生物分子递送系统所必需的特征是在包封、储存和释放过程中保 持生物分子结构的完整性，并具有能够获得合适的释放动力学的机制。
一种常见的应用是蛋白质药物递送。目前用于蛋白质药物递送应 用的技术主要是基于聚合物的。基于聚合物的系统作为用于生物学实 体如蛋白质的包封剂有一些缺点：
●聚合物制造可能涉及使用化学品和/或较高的温度，其均可使蛋 白质变性；
●通常蛋白质从聚合物基质释放的机制是聚合物基质的侵蚀(即 溶解)。侵蚀(和因此的释放)速率通常取决于聚合物颗粒的化 学环境(例如，依赖于pH)。侵蚀还可产生使蛋白质变性的降 解副产品；
●聚合物通常具有疏水表面，需要表面处理来引入亲水性，从而 增加在血液中的稳定性；
●储存过程中，由于例如脱水作用，蛋白质可能被破坏/变性；
●干燥过程中聚合凝胶可能经受严重的收缩，挤压被包封的蛋白 质，并引起其构象变化。
WO 01/62232(Barbé和Dartlett)涉及将生物学活性材料加入至陶 瓷包封剂中，但该专利中描述的化学作用对于较大生物分子的包封和 释放并不理想。已知用于形成二氧化硅球的硅醇盐前体的水解过程中 释放的短链醇使蛋白质分子变性，导致生物学活性显著丧失。此外， 溶胶-凝胶反应通常在酸或碱催化剂的存在下发生，使pH与大多数生 物分子不相容。另外，蛋白质的大小范围可达到大约3000kDa，直径 可超过10nm。酸性条件中形成的微孔通常非常小而不能释放这种大小 的分子，尽管在碱性条件下形成的中孔较大，能够释放小蛋白质。理 想的系统需要其中的pH可以保持在典型的生理学范围～5-8以内，该条 件不适合催化硅醇盐的水解。
JP5 261274(Lion Corp.)描述了在陶瓷基质中包封生物分子的方 法。但通过上述专利方法制备的微粒不能设计用于生物分子的可控释 放。另外，该方法将生物分子与严格条件如极端的pH和高切变力接触， 这样的条件可使敏感的生物分子(尤其是蛋白质)变性或另外发生损 害。而且，该方法中使用的快速絮凝有可能产生范围非常宽且不可控 的粒度分布。
因此需要一种生物学实体的递送系统，其表现出所需的释放动力 学，并能够在包封、储存和释放过程中保持生物学实体的结构完整性。

本发明的目的是克服或基本上改善至少一种上述缺点。本发明的 另一个目的是至少部分满足上述需求。
在本发明的第一个方面，提供了一种可释放地包封生物学实体的 方法，该方法包括：
-形成乳液，该乳液包括分散在非极性溶剂中的乳液液滴，其中乳 液液滴包括前体材料和生物学实体；和
-从乳液液滴形成颗粒，所述颗粒之中和/或之上具有生物学实体。
在形成乳液的步骤中，从非极性溶剂、表面活性剂和前体材料形 成第一乳液，生物学实体与第一乳液混合，或者从非极性溶剂、表面 活性剂和生物学实体形成第一乳液，前体材料和该乳液混合，或者生 物学实体可与前体材料混合，得到的混合物与非极性溶剂和表面活性 剂混合以形成乳液，或者可以采用一些其它的添加次序。另外可选地， 形成乳液的步骤可以包括将表面活性剂和非极性溶剂与水溶液，任选 酸性水溶液混合，以形成第一乳液，并将第一乳液与前体材料和生物 学实体混合形成乳液。第一乳液可以是，例如，微乳液或小液滴乳液。
因此，本发明提供了可释放地包封生物学实体的方法，其包括：
a)将表面活性剂在非极性溶剂中的溶液与前体材料和生物学实体 混合形成乳液，该乳液包括分散在非极性相中的极性相，所述极性相 包括生物学实体；和
b)从极性相形成包括生物学实体的颗粒。
极性相也可包括前体材料。上述方法的步骤a)可以包括：
c)将表面活性剂在非极性溶剂中的溶液与前体材料混合，形成第 一乳液，所述第一乳液具有分散在非极性相中的极性相，所述前体材 料位于极性相中；和
d)将第一乳液与生物学实体混合，使得极性相包括生物学实体。
该方法可以额外地包括将第一乳液的pH调节至适合所讨论生物 学实体的pH的步骤，即，调节至不使生物学实体降解或变性的pH或 不引起其变质的pH。pH可以调节至在其下生物学实体保持活性，例 如生物学活性的pH。该pH可以在大约1和大约11之间，或大约2和 11之间、3和11之间、4和11之间、5和11之间、6和11之间、7 和11之间、1和9之间、1和7之间、1和6之间、2和10之间、2和 8之间、2和7之间、3和9之间、3和7之间、3和5之间、5和6之 间、6和7之间、7和8之间、8和9之间、9和10之间、5和8之间、 5和7之间、5和8.5之间、10和11之间、5和7之间、8和10之间、 8.5和10之间、9和11之间或8.5和11之间，例如大约1、1.5、2、 2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、 10.5或11。调节pH可以在步骤d)之前进行。
该方法的步骤a)可以包括：
e)将表面活性剂在非极性溶剂中的溶液与酸的水溶液混合，形成 第二乳液(其可以可任选地是微乳液或小液滴乳液)，所述第二乳液具 有分散在非极性相中的极性相；
f)将前体材料加入到第二乳液中，使得前体材料位于极性相中； 和
g)加入生物学实体，使得极性相包括生物学实体。
另外可选地，步骤a)可以包括：
h)将前体材料和生物学实体混合，形成极性混合物；和
i)将极性混合物与表面活性剂溶液混合，形成乳液，所述乳液具 有分散在非极性相中的极性相，使得极性相包括前体材料和生物学实 体。
该可选方案还可以包括将前体材料的pH调节至大约1和大约11 之间、或大约3和11之间、5和11之间、7和11之间、7.5和11之间、 1和9之间、1和7之间、1和5之间、3和9之间、3和7之间、5和 9之间、5和7之间、7.5和9.5之间、8.5和9之间、9和10之间、9.5 和10之间、9和9.5之间、5和8之间、5和7之间、5和8.5之间、 10和11之间、5和7之间、8和10之间、8.5和10之间、9和11之 间、或8.5和11之间，例如大约1、2、3、4、5、6、7、7.5、8、8.5、 9、9.5、10、10.5或11。在此情况下，优选生物学实体在pH被调节的 前体材料的pH下是稳定的。
作为另一种可选方案，步骤a)可以包括：
j)将生物学实体加入到表面活性剂溶液中；和
k)加入前体材料，pH调节至大约1和大约11之间，例如大约7.5 和大约11之间，使得乳液的极性相包括前体材料和生物学实体。
前体可以包括陶瓷前体。其可以包括硅胶或一些其它陶瓷前体， 或可以是两种或多种不同陶瓷前体的混合物。生物学实体可以包括蛋 白质。其可以包括酶。该方法可以额外地包括在步骤b)之前加入凝胶 化助剂。凝胶化助剂可包括盐(例如氯化钠)和/或水溶性聚合物。凝 胶化助剂可以加入到溶液中，任选地为水溶液中。该方法可以包括至 少部分地从非极性相中分离颗粒。至少部分分离的步骤可以包括将包 括微粒的乳液与沉淀溶剂混合，从而沉淀出颗粒，所述沉淀溶剂与非 极性溶剂可混溶。合适的沉淀溶剂可以是丙酮、乙醇或这些溶剂的混 合物。沉淀溶剂可以选择成不使生物学实体变性或损坏。至少部分分 离的步骤可以额外地或另外可选地包括对包括颗粒的乳液进行离心。 在至少部分分离的步骤之后，可以对颗粒进行干燥。
因此，在一个实施方式中，本发明的方法包括：
-将生物学实体加入到包括选自锆四醇盐(zirconium tetraalkoxide)、钛四醇盐(titanium tetraalkoxide)的至少一种醇盐的前 体材料中，pH调节至大约2至大约4；和
-将生物学/前体材料混合物加入到表面活性剂溶液中，形成乳液， 该乳液包括分散在非极性相中的极性相，其中极性相包括生物学实体 和前体材料；和
-从极性相形成包括生物学实体的颗粒。
在另一个实施方式中，本发明的方法包括：
-将生物学实体水溶液加入到表面活性剂溶液中，形成乳液，该乳 液包括分散在非极性相中的极性相，其中极性相包括生物学实体；
-加入包括硅酸盐的前体材料，pH调节至大约8至大约10，使得 乳液的极性相包括前体材料和生物学实体；
-将pH调节至大约6至大约8；和
-从极性相形成包括生物学实体的颗粒。
在一个实施方式中，本发明的方法包括：
a)将表面活性剂在非极性溶剂中的溶液与硅胶混合，形成乳液， 所述乳液具有分散在非极性相中的极性相；
b)将乳液的pH调节至pH大约5至大约11；
c)将乳液与生物学实体混合，使得极性相包括生物学实体；和
d)从极性相形成包括生物学实体的颗粒。
在另一个实施方式中，本发明的方法包括：
a)将表面活性剂在非极性溶剂中的溶液与酸的水溶液混合，形成 乳液，所述乳液具有分散在非极性相中的极性相；
b)将硅胶加入到乳液中，使得乳液的pH为大约5至大约11；
c)将生物学实体加入到乳液中，使得极性相包括生物学实体；和
d)从极性相形成包括生物学实体的颗粒。
在另一个实施方式中，本发明的方法包括：
a)将前体材料和生物学实体混合，形成极性混合物；
b)将极性混合物的pH调节为大约7.5至大约11；
c)将极性混合物与表面活性剂溶液混合，形成乳液，该乳液具有 分散在非极性相中的极性相，所述极性相包括极性混合物；和
d)从极性相形成包括生物学实体的颗粒。
在另一个实施方式中，本发明的方法包括：
a)将表面活性剂溶液与包括生物学实体的溶液或悬浮液在非极性 溶剂中混合；
b)将前体材料的pH调节为大约7.5至大约11；
c)将pH经调节的前体材料加入到包括生物学实体的溶液中，形 成乳液，该乳液包括分散在非极性相中的极性相，所述极性相包括生 物学实体和前体材料；和
d)从极性相形成包括生物学实体的颗粒。
在第一个方面的另一个实施方式中，提供了一种可释放地包封生 物学实体的方法，该方法包括：
-将前体材料、表面活性剂和非极性溶剂混合，形成乳液，该乳液 包括分散在非极性溶剂中的乳液液滴，所述乳液液滴包括前体材料；
-将生物学实体加入到乳液中；和
-从乳液液滴形成颗粒，所述颗粒之中和/或之上具有生物学实体。
将前体材料、表面活性剂和非极性溶剂混合的步骤可包括将表面 活性剂和非极性溶剂混合(例如将表面活性剂溶解在非极性溶剂中)， 然后加入前体。
前体材料可以是溶液、悬浮液、分散体、溶胶或乳液，并能够形 成颗粒。它可以是极性的。它可以是水性的。形成颗粒的步骤可包括 以下步骤：
-任选地，将乳液液滴的pH调节至在其下生物学实体稳定和/或活 性的pH；和
-等待足够长时间，使乳液液滴形成颗粒。
形成颗粒的步骤可包括前体材料的去稳定和/或凝胶化和/或聚集。 前体材料可以包括水，可以是水溶液、悬浮液、分散体、乳液或溶胶。 它可以包括陶瓷前体材料(即陶瓷材料的前体)。陶瓷前体材料可以包 括金属氧化物前体材料，例如金属含氧阴离子(oxo anion)的水溶性 盐。金属含氧阴离子可以是例如，硅酸盐、铝酸盐、钛酸盐、锆酸盐 或一些其它含氧阴离子。陶瓷前体可以包括二氧化硅前体材料如硅胶 或硅溶胶或烷氧基硅烷(例如四烷氧基硅烷如四甲基硅烷)或金属硅 酸盐(例如硅酸钠)或任意两种或更多种这些物质的混合物。其可包 括任何能够形成稳定胶体分散体的含水金属氧化物。氧化物可以是第2 族至第4族元素包括过渡元素和镧系元素的氧化物。前体材料可包括 一级颗粒，一级颗粒的直径可以是大约5至大约500nm，或大约5至 大约100nm，或大约5至大约50nm。其可以包括不同大小的一级颗 粒的混合物，不同大小的一级颗粒可以在将前体材料与表面活性剂溶 液混合的步骤之前进行混合。前体材料可以是碱性的，其pH可以为大 约9至大约12，或者可以是酸性的，pH为大约0.5至大约3.5、或大 约3.5至大约5.5，或者可以是一些其它pH。表面活性剂可以是阴离子 型、阳离子型、非离子型或两性离子型的，并可以溶解在非极性溶剂 中。乳液可以是油包水(W/O)乳液。液滴大小可以是大约0.01至大 约500μm。乳液液滴形成颗粒的足够长时间可以是大约1分钟至24 小时，或大约1至12小时。在从乳液液滴形成颗粒的过程中，可以将 乳液可以搅拌、旋动或以其它方式搅动。
混合的步骤可以包括搅拌、摇动、混合、旋动或搅动。其可以包 括将前体材料与表面活性剂溶液在非极性溶剂中混合。加入生物学实 体的步骤可以在低切变力下进行。低切变力可以足够低，以避免损害， 例如使生物学实体变性。生物学实体可以溶液或悬浮液的形式加入。 生物学实体可以是生物分子，例如可以是蛋白质、肽、抗体、酶、多 糖、DNA或RNA链或片段、或一些其它生物分子。
微粒可以是中孔的，其平均孔径可以是直径大约1至大约50nm。 它们可包括多种聚集体，各种聚集体包括多个一级颗粒。颗粒的平均 粒径为大约0.05至大约500μm、或大约0.05至大约100μm、或大约 0.5至大约50μm。颗粒的粒径分布可以很宽、中等或很窄。
本发明的方法可以额外地包括一个或多个以下步骤：
-在加入生物学实体的步骤之前、之后或之中加入凝胶化助剂；
-至少部分地从非极性溶剂中分离出颗粒；
-洗涤颗粒；和
-干燥颗粒。
凝胶化助剂的量可以足以有助于球形颗粒的形成。该助剂可以溶 液的形式加入，该溶液还可以包括生物学实体。凝胶化助剂可以是水 溶性盐，例如氯化钠。另外可选地，其可以是一些其它材料，例如水 溶性聚合物，如羟甲基纤维素或羟丙基纤维素。凝胶化助剂可以大约 0.1至40％w/v的浓度加入到溶液如水溶液中。如果凝胶化助剂是盐， 则盐溶液可以为大约0.5至6M。至少部分分离的步骤可以包括离心、 过滤、微过滤、沉降或一些其它合适的方法。洗涤步骤可以包括用洗 涤溶剂洗涤，该溶剂可以是有机溶剂，例如非极性溶剂或与非极性溶 剂混溶的溶剂，或者可以是极性溶剂，例如极性有机溶剂、水或水溶 液。洗涤步骤可以重复，每次重复可以使用相同或不同的洗涤溶剂。 每个洗涤步骤之后可以是至少部分地从洗涤溶剂中分离出颗粒的步 骤，例如通过过滤或离心。干燥步骤可以包括使微粒与气流接触，例 如空气、氧气、氮气、二氧化碳或其它一些不损害生物学实体或使其 变性的气体。干燥步骤可以在环境温度下进行，或者在不损害生物学 实体或使其变性的不同温度下进行。可以额外地或另外可选地包括对 生物学实体施加真空或冷冻干燥。
在一个实施方式中，提供可释放地包封生物分子的方法，其包括：
-将前体材料和表面活性剂溶液在非极性溶剂中混合，形成乳液， 该乳液包括分散在非极性溶剂的乳液液滴，所述乳液液滴包括前体材 料；
-任选地调节乳液液滴的pH；
-将生物学实体和任选的凝胶化助剂加入到乳液中；
-等待足够长时间使乳液液滴形成颗粒，所述颗粒之中和/或之上 具有生物学实体；
-至少部分地从非极性溶剂中分离颗粒；
-洗涤颗粒；和
-干燥颗粒。
调节乳液液滴pH的步骤可以在加入生物学实体的步骤之前、同时 或之后进行。如果加入的话，可溶性盐可以在加入生物学实体之前、 同时或之后加入。
在另一个实施方式中，提供一种可释放地包封生物分子的方法， 其包括：
-将硅胶和表面活性剂溶液在非极性溶剂中混合，形成乳液，该乳 液包括分散在非极性溶剂中的乳液液滴，所述乳液液滴包括硅胶；
-将pH调节剂加入到乳液中，将pH调节为大约5至11；和
-加入生物分子的溶液或悬浮液；
-加入可溶性无机盐溶液；和
-等待大约1至大约12小时，使二氧化硅颗粒从乳液液滴中形成， 所述二氧化硅颗粒之中和/或之上可释放地包封有生物分子。生物分子 可以是，例如，蛋白质、肽、DNA片段、抗体或多糖。
在另一个实施方式中，提供了一种可释放地包封生物分子的方法， 该方法包括：
-将硅胶和表面活性剂溶液在非极性溶剂中混合，形成乳液，该乳 液包括分散在非极性溶剂中的乳液液滴，所述乳液液滴包括硅胶；
-将pH调节剂加入到乳液中，将pH调节为大约5至大约10；和
-加入生物分子的溶液或悬浮液；
-加入可溶性无机盐溶液；和
-等待大约1至12小时，使二氧化硅颗粒从乳液液滴中形成，所 述二氧化硅颗粒之中和/或之上可释放地包封有生物分子；
-至少部分地从非极性溶剂中分离二氧化硅颗粒；
-用非极性溶剂洗涤二氧化硅颗粒；
-任选地用不同于该非极性溶剂的溶剂洗涤二氧化硅颗粒；和
-干燥二氧化硅微粒。
在本发明的第二个方面，提供了一种包括可释放生物学实体的颗 粒，所述颗粒的平均孔径为直径大约1至50nm，平均粒径为大约0.05 至大约500μm、或大约0.05至大约100μm。本发明还提供多种所述 的颗粒。生物学实体可以基本上均匀地分布在颗粒中，或不均匀地分 布在其中。颗粒可以是这样的：生物学实体在从颗粒中释放出之后是 有生物学活性的。例如，如果生物学实体是酶，则酶从颗粒中释放后 保持其酶活性。生物学实体在从颗粒中释放之后可以保留包封之前其 活性的至少大约50％，或其活性的至少大约60、70、80或90％。
本发明的颗粒可以通过包括以下步骤的方法制成：
a)将表面活性剂在非极性溶剂中的溶液与前体材料和生物学实体 混合，形成乳液，所述乳液具有分散在非极性相中的极性相，所述极 性相包括生物学实体；和
b)从极性相形成包括生物学实体的颗粒。
本发明的颗粒可以通过本发明第一个方面的方法制备。
颗粒可以包括直径大约5至500nm的一级颗粒的聚集体。颗粒可 以在其中和/或其上可释放地包封有生物学实体。颗粒和一级颗粒可以 包括陶瓷，可以包括金属氧化物，例如二氧化硅、氧化锆、氧化铝、 氧化钛或任意两种或多种这些物质的混合物，或者可以包括硅、钛、 锆、铝中的任意两种或多种的混合金属氧化物。微粒可以是中孔的， 其平均孔径为直径大约1至50nm。其可以包括聚集体，该聚集体包括 多个一级颗粒。颗粒微粒的平均粒径为大约0.05至大约500μm，或大 约0.5至大约50μm。生物学实体可以是生物分子，可以是，例如，蛋 白质、肽、抗体、酶、多糖、DNA或RNA链或片段、或一些其它生 物分子。
在本发明的第三个方面，提供了一种其中和/或其上可释放地包封 有生物学实体的陶瓷颗粒，所述陶瓷颗粒通过本发明第一个方面的方 法制备。
在本发明的第四个方面，提供了一种将生物学实体递送给患者的 方法，该方法包括给予患者一种或多种根据本发明第二个或第三个方 面的颗粒。该方法的目的是治疗患者的病状，如疾病，其中生物学实 体在治疗该病状中是有指征的。对于治疗病状，生物学实体可以是有 指征的。给药可通过注射，例如静脉内、肌肉内、皮下或一些其它类 型的注射，或者可以通过肺、鼻、口或透皮递送或一些其它合适的递 送方法。该方法可以包括将一种或多种颗粒悬浮在临床上可接受的载 体中，所述载体适于注射或肺、鼻、口或透皮递送。
在本发明的第五个方面，提供了一种将生物学实体递送至液体的 方法，该方法包括将液体与一种或多种根据本发明第二个或第三个方 面的颗粒接触。在该方面，生物学实体可以是例如酶。生物学实体可 以催化该液体中的反应。
在本发明的第六个方面，提供了根据本发明第二个或第三个方面 的颗粒或多种颗粒在将生物学实体递送给患者或液体中的应用。该应 用的目的可以是治疗患者的病状，或者催化液体中的反应或一些其它 目的。该应用可以包括生物学实体可控地释放给患者或液体。
在本发明的第七个方面，提供了根据本发明第二个或第三个方面 的颗粒或多种颗粒在制造用于治疗患者病状的药物中的应用。生物学 实体可以对所述治疗是主治的。患者可以是动物或人类患者，动物可 以是哺乳动物、灵长类、鸟类或一些其它动物。
在本发明的第八个方面，提供了一种治疗患者病状的药物，所述 药物包括根据本发明的颗粒或多种所述颗粒，其中所述颗粒或多种颗 粒的生物学实体是主治该病状的。该药物还可以包括一种或多种临床 上可接受的载体和/或佐剂。该药物可以适合注射给患者，或肺、鼻、 口或透皮递送给患者。载体和/或佐剂可以适合于注射给患者，或肺、 鼻、口或透皮递送。
附图说明
现在通过实施例参考附图说明本发明的优选方式，其中：
图1显示了在pH～10下形成颗粒的方法的流程图；
图2显示了一些表面活性剂的结构，这些表面活性剂使得在pH～10 下形成球形颗粒；
图3显示了使用不同的表面活性剂制得的二氧化硅产物的扫描电 镜显微图像；
图4显示了使用不同的表面活性剂浓度制得的二氧化硅微粒的扫 描电镜显微图像；
图5显示了使用不同的乳液溶剂制得的二氧化硅产物的扫描电镜 显微图像；
图6显示了使用不同浓度的Ludox SM-30制得的二氧化硅微粒的 扫描电镜显微图像；
图7中的曲线显示了使用图1所概括的方法的产物收率与所加入 Ludox SM-30的体积的关系；
图8中的曲线显示了硅胶(30mL)的pH随酸变化的情况：(a) 用0.5mol/L硝酸滴定的Ludox SM-30和Bindzil 30/360；(b)用12mol/L 乙酸滴定的Ludox SM-30；
图9显示了使用硝酸滴定的Ludox SM-30形成的二氧化硅产物的 扫描电镜显微图像和透射电镜显微图像；
图10显示了使用乙酸滴定的Ludox SM-30形成的二氧化硅产物的 扫描电镜显微图像；
图11显示了使用不同类型的硅胶形成的二氧化硅产物的扫描电镜 显微图像；
图12的曲线描绘了由光散射测定的使用图1所概括的方法形成的 颗粒的粒径分布；
图13的曲线显示了由本发明的方法生造的颗粒的粒度分布，其中 使用超声波探头制备这些颗粒；
图14是通过在乳液内部将pH降低至6.0形成的二氧化硅颗粒的 扫描电镜显微照片。
图15的曲线说明了碱性磷酸酶从pH＝9.7下形成的颗粒中的释放。
图16的图说明了8小时内α-糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性磷 酸酶的归一化释放。
图17显示了在pH＝6.0下包封蛋白，使用Span20/煤油乳液合成颗 粒的流程图。
图18的曲线显示了糜蛋白酶、碱性磷酸酶和尿素酶从根据本发明 的平均孔径为5.5和6.7nm的二氧化硅颗粒的释放(注意，尿素酶从 孔径6.7nm的微粒中的释放在此没有显示)。
图19的曲线显示了枯草杆菌蛋白酶从使用(◆)Bindzil 30/360、(■) Bindzil 15/500和(▲)硅酸盐制得的二氧化硅中的释放；
图20的曲线显示了如实施例4所述的从硅酸盐、Bindzil 15/500(6 nm)和Bindzil 30/360(9nm)前体制备的颗粒的孔径分布。
图21是根据本发明的二氧化硅颗粒的扫描电镜显微照片；
图22是显示颗粒切片中C、Fe、Si和O分布的不含铁蛋白的对照 样品的STEM(扫描透射电镜显微照片)EDX光谱图像；
图23是显示根据本发明的颗粒的切片中C、Fe、Si和O分布的 STEM EDX光谱图像；
图24是显示颗粒切片中C、Fe、Si和O分布的不含铁蛋白的对照 样品的STEM EDX光谱图像；
图25的图显示了本发明的包封方法中各种组分对α-糜蛋白酶活性 的影响。
图26的图显示了用本发明包封方法中的各种化学品处理后枯草杆 菌蛋白酶的活性；
图27中的图显示了使用各种包封方法在包封后和在两周时碱性磷 酸酶的活性；
图28的图显示了使用a)HPC 2mg/mL(◆)、b)5mg/mL HPC(■)、 c)30/360和硅酸钠的1∶1混合物(▲)制备的含有枯草杆菌蛋白酶的 颗粒的包封酶活性的速率，其中标准品是酶溶液(●)；
图29是显示在(A)室温下和(B)低于0℃储存的根据本发明的 颗粒的扫描电镜显微图像；
图30中的图显示了各种储存条件下枯草杆菌蛋白酶的活性；
图31中的图显示了在低于0℃下储存两周后的包封碱性磷酸酶的 活性变化；
图32是根据本发明制备的氧化铝颗粒的光学显微照片；
图33是根据本发明的钛酸锆微粒的扫描电镜显微图像；
图34中的曲线显示了使用根据本发明的Span20/煤油乳液得到的 钛酸锆颗粒的粒度分布；
图35的曲线显示了菠萝蛋白酶从根据本发明的钛酸锆颗粒中的归 一化释放。

本发明涉及生物学实体(例如生物分子和/或微生物)在颗粒中的 包封和释放。在一个实施例中，颗粒包括来源于含水硅胶和/或硅酸盐 溶液的溶胶-凝胶二氧化硅。接近中性的pH和不存在有机化学品是相 对良性的条件，有助于保留生物学实体的天然结构。在使用硅溶胶作 为前体的情况下，由于二氧化硅一级颗粒的聚集，凝胶可以是中孔的， 这些一级颗粒的大小决定了孔的大小，从而能够调节凝胶的孔隙度。 如果粒径和形状也可被控制，则这种孔隙度控制为可控释放应用提供 了可能性。通过在油包水乳液内聚集掺有蛋白的硅胶，本发明人已经 制成了大小可控的球体，其可用于生物学实体如生物分子(例如蛋白 质)的可控释放。本发明的方法可以制造生物学实体基本上均匀地遍 及颗粒分布的颗粒。这可以有助于促进生物学实体的可控释放。
选择用于本发明的合适的溶剂/表面活性剂混合物需要认真考虑， 以尽量减少对生物学实体的破坏，并避免使用与胶体纳米颗粒明显发 生相互作用的材料。非极性溶剂的熔点可以低于生物学实体分解、变 性或变质的温度。该温度将取决于生物学实体的性质。熔点可以低于 大约60℃，或者低于大约55、50、45、40、或35℃。可使用的合适溶 剂包括烷烃，例如长链烷烃。烷烃可以是线性、分支或环状的。它们 可以具有大约5至24个碳原子，或大约10至24个、20至24个、5 至20个、5至10个、或10至20个碳原子，可以具有大约5、6、7、 8、10、12、14、16、18、20、22或24个碳原子。溶剂可以是不同化 合物的混合物，例如不同烷烃的混合物。可使用的溶剂包括十二烷、 煤油、正己烷、环己烷和甲苯。可使用的其它溶剂包括卤代溶剂。溶 剂可以是低极性溶剂，通常是用于表面活性剂的溶剂。溶剂不应当使 生物学实体变性或使其另外变质或分解。在本发明方法中所附带的条 件下，它不应当与生物学实体发生反应。溶剂可以选择为成本很低。
已经发现，含有足够长聚乙氧基(-O-CH2-CH2-)链的表面活性(如 Brij52)会阻止二氧化硅球体的形成。本发明人推测这可能是由于氢与 一级颗粒表面结合，从而提供了立体屏障，阻止聚集和凝胶化。用于 本发明的合适的表面活性剂可以是阴离子型、阳离子型、非离子型或 两性离子型的，可以包括，例如，去水山梨糖醇酯，例如Span 20，以 及磺基琥珀酸酯，例如Aerosol OT。优选在凝胶化pH下电荷符号与胶 体颗粒相同(即正性或负性)的非离子型表面活性剂或离子型表面活 性剂。因此，当颗粒在低pH下(例如低于大约pH8)形成时，通常 建议避免使用具有长聚乙氧基(-O-CH2-CH2-)链的表面活性剂。当微 粒在较高pH(例如，高于大约pH8)下形成时，已经发现某些具有聚 氧乙烯链的表面活性剂能产生合适的颗粒。凝胶化pH可以取决于前体 材料的性质。
前体材料可以是硅胶或胶体二氧化硅，可以额外地或另外可选地 包括金属含氧阴离子的水溶性盐。水溶性盐可以是硅酸盐，例如碱性 硅酸盐如硅酸钠，或可以是锆酸盐或一些其它合适的陶瓷前体(即陶 瓷材料的前体)。一种合适的前体材料是Bindzil 30/360(Eka Chemicals)，其具有约9nm的一级颗粒的胶体二氧化硅，当pH从10 降低至6时，在几小时内形成块状凝胶。大小类似的其它胶体二氧化 硅的商标如Snowtex ST-40(Nissan Chemicals)也是合适的。也可以使 用Ludox SM-30(Grace Davison)，但它含有杀虫剂，因而不适合本发 明的一些应用。前体材料可以具有直径在大约5和500nm之间的一级 颗粒，或直径在大约5和250nm之间、5和100nm之间、5和50nm 之间、5和40nm之间、5和30nm之间、5和20nm之间、10和100nm 之间、20和100nm之间、10和30nm之间、10和20nm之间、100 和500nm之间、100和250nm之间、250和500nm之间、或50和250 nm之间的一级颗粒，可以具有直径为大约5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、 200、250、300、350、400、450或500nm的一级颗粒。可以使用大小 不同的一级颗粒的前体材料的混合物。其它前体材料包括铝酸盐、锆 酸盐、钛酸盐、其它金属含氧阴离子、和这些材料的混合物。
本发明的方法包括将前体材料和表面活性剂溶液在非极性溶剂混 合形成乳液的步骤。乳液可以是油包水(W/O)乳液。它的液滴大小 在大约0.05和500μm之间，或大约0.05和250μm之间、0.05和100 μm之间、0.05和50μm之间、0.05和25μm之间、0.05和10μm之间、 0.05和5μm之间、0.05和2μm之间、0.05和1μm之间、0.05和0.5μm 之间、0.1和50μm之间、0.5和50μm之间、1和50μm之间、10和 50μm之间、25和50μm之间、1和20μm之间、1和10μm之间、1 和5μm之间、100和500μm之间、50和500μm之间、250和500μm 之间、1和250μm之间、1和100μm之间、1和50μm之间、1和20 μm之间、0.1和100μm之间、0.1和10μm之间、或1和2μm之间， 液滴大小可以为大约0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、 300、350、400、450或500μm。
表面活性剂与非极性溶剂的比例可以是大约5至30％或其基于 w/w或w/v，或大约5至20％或其基于w/w或w/v、5至15％或其基 于w/w或w/v、5至10％或其基于w/w或w/v、10至30％或其基于 w/w或w/v、15至30％或其基于w/w或w/v、或10至20％或其基于 w/w或w/v，可以是大约5、10、15、20、25或30％或其基于w/w或 w/v。存在的总水量(决定前体材料的加入量)作为水∶表面活性剂的摩 尔比例可以在大约2∶1和10∶1之间、或在大约5∶1和10∶1之间、或大 约2∶1和5∶1之间、或大约3∶1和7∶1之间，水∶表面活性剂的摩尔比例 可以是大约2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1。生物分子 的加入量可以取决于生物分子在水溶液中的溶解性。其可以是，例如， 大约20mg/g二氧化硅。生物分子的量可以是大约1至50mg/g二氧化 硅之间，可以是大约1至20、1至10、1至5、5至50、10至50、25 至50、10至40、或10至30mg/g，可以是大约1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/g二氧化硅，或可 以是一些其它的量，其至少部分取决于生物学实体的性质和/或其所需 的释放模式。
在本发明的方法中，前体材料被转化成其上和/或其中具有生物学 材料的颗粒。这些颗粒可以是多孔的，具有的孔的平均直径为大约1 至50nm、或大约1至2nm、1至10nm、1至20nm、2至50nm、2 至20nm、2至10nm、2至5nm、5至20nm、10至20nm、20至50 nm、10至40nm、5至30nm、或5至10nm，可具有直径大约1、1.5、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、25、30、35、40、45或50nm的孔。颗粒直径(例如平均直 径)可以是大约0.05至500μm、或大约0.05至250μm、0.05至100μm、 0.05至50μm、0.05至25μm、0.05至10μm、0.05至5μm、0.05至2 μm、0.05至1μm、0.05至0.5μm、0.1至50μm、0.5至50μm、1至 50μm、10至50μm、25至50μm、1至20μm、1至10μm、1至5μm、 100至500μm、50至500μm、250至500μm、1至250μm、1至100μm、 1至50μm、1至20μm、0.1至100μm、0.1至10μm、或1至2μm， 直径可以为大约0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、 1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、 400、450、或500μm。
有关选择目标粒径的两个因素是：
-包括聚集体的一级颗粒的大小可以与待包封生物学实体(例如蛋 白质)的相当。例如，Bindzil 30/360一级颗粒为大约9nm。因此需 要数目最少的一级颗粒将生物学实体充分包封。
-蛋白质可以包括亲水区和疏水区，尽管蛋白质分子可以位于油包 水乳液的水相中，它们可以优选地位于表面活性剂/溶剂界面附近，形 成外侧载有蛋白的“外壳”。因此为了尽量减少微粒中过多的死空间(即 与蛋白无关的空间)、但仍保持足够的一级颗粒以保留蛋白质，大约1 微米的目标粒径可以是合适的。
本发明人已经发现，在二氧化硅的情况下，向乳液中加入凝胶化 助剂可以促进球形颗粒的形成。凝胶化助剂可以是盐，或可以是一些 其它材料，例如水溶性聚合物如羟甲基纤维素或羟丙基纤维素。凝胶 化助剂可以溶液如水溶液的形式加入，其浓度为大约0.1至40％或其基 于w/w或w/v，或大约0.1至20％或其基于w/w或w/v、0.1至10％ 或其基于w/w或w/v、0.1至5％或其基于w/w或w/v、0.1至1％或其 基于w/w或w/v、0.5至40％或其基于w/w或w/v、1至40％或其基于 w/w或w/v、5至40％或其基于w/w或w/v、10至40％或其基于w/w或 w/v、20至40％或其基于w/w或w/v、1至20％或其基于w/w或w/v、 或5至20％或其基于w/w或w/v，可以是大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40％ 其基于w/w或w/v。凝胶化助剂可以是水溶性的，可以溶液如水溶液 的形式加入。如果凝胶化助剂是盐，则溶液中的盐浓度为大约0.5至6 M，可以为大约0.5至3、大约0.5至3、大约0.5至1、大约1至6、 大约3至6、大约0.5至2或大约1至2M，盐的浓度可以是大约0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6M。 凝胶化助剂内包括磷酸二氢钾(0.0037-0.015M)用于将pH保持在5-7 的范围内。磷酸二氢钾的浓度可以在0.0037-0.01M、0.0037-0.005M、 0.005-0.015M、0.01-0.015M或0.005-0.01M的范围内，可以是大约 0.0037、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.011、0.012、 0.013、0.014或0.015M。也可使用其它的缓冲溶液。凝胶化助剂可 在加入生物学实体之前、之中或之后加入，或与生物学实体一起加入。 凝胶化助剂的加入量根据前体和所用助剂的性质而变化，但在胶体二 氧化硅的情况下，凝胶化助剂：二氧化硅的质量比通常在大约1∶10至 1∶200、或大约1∶10至1∶20的范围之内。作为凝胶化助剂：二氧化硅的 质量比，凝胶化助剂的用量可可以在大约1∶10和1∶100之间、1∶10和 1∶50之间、1∶10和1∶20之间、1∶20和1∶100之间、1∶50和1∶100之间、 1∶100和1∶200之间、1∶100和1∶150之间、1∶150和1∶200之间、1∶20 和1∶80之间、1∶20和1∶50之间、1∶10和1∶15之间、1∶15和1∶20之间 或1∶13和1∶17之间，可以是大约1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、 1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、 1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100、1∶20、1∶140、1∶160、1∶180或1∶200。
对于颗粒的形成和老化，必须等待一些时间，使得它们可以在不 受损坏的情况下进行洗涤和干燥。时间可以在大约1分钟和24小时之 间，或大约10分钟和24小时之间、或大约30分钟和24小时之间、 或大约0.5和12小时之间、或0.5和6小时之间、或1和24小时之间、 或6和24小时之间、或12和24小时之间、或1和12小时之间、或2 和8小时之间、或4和8小时之间、或大约1和60分钟之间、或大约 1和30分钟之间、1和10分钟之间、1和5分钟之间、5和60分钟之 间、5和30分钟之间、或15和30分钟之间，可以是大约1、2、3、4、 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55分钟、或大约1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20或24小时。在等待期间， 乳液可被搅拌、旋动或另外进行搅动，或在不搅动的情况下静置。
在颗粒已经形成和老化后，可以对其进行洗涤。在洗涤之前，可 以将其至少部分地从非极性溶剂中分离。至少部分分离的步骤可以包 括离心、过滤、微过滤、沉降或一些其它合适的方法或这些方法中任 意两种或更多种的组合。洗涤步骤可以重复，可以用不同的洗涤溶剂 进行一些次或所有的重复。可以使用的洗涤溶剂包括非极性溶剂、水、 醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇，取决于生物学 实体的敏感性)、烷烃、卤代烷烃、酮、酯和其它常规溶剂、或这些溶 剂的混合物。洗涤可以包括将微粒浸泡在洗涤溶剂中，可以包括搅动 (例如旋动、摇动、搅拌)其中浸泡有颗粒的洗涤溶剂，和/或包括使 洗涤溶剂流过颗粒，例如通过过滤。其可以额外地包括至少部分地从 洗涤溶剂中分离微粒。
可以对颗粒进行干燥，例如在气流中和/或通过加热和/或施加真 空。干燥颗粒的温度可以取决于生物学实体的性质，应该低于生物学 实体可能被损坏或变性的温度。温度可以是，例如，大约15和50℃之 间、或大约15和40℃之间、15和30℃之间、15和20℃之间、20和 50℃之间、30和50℃之间、或20和40℃之间，可以是大约15、20、 25、30、35、40、45或50℃。另外可选地，可以对颗粒胶进行冻干。 冻干温度可以是大约-80℃。该温度可小于大约-30℃，或小于大约-40、 -50、-60、-70、-90、-100、-120、-140、-160或-180℃。其可以在大约 -30和大约-200℃之间、或大约-130和-150℃之间、-30和-100℃之间、 -30和-80℃之间、-30和-60℃之间、-50和-100℃之间、-50和-80℃之 间、-100和-200℃之间、-100和-150℃之间、-150和-200℃之间、-150 和-50℃之间、或-70和-90℃之间，可以是大约-30、-40、-50、-60、-70、 -80、-90、-100、-110、-120、-130、-140、-150、-160、-170、-180、 -190、-196或-200℃。冻干压力可以是，例如，大约1和大约200毫托 之间、或大约1和150毫托之间、1和100毫托之间、1和50毫托之 间、1和20毫托之间、1和10毫托之间、10和100毫托之间、10和 50毫托之间、50和200毫托之间、100和200毫托之间、150和200 毫托之间、100和150毫托之间、50和100毫托之间、或120和170 毫托之间，可以是大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、 180、190或200毫托。干燥过程中的压力可以在0和1个大气压之间、 或0.01和1个大气压之间、0.1和1个大气压之间、0.5和1个大气压 之间、0.01和0.5个大气压之间、0.01和0.1个大气压之间、或0.1和 0.5个大气压之间，可以在大约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9或1个大气压性下，或可以在一些其它合适的压力 下。
本发明的颗粒可以用于递送其中或其上包封的生物学实体。生物 学实体可以是治疗性物质，可以通过将颗粒给予患者而递送给患者。 其目的可以是治疗生物学实体主治的病状。病状可以是疾病。生物学 实体可以主治的病状的例子包括可用单克隆抗体治疗的自体免疫性疾 病，和癌症，其治疗可以涉及通过酶来活化前药。给药可以是，例如， 通过注射颗粒在液体中的悬浮液，或可以经口、经肺或一些其它途径 实施。患者可以是脊椎动物，脊椎动物可以是哺乳动物、有袋动物或 爬行动物。哺乳动物可以是灵长类或非人的灵长类或其它非人动物。 哺乳动物可选自人、非人灵长类、马科、鼠科、牛科、兔属、绵羊科、 山羊科、猫科和犬科动物。例如，哺乳动物可选自人、马、牛、奶牛、 黄牛、水牛、绵羊、犬、猫、山羊、美洲驼、兔、猿、猴和骆驼。
本发明的颗粒还可以用于将生物学实体递送给液体，例如反应混 合物。生物学实体可以是，例如，催化物质如酶，颗粒可以用于将生 物学实体递送至反应混合物，从而被催化物质催化。一个例子是将包 括蛋白裂解酶如枯草杆菌蛋白酶的颗粒加入到粉末状洗衣洗涤剂中， 随后在洗涤剂分散期间释放。第二个例子是将常规用于口腔卫生目的 的酶，如葡萄糖氧化酶和/或乳过氧化物酶加入到可被掺入牙膏中的颗 粒中。
生物学实体包封在本发明的颗粒中可以保护生物学实体免受有害 环境条件如高切变力的影响，从而使生物学实体更容易处理或延长其 寿命。包封作用也提供了生物学实体的可控释放，生物学实体从而以 可控的速率递送给患者或液体。速率可以通过控制颗粒的孔径来控制。 凝胶化方法
本发明人已经发现，当胶体二氧化硅分散在表面活性剂溶液中时， 胶凝化同时发生，随后在几分钟内形成颗粒并老化。初始胶体悬浮液 的pH一般为大约pH10。在加入至表面活性剂溶液之前可以降低胶体 悬浮液的pH，但该pH范围有一定限制(大约7.5-10，取决于所使用 的胶体溶液/表面活性剂/酸)，在此范围内可形成球形颗粒。
该方法中使用的表面活性剂可以是，例如：NP-5、AOT、Span20、 Span40、Span60、Span80等。可使用的胶体包括：Ludox SM-30、Ludox HS-40、Bindzil 30/360、Bindzil 15/500、Snowtex 40、Snowtex UP等。 优选胶体颗粒的直径应该小于大约30nm，尽管也可以使用大一些的微 粒。胶体二氧化硅和表面活性剂的浓度可以很宽，溶剂可以选自非极 性溶剂类。
胶体二氧化硅的特性
通过将带负电荷的无定形二氧化硅颗粒分散在水中，制成胶体二 氧化硅悬浮液。颗粒的形状通常是球形的。OH-离子存在于颗粒表面， 碱离子形成双电荷层。通过带负电荷颗粒之间的排斥作用达到稳定。 扰乱电荷平衡会引起聚集，导致悬浮液的粘度升高和/或凝胶化。通过 改变pH或加入盐、电解质、有机溶剂或表面活性剂，可以使胶体二氧 化硅去稳定。
这些因素中的每一个对凝胶化时间的影响取决于溶胶的特性和诱 发去稳定的参数。例如，浓度越高或粒径越小，pH对凝胶化时间的影 响越大，即凝胶化时间越短。但凝胶化时间也随用于调节pH的酸的种 类而变化。就凝胶化时间而言，有机酸通常提供较好的稳定性，其取 决于SiO2的浓度和粒径。例如，在相同的SiO2和酸浓度下，乙酸与强 酸如HCl相比产生的凝胶化较慢。这是因为弱酸释放的H+较少，从而 减少了颗粒表面上H+和-O-之间的反应。
合成方法
在pH大约10下形成颗粒的合成通法的一个例子概括于图1。
在50mL非极性溶剂中制备0.2mol/L表面活性剂溶液。然后在环 境温度下加入含生物学实体如蛋白质的2.16mL胶体二氧化硅(pH＝9 或更高)。搅拌大约10分钟后，加入40mL极性溶剂，使乳液去稳定 并稀释。然后将得到的颗粒过滤，然后用溶剂冲洗。然后将颗粒微在 室温下干燥。
在具体的例子中，使用NP-5和环己烷来制备表面活性剂溶液，胶 体二氧化硅为Ludox SM-30。使用丙酮作为极性溶剂，使乳液去稳定 并稀释，并洗涤微粒。
另外可选地，含生物学实体的颗粒可以在2000rpm下离心3分钟， 以将其从乳液中去除，然后通过温和的溶剂如煤油和/或正己烷洗涤。 颗粒可以在流动的氮气中在室温下进行干燥。
可能的凝胶化机制：
在胶体溶液中，存在两种主要的力：范德华力(FVDW)和静电 力(FEL)。总力(FTOT)是FVDW和FEL的总和(根据DLVO理 论)。在含有大聚合物的胶体溶液中，还存在一种力，耗散力(depletion force)FOS。在这种情况下，总力FTOT＝FVDW+FEL+FOS。通过 改变pH、加入盐或加入表面活性剂等使这些力重排，可以破坏胶体的 稳定性。
在热力学稳定的微乳液(W/O)(通常当表面活性剂的HLB为大 约10至大约13时发生)中，界面张力非常低。当胶体溶液与微乳液 混合时，局部的界面张力可以驱使胶体二氧化硅聚集在水滴中聚集， 形成大的颗粒。该聚集作用中一个很重要的因素是胶体的浓度。据信 聚集作用的机制如下。当胶体悬浮液加入至表面活性剂溶剂混合物中 时，形成了含水和胶体的亲水区。一些水分子将与液-液界面上形成水 化层的表面活性剂分子的亲水头部相互作用。这样导致许多水分子被 吸收和俘获，降低了池中游离水的量，因此水池中胶体浓度被人为增 加，引起胶体的凝胶化。除其它因素以外，许多参数可以影响球形颗 粒的形成：胶体中的二氧化硅浓度、表面活性剂浓度、和水与表面活 性剂的摩尔比。
为形成根据该方法的颗粒，表面活性剂需要在其极性头和水池之 间具有强度中等的分子相互作用。这种分子相互作用的特征是表面活 性剂足迹(surfactant footprint)(A)，其可通过将水滴表面的表面积(π *d2，其中d为水池直径)除以表面活性剂的聚集数(N)来计算。
A＝(π*d2)/N
使用文献值，计算所用表面活性剂的足迹范围。结果如下所列。
液-液界面的半定量结构预测
    Brij30     NP-5  Triton X-100 AOT 表面活性剂 结构     C12H25-     (OCH2CH2)4OH     C9H19-C6H4-     (OCH2CH2)5OH  C6H17-C6H4-  (OCH2CH2)9.5OH 见图2 聚集数：N     150(R＝6.4)     45(R＝1.61)     362(R＝12.86)     210(R＝6)  140 60(R＝5) 130(R＝10) 反胶束直径     3nm(R＝1.34)     6nm(R＝13.4)     10nm(R＝6)     13nm  46.5(R＝5.5) 4.8nm(R＝5) 6.6nm (R＝10) 足迹：A (nm2/分子)     0.628(R＝1.61)     0.312(R＝12.86)     1.50(10nm尺寸)     2.55(13nm尺寸)  48.5 1.20(R＝5) 1.05(R＝10) 表面活性剂 数量/nm2     1.6(R＝1.61)     3.2(R＝12.86)     0.67(10nm尺寸)     0.39(13nm尺寸)  0.021 0.83(R＝5) 0.96(R＝10)
R：[水]/[表面活性剂]摩尔比
强度中等的相互作用所对应的足迹在大约1和大约5nm2/分子之 间，相当于大约10-2个表面活性剂分子/10nm2。足迹值小于大约1nm2/ 分子的任何表面活性剂(如Brij 30)可以形成具有水池大小很小、极 其稳定的微乳液。因此，仅可以产生亚微球形颗粒。足迹较大(＞5nm2/ 分子)的乳液系统并不适合通过该方法形成球形颗粒。
另一种假设是，表面活性剂分子中的氧乙烯单元在一级颗粒凝胶 化形成亚微颗粒中可能发挥重要作用。形成表面活性剂分子极性头的 氧乙烯单位可以通过氢键与颗粒表面相互作用，从而影响二氧化硅颗 粒表面和水之间的相互作用，这可以控制聚结过程。这样可以解释为 什么在低pH下，(-OH)和(-O-)之间的数量比较高，因此氢键较强，不 利于一级胶体的聚结，不能产生微粒。
上述假设仅满足微乳液，即，表面活性剂的HLB为大约10至大 约13时。对于HLB小于大约9的表面活性剂，需要以不同的方式理 解颗粒的形成机制。广泛认可的是HLB值为3-9的材料适合用作油包 水型乳液的乳化剂或用作湿润剂。使用的所有Span表面活性剂亲水头 相同，但亲脂尾不同，其HLB值在4.3(Span 80)和8.6(Span 20) 之间。因此，通过这些表面活性剂可以产生W/O型乳液。推测的机制 如下。当加入胶体二氧化硅水悬浮液时，可能穿透了液-液界面，并形 成亲水区(水滴)，其中界面力干扰了稳定胶体的各种力。结果，胶体 溶液发生凝胶化，形成大的球体。对此观察的一种可能的解释是，由 Span 20形成的微粒比由Span 80形成的微粒光滑得多，Span 80的HLB 非常小，以致界面力非常强。一旦胶体悬浮液遇到表面活性剂溶液， 胶体二氧化硅的凝胶化速率非常快，因此，最初产生较小的颗粒。随 后经由水滴的融合和分裂过程，形成了表面粗糙的微粒。
表面活性剂类型的作用：
经检测的表面活性剂列于下表中。在环己烷溶液中制备0.2mol/L 表面活性剂溶液。对于Triton X-114、NP-9和Triton X-100系统，加入 0.2mol/L助表面活性剂(1-戊醇)以增加乳液的稳定性。Tween和Span 表面活性剂产生不稳定的乳液。该方法根据图1中所述的典型合成方 法，不同之处在于加入1.08mL Ludox SM-30作为胶体二氧化硅。相应 的SEM图像显示在图3中。
表面活性剂特性和对应的产物
表面活性剂  M.W.  HLB 结果 Brij 30  362  9.7 聚集的颗粒 NP-5  440  10 微粒 NP-6  485  10.9 聚集的颗粒
Triton X-114  537  12.4 凝胶 NP-9  630  13 凝胶 Triton X-100  646  13.5 凝胶 AOT  445  10-15 微粒 Tween 21  522  13.3 凝胶 Tween 61  606  9.6 凝胶 Tween 81  650  10 凝胶 Span 20  346  8.6 微粒 Span 40  403  6.7 微粒 Span 60  431  4.7 微粒 Span 80  429  4.3 微粒
使用NP-5、AOT和不同的Span表面活性剂形成球形微粒。由Brij 30和NP-6形成的颗粒似乎发生了聚集。所有其它系统都产生了不规则 形产物。
导致形成球形微粒的表面活性剂的结构列于图2。建议的选择原则 将根据现有的试验结果在后面的章节进行描述。
表面活性剂浓度的影响：
选择NP-5作为表面活性剂以研究表面活性剂浓度对颗粒形貌的影 响。表面活性剂的浓度从0.05mol/L变化至0.5mol/L。相应的SEM图 像显示于图4。似乎有可能将NP-5的浓度增加至0.5mol/L以上，并仍 产生球形颗粒。但表面活性剂的最小浓度为大约0.1mol/L：浓度较低 产生的球形颗粒较少，产生更多聚集的凝胶产物。
乳液溶剂的影响：
使用图1中所概括的典型合成方法，使用七种不同的溶剂产生二 氧化硅微粒。它们是：石油醚(PE：低分子量烃的混合物)、戊烷、己 烷、辛烷、癸烷、十二烷、煤油和环己烷。所得颗粒的SEM图像显示 于图5。图像表明，长链烷烃如煤油(中等重量烷烃的混合物)产生较 多的球形颗粒，似乎烷烃链越长，产生的颗粒越小。
在“Effect of reaction condition and solvent on the size and morphology of silica powder prepared by an emulsion technique(反应条件 和溶剂对通过乳液技术制备的二氧化硅粉末尺寸和形貌的影响)”， W-Kyu Part等人，Korean J，Ceram.，6，229-235(2000)中，阐述了乳液 中的液滴尺寸以及因此二氧化硅凝胶颗粒的尺寸受到有机溶剂位阻效 应的显著影响。为证明这一点，作者使用了化学通式相同、结构不同 的辛烷异构体，和一系列CnH2n+2烷烃来产生乳液。辛烷异构体和烷烃 基系列中的颗粒平均大小，如所期望的那样，随着链长的增加而下降。 从异辛烷获得的平均尺寸为64μm，辛烷的平均尺寸为46μm。随着链 长增加，二氧化硅凝胶粉末的平均尺寸从75μm逐渐下降至28μm。 使用正己烷、正庚烷、正辛烷、壬烷和正癸烷获得的平均尺寸分别为 75、51、46、44和29μm。这些数字与本发明的结果是一致的。
在另一篇参考文献：“Solvent Effects on Copper Nanoparticle Growth Behaviour in AOT Reverse Micelle Systems(AOT反胶束系统中溶剂对铜 纳米微粒生长行为的影响)”，J.P.Cason等人，J.Phys.Chem.B，105， 2297-2302，(2001)中，发现铜颗粒生长在异辛烷溶剂中明显比在环己烷 溶剂中快。该参考文献指出，环己烷较异辛烷能支撑稍大一些的末端 颗粒尺寸。这种依赖性的原因在于以下事实：环己烷能够挤进胶束尾 部中，并有效地将表面活性剂尾部溶剂化，而异辛烷由于体积较大， 不能很容易地将尾部溶剂化。
胶体浓度的影响：
将不同量的Ludox SM-30加入到含10mmol NP-5的50ml乳液中， 以产生二氧化硅微粒。结果显示于下表，SEM图像显示于图6。从这 些结果中显示，高达5.4mL的胶体体积产生占优势的球形产物。似乎 随着胶体二氧化硅的量增加，颗粒更有可能发生聚集。选择2.16mL 胶体二氧化硅进行通常的合成。似乎当乳液中存在的颗粒较少时，颗 粒不太可能发生碰撞，从而降低了形成聚集产物的可能性。该结果的 原因可能是，对于数目较小的颗粒，每个颗粒上表面活性剂分子的数 目较高，从而减少了聚集的发生机率。
样品编号     1     2     3     4     5     6 胶体体积(mL)     1.08     1.62     2.16     3.24     4.32     5.40 悬浮液中的 SiO2(g)     0.395     0.593     0.791     1.186     1.581     1.976
悬浮液中的H2O (g)     0.922     1.384     1.845     2.767     3.689     4.612 H2O(mmol)     51.24     76.86     102.48     153.72     204.96     256.20 [H2O]/[NP-5]摩 尔比     5.12     7.69     10.25     15.37     20.50     25.62 产物(g)     0.483     0.693     0.956     1.466     1.800     2.298 吸收的材料(g)     0.088     0.100     0.165     0.280     0.219     0.322 残余物/SiO2(wt.％)     22.3     16.9     20.9     23.6     13.9     16.3
密度(Ludox SM-30)＝1.22g/cm3
Ludox SM-30中的SiO2＝30wt.％
使用10mmol NP-5来制备微乳液。
从图7(对该方法的颗粒收率与初始加入的二氧化硅量作图)中， 可以看出Ludox SM-30(二氧化硅：30wt.％；密度：1.22g/cm3)的产 物收率稍高于初始加入的纯二氧化硅。额外的质量可能是吸收的表面 活性剂和水。胶体二氧化硅的浓度高似乎引起较大的重量差异，可能 是由于吸收了较多的表面活性剂。
胶体pH的影响：
图8显示了Ludox和Bindzil(pH相对于酸加入量)的滴定曲线。 随着加入0.5mol/L硝酸，Ludox SM-30(30mL)和Bindzil 30/360(30 mL)的pH逐渐降低至大约5.5。两个系统均在5.5-2.0的pH范围内急 剧下降，之后pH再次缓慢降。相反，当Ludox SM-30用12mol/L乙 酸滴定时，pH变化显示出两种下降速率，它们之间的转变发生在pH5 附近。在滴定过程(大约2小时)中上述系统任意一个都没有发生凝 胶化。但是当Ludox SM-30用2mol/L硝酸滴定时，当加入4mmol HNO3 时，胶体发生凝胶化。该点的pH为6.65。这可能是由胶体的浓度影响 引起的。
图9显示了用硝酸滴定的Ludox SM-30形成的二氧化硅产物的 SEM和TEM图像。当pH高于9时，产生球形颗粒。低于pH9时， 胶体二氧化硅凝胶化，但不形成球形颗粒，如图9d和e所示。
相反，如果使用乙酸使Ludox SM-30的pH降低，则如果pH高于 9，大多数颗粒呈球形(图10a和b)。这与硝酸滴定的结果一致。这 可能是因为胶体的聚集非常强烈地依赖于介质的pH，但不依赖于用于 降低pH的酸的性质。在pH8.57时产生不规则形的产物(图10c)。在 pH为：7.754、6.707、5.869和5.378时没有固体产物产生。
胶体类型的影响：
采用通常的合成步骤，然后加入1.62ml各种胶体二氧化硅，结果 列于下表。相应的SEM/TEM图像显示于图11。Ludox SM-30、Ludox HS-40、Bindzil 30/360、Bindzil 15/500、Snowtex 40和Snowtex UP形 成微颗粒，而Ludox TM-50、Snowtex 50和Snowtex 20L产生聚集的产 物(约500nm球形颗粒)。Snowtex ZL形成聚集产物(最初的胶体约 70-100nm)。Snowtex N没有凝胶化，这表明供应商已经将一些表面活 性剂掺入进胶体悬浮液中。
胶体特性和不同胶体二氧化硅的相应产物
 SiO2(wt.％)  尺寸(nm)  pH 产物 Ludox SM-30  30  7  9.9 微粒 Ludox HS-40  40  12  9.7 微粒 Ludox TM-50  50  22  8.9 聚集的球体 Bindzil 30/360  30  9  10 微粒 Bindzil 15/500  15  6  10 微粒 Snowtex 40  40  10-20  9.0-10.5 微粒 Snowtex 50  50  20-30  8.5-9.5 聚集的球体 Snowtex N  20  10-20  9-10 没有凝胶化 Snowtex UP  20  9-15/40-300  9-10.5 微粒 Snowtex ZL  40  70-100  9-10 聚集 Snowtex 20L  20  40-50  9.5-11 聚集的球体 硅酸钠 27  Na2Si3O7  ～14wt.％NaOH 快速凝胶化
粒径分布：
所产生颗粒的粒径分布可以通过光散射(例如使用Malvern Mastersizer 2000)测定。使用典型合成(Ludox SM-30用量的范围从 1.62mL至5.40mL)产生的二氧化硅微粒的粒径分布显示在图12中。 大体上，从30nm至100μm出现了三个离散的峰。最小的峰集中在130 nm左右，似乎不依赖于胶体的浓度。随着Ludox浓度的增加，中间 的峰从1.45μm略增加至2.2μm。最大的峰(1-100μm)从1.62mL Ludox 的17.4μm变化至23μm(3.24mL Ludox)、26μm(4.32mL Ludox) 和5.40mL Ludox的30μm。所用胶体悬浮液体积的增加导致粒径增加， 因为水和表面活性剂的比例增加，从而使水滴大小增加。
为了减少粒径分布，可以向体施加加更多的能量。例如，可以通 过更快速地搅拌或切变混合来完成。图13显示了使用实施例3所述的 方法(不加入酶)，不使用搅拌来混合乳液，而是在操作的第一个小时 中使用超声波探头增加系统的搅动，从Bindzil 30/360制备的颗粒获得 的粒径分布。超声波探头以1秒脉冲/2秒(50％占空比)进行操作。1 小时后，从乳液中取出探头，开始搅拌，持续合成剩余5个小时。粒 径很明显从典型的大小降低(显示于图12)，集中在1微米左右。存在 有小组分的大颗粒。由于增加了能量输入，在1小时超声处理后，系 统的温度明显增加至60℃。显然这不适合大多数蛋白质，但通过调节 超声波探头的占空比或通过使用冰浴降低温度，可以进行改良。
蛋白质的包封
某些蛋白质可以在很高的pH下进行包封，这取决于其pKa。碱性 磷酸酶的pKa为9.5，包封该酶并保留全部酶活性的方法见实施例1(参 见下文)。但大多数酶在中性pH左右活性最佳。如上所述，在加入至 表面活性剂溶液之前，可以降低胶体前体的pH，在降低至pH＝7.5的 胶体中包封α-糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性磷酸酶的方法见实施 例2(参见下文)。但本发明人已经发现，通过将含水前体加入至表面 活性剂溶液中形成乳液，然后加入酸将pH降低至合适的数值，随后加 入生物学实体，可以形成掺杂颗粒。尽管在pH10下加入后迅速形成 颗粒，但本发明人假设，微粒在形成后不会立即是十分密集的，因此 当蛋白质或其它生物学实体在乳液的水滴中老化时，能够融合进这些 颗粒中。一般，水滴中的pH在加入蛋白质之前已经降低至6.0。使用 该方法，已经包封了不同大小的酶、α-糜蛋白酶(～25kDa)、枯草杆菌 蛋白酶(～27kDa)、碱性磷酸酶(～160kDa)和尿素酶(～480kDa)。 用于大多数这种包封作用的表面活性剂(即在乳液内部pH降低至6.0) 为Span20，尽管也已经使用了AOT，这两种情况下均形成类似的颗粒。 使用该方法用Span 20形成的颗粒的典型SEM图像显示于图14。
调节α-糜蛋白酶、碱性磷酸酶和尿素酶从这些颗粒中释放的速率 的机制在实施例3中进行了研究(见下)，其中使用了不同尺寸的胶体前 体来影响颗粒的平均孔径。实施例4(见下)也描述了使用不同尺寸的胶 体溶液来控制释放的枯草杆菌蛋白酶的量。铁蛋白在微颗粒中的分布 在实施例5中进行了研究(见下)，使用横截面TEM来描绘铁蛋白分子 的定位。包封方法对枯草杆菌蛋白酶活性的影响在实施例6中进行了 研究(见下)。枯草杆菌蛋白酶和碱性磷酸酶的储存稳定性研究在实施例 7中加以描述(见下)。酶在可选的陶瓷(即，除二氧化硅之外)基质中 的包封在实施例8中加以描述(见下)。
实施例1.pH＝9.7时碱性磷酸酶的包封
将0.5mL 0.5mol/L硝酸加入至10mL Bindzil 30/360中，得到pH 为9.7。将碱性磷酸酶(8mg，溶解在400μl pH＝9.5的缓冲液中)与 2.5mL上述胶体二氧化硅悬浮液混合，然后加入至Span 20溶液(0.2 mol/L)/50mL煤油中并搅拌。搅拌大约10分钟后，通过以2000rpm 离心3分钟分离颗粒。得到的颗粒用煤油洗涤一次，然后用己烷洗涤 三次(每次洗涤后，用离心机从固体分离上清液)，然后在流动氮气下 在室温下干燥，然后储存在冰箱中。
碱性磷酸酶以大约0.6wt.％蛋白的负载量进行包封(见下面的蛋白 质含量测定法)。干燥之后立即测定酶活性，发现实际上高于溶液中的 游离酶。这表明所述的包封方法不会使蛋白变性至任意显著程度。
图15显示了如上所述在pH＝9.7下包封的碱性磷酸酶的释放速率。
蛋白质含量测定
微粒的蛋白质含量和从微粒释放蛋白的定量使用二金鸡纳酸 (Bicinchoninic Acid)测定法如下进行测定：
标准测定：
试剂A：二金鸡纳酸钠(0.1g)、Na2CO3.2H2O(2g)、酒石酸钠(二水 化物)(0.16g)、NaOH(0.4g)、NaHCO3(0.95g)，补足至100mL，如果 需要，用NaOH将pH调节至11.25。
试剂B：CuSO4.5H2O(0.4g)补足至10mL。
标准工作试剂(SWR)＝100体积试剂A+2体积试剂B。
方法：
微粒中蛋白质的定量：
含蛋白质的微粒(20mg)悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS溶液)(400 μL)中，悬浮液超声处理5分钟。取悬浮液(50μL)样品三份，与SWR(1 mL)合并，在60℃下孵育60分钟。样品在3000rpm下离心5秒，测定 溶液在562nm处的吸光度，并与一系列浓度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0mg/mL的标准品对比。
从微粒中释放的蛋白质的定量：
将含蛋白质的微粒(100mg)悬浮在PBS溶液(2mL)中，并搅动。 在所需的时间点处，将悬浮液离心，取样(50μL)。每个时间点的样品 与SWR(1mL)合并，在60℃下孵育60分钟。测定样品在562nm处的 吸光度，并与一系列浓度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/mL的标准 品对比。
实施例2.在pH＝7.5(乳液内部降低至pH＝6)时α-糜蛋白酶、枯草杆 菌蛋白酶和碱性磷酸酶的包封
α-糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性磷酸酶使用下列方法包封在由 Bindzil 30/360形成的颗粒中：将4.6g Span20溶解在30ml煤油中并搅 拌。将1.25ml Bindzil 30/360与158ml 1M HCl混合，将pH从10降低 至7.5，将4mg蛋白质溶解在200μl水中，然后分散至Bindzil溶液中 并搅拌。然后向乳液中加入含蛋白质的前体溶液。搅拌几分钟后，加 入72μl 1M HCl以进一步将pH降低至6.0。最后，向乳液中加入175μl 盐溶液2(其组成见实施例6)。6小时搅拌后，将乳液离心，固体用煤 油洗涤一次，然后用己烷洗涤两次，然后干燥过夜。
在枯草杆菌蛋白酶和α-糜蛋白酶的情形中，将100mg样品分散在 2ml PBS中，在碱性磷酸酶的情形中分散在乙醇胺缓冲液(pH＝9.5)中。 在规定的时间点，样品在10,000rpm下旋转10秒，取50μl。如实施 例1中所述测定蛋白质含量，计算释放曲线。图16显示了在8小时内 α-糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性磷酸酶的释放。迅速的释放(10 分钟后几乎全部释放)似乎是由于使用该方法(见下面实施例4的讨论) 形成了大的孔径(8.7nm)。
实施例3.pH＝6.0时α-糜蛋白酶、碱性磷酸酶和尿素酶的包封
α-糜蛋白酶、碱性磷酸酶和尿素酶使用下列方法包封在由Bindzil 30/360形成的颗粒中：
描述颗粒合成的流程图显示在图17中。如实施例1中所述测定释 放速率。将Span 20(18g)/煤油(120mL)溶液与Bindzil 30/360胶体二氧 化硅(3.0mL；pH10)合并，以大约500rpm搅拌，产生了白色乳液。在 该情况下，在加入到乳液中之前将生物分子(蛋白质)溶解在盐溶液中。 加入生物分子和盐(1.69ml)的溶液，用盐酸(0.48mL，1M)调节pH，得到 pH约6的白色乳液。搅拌6小时后，通过在2000rpm下离心分离颗粒， 进一步用煤油洗涤，然后用异丙醇洗涤两次，然后在氮气流中干燥。 得到的粉末包封有生物分子。
为了增加二氧化硅中孔的大小，采用Bindzil 30/360和Snowtex ZL 的混合物。Snowtex ZL由70-100nm的胶体颗粒组成，比Bindzil 30/360 中的9ml胶体颗粒大的多。α-糜蛋白酶、碱性磷酸酶和尿素酶通过下 列方法包封在由Bindzil 30/360和Snowtex ZL的混合物形成的颗粒中：
将18g Span20溶解在120mL煤油中并搅拌。将1.5mL Bindzil 30/360与1.5mL Snowtex-ZL混合，并加入至乳液中并搅拌。将30mg 蛋白质溶解在0.31mL 1M HCl和0.422ml浓缩盐溶液(浓缩1/4)的溶液 中，并加入至乳液中。6小时后，通过离心去除固体，用煤油和异丙醇 洗涤，干燥过夜。如实施例1所述测定释放速率，并显示在图18中。 在此没有再现尿素酶从Bindzil 30/360/Snowtex ZL混合物中的释放，因 为吸收溶液混浊干扰了蛋白质的定量。α-糜蛋白酶和碱性磷酸酶从 Bindzil 30/360/Snowtex ZL颗粒中的释放增加(平均DFT孔径为6.7nm， 相比Bindzil 30/360微粒为5.5nm)，表明较大的孔对酶释放速率有显著 的影响。
采用实施例4中概括的方法，使用Bindzil 30/360和Bindzil 15/500 一起进行颗粒的制备，但不加入盐溶液。产物主要由球形颗粒组成， 小部分成分是非球形物质。粒径和孔隙度的测定表明微粒的尺寸和内 部微观结构实际上与使用盐溶液制备的颗粒是相同的。使用和不使用 盐制备的颗粒的比较表明加入盐有两种主要的优势。第一是降低了非 球形材料的比例。第二是加入盐得到的包封蛋白收率较高。在碱性磷 酸酶作为生物学实体的情况下中，略去加入盐溶液的步骤导致蛋白质 负载量减少40％(对于相同初始量的含水胶体和酶溶液，从1.5wt％降 低至1.1wt％)。当凝胶化包括较大的一级颗粒(10-20nm)的胶体溶液如 Snowtex-40时，盐溶液更为重要一些。但尤其是在盐的存在可能引起 问题的情况下，它可以省略掉。
200mL盐溶液的组成(对于浓缩盐溶液是50mL)：
0.1g KH2PO4
0.2g NH4Cl
0.21g Na2SO4
0.223g CaCl2
1.2g乳酸钠
0.06g柠檬酸钠
4.1g NaCl
1.973g MgCl2.6H2O
实施例43.在pH＝6.0时枯草杆菌蛋白酶的包封，孔径影响的确定
枯草杆菌蛋白酶从使用Bindzil 30/360制备的颗粒中释放的速率的 测定表明，大多数蛋白质的释放出现在粉末浸入0.02M PBS溶液中的 1小时内。减少孔径的一种可能的方法是使用较小的胶体如二氧化硅前 体。Bindzil 30/350包括9nm二氧化硅微粒，在溶液中为30wt％。Bindzil 15/500包括6nm二氧化硅微粒，在溶液中为15wt％。需要将pH降低 至6.0所需的酸量有很小的差异(0.115mL 1M HCl/mL Bindzil 15/500， 相比0.183mL/mL Bindzil 30/360)。该产物的孔隙度讨论如下。
另外可选地，可以使用硅酸钠溶液作为前体替代胶体二氧化硅。 首先制备含有9g Span20、60mL煤油和1mL 4M HCl的乳液，产生球 形颗粒。加入1ml硅酸钠溶液(27％)，形成大小约1-100微米的球形 颗粒。但该制备方法因遇到极端pH，不适合蛋白质的包封。硅酸钠溶 液pH的降低立即引起沉淀。为了降低pH，需要对硅酸钠溶液加以稀 释，并使用离子交换树脂降低钠含量。
去离子化硅酸盐溶液的制备实施例：
将33mL硅酸钠溶液(27％)用蒸馏水稀释至99mL。加入34.5g Duolite阳离子交换树脂(H+型)并搅拌，使pH降低至11.45。通过过滤 去掉duolite树脂，加入31.16g新鲜树脂将pH降低至9.8。
将20g Span 20溶解在135mL煤油中并搅拌。加入6ml pH＝9.8 的硅酸盐溶液，并搅拌几分钟，以分散表面活性剂混合物。加入1mL 1 M HCl，搅拌乳液。6小时后，通过离心去掉固体，使用煤油和乙醇(2×) 洗涤。冻干样品的平均孔径与其它胶体前体进行比较，列在下表中。
枯草杆菌蛋白酶的包封：
将4.5g Span 20溶解在30mL煤油中，并搅拌溶解。向混合物中 加入1.25mL Bindzil 15/500或Bindzil 30/360，形成乳液。乳液用1M HCl (Bindzil 15/500为144μL，Bindzil 30/360为198μL)酸化，然后加入10 mg枯草杆菌蛋白酶/200μl水和98μl盐溶液4。将反应搅拌5小时。 通过离心分离颗粒，用煤油洗涤，用环己烷洗涤两次，在氮气流下干 燥，得到淡白色粉末。
通过下面的方法将枯草杆菌蛋白酶包封在硅酸盐颗粒中：
将18g Span 20溶解在120mL煤油中，并搅拌。向表面活性剂溶 液中加入8mg枯草杆菌蛋白酶/200μl水的溶液，然后加入4ml如上 所述制备的去离子化硅酸盐。加入0.67mL 1M HCl，将pH降低至7.2。 溶液搅拌6小时，然后通过离心去掉固体。颗粒用煤油洗涤一次，然 后用己烷洗涤两次(每次洗涤后离心去除上清液)，干燥过夜。
图19显示了枯草杆菌蛋白酶从Bindzil 30/360、Bindzil 15/500和 如上所述合成的硅酸盐微粒中释放的释放曲线图。释放曲线是类似的 形式，但释放的总百分比根据颗粒的孔径而发生变化。图20显示了在 本实施例中使用的三种不同样品的孔径分布。孔径越小，从微粒中释 放的蛋白质的总百分比越低。所使用的典型前体的平均孔径列于下表。
微粒孔隙度
使用密度泛函理论(DFT)对氮气吸收数据进行建模，该理论描述了 气体吸收在分子水平上的行为，适合对很宽范围的孔径进行建模。假 设为圆柱形孔。下面列举了多种二氧化硅前体的平均孔径。平均孔径 似乎由初始胶体颗粒的大小和胶凝化pH决定。除非另外指明，制备中 使用的表面活性剂均为Span20。
二氧化硅前体   一级颗粒尺寸   (nm)    平均DFT孔径    (nm) 硅酸盐溶液(9％)   ------    2.1 Bindzil 15/500-乳液中降低至pH＝6.0   6    2.7 Bindzil 30/360-乳液中降低至pH＝6.0   9    5.5 Bindzil 30/360-乳液中降低至pH＝6.0，表面 活性剂＝AOT   9    5.8
Bindzil 30/360-不工作时降低至pH＝7.5，然 后乳液中降低至pH＝6.0     9     8.7 Bindzil 30/360-乳液中pH＝6.0     9     5.9 Ludox SM-30-乳液中降低至pH＝6.0     7     6.2 Snowtex-40-液中降低至pH＝6.0     (10-20)     7.1 Bindzil 30/360(60％)+Snowtex ST-50(40％)- 在乳液中降低至pH＝6.0     9+(20-30)     6.2 Bindzil 30/360(50％)+Snowtex-ZL(50％)-乳液 中降低至pH＝6.0     9+(70-100)     6.7 Snowtex ZL*-乳液中降低至pH＝6.0     70-100     45
*在加入聚乙烯亚胺溶液时胶体凝胶化
实施例5.铁蛋白在微粒粒子中的分布
本发明人考虑到蛋白质有可能倾向于保留在乳液的界面区而不是 在水滴的内部，其原因是蛋白质分子中存在疏水区。这种取向效应被 认为导致蛋白质被包封在形成于乳液液滴内部的微粒的外壳中。为了 研究包封蛋白在微粒体内的分布，将二氧化硅微粒用铁蛋白掺杂，铁 蛋白含有铁核心，因此应该很容易地通过透射电子显微镜(TEM)检 测到。
制备细节：将Span 20(1.8g)溶解在煤油(12mL)中。将铁蛋白溶液 (～100mg/mL，126μL)与Bindzil 30/360(300μL)混合。然后将该混合物 逐滴加入到表面活性剂溶液中，并以500rpm搅拌。将HCl(1M，480μL) 和浓缩盐溶液混合。将91μL此溶液加入至乳液中。将该乳液搅拌2.5 小时，在此时反应容器底部出现了固体物质。将混合物离心(2000rpm， 3分钟)，固体用煤油洗涤一次，用异丙醇洗涤两次。在流动氮气下将 固体物质干燥。最终的粉末是“赭色”的，表明成功地将铁蛋白包封 在颗粒内。
颗粒中的蛋白质分布谱
将颗粒包埋到树脂中，使用30°Diatome金刚钻刀在Leica Ultracut UCT超薄切片机上切取80nm薄切片，并置于涂有碳的多孔铜网上。 图21显示了颗粒的典型扫描图，中央的颗粒上明显有一些刀痕。通过 扫描TEM(STEM)能量分散X-线光谱仪(EDX)光谱成像对部分二氧化 硅颗粒横截面上的Fe分布进行作图。该技术涉及在STEM图像的每个 像素上收集完整的EDX光谱，随后对每个光谱进行处理，去掉本底 X-线。通过在对应于每个目标元素的光谱区域中对X-线强度作图，得 到元素分布图。Fe分布图表明铁蛋白均匀地分布在被考察的区域中， 表明蛋白质没有定向在液滴内，仍然靠近表面活性剂/溶剂界面。
图22显示了对应于STEM暗视野成像(DFI)图像(左上)较大方框的 50像素×50像素区域中的C、Fe、Si和O分布图。画面下方中显示的 光谱清楚地显示了STEM DFI中小十字位置处由铁蛋白产生的Fe-K X- 线峰。
图23显示了对应于STEM DFI图像(左上)方框的75像素×46像素 区域中C、Fe、Si和O的分布图。画面下方显示的光谱清楚地显示了 STEM DFI中小十字位置处由铁蛋白产生的Fe-K X-线峰。Fe的分布图 表明铁蛋白均匀地分布在被分析的区域中。
图24显示了没有包封铁蛋白的对照样品的STEM EDX光谱图像， 显示在微球体的一个切片中C、Fe、Si和O的分布。如所预期的那样， 没有检测到Fe。
实施例6.包封过程中使用的各种组分对α-糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶 和碱性磷酸酶活性的影响
很明显释放后的蛋白质活性是本发明的颗粒应用中的一个重要问 题。为了鉴定全部测定物中哪些组分对活性的损失起作用，使用α-糜 蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶进行一些检测。这些检测中所用的各种盐溶 液的组成见下。所有溶液均用去离子水补足至体积50ml。
盐溶液1  盐溶液2  盐溶液4 0.1g KH2PO4  0.1g KH2PO4  0.1g KH2PO4 6.46g NaCl  6.69g NaCl  7.02g CaCl2 0.233g CaCl2  1.3g CaCl2 1.97g MgCl2
图25显示了包封方法的各种组分对α-糜蛋白酶活性的作用。加入 到Bindzil中导致酶完全变性。但这最可能是由于Bindzil的pH高(大 约10)引起的。除了pH10下的Bindzil外，最有害的化学品似乎是用 于洗涤颗粒的异丙醇。盐溶液似乎对酶活性的影响也是可变的。
图26显示了相同组分/化学品加上一些其它洗涤溶剂对枯草杆菌 蛋白酶的影响。对枯草杆菌蛋白酶活性最有害的两种化学环境似乎是 酸性条件(pH大约为2)和盐溶液4。酸性条件(＜pH6)已知对枯草杆菌 蛋白酶是有害的。盐溶液4，浓缩的钙盐溶液，证明也是有害的。如上 所见，有时用于洗涤微粒的两种化学品乙醇和异丙醇似乎对酶活性均 极为有害。发现己烷和环己烷对酶的活性没有有害影响。
碱性磷酸酶，pKa为9.5，在较高的pH下明显比大多数酶更稳定。 该酶用于在pH大约10下检测对包封活性的影响，并将此与在pH6下 包封的酶的活性相关联。图27显示了如下过程之后碱性磷酸酶的释放 后活性：a)图1 7所述的pH＝6.0时的包封方法，和b)相同的方法， 不使用盐。在存在或不存在盐时，该方法均类似地引起大约50％的活 性损失。相反，在非常接近该酶pKa的pH9.7下(如实施例1中所述)， 似乎增加了其催化作用。这表明在pH为大约10时的包封可以用于能 够经受或甚至优选pH超过大约9的系统。
从根据本发明的颗粒释放的酶的进一步动力学研究在下文进行描 述。图28显示了与标准品(酶溶液)相比三个样品的酶促反应的速率。 在该图中，线的倾斜度代表酶活性，表示为每单位酶、每单位时间形 成的底物单位数目。曲线a)和b)代表包封在微粒内的枯草杆菌蛋白酶， 其中羟丙基纤维素(HPC)代替盐溶液分别加入至浓度为2mg/mL的 Bindzil和5mg/mL的Bindzil。用HPC代替盐降低了反应速率，表明 HPC的存在降低了枯草杆菌蛋白酶的活性。(见下面的合成细节)。当 HPC浓度增加时，反应速率下降。如下所述，曲线c)代表了包封在 Bindzil 30/360和硅酸钠的1∶1(w/w)混合物中的枯草杆菌蛋白酶。可见 这些颗粒显示出与标准品相似的活性。
合成细节：
将HPC以两种不同的浓度溶解在Bindzil 30/360中，制备含HPC 样品的前体，所述的两种浓度分别对应每mL Bindzil 30/360 2mg和5 mg HPC。在第三个样品的情况下，如实施例4中所述，前体由0.625mL Bindzil 30/360和1.875mL去离子化硅酸盐溶液的混合物组成。
对于每种样品，将9g Span20溶解在60ml煤油中。加入2.5ml 上述的前体溶液，并搅拌。通过加入0.46mL 1M HCl将乳液内部的 pH降低至6.0。然后加入含8mg枯草杆菌蛋白酶/200μl水的溶液，然 后加入0.35mL盐溶液1(如上所述)。使用离心分离颗粒，在干燥之前 用煤油和己烷洗涤。
实施例7.包封的枯草杆菌蛋白酶和碱性磷酸酶的储存稳定性
包封在微粒中的酶的储存稳定性是一个重要的考虑因素。大多数 蛋白质需要在低于0℃的温度下进行长期储存。使用在下述方法所形成 微粒的结构耐久性在冷冻-复温过程中进行考察。开始认为在冷冻过程 中颗粒的含水量膨胀可以导致颗粒破裂或破碎的速率增加，降低其长 期储存的耐久性。图29显示了(a)储存在室温下的样品和(b)＜0℃ 下储存的样品的SEM显微照片。图29中没有证据显示不同储存条件 之间存在微粒破裂或破碎程度的增加。
尽管整个微粒的结构整体性非常重要，但也考察了在微粒基质内 储存的蛋白质的耐久性。图30显示了在大约4℃和小于0℃下储存的 枯草杆菌蛋白酶的酶活性，与颗粒合成后立即获得的样品的活性进行 比较。可以看出，在所显示的储存期内酶活性减少了大约80-90％。但 在4℃和低于0℃之间没有显著差异。
枯草杆菌蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，在许多种化学环境中都是 坚固且稳定的。但由于是蛋白酶对自身的破坏性，从而降低了其长期 储存稳定性。很明显，蛋白质可以在冰箱内长时间保持冻干状态，而 相同条件下微粒内部的酶活性明显降低。这表明微粒内的环境基本上 是准含水性的。这种推测通过制备下述两种掺有枯草杆菌蛋白酶的样 品并冻干其一进行检测。然后两个样品都储存在冰箱中。储存两天后， 冻干样品的活性比未冻干样品高三倍，且在储存9天之后基本上没有 变化。这证实，尽管材料看上去是干燥固体，但在蛋白酶的情况下， 存在的水量可能是有问题的，样品在储存之前应该被冻干。相反，从 图31可以看出，碱性磷酸酶(合成细节见实施例1)的活性在储存两周 后未受显著影响，在所示的时间内大体上显示活性仅有很小的损失。
合成细节：
将18g Span 20溶解在120mL煤油中，并搅拌。加入5mL Bindzil 30/360，并搅拌。加入0.915mL 1M HCl，将pH降低至6.0。向乳液中 加入16mg枯草杆菌蛋白酶/400μl水，然后加入0.39mL盐溶液1。 使用离心分离颗粒，用煤油和己烷洗涤，然后干燥。
实施例8.另外可选的用于蛋白质包封的基质
研究了两种可选的陶瓷基质。首先，如下所述由氧化铝溶胶制备 氧化铝。使用10∶1的水∶醇盐比和75℃的反应温度，在水中使仲丁醇铝 水解，制备氧化铝溶胶。混合物搅拌30分钟，将温度升高至81℃，以 去除产生的醇。然后以0.07∶1的H+∶醇盐摩尔比例加入硝酸，溶液在 81℃下搅拌1小时。然后将混合物密封，并在80℃下储存，以完成胶 溶作用。光散射表明平均胶体尺寸为9nm。溶胶通过旋转蒸发浓缩至 氧化铝浓度为10wt％。
将9g Span20溶解在60mL煤油中。将2mL 10wt％氧化铝溶胶加 入至Span20/煤油混合物中，以500rpm搅拌。加入从含有0.1g KH2PO4、 6.69g NaCl和1.3g CaCl2的50mL水溶液中取出的0.05mL等分试样。 持续搅拌5小时，然后将混合物在2000rpm下离心，去除固体，固体 用煤油洗涤一次，然后用乙醇洗涤两次，然后干燥。光学显微图像(图 32)表明微粒很大(平均粒径为大约60微米)，样品含有明显部分的干燥 和处理过程中由较大球体破碎形成的非球形碎片。氧化铝颗粒也有些 奇形的，可能是由于氧化铝凝胶较软的性质所致。由于氧化铝颗粒受 损，对第二种陶瓷钛酸锆(已知形成相对较硬的凝胶)进行了研究。
使用四丁氧基锆(ZBT)和四丁氧基钛(TBT)的1∶1(摩尔)混合物制备 钛酸锆溶胶。加入乙酸(5∶1(摩尔)乙酸∶(Ti+Zr))以延缓ZBT和TBT的 水解，然后加入水(25∶1(摩尔)H2O∶(Ti+Zr))。PCS测定表明溶胶由28 nm的胶体颗粒组成。溶胶的pH为3.0。将2.5mL上述溶胶加入至9g Span 20/60mL煤油的溶液中。搅拌1小时后，通过离心去除固体，使 用煤油和乙醇洗涤。通过光学显微镜观察球形微粒。图33显示了典型 的SEM图像。光散射测定表明微粒的尺寸为大约1-100微米，平均尺 寸为大约26微米(见图34)。表面积和孔隙度测定表明材料是微孔的， 孔径分布中的两个峰在1.1和2.0nm。
作为将生物分子包封在钛酸锆微粒中的一个例子，选择菠萝蛋白 酶(来源于菠萝的一种蛋白酶)，因为其大小相对很小(～28kDa)，且在酸 性条件下稳定。释放曲线显示在图35中。
合成细节：将9g Span 20溶解在60ml煤油中。将8mg菠萝蛋白 酶部分溶解在200μl水中。对样品进行离心，除去未溶解的蛋白质， 然后加入2.5mL如上所述制备的钛酸锆溶胶。溶胶/蛋白质混合物分散 并搅拌在表面活性剂溶液中，搅拌6小时。通过离心去除固体，用煤 油洗涤一次，用己烷洗涤两次，每次洗涤后通过离心去除上清液。
本发明的优势
通过与聚合系统的比较，如本发明中所述使用陶瓷包封剂提供了 如下优势：
●制造使用了对于蛋白质和其它生物学实体来说相对良性的条 件，从而在释放时保持了很高的蛋白质活性(如实施例6中所证 明)。在合成过程中仅与相对无害的长链有机物有较少的接触， 包封基质完全是无机的。颗粒的合成和生物学实体的包封可以 在环境温度下进行。
●释放机制是通过大小可控的内部孔隙进行扩散。扩散速率较少 依赖于局部化学环境(即，随不同环境变化的可能性较小)。
●金属氧化物本身是亲水的，因此在血液中应该更加稳定。可能 有新的生物分布作用。
●从含水胶体产生的凝胶本身便提供了准含水环境，得到的颗粒 可以含有～10％wt的水。如实施例7所证明，这为一些生物学 物质提高储存稳定性提供了可能性。
另外，陶瓷系统的固有特征使其引人注目地用于蛋白质药物递送， 如下：
●陶瓷微粒在化学和生物学上是惰性的，不会与聚合物易感的溶 剂/化学品发生反应。它们甚至在强酸性条件(例如，胃)下也是 稳定的。
●它们具有热稳定性，不易燃。
●二氧化硅和其它轻金属氧化物本身是生物相容的，一些甚至在 体内是天然存在的。
●颗粒的合成是“生物分子友好的”，二氧化硅凝胶前体对蛋白 质是无害的。
●陶瓷颗粒具有亲水的表面，提高了在血液中的稳定性。它们可 以提供新的生物分布特性。
●陶瓷颗粒是机械坚硬的，不容易被外力损坏。
●可以对颗粒的大小和释放速率加以独立的控制。这些参数可以 良好的可重复性被引入。
●所有合成均可在环境温度下进行。
●相同的包封通法可以用于所有蛋白质。
●该方法使用相对廉价的成分，这些成分可以工业用量购得。
●该方法仅需要很低的资金投入。
●可以对颗粒表面进行官能化。这便有可能进行蛋白质的靶向递 送。
开发本发明方法的目的是将Barbe和Bartlett的WO 01/62232(2001) 中所详述的可控释放技术从释放小分子如药物延伸至释放较大的生物 分子，如蛋白质(包括酶)、多肽、和DNA/RNA片段。该方法基于使用 溶剂/表面活性剂乳液系统以形成球形二氧化硅颗粒，但使用了更适于 蛋白质和其他生物学实体的化学品。可用于本发明的一种合适的前体 材料是市售的二氧化硅胶体，或胶体混合物，可任选地加入硅酸钠溶 液以进一步控制颗粒孔径。使用水基二氧化硅前体有助于克服两个问 题。首先，蛋白质一般会被硅醇盐水解中产生的醇变性，通过使用本 发明的系统可以避免这个问题。第二，应用含水二氧化硅凝胶前体得 到了中孔产物，其具有大小合适的孔，以释放蛋白质，其孔大小的范 围为1-15nm。尽管水基二氧化硅前体由于成本低、易于制备是优选的， 但如果需要可以将其替换(例如，为保护碱中的有效负载)成其它的水基 陶瓷前体，如钛酸盐、锆酸盐或铝酸盐。
本发明所述技术的可能应用包括：
●蛋白质医学/药物递送(蛋白质药物递送、皮肤移植、骨再生、 基因治疗)
●生物技术应用，如酶(生物催化剂)的可控释放，例如在洗涤剂 中、淀粉水解/果糖生产、果汁制造、酿造、纺织品、动物饲料、 烘烤、纸浆和造纸生产、皮革工业、食品生产(例如，乳酪)。
●酶的特殊工业应用，例如在生物传感器和其它分析领域、个人 护理产品(例如，牙膏、隐形眼镜清洗)、高纯化学品制造(例如， 手性纯氨基酸、稀有糖类、半合成青霉素)、DNA-技术(遗传工 程)。
●化妆品、药物化妆品
●食品、营养品
●兽医应用