg    3840
Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu
1265             1270             1275             1280
gga aat caa acc aag caa att gta gag aaa tat gca tgc acc aca agg    3888
Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg
            1285              1290             1295
ata tct cct aat aca agc cag cag aat ttt gtc acg caa cgt agt aag    3936
Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys
         1300             1305              1310
aga gct ttg aaa caa ttc aga ctc cca cta gaa gaa aca gaa ctt gaa    3984
Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu
      1315             1320              1325
aaa agg ata att gtg gat gac acc tca acc cag tgg tcc aaa aac atg    4032
Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met
  1330              1335             1340
aaa cat ttg acc ccg agc acc ctc aca cag ata gac tac aat gag aag    4080
Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys
1345            1350              1355             1360
gag aaa ggg gcc att act cag tct ccc tta tca gat tgc ctt acg agg    4128
Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg
             1365             1370             1375
agt cat agc atc cct caa gca aat aga tct cca tta ccc att gca aag    4176
Ser His Ser Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys
         1380             1385              1390
gta tca tca ttt cca tct att aga cct ata tat ctg acc agg gtc cta    4224
Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu
      1395             1400              1405
ttc caa gac aac tct tct cat ctt cca gca gca tct tat aga aag aaa    4272
Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys
  1410              1415             1420
gat tct ggg gtc caa gaa agc agt cat ttc tta caa gga gcc aaa aaa    4320
Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys
1425             1430             1435             1440
aat aac ctt tct tta gcc att cta acc ttg gag atg act ggt gat caa    4368
Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln
            1445              1450             1455
aga gag gtt ggc tcc ctg ggg aca agt gcc aca aat tca gtc aca tac    4416
Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr
         1460              1465             1470
aag aaa gtt gag aac act gtt ctc ccg aaa cca gac ttg ccc aaa aca    4464
Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
      1475             1480              1485
tct ggc aaa gtt gaa ttg ctt cca aaa gtt cac att tat cag aag gac    4512
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys Asp
  1490              1495             1500
cta ttc cct acg gaa act agc aat ggg tct cct ggc cat ctg gat ctc    4560
Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu Asp Leu
1505            1510              1515             1520
gtg gaa ggg agc ctt ctt cag gga aca gag gga gcg att aag tgg aat    4608
Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn
            1525              1530             1535
gaa gca aac aga cct gga aaa gtt ccc ttt ctg aga gta gca aca gaa    4656
Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu
         1540              1545             1550
agc tct gca aag act ccc tcc aag cta ttg gat cct ctt gct tgg gat    4704
Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp
      1555             1560              1565
aac cac tat ggt act cag ata cca aaa gaa gag tgg aaa tcc caa gag    4752
Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu
   1570             1575             1580
aag tca cca gaa aaa aca gct ttt aag aaa aag gat acc att ttg tcc    4800
Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser
1585            1590              1595             1600
ctg aac gct tgt gaa agc aat cat gca ata gca gca ata aat gag gga    4848
Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly
             1605             1610             1615
caa aat aag ccc gaa ata gaa gtc acc tgg gca aag caa ggt agg act    4896
Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr
         1620              1625             1630
gaa agg ctg tgc tct caa aac cca cca gtc ttg aaa cgc cat caa cgg    4944
Glu Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg
      1635             1640              1645
gaa ata act cgt act act ctt cag tca gat caa gag gaa att gac tat    4992
Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
  1650              1655             1660
gat gat acc ata tca gtt gaa atg aag aag gaa gat ttt gac att tat    5040
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr
1665            1670              1675             1680
gat gag gat gaa aat cag agc ccc cgc agc ttt caa aag aaa aca cga    5088
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg
            1685              1690             1695
cac tat ttt att gct gca gtg gag agg ctc tgg gat tat ggg atg agt    5136
His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser
         1700              1705             1710
agc tcc cca cat gtt cta aga aac agg gct cag agt ggc agt gtc cct    5184
Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
      1715             1720              1725
cag ttc aag aaa gtt gtt ttc cag gaa ttt act gat ggc tcc ttt act    5232
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr
  1730              1735             1740
cag ccc tta tac cgt gga gaa cta aat gaa cat ttg gga ctc ctg ggg    5280
Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly
1745            1750              1755             1760
cca tat ata aga gca gaa gtt gaa gat aat atc atg gta act ttc aga    5328
Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg
            1765              1770             1775
aat cag gcc tct cgt ccc tat tcc ttc tat tct agc ctt att tct tat    5376
Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr
         1780              1785             1790
gag gaa gat cag agg caa gga gca gaa cct aga aaa aac ttt gtc aag    5424
Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
      1795             1800              1805
cct aat gaa acc aaa act tac ttt tgg aaa gtg caa cat cat atg gca    5472
Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala
  1810              1815             1820
ccc act aaa gat gag ttt gac tgc aaa gcc tgg gct tat ttc tct gat    5520
Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp
1825             1830             1835             1840
gtt gac ctg gaa aaa gat gtg cac tca ggc ctg att gga ccc ctt ctg    5568
Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu
            1845              1850             1855
gtc tgc cac act aac aca ctg aac cct gct cat ggg aga caa gtg aca    5616
Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr
         1860              1865             1870
gta cag gaa ttt gct ctg ttt ttc acc atc ttt gat gag acc aaa agc    5664
Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser
      1875             1880              1885
tgg tac ttc act gaa aat atg gaa aga aac tgc agg gct ccc tgc aat    5712
Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
  1890              1895             1900
atc cag atg gaa gat ccc act ttt aaa gag aat tat cgc ttc cat gca    5760
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala
1905             1910             1915              1920
atc aat ggc tac ata atg gat aca cta cct ggc tta gta atg gct cag    5808
Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln
             1925             1930             1935
gat caa agg att cga tgg tat ctg ctc agc atg ggc agc aat gaa aac    5856
Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn
         1940              1945             1950
atc cat tct att cat ttc agt gga cat gtg ttc act gta cga aaa aaa    5904
Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
      1955             1960              1965
gag gag tat aaa atg gca ctg tac aat ctc tat cca ggt gtt ttt gag    5952
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu
  1970              1975             1980
aca gtg gaa atg tta cca tcc aaa gct gga att tgg cgg gtg gaa tgc    6000
Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys
1985             1990             1995             2000
ctt att ggc gag cat cta cat gct ggg atg agc aca ctt ttt ctg gtg    6048
Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
             2005             2010             2015
tac agc aat aag tgt cag act ccc ctg gga atg gct tct gga cac att    6096
Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile
         2020              2025             2030
aga gat ttt cag att aca gct tca gga caa tat gga cag tgg gcc cca    6144
Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
      2035             2040              2045
aag ctg gcc aga ctt cat tat tcc gga tca atc aat gcc tgg agc acc    6192
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr
  2050              2055             2060
aag gag ccc ttt tct tgg atc aag gtg gat ctg ttg gca cca atg att    6240
Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile
2065            2070              2075             2080
att cac ggc atc aag acc cag ggt gcc cgt cag aag ttc tcc agc ctc    6288
Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu
             2085             2090             2095
tac atc tct cag ttt atc atc atg tat agt ctt gat ggg aag aag tgg    6336
Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp
         2100             2105              2110
cag act tat cga gga aat tcc act gga acc tta atg gtc ttc ttt ggc    6384
Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly
      2115             2120             2125
aat gtg gat tca tct ggg ata aaa cac aat att ttt aac cct cca att    6432
Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
  2130              2135             2140
att gct cga tac atc cgt ttg cac cca act cat tat agc att cgc agc    6480
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser
2145            2150             2155              2160
act ctt cgc atg gag ttg atg ggc tgt gat tta aat agt tgc agc atg    6528
Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met
            2165              2170             2175
cca ttg gga atg gag agt aaa gca ata tca gat gca cag att act gct    6576
Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala
         2180              2185             2190
tca tcc tac ttt acc aat atg ttt gcc acc tgg tct cct tca aaa gct    6624
Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
      2195             2200             2205
cga ctt cac ctc caa ggg agg agt aat gcc tgg aga cct cag gtg aat    6672
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn
  2210              2215             2220
aat cca aaa gag tgg ctg caa gtg gac ttc cag aag aca atg aaa gtc    6720
Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val
2225            2230              2235             2240
aca gga gta act act cag gga gta aaa tct ctg ctt acc agc atg tat    6768
Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr
            2245              2250             2255
gtg aag gag ttc ctc atc tcc agc agt caa gat ggc cat cag tgg act    6816
Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr
         2260              2265             2270
ctc ttt ttt cag aat ggc aaa gta aag gtt ttt cag gga aat caa gac    6864
Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
      2275             2280              2285
tcc ttc aca cct gtg gtg aac tct cta gac cca ccg tta ctg act cgc    6912
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg
  2290              2295             2300
tac ctt cga att cac ccc cag agt tgg gtg cac cag att gcc ctg agg    6960
Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg
2305            2310              2315             2320
atg gag gtt ctg ggc tgc gag gca cag gac ctc tac                    6996
Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
            2325              2330
<210>9
<211>2332
<212>PRT
<213>人
<400>9
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
  1            5               10               15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
           20               25               30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
       35               40                45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
    50               55                60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
 65               70               75               80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
              85               90               95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
          100              105              110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
       115              120              125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
   130               135              140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145              150              155              160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
             165               170              175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
          180              185              190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
       195              200              205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
   210              215               220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225              230              235               240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
             245               250              255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
          260              265              270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
       275              280              285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
   290              295               300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305              310              315               320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
              325              330              335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
          340              345              350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
       355              360              365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
   370              375               380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385              390               395              400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
             405               410              415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
          420              425              430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
       435              440              445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
   450              455               460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465              470              475              480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
             485               490              495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
          500              505              510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
       515              520              525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
   530              535              540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545              550              555              560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
             565               570              575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
          580              585               590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
       595              600              605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
   610              615               620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625              630              635               640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
              645              650              655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
          660              665              670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
       675              680              685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
   690               695              700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705              710              715               720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
             725               730              735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
          740              745              750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
       755              760              765
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
    770             775               780
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785              790              795               800
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
              805              810              815
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
          820              825               830
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
       835              840              845
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
   850              855               860
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865              870               875              880
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
             885               890              895
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
          900              905              910
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
       915              920              925
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
   930              935               940
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945              950               955              960
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
              965              970              975
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
          980              985              990
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala
       995             1000             1005
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu Asn
   1010             1015             1020
Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys
025             1030              1035             1040
Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala
            1045              1050             1055
Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys
         1060              1065             1070
Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp
      1075             1080             1085
Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu
  1090              1095             1100
Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser
105             1110              1115             1120
Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys
            1125              1130             1135
Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val
         1140              1145             1150
Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe
      1155             1160              1165
Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu
  1170              1175             1180
Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys
185             1190              1195             1200
Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr
            1205              1210             1215
Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr
         1220              1225             1230
Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu
      1235             1240              1245
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys His
  1250              1255             1260
Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu
265             1270              1275             1280
Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg
            1285              1290             1295
Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys
         1300              1305             1310
Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu
      1315             1320             1325
Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met
  1330              1335             1340
Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys
345             1350              1355             1360
Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg
            1365              1370             1375
Ser His Ser Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys
         1380             1385              1390
Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu
      1395             1400             1405
Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys
  1410              1415             1420
Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys
425             1430              1435             1440
Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln
            1445              1450             1455
Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr
         1460             1465              1470
Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
      1475             1480             1485
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys Asp
  1490              1495             1500
Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu Asp Leu
505             1510              1515             1520
Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn
            1525              1530             1535
Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu
         1540              1545             1550
Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp
      1555             1560             1565
Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu
  1570              1575             1580
Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser
585             1590              1595             1600
Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly
            1605              1610             1615
Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr
         1620              1625             1630
Glu Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg
      1635             1640             1645
Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
  1650              1655             1660
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr
665              1670             1675             1680
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg
            1685              1690             1695
His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser
         1700              1705             1710
Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
      1715             1720              1725
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr
  1730              1735             1740
Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly
745             1750              1755             1760
Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg
            1765              1770             1775
Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr
         1780              1785             1790
Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
      1795             1800              1805
Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala
  1810              1815             1820
Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp
825             1830              1835             1840
Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu
            1845              1850             1855
Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr
         1860              1865             1870
Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser
      1875             1880              1885
Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
  1890              1895             1900
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala
905             1910              1915             1920
Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln
             1925             1930             1935
Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn
         1940              1945             1950
Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
      1955             1960              1965
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu
  1970              1975             1980
Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys
985             1990              1995             2000
Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
            2005              2010             2015
Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile
         2020             2025              2030
Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
      2035             2040             2045
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr
  2050             2055             2060
Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile
065             2070             2075             2080
Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu
            2085             2090             2095
Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp
         2100             2105              2110
Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly
      2115             2120             2125
Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
  2130             2135             2140
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser
145             2150             2155              2160
Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met
            2165              2170             2175
Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala
         2180             2185              2190
Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
      2195             2200             2205
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn
  2210              2215             2220
Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val
225              2230             2235             2240
Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr
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Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr
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Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
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Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg
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Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg
305             2310             2315             2320
Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
            2325             2330
<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：B-结构域接头肽
<400>10
Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His
  1            5
<210>11
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：B-结构域接头肽
<400>11
Gln Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly
  1            5
<210>12
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：B-结构域接头肽
<400>12
Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Gln Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly
  1            5               10               15
<210>13
<211>2478
<212>DNA
<213>人
<400>13
agtcccatgg ggaatgtcaa caggcagggg cagcactgca gagatttcat catggtctcc 60
caggccctca ggctcctctg ccttctgctt gggcttcagg gctgcctggc tgcaggcggg 120
gtcgctaagg cctcaggagg agaaacacgg gacatgccgt ggaagccggg gcctcacaga 180
gtcttcgtaa cccaggagga agcccacggc gtcctgcacc ggcgccggcg cgccaacgcg 240
ttcctggagg agctgcggcc gggctccctg gagagggagt gcaaggagga gcagtgctcc 300
ttcgaggagg cccgggagat cttcaaggac gcggagagga cgaagctgtt ctggatttct 360
tacagtgatg gggaccagtg tgcctcaagt ccatgccaga atgggggctc ctgcaaggac 420
cagctccagt cctatatctg cttctgcctc cctgccttcg agggccggaa ctgtgagacg 480
cacaaggatg accagctgat ctgtgtgaac gagaacggcg gctgtgagca gtactgcagt 540
gaccacacgg gcaccaagcg ctcctgtcgg tgccacgagg ggtactctct gctggcagac 600
ggggtgtcct gcacacccac agttgaatat ccatgtggaa aaatacctat tctagaaaaa 660
agaaatgcca gcaaacccca aggccgaatt gtggggggca aggtgtgccc caaaggggag 720
tgtccatggc aggtcctgtt gttggtgaat ggagctcagt tgtgtggggg gaccctgatc 780
aacaccatct gggtggtctc cgcggcccac tgtttcgaca aaatcaagaa ctggaggaac 840
ctgatcgcgg tgctgggcga gcacgacctc agcgagcacg acggggatga gcagagccgg 900
cgggtggcgc aggtcatcat ccccagcacg tacgtcccgg gcaccaccaa ccacgacatc 960
gcgctgctcc gcctgcacca gcccgtggtc ctcactgacc atgtggtgcc cctctgcctg 1020
cccgaacgga cgttctctga gaggacgctg gccttcgtgc gcttctcatt ggtcagcggc 1080
tggggccagc tgctggaccg tggcgccacg gccctggagc tcatggtgct caacgtgccc 1140
cggctgatga cccaggactg cctgcagcag tcacggaagg tgggagactc cccaaatatc 1200
acggagtaca tgttctgtgc cggctactcg gatggcagca aggactcctg caagggggac 1260
agtggaggcc cacatgccac ccactaccgg ggcacgtggt acctgacggg catcgtcagc 1320
tggggccagg gctgcgcaac cgtgggccac tttggggtgt acaccagggt ctcccagtac 1380
atcgagtggc tgcaaaagct catgcgctca gagccacgcc caggagtcct cctgcgagcc 1440
ccatttccct agcccagcag ccctggcctg tggagagaaa gccaaggctg cgtcgaactg 1500
tcctggcacc aaatcccata tattcttctg cagttaatgg ggtagaggag ggcatgggag 1560
ggagggagag gtggggaggg agacagagac agaaacagag agagacagag acagagagag 1620
actgagggag agactctgag gacatggaga gagactcaaa gagactccaa gattcaaaga 1680
gactaataga gacacagaga tggaatagaa aagatgagag gcagaggcag acaggcgctg 1740
gacagagggg caggggagtg ccaaggttgt cctggaggca gacagcccag ctgagcctcc 1800
ttacctccct tcagccaagc cccacctgca cgtgatctgc tggccctcag gctgctgctc 1860
tgccttcatt gctggagaca gtagaggcat gaacacacat ggatgcacac acacacacgc 1920
caatgcacac acacagagat atgcacacac acggatgcac acacagatgg tcacacagag 1980
atacgcaaac acaccgatgc acacgcacat agagatatgc acacacagat gcacacacag 2040
atatacacat ggatgcacgc acatgccaat gcacgcacac atcagtgcac acggatgcac 2100
agagatatgc acacaccgat gtgcgcacac acagatatgc acacacatgg atgagcacac 2160
acacaccaag tgcgcacaca caccgatgta cacacacaga tgcacacaca gatgcacaca 2220
caccgatgct gactccatgt gtgctgtcct ctgaaggcgg ttgtttagct ctcacttttc 2280
tggttcttat ccattatcat cttcacttca gacaattcag aagcatcacc atgcatggtg 2340
gcgaatgccc ccaaactctc ccccaaatgt atttctccct tcgctgggtg ccgggctgca 2400
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ctgtggtgcc tgccaccc                                               2478
<210>14
<211>2412
<212>DNA
<213>人
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caggccctca ggctcctctg ccttctgctt gggcttcagg gctgcctggc tgcagtcttc 120
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cagtcctata tctgcttctg cctccctgcc ttcgagggcc ggaactgtga gacgcacaag 420
gatgaccagc tgatctgtgt gaacgagaac ggcggctgtg agcagtactg cagtgaccac 480
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tcctgcacac ccacagttga atatccatgt ggaaaaatac ctattctaga aaaaagaaat 600
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<213>人
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ctgagccaag ccctccccat cccatgtatt tatctctatt taatatttat gtctatttaa 720
gcctcatatt taaagacagg gaagagcaga acggagcccc aggcctctgt gtccttccct 780
gcatttctga gtttcattct cctgcctgta gcagtgagaa aaagctcctg tcctcccatc 840
ccctggactg ggaggtagat aggtaaatac caagtattta ttactatgac tgctccccag 900
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cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 2220
atcttatcat gtctggatcc ccagcttggc actggcgcca gaaatccgcg cggtggtttt 2280
tgggggtcgg gggtgtttgg cagccacaga cgcccggtgt tcgtgtcgcg ccagtacatg 2340
cggtccatgc ccaggccatc caaaaaccat gggtctgtct gctcagtcca gtcgtggacc 2400
tgaccccacg caacgcccaa aagaataacc cccacgaacc ataaaccatt ccccatgggg 2460
gaccccgtcc ctaacccacg gggcccgtgg ctatggcggg cttgccgccc cgacgttggc 2520
tgcgagccct gggccttcac ccgaacttgg gggttggggt ggggaaaagg aagaaacgcg 2580
ggcgtattgg ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg 2640
aaccccgcgt ttatgaacaa acgacccaac acccgtgcgt tttattctgt ctttttattg 2700
ccgtcatagc gcgggttcct tccggtattg tctccttccg tgtttcagtt agcctccccc 2760
atctcccgat ccccacgagt gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag tacttctaca 2820
cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg 2880
gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg 2940
ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc ggagcatata cgcccggagc 3000
cgcggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata 3060
caagccaacc acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct cgtattggga atccccgaac 3120
atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg 3180
gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc 3240
agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag 3300
tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg 3360
attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc 3420
gcatccatgg cctccgcgac cggctgcaga acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct 3480
tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc gctgaattcc 3540
ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa 3600
cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca ggacatatcc acgccctcct 3660
acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg 3720
ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc aggctttttc 3780
atatcaagct gatcttgcgg cacgctgttg acgctgttaa gcgggtcgct gcagggtcgc 3840
tcggtgttcg aggccacacg cgtcacctta atatgcgaag tggacctggg accgcgccgc 3900
cccgactgca tctgcgtgtt cgaattcgcc aatgacaaga cgctgggcgg ggtttgtgtc 3960
atcatagaac taaagacatg caaatatatt tcttccgggg acaccgccag caaacgcgag 4020
caacgggcca cggggatgaa gcagcccggc ggcacctcgc taacggattc accactccaa 4080
gaattggagc caatcaattc ttgcggagaa ctgtgaatgc gcaaaccaac ccttggcaga 4140
acatatccat cgcgtccgcc atctccagca gccgcacgcg gcgcatctcg gggccgacgc 4200
gctgggctac gtcttgctgg cgttcggggt accgctctag agcgaattaa ttcactggcc 4260
gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 4320
gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 4380
caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 4440
ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 4500
tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 4560
ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 4620
ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 4680
taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 4740
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 4800
agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 4860
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ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 4980
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gcatgcctgc aggtcga                                                6917
<210>26
<211>615
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(612)
<400>26
atg gct gga cct gcc acc cag agc ccc atg aag ctg atg gcc ctg cag    48
Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln
1            5                10               15
ctg ctg ctg tgg cac agt gca ctc tgg aca gtg cag gaa gcc acc ccc    96
Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro
          20               25               30
ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag tgc tta    144
Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
      35               40               45
gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag gag aag    192
Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys
   50               55               60
ctg tgt gcc acc tac aag ctg tgc cac ccc gag gag ctg gtg ctg ctc    240
Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu
65               70               75               80
gga cac tct ctg ggc atc ccc tgg gct ccc ctg agc agc tgc ccc agc    288
Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser
             85               90               95
cag gcc ctg cag ctg gca ggc tgc ttg agc caa ctc cat agc ggc ctt    336
Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
          100             105               110
ttc ctc tac cag ggg ctc ctg cag gcc ctg gaa ggg atc tcc ccc gag    384
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu
      115               120              125
ttg ggt ccc acc ttg gac aca ctg cag ctg gac gtc gcc gac ttt gcc    432
Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala
   130               135              140
acc acc atc tgg cag cag atg gaa gaa ctg gga atg gcc cct gcc ctg    480
Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu
145              150               155              160
cag ccc acc cag ggt gcc atg ccg gcc ttc gcc tct gct ttc cag cgc    528
Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg
             165               170              175
cgg gca gga ggg gtc ctg gtt gcc tcc cat ctg cag agc ttc ctg gag    576
Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu
          180              185              190
gtg tcg tac cgc gtt cta cgc cac ctt gcc cag ccc tga               615
Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
      195               200
<210>27
<211>204
<212>PRT
<213>人
<400>27
Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln
1             5               10               15
Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro
          20               25               30
Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
      35                40              45
Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys
   50               55                60
Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu
65               70               75               80
Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser
             85               90               95
Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
          100              105              110
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu
      115              120               125
Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala
  130               135              140
Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu
145              150              155              160
Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg
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Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu
          180              185              190
Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
      195               200