改进的微生物燃料电池
专利汇可以提供改进的微生物燃料电池专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供具有改变的产电功效的转基因 微 生物 ，包含这种微生物的 生物膜 以及包含这种微生物的微生物 燃料 电池 (产电 生物反应器 )。所述 微 生物燃料 电池 可作为检测器、过滤装置和 传感器 操作。，下面是改进的微生物燃料电池专利的具体信息内容。
1.一种用分离的核酸分子稳定转化的转基因铜绿假单胞菌细胞，所述分离的核酸分子使选自包含pilT(SEQ ID NO:1)、pilA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQ ID NO:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、lasI(SEQ IDNO:5)、lasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和fliC(SEQ ID NO:8)的组的所关注内源核苷酸序列中断，其中所述微生物细胞呈现降低的所述所关注内源核苷酸序列表达并且所述细胞呈现改变的产电功效。
2.根据权利要求1所述的转基因细胞，其中至少2个所关注内源核苷酸序列被中断并且其中所述中断的内源核苷酸序列选自包含以下的组：pilT(SEQ ID NO:1)、pilA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQ IDNO:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、lasI(SEQ ID NO:5)、lasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和fliC(SEQ ED NO:8)。
3.根据权利要求2所述的转基因细胞，其中所述至少两个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注双核苷酸序列的组：pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)；bdlA(SEQ ID NO:4)nirS(SEQ ID NO:3)；bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)；nirS(SEQ ID NO:3)pilT(SEQ ID NO:1)；nirS(SEQ ID NO:3)lasI(SEQ ID NO:5)；lasI(SEQ ID NO:5)pilT(SEQ ID NO:1)；ftsZ(SEQ ID NO:7)pilT(SEQ IDNO:1)；ftsZ(SEQ ID NO:7)bdlA(SEQ ID NO:4)；
ftsZ(SEQ ID NO:7)nirS(SEQ ID NO:3)；和ftsZ(SEQ ID NO:7)lasI(SEQ ID NO:5)。
4.根据权利要求2所述的转基因细胞，其中至少三个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少三个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注三核苷酸序列的组：
pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)ftsZ(SEQ ID NO:7)；bdlA(SEQ ID NO:4)nirS(SEQ ID NO:3)ftsZ(SEQ ID NO:7)；bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)ftsZ(SEQ ID NO:7)；
nirS(SEQ ID NO:3)pilT(SEQ ID NO:1)ftsZ(SEQ IDNO:7)；nirS(SEQ ID NO:3)lasI(SEQ ID NO:5)ftsZ(SEQ ID NO:7)；lasI(SEQ ID NO:5)pilT(SEQ ID NO:1)ftsZ(SEQ ID NO:7)；
pilT(SEQID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)nirS(SEQ ID NO:3)；pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)；和bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)。
5.根据权利要求2所述的转基因细胞，其中至少四个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少四个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注四核苷酸序列的组：
pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)nirS(SEQ ID NO:3)ftsZ(SEQ ID NO:7)；pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)ftsZ(SEQ ID NO:7)；bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)ftsZ(SEQ IDNO:7)和pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)。
6.根据权利要求2所述的转基因细胞，其中至少五个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少五个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注五核苷酸序列的组：
pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)ftsZ(SEQ ID NO:7)。
7.根据权利要求1所述的转基因细胞，其中所述细胞相比于非转基因细胞具有降低的增殖能力。
8.根据权利要求1所述的转基因细胞，其中所述细胞相比于非转基因细胞具有降低的毒性。
9.根据权利要求8所述的转基因细胞，其中所述降低的毒性是在哺乳动物或植物中。
10.根据权利要求1所述的转基因细胞，其中所述细胞相比于非转基因细胞呈现降低的运动性。
11.根据权利要求1所述的转基因细胞，其中所述细胞相比于非转基因细胞呈现改变的菌毛粘性。
12.根据权利要求1所述的转基因细胞，其中所述细胞相比于非转基因细胞呈现改变的蹭行运动性。
13.根据权利要求1所述的转基因细菌细胞，其中当所述细菌细胞是微生物燃料电池的组分时所述细胞呈现增加的电流输出/细菌细胞。
14.根据权利要求1所述的转基因细胞，其中所述细胞呈现增加的向阳极的电子转移。
15.根据权利要求14所述的转基因细胞，其中所述电子转移是直接或间接的。
16.一种基质，包含根据权利要求1所述的转基因细胞。
17.根据权利要求16所述的基质，其中所述基质选自包含以下的组：海绵、过滤器、小珠、粉末、纸巾、盒、药筒和胶囊。
18.一种生物膜，包含根据权利要求1所述的转基因细菌细胞，其中所述生物膜的厚度介于1μm和300μm之间。
19.一种过滤装置，包含根据权利要求1所述的转基因细菌细胞。
20.一种包含生物膜的过滤装置，所述生物膜包含根据权利要求1所述的转基因细菌细胞。
21.根据权利要求20所述的过滤装置，其中所述装置包含指示器。
22.根据权利要求20所述的过滤装置，其中所述过滤装置选自包含以下的组：液体材料过滤装置和气体材料过滤装置。
23.根据权利要求22所述的气体材料过滤装置，其中所述转基因细菌细胞利用选自包含二氧化碳、NO2、NO3、SO2、甲烷、N2O和SO3的组的温室气体作为原料。
24.一种微生物燃料电池，包含根据权利要求1所述的转基因细菌细胞、阳极室和阴极室。
25.一种微生物燃料电池，包含含有根据权利要求1所述的转基因细胞的生物膜、阳极室和阴极室。
26.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，其中所述阳极室为可拆卸的。
27.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，其中所述生物膜附着到所述阳极。
28.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，其中所述生物膜暴露于选自包含污水、肥料径流、废水、动物废弃物、气体材料和温室气体的组的原料。
29.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，其中在所述生物膜周围保持厌氧条件。
30.根据权利要求25所述的微生物染料电池，其中所述阳极室用生物膜抑制剂预处理。
31.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，还包含介体。
32.一种用于检测预定化合物的传感器，包含根据权利要求25所述的微生物燃料电池和指示器，其中所述指示器指示所述化合物的异常水平。
33.根据权利要求32所述的传感器，还包含用于检测第二预定化合物的第二转基因细菌细胞。
34.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，还包含超级电容器。
35.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，还包含水转移组件，其中所述水转移组件将由所述微生物燃料电池产生的水转移到集水装置或转移到外部环境。
36.根据权利要求25所述的微生物燃料电池，还包含氢转移组件。
37.根据权利要求36所述的微生物燃料电池，还包含氢燃料电池。
38.一种生物修复系统，包含根据权利要求25所述的微生物燃料电池，其中所述转基因细菌细胞利用预定化合物作为原料并且所述细胞将所述预定化合物转化成第二化合物。
39.一种微生物燃料电池，包含：
至少一个阴极；
至少一个与所述至少一个阴极电连通的阳极，所述至少一个阳极包含导电材料；
包含多个细菌细胞的生物膜，所述生物膜可操作地偶联到所述至少一个阳极，其中所述生物膜有利于从所述生物膜转移多个电子至所述至少一个阳极。
40.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，
其中所述至少一个阴极容纳在阴极室中，并且其中所述至少一个阳极容纳在阳极室中。
41.根据权利要求40所述的微生物燃料电池，还包含：
介于所述阳极室和所述阴极室之间的屏障，所述屏障适于限制所述至少一个阳极和所述至少一个阴极之间的电子直接转移。
42.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述生物膜暴露于能够被所述生物膜代谢的原料。
43.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述生物膜暴露于包含污水、肥料径流、废水、动物废弃物、气体材料和/或温室气体中的一者或多者的原料。
44.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述至少一个阳极可拆卸地偶联到所述至少一个阴极。
45.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述导电材料包括多孔材料。
46.根据权利要求45所述的微生物燃料电池，其中所述多孔材料包含金属、不锈钢、碳、碳纳米管、碳纳米纤维、碳布、碳纸、铂、石墨、石墨棒、石墨毡、石墨泡沫、石墨粒、97%孔隙率网状玻璃碳(RVC)、人造金刚石、金和/或铝中的至少一种。
47.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述导电材料包括纳米材料。
48.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述至少一个阳极包括可操作地偶联到一起的多个阳极。
49.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述至少一个阳极包括平面形状、圆柱形状、分层螺旋圆柱形状、曲线形状、成角度形状和几何形状中的至少一种。
50.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述至少一个阳极包括片、多个片、金属丝网结构、多孔管和/或基体结构。
51.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，还包含：
可操作地偶联到所述至少一个阳极的第一电极，所述第一电极进一步可操作地偶联到负载；
可操作地偶联到所述负载的第二电极，所述第二电极进一步可操作地偶联到所述至少一个阴极。
52.根据权利要求13所述的微生物燃料电池，其中所述负载包含发光装置、机械、显示器、电气器具和/或电池充电器中的至少一种。
53.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，还包含可操作地偶联到所述至少一个阳极的超级电容器，所述超级电容器适于储存所述多个电子的至少一部分。
54.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述至少一个阳极包括大致平行于其他多个导电片中的每个取向的多个导电片。
55.一种微生物燃料电池，包含：
阴极；
与所述阴极电连通的阳极，所述阳极具有至少部分地偶联到其上的细菌生物膜，所述细菌生物膜适于代谢原料以产生至少电子和氢；
用于产生至少电子和氢的原料；
用于捕获由所述细菌生物膜代谢所述原料而产生的所述氢的氢捕获模块；以及
用于捕获由所述细菌生物膜代谢所述原料而产生的所述电子的电子捕获模块。
56.根据权利要求55所述的微生物燃料电池，其中所述阳极包含金属、不锈钢、碳、碳纳米管、碳纳米纤维、碳布、碳纸、铂、石墨、石墨棒、石墨毡、石墨泡沫、石墨粒、97%孔隙率网状玻璃碳(RVC)、人造金刚石、金和/或铝中的至少一种。
57.根据权利要求55所述的微生物燃料电池，其中所述阳极包括片、多个片、金属丝网结构、多孔管和/或基体结构。
58.一种微生物燃料电池，包含：
阳极室，所述阳极室包含：
多个包含导电材料的阳极；
包含多个细菌细胞的生物膜，所述细菌细胞适于帮助将多个电子转移到所述多个阳极，所述生物膜覆盖所述多个阳极的至少一部分；
至少部分地接触所述生物膜的原料；和
与所述多个阳极中的至少一个可操作地偶联的阳极电极，所述阳极电极进一步可操作地偶联到位于所述阳极室外部的负载；
阴极室，所述阴极室包含：
至少一个阴极；和
与所述至少一个阴极可操作地偶联的阴极电极，所述阴极电极进一步可操作地偶联到所述负载；以及
将所述阳极室和所述阴极室分隔的离聚物屏障。
59.根据权利要求39所述的微生物燃料电池，其中所述生物膜包含用分离的核酸分子稳定转化的转基因铜绿假单胞菌细胞，所述分离的核酸分子使选自包含pilT(SEQ ID NO:1)、pilA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQ ID NO:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、lasI(SEQ ID NO:5)、lasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和fliC(SEQ ID NO:8)的组的所关注内源核苷酸序列中断，其中所述微生物细胞呈现降低的所述所关注内源核苷酸序列表达并且所述细胞呈现改变的产电功效。
60.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中至少2个所关注内源核苷酸序
列被中断并且其中所述中断的内源核苷酸序列选自包含以下的组：pilT(SEQ ID NO:1)、pilA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQID NO:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、lasI(SEQ ID NO:5)、lasR(SEQ IDNO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和fliC(SEQ ED NO:8)。
61.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中所述至少两个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注双核苷酸序列的组：pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)；
bdlA(SEQ ID NO:4)nirS(SEQ ID NO:3)；bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)；nirS(SEQ IDNO:3)pilT(SEQ ID NO:1)；nirS(SEQ ID NO:3)lasI(SEQ ID NO:5)；lasI(SEQ ID NO:5)pilT(SEQ ID NO:1)；ftsZ(SEQ ID NO:7)pilT(SEQID NO:1)；ftsZ(SEQ ID NO:7)bdlA(SEQ ID NO:4)；ftsZ(SEQ ID NO:7)nirS(SEQ ID NO:3)；和ftsZ(SEQ ID NO:7)lasI(SEQ ID NO:5)。
62.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中至少三个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少三个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注三核苷酸序列的组：
pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)ftsZ(SEQ ID NO:7)；bdlA(SEQ ID NO:4)nirS(SEQ ID NO:3)ftsZ(SEQ ID NO:7)；bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ IDNO:5)ftsZ(SEQ ID NO:7)；
nirS(SEQ ID NO:3)pilT(SEQ ID NO:1)ftsZ(SEQ ID NO:7)；nirS(SEQ ID NO:3)lasI(SEQ ID NO:5)ftsZ(SEQID NO:7)；lasI(SEQ ID NO:5)pilT(SEQ ID NO:1)ftsZ(SEQ ID NO:7)；
pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)nirS(SEQ ID NO:3)；pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)；和 bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)。
63.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中至少四个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少四个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注四核苷酸序列的组：
pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)nirS(SEQ ID NO:3)ftsZ(SEQ ID NO:7)；pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)ftsZ(SEQ ID NO:7)；bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)ftsZ(SEQ ID NO:7)和pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)。
64.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中至少五个所关注内源核苷酸序列被中断并且所述至少五个中断的内源核苷酸序列选自包含以下的所关注五核苷酸序列的组：
pilT(SEQ ID NO:1)bdlA(SEQ ID NO:4)lasI(SEQ ID NO:5)nirS(SEQ ID NO:3)ftsZ(SEQID NO:7)。
65.根据权利要求59所述的微生物燃料电池，其中所述细胞相比于非转基因细胞具有降低的增殖能力。
改进的微生物燃料电池
触和/或改进的生物膜形成的基因修饰细菌。
化和磷酸化的过程(通常称为氧化磷酸化)获得ATP形式的能量。诸如铜绿假单胞菌
(Pseudomonas aeruginosa)的革兰氏阴性细菌在产生能量方面类似于真核生物线粒体发
挥作用。铜绿假单胞菌是具有单极生鞭毛的革兰氏阴性杆状细菌。作为人条件致病菌，铜
绿假单胞菌同时也是植物的条件致病菌。铜绿假单胞菌能够在4℃至42℃的范围下生长。
其可以柴油机燃料和喷气燃料为生，在这种情况下其是碳氢化合物利用微生物。其还可以
代谢高含硝酸盐的有机材料。铜绿假单胞菌从无数碳源获得电子并且可在有氧、厌氧和厌
氧发酵过程(例如，用精氨酸或丙酮酸)中获得电子。在厌氧生长中，铜绿假单胞菌细胞连
续偶联氧化和磷酸化以获得能量。
生物燃料电池最常用的细菌诸如地杆菌属(Geobacter)或希瓦氏菌属(Shewanella)。地杆
菌属细胞以一种干扰大表面积生物膜形成的方式响应于高微生物密度。
底物的电子提供给阳极以通过电路进行转移。该电路输送电流通过负载，所述负载代表待
通过电子流执行的工作。所述负载可为发光装置、机械、LCD、电气器具、电池充电器以及许多其他装置。
原料或底物接受电子并因此使原料或底物氧化。NAD 从反应物底物切下两个氢原子。NAD
接受该氢原子中的一个从而变成NADH并在该过程中获得电子。氢负离子或阳离子被释放。
+
公式如下所示，其中RH2被氧化，从而将NAD 还原成NADH。RH2可以代表诸如葡萄糖的有机
底物或诸如有机废弃物的其他有机物质。
并且同时重新氧化成NAD。在自然状态中，该另一物质可为氧或硫酸盐。在微生物燃料电
池中，该另一物质可为介体或阳极。介体将电子转移到阳极。被阻止从阳极直接移动到阴
极的电子，通过外部电路转移到阴极并通过负载执行有用工作。
方面，分离的核酸分子包含表达盒，该表达盒含有与所关注异源核苷酸序列可操作地连接
的启动子。所述细胞可呈现改变的所关注异源核苷酸序列表达，例如在细胞中表达新的或
不同的多肽。相比于非转基因细胞(通常称为野生型)中所关注核苷酸序列的表达，转基
因(突变)细胞中所关注异源核苷酸序列的表达可被增加。在一个方面，启动子选自包含
诱导型启动子和组成型启动子的组。所述转基因微生物细胞还可包含第二表达盒。在本发
明的一些方面，第一表达盒可包含第二所关注异源核苷酸序列。
注内源核苷酸序列。在一个方面，微生物细胞呈现降低的所关注内源核苷酸序列表达。
(Geobacter)、希瓦氏菌属(Shewanella)和红育菌属(Rhodoferax)，特别是铜绿假单胞菌
和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
NO:1)、pilA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQ ID NO:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、lasI(SEQ ID NO:5)、lasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和fliC(SEQ ID NO:8)。在一个方面，转基因细菌细胞包含至少两个选自包含pilT(SEQ ID NO:1)、pilA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQ ID NO:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、lasI(SEQ ID NO:5)、lasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和
fliC(SEQ ID NO:8)的组的中断的所关注内源核苷酸序列。在多个方面，转基因细菌细胞
包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个选自包含pilT(SEQ ID NO:1)、pilA(SEQ ID NO:2)、nirS(SEQ ID NO:3)、bdlA(SEQ ID NO:4)、lasI(SEQ ID NO:5)、lasR(SEQ ID NO:6)、ftsZ(SEQ ID NO:7)和fliC(SEQ ID NO:8)的组的中断的所关注内源
核苷酸序列。
菌细胞。在一个方面，转基因细菌呈现增加的直接或间接向阳极的电子转移。
器、小珠、粉末、纸巾、盒、药筒和胶囊的组。
至200μm、10μm至30μm、和30μm至100μm的范围。
进一步包含指示器。过滤装置可为液体材料过滤装置或气体材料过滤装置。在气体材料过
滤器的方面，转基因细菌利用温室气体作为原料。温室气体可选自包含二氧化碳、NO2、NO3、SO2、甲烷、N2O和SO3的组。
菌细胞是铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。在一个方面，阳极室是可拆卸的。在一个方面，微生物燃料电池包含含有转基因细菌细胞的生物膜，所述转基因细菌细胞选自电子转移细菌
的组并且呈现改变的产电功效。在一个方面，生物膜附接到阳极或阴极。在一个方面，生
物膜暴露于原料。原料可选自包含以下的组：污水、肥料径流、工业废弃物(例如，乳制品、罐装食品、酿造厂、酿酒厂、果蔬汁)、炼油废弃物、公共场所废弃物(学校、医院、疗养院、监狱)、军用物、垃圾渗滤液和动物废弃物。在一个方面，原料为气体材料，可能包含温室气体。
在一个方面，原料是循环的；在一个方面，原料是起泡的；在一个方面，原料是静态的。在一个实施方案中，原料可以更换。在一个实施方案中，在阳极室中在生物膜周围保持厌氧条
件。在一个方面，可将阳极室用诸如多肽或小肽的生物膜抑制剂预处理。
或抑菌活性。
物的异常水平。传感器还可包含用于检测第二预定化合物的第二转基因细菌细胞。
电池。
物可选自包含甲烷、温室气体和铀的组。在该系统的一个方面，转基因细菌细胞将预定化合物转化成第二化合物。
码改变产电功效的多肽。分离的核酸分子还可包含所关注第二核苷酸序列，其中所关注第
二核苷酸序列也编码改变产电功效的多肽。
以伏特为单位表示在y轴上。时间进展表示在x轴上；对微生物燃料电池监测3.5天。小
图A示出从希瓦氏菌属获得的电压；该电压在整个监测期间增加，达到近0.2V。小图B(通
道1)示出从转基因铜绿假单胞菌获得的电压；该电压在整个监测期间波动，早期峰值介于
0.2V和0.22V之间。小图C(通道2)示出从第二转基因铜绿假单胞菌获得的电压；该电压
在监测期间早期较高(0.3V)且迅速下降。小图D(通道3)示出从第三转基因铜绿假单胞
菌获得的电压；该电压在0.005V和0.05V之间波动。小图E(通道4)示出从第四转基因铜
绿假单胞菌(pilT突变体)获得的电压；该电压开始接近0.5V，然后随着原料被消耗而降
低。来自第四转基因铜绿假单胞菌的结果表明所产生的电压超过包含希瓦氏菌属的微生物
燃料电池中产生的电压。
属(Brevibacillus sp.)PTH1、假单胞菌属、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、
恶臭假单胞菌属、希瓦氏菌属、奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)MR-1、腐败希瓦氏菌(Shewanell putrefaciens)IR-1、奥奈达希瓦氏菌DSP10、地杆菌属、硫还原地杆菌
(Geobacter sulfurreducens)、金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)、喜温地
杆菌(Peletomaculum thermopropionicum)、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter
thermautotrophicus)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、丁酸梭菌(Clostridium
butyricum)EG3、乙酸氧化脱硫单胞菌(Desulfuromonas acetoxidans)、铁还原红育菌
(Rhodoferax ferrireducens)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)A3、丙酸脱硫
叶 菌 (Desulfobulbus propionicus)、Geopsychrobacter electrodiphilus、Geothrix
fermentans、大肠杆菌(Escherichia coli)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas
palustris)、人苍白杆菌YZ-1、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)、嗜酸菌属(Acidiphilium sp.)3.2Sup5、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)L17。可由代谢
物产生电流的真菌细胞包括但不限于异常毕赤酵母(Pichia anomala)。参见例如Prasad
等 (2007)Biosens.Bioelectron.22:2604-2610；Gorby 等 (2006)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 103:11358-11363；Pham 等 (2008)Appl.Microbiol.Biotechnol.77:1119-1129；和
El-Naggar等(2008)Biophys J.95:L10-L12；这些文献全文以引用方式并入本文。能够进
行胞外电子转移的微生物细胞有时描述为“胞外产电菌”、“电化学活性微生物”、“产电微生物”、“阳极呼吸微生物”、“电化学活性细菌”和“阳极呼吸细菌”。
特性包括但不限于生物膜相关的特性例如生物膜形成能力、生物膜密度、在生物膜中存在
的耐受性、细胞装填特性、群体感应特性、细胞生长速率、细胞分裂速率、细胞运动性、底物附着、底物粘附、原料的酶加工、氧化、磷酸化、还原、电子转移、蹭行运动性、菌毛形成、细胞间粘附、纳米线形成、纳米线结构、从生物膜分散的能力以及介体相关的特性。产电功效可以使用本领域已知的电压或电流测量装置(万用表和基于计算机的测量技术)进行测量。
溶性底物。参见Yu等(2007) J.Bionanoscience 1:73-83，该文献全文以引用方式并入
本文。铜绿假单胞菌在包括有氧和厌氧条件的各种条件中形成生物膜；厌氧条件导致改
善的生物膜形成(Yoon等，2002.Pseudomonas aeruginosa anaerobic respiration in
biofilms:relationships至cystic fibrosis pathogenesis.Dev.Cell.3:593-603)。在
+
厌氧条件期间，电子被转移到阳极表面。质子(H)然后可在阴极表面反应从而产生氢气作
为副产物。在有氧条件中，铜绿假单胞菌在微生物燃料电池中在阴极处或在浮游(自由游
动)生长期间产生水作为副产物。
注内源核苷酸序列中断，从而导致中断的所关注内源核苷酸序列表达改变，或者分离的核
酸可包含表达盒，该表达盒含有与所关注异源核苷酸序列可操作地连接的启动子，从而导
致改变的所关注异源核苷酸序列表达。已经认识到，转基因微生物可包含多个使基因失活
的基因改变或突变；这些可包括一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更多个稳定掺入的突变。这种稳定掺入的突变可引入所关注异源核苷酸序列或使内源核苷酸序列中断。
生物包括稳定转化的微生物的子代。本发明涵盖分离的或基本上纯化的核酸组合物。当由
重组技术产生时，“分离的”或基本上“纯化的”核酸分子或其生物活性部分基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时，其基本上不含化学前体或其他化学物。分离的核酸分子可包含从宿主细胞纯化的载体或质粒以及从宿主细胞纯化的载体或质粒的片段。
500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、
1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、
2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、
2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、
3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、
4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、4500、4550、
4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、
5350、5400、5450、5500、5550、5600、5650、5700、或高达分离的核酸分子中所有完整数目的核苷酸的范围并且包括分离的核酸分子中所有完整数目的核苷酸。
将受启动子的控制。这种表达盒设置有至少一个限制性位点，该限制性位点用于插入将处
于调控区的转录调控下的核苷酸序列。该表达盒可另外包含选择标记基因。
转录区的用于翻译的核糖体结合位点。其他表达调控元件包括起始和终止密码子以及聚腺
苷酸化信号。本领域的普通技术人员应该知道许多可用于表达载体的调控序列。这些调控
序列描述于例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual第二版，
Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.。
TAC启动子、来自SV40的早期和晚期启动子、CMV即刻早期启动子、腺病毒早期和晚期启动
子以及逆转录病毒长末端重复。
些核苷酸序列可以使用用于提高表达的物种偏好密码子来合成。用于合成物种偏好核苷
酸序列的方法是本领域可获得的。参见例如Wada等(1992)Nucleic Acids Res.20(增
刊 )，2111-2118；Butkus 等 (1998)Clin Exp Pharmacol Physiol Suppl.25:S28-33；
和Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual第二版，Cold Spring
Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，这些文献以引用方式并入本文。
平。如果可能，对序列进行改造以避免预测的发夹二级mRNA结构。
EMCV前导区(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy-Stein等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA
86:6126-6130)；马铃薯Y病毒属前导区，例如TEV前导区(烟草蚀纹病毒)(Allison等
(1986))；MDMV前导区(玉米矮花叶病毒)(Virology 154:9-20)；和人免疫球蛋白重链结
合蛋白(BiP)(Macejak等(1991)Nature 353:90-94)。还可以利用其他已知用于增强翻译
和/或mRNA稳定性的方法，例如内含子等。
括其他操作以提供方便的限制性位点、移除多余DNA、移除限制性位点等等。为此，可以包括体外诱变；引物修补；限制；退火；替换例如转换和颠换；或其任何组合。
Sons,New York,New York，其以引用方式并入本文。
P.1993.Small broad-host-range gentamicin resistance gene cassettes for
site-specific insertion and deletion mutagenesis Biotechniques 15:831-833.，
羧 苄 青 霉 素 Parvatiyar 等，2005.Global analysis of cellular factors and
responses involved in Pseudomonas aeruginosa resistance to arsenite.J
Bacteriol187:4853-64.，氯 霉素 (Herrera Estrella等(1983)EMBO J. 2:987-992)；
氨甲 蝶呤(Herrera Estrella等(1983)Nature 303:209-213；Meijer等(1991)Plant
Mol.Biol.16:807-820)；潮 霉 素 (Waldron 等 (1985)Plant Mol.Biol.5:103-108；
Zhijian等 (1995)Plant Science 108:219-227)；链 霉 素 (Jones等 (1987)Mol.Gen.
Genet.210:86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等(1996)Transgenic Res.5:131-137)；
博来霉素(Hille等(1990)Plant Mol.Biol.7:171-176)；磺酰胺(Guerineau等(1990)
Plant Mol.Biol.15:127-136)；嘌呤霉素(Abbate等(2001)Biotechniques 31:336-40；
阿糖胞苷(Eliopoulos等(2002)Gene Ther.9:452-462)；6-硫鸟嘌呤(Tucker等(1997)
Nucleic Acid Research 25:3745-46)。
Plant Mol.Biol.Rep.5:387)；GFP(绿 色 荧 光 蛋 白；Wang等 (2001)Anim Biotechnol
12:101-110；Chalfie 等 (1994)Science 263:802)、BFP( 蓝 色 荧 光 蛋 白；Yang 等
(1998)J.Biol.Chem.273:8212-6)、CAT；和 荧 光 素 酶(Riggs 等 (1987)NucleicAcid
Res.15(19):8115；Luchrsen等(1992)Methods Enzymol.216:397-414)。
(WO 94/29442、WO 96/40892、WO96/01313、美国申请No.10/613,728)；激素反应系统、
干扰素诱导系统、金属诱导系统、和热诱导系统，(WO 93/20218)；蜕皮激素诱导系统、和araC-Pbad。这些系统中的一些(包括蜕皮激素诱导系统和四环素诱导系统)可分别商购自
Invitrogen(Carlsbad,Calif.)和Clontech(Palo Alto,Calif)。参见Qiu等，(2008)App.& Environ Microbiology74:7422-7426和Guzman等，(1995)J. Bacteriol.177:4121-4130，
这些文献全文以引用方式并入本文。
刺激物。各种化学刺激物是本领域已知的。
Med.1:372-374；Furth等(1994).Proc.Natl. Acad. Sci.USA 91:9302-9306；和Mansuy & Bujard(2000).Curr.Opin.Neurobiol.10:593-596，这些文献全文以引用方式并入本文)。
另一个这种二元系统的例子是噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。关于cre/loxP重组酶
系统的描述，参见例如Lakso等(1992)PNAS89:6232-6236。在Cre/LoxP重组酶系统中，激
活蛋白转基因编码重组酶。如果使用cre/loxP重组酶系统来调节转基因表达，则需要包含
编码Cre重组酶和选定靶蛋白两者的转基因的微生物。另一个重组酶系统的例子是酿酒酵
母(S.cerevisiae)的FLP重组酶系统(O'Gorman等(1991)Science 251:1351-1355)。单
个转基因微生物可包含多个诱导型启动子。
Protocols in Molecular Biology,Wiley-Interscience,New York,New York；Coligan
等(2002)Current Protocols in Protein Science,Wiley-Interscience,New York,New
York；和Sun等(2001)Gene Ther.8:1572-1579，这些文献以引用方式并入本文。已经认识
到，可在RNA、多肽或肽水平对所关注核苷酸序列的表达进行评估、分析或估计。
40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。表达水平可下降大约1%、
2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。已经认识到，改变的表达还包括所关注核苷酸序列的片段而不是全长所关注核苷酸序列的表达。
一步认识到，一种特性的增加可降低第二特性，一种特性的增加可增加第二特性，一种特性的降低可降低第二特性，并且一种特性的降低可增加第二特性。改变的细胞特性可相比于
非转基因微生物细胞中的该细胞特性被改变1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、
70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。分析细胞特性的方法是本领域已知的。
注内源核苷酸序列表达的调节区，可打断控制所述内源核苷酸序列表达的调节区，可删除
所关注内源核苷酸序列、可删除内源核苷酸序列的部分、可删除调节区、或可删除调节区
的部分。所关注内源核苷酸序列包括但不限于pilT(SEQ ID NO:1)、bdlA(SEQ ID NO:4)、
lasI(SEQ ID NO:5)、lasR(SEQ ID NO:6)、nirS(SEQ ID NO:3)、ftsZ(SEQ ID NO:7)、
pilA(SEQ ID NO:2)和fliC(SEQ ID NO:8)。
增加的菌毛形成或超菌毛形成。这些pilT突变体呈现改善的附着、细胞间粘附和生物膜
形成。某些pilT突变体呈现降低的毒性和降低的从表面分离的能力。虽然不受机制的限
制，但降低的蹭行运动性似乎增加附着和细胞间附着，从而改善生物膜形成且增加生物膜
厚度。参见Chaing& Burrows (2003)J. Bacterio.2374-2387，其全文以引用方式并入本
文。
化是细菌朝向或远离多种刺激物或拒斥剂运动的过程。打断或删除bdlA降低细菌细胞从
表面分离的能力，从而改善生物膜形成和保持并增加向阳极的电子转移。参见Morgan等
(2006)J. Bacteriol.7335-7343，其全文以引用方式并入本文。
但是FliC中断突变体可向阳极转移更多的电子。
基)-L-高丝氨酸内酯合成酶突变体具有改变的生物膜特性。这些改变的生物膜形成特性
包括但不限于更薄、更紧实的生物膜、增加的细胞密度、改变的表面附着特性、改变的多糖产生、降低的多糖产生以及改变的绿脓素产生。绿脓素是氧化还原活性的，呈现抗生素活性并可用作电子转移的介体。删除lasI也改变细菌细胞在动物和人细胞中的毒性。这种改
变的毒性可为在人或动物细胞中降低的毒性。参见Davies等(1998)Science，其全文以引
用方式并入本文。
染任何其他活生物体；特定类型的微生物细胞可具有有限范围的靶。铜绿假单胞菌能够感
染广泛范围的靶，包括植物、昆虫、哺乳动物。示例性哺乳动物包括但不限于人、牛科动物、类人猿、绵羊、山羊、猪科动物、兔科动物(lapines)、鼠科动物和骆驼科动物(camellids)。
毒性的方面包括但不限于合适靶的范围、感染性、多重感染、从一个靶到另一个靶的转移速度、靶细胞结合能力、抗生素敏感性、致病性以及抗原产生。已经认识到，降低毒性的一个方面可不影响毒性的另一方面或可增加毒性的另一方面。
入本文)。虽然不受机制的限制，但NIR可为在厌氧呼吸期间硝酸盐还原成氮气的全过程
中的第二酶促步骤。呼吸型NIR的产物是一氧化氮(NO)，一种在微摩尔浓度下固有地对
-
细菌具有毒性的化合物。NIR可催化NO2 到NO的一电子还原并且可催化O2到2H2O的四
电子还原。nirS的失活可减少与厌氧生物膜中的NO相关的问题，增加通过菌毛的电子
流并减少一氧化二氮(N2O)的产生。nirS突变体的表面暴露的III型分泌器产生比野生
型细菌低的毒素浓度；nirS突变体呈现改善的毒性特性。参见Van Alst,N.E.等，2009.
Nitrite reductase NirS is required for type HI secretion system expression and virulence in the human monocyte cell line THP-1by Pseudomonas aeruginosa Infect Immun 77:4446-4454，其全文以引用方式并入本文。
同区域中不同。优选的生物膜厚度在介于1μm和300μm之间，特别地介于10μm和200μm
之间并且更特别地介于30μm和100μm之间的范围内。生物膜可由多种细胞类型、单种细
胞类型或克隆群体的细胞组成。多种细胞类型可指不同种的细胞、相同种的不同菌株的细
胞以及具有不同转基因改变的细胞。若干生物膜相关的特性影响产电功效。影响产电功效
的生物膜相关特性包括但不限于生物膜中的细菌数目、生物膜中的细菌密度和附着到阳极
的菌毛数目。在一个实施方案中，生物膜可附着到、生长在、粘附至、包被、接触、覆盖或临近阳极表面或阳极室。生物膜可改善包含生物膜的细胞在不利条件中的存活，所述不利条件
包括但不限于非偏好温度、pH范围、重金属浓度等。对原料的调节可以调节生物膜稳健性。
代谢特性的化合物，这种代谢特性可影响可用底物的代谢或生物膜或微生物燃料电池内的
微生物之间的生理协作。可添加到原料中的抗生素选自转基因微生物耐受的抗生素的组。
得到具有非最佳厚度的生物膜。此外，细胞分裂需要可转移到阳极的能量。因此，在一个实施方案中，可进行细胞分裂(或细胞增殖)的外源调节。这种调节可涉及使用诱导型启动
子。
热素、UCXP-1、UCP-2和UCP-3。在一个实施方案中，将具有编码解偶联多肽(例如但不限
于产热素、UCXP-1、UCP-2和UCP-3)的核苷酸序列的核酸分子与诱导型启动子可操作地连
接。然后可用包含与所关注解偶联核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子的表达盒稳定
转化细菌细胞。
0.001%至5%、0.01%至4%、0.01%至3%、0.01%至2%、0.01%至1%或0.01%至0.05%的范围
内。因此，细菌在厌氧环境中代谢原料不同于在有氧条件中代谢原料。在某些实施方案中，需要有氧条件。在某些实施方案中，需要厌氧条件。铜绿假单胞菌迅速利用氧，因而可形
成厌氧条件。可通过利用氧移除系统来建立厌氧条件。氧移除酶系统包括但不限于葡萄
糖-葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶酶促O2移除系统。葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化成尿酸和
H2O2。葡萄糖氧化酶是一种氧依赖酶。在每个循环中葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶反应共同
使氧浓度减半。所谓“保持”生物膜周围的厌氧条件意指建立厌氧条件并将所述厌氧条件
维持包括但不限于以下的一段时间：30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、
25分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、15小时、20小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、5天、
6天、7天、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、个4月、5个月、6个月和1年。已经认识到，特别地对于保持或将原料引入到微生物燃料电池(例如但不限于当污水进入燃料电池
时)可发生厌氧条件的间断期。
生物膜形成。在一个实施方案中，将阳极室用该17聚体预处理或涂布，但阴极不进行预处
理或涂布。
积可损害微生物燃料电池的功能。因此，可取的是将屏障上的生物膜沉积保持在适度水平。
调节生物膜沉积的方法包括但不限于调节细菌细胞分裂速率和用生物膜形成抑制剂预先
涂布屏障。生物膜形成抑制剂是本领域已知的并且包括具有PilA蛋白的末端17个氨基酸
的氨基酸序列(也称为PilA17聚体)的多肽。或者，阳极和阴极可为可分开的组件，例如
可从微生物燃料电池的阴极部分移除的阳极管。
组件可以清洁。这种清洁可涉及化学清洁、机械清洁、清除利用蛭弧菌属(Bdellovibrio)
物种的生物膜、清除利用食肉生物体(例如但不限于真菌)的生物膜、或其组合。蛭弧菌属，一种食菌的细菌，以铜绿假单胞菌为食并且临时反转电极的极性以释放结合的菌毛。
室36之间的屏障22。阳极室34可包含一个或多个阳极14。阴极室36可包含一个或多个
阴极16。在一些实施例中，微生物燃料电池10可包含原料18，阳极14和/或阴极16可放
置于其中。在一些实施例中，阳极14可覆盖有由许多细菌形成的细菌膜或生物膜28，如在
整个本发明中所述。
过负载24连接阳极14和阴极16。电极26可将阳极14和阴极电偶联。用于电极26的合
适物质可包括但不限于铜或金刚石。
为离聚物膜，例如但不限于Nafion全氟磺酸(PFSA)膜(DuPont Fuel Cells,Inc)。生物膜
28在屏障22上的过度沉积可损害微生物燃料电池10的功能。因此，可取的是将屏障22上
的生物膜28沉积保持在适度水平。调节生物膜28沉积的方法包括但不限于调节细菌细胞
分裂速率和用生物膜形成抑制剂预先涂布屏障22。生物膜形成抑制剂是本领域已知的并且
包括具有PilA蛋白的末端17个氨基酸的氨基酸序列(也称为PilA17聚体)的多肽。或
者，阳极14和阴极16可为可分开的组件，例如可从微生物燃料电池10的阴极部分36移除
的阳极管。
和56。微生物燃料电池进一步偶联到负载58。负载58可包括例如电灯泡或其他负载。微生
物燃料电池中的一个或多个可以拆卸并清洁。已经认识到，微生物燃料电池中的一个或多
个组件可以清洁。这种清洁可涉及化学清洁、机械清洁、清除利用蛭弧菌属(Bdellovibrio)物种的生物膜、清除利用食肉生物体(例如但不限于真菌)的生物膜、或其组合。蛭弧菌属，一种食菌的细菌，以铜绿假单胞菌为食并且临时反转电极的极性以释放结合的菌毛。
从阳极穿过负载到达阴极的电路。使用者可例如通过接入开关使得由转基因微生物产生的
电流流过负载。转基因微生物将电子从原料转移到阳极，电子继续流过电极和负载到达阴
极。屏障阻止电子通过燃料电池的内部流动。微生物燃料电池可用于消费性电子产品，或
许通过锂/离子电池充电器或作为锂/离子电池的替代物。微生物燃料电池可用于插电型
汽车或给插电型汽车充电。微生物燃料电池可通过接入从建筑物沿着向外的污水管道排出
的有机废弃物而产生用于住宅和商业建筑物的电力。微生物燃料电池可用于大型废弃物处
理、农场和公用设施。
个实施方案将超级电容器与燃料电池配对使得当开始启动该系统时该成对系统的使用者
可具有持续的电力流。
的细菌的微生物燃料电池42并联连接。当对于超过微生物燃料电池42可供应电力的电力
的需求出现时，超级电容器46可放电相对较短的时间。当对于增加的电力的需求消退时，
超级电容器46可利用微生物燃料电池42以进行充电。相对较短时间的对增加的电力的需
求可例如在以下情况下发生：在电动车辆的快速加速、与燃料电池连接的发动机的启动期
间，或在微生物燃料电池系统40开始用于紧急备用系统之后紧接的时间期间。将微生物燃
料电池42与超级电容器46配对可允许系统40的设计者利用较小的微生物燃料电池42，因
为微生物燃料电池42可能不需要设定尺寸以用于峰值功率应用。超级电容器46还可用于
使电能传输到输电网络、负载48或更常用的装置。如果来自燃料电池42的能量流变得波
动，超级电容器46可使电力传输的峰和谷平滑。另外，多个微生物燃料电池42和/或多个
超级电容器46可以配对以增加电力输出。在一些实施例中，超级电容器46可作为一个紧
凑单元嵌在外壳12内。对于本领域的技术人员而言，可以进行其他应用和/或配置。
被捕获和/或收集并用来给氢燃料电池44提供动力。图3示出氢燃料电池44与微生物燃
料电池42配对以形成燃料电池系统40。燃料电池系统40可包含每种类型(微生物和/或
氢)的很多个燃料电池、每种类型一个燃料电池、或可省去一种燃料电池类型，如应用可决定的。在这些实施例中，微生物燃料电池42可排出极少的二氧化碳，因而能够成为一种环
保能源。另外，微生物燃料电池42可设计成排出可变成其他装置的能源的可用糖类。微生
物燃料电池42可有氧地运行以排出水作为副产物。水可转移到储水装置或转移到外部环
境。
培养基接种10cfu的细菌细胞。将培养板在37℃下孵育24小时。移除培养基并用盐水缓
冲液洗涤培养板。将LIVE/DEAD BacLight(Molecular Probes,Inc)细菌活力染料(0.5ml)
添加到各培养板中。在附接到具有63 X 14NA油浸物镜的Axiovert显微镜的Zeiss LSM
510激光扫描共聚焦单元上获得图像。对于两种彩色图像，在488nm和546nm下连续扫描样
品。Syto 9(绿色荧光)通过505-530nm带通滤波器检测，而碘化丙啶(红色荧光)通过
560nm长通滤波器检测，并呈现在两个512 X 512像素、8比特图像的通道中。
1小时之后，以0.17ml/min的速率开始流动。将细胞在室温下孵育3天。将细胞用由SYTO
9和碘化丙啶(Molecular Probes,Inc.)组成的活/死活力染料进行染色。使用LSM 510
共聚焦显微镜(Carl Zeiss,Inc.)获得生物膜图像。绿色荧光的激发波长和发射波长分别
为488nm和500nm，而红色荧光的激发波长和发射波长分别为490nm和635nm。所有生物膜
实验均重复至少3次。使用3D for LSM(V.1.4.2)软件(Carl Zeiss)计算生物膜的活/死
比。使用COMSTAT软件评估总体生物膜结构，例如厚度、水通道、细菌密度(底物覆盖率)、
3 2
粗糙度系数和以m/m 计的总生物量。COMSTAT分析使用扫描共聚焦激光显微镜(SCLM)获
得的图像叠加以量化生物膜结构的3维性质。参见Heydorn等(2000)Microbiology146(Pt
10):2395，其全文以引用方式并入本文。
R
形成插入突变盒，该插入突变盒包含庆大霉素抗性(Gm)核苷酸序列、绿色荧光蛋白(GFP)
核苷酸序列以及位于庆大霉素抗性序列和GFP序列两侧的FLP重组酶靶(FRT)位点。在接
合转移或电穿孔之后，选择质粒整合体。将细胞在含6%蔗糖的培养基中培养。蔗糖启动所
关注靶序列的删除。突变体通过PCR或DNA印迹法进行确认。突变细胞经历用含有诸如
pFLP2的FLP-重组酶表达质粒的细胞进行的接合转移。pFLP2包含sacB序列；在含蔗糖培
养基上的生长使细菌细胞消除含sacB质粒。FLP重组酶的表达使得切除FRT盒。在消除质
粒之后，铜绿假单胞菌删除突变菌株是庆大霉素敏感的。通过相似方法构建诸如双突变体
和三突变体的多突变体。
在滤膜上收集细胞以在闪烁计数器中进行放射性测量时，将滤膜放置在每个孔的烧结塑料
表面上。所述装置的顶部紧紧旋拧在底部上。所述装置的顶“杯”部分具有橡胶密封件以
防止从每个孔的渗漏。底部包括真空口。该Millipore过滤装置具有12个孔。
用丙酮处理，然后用甲醇处理以移除残余油。将钢晶片用钢丝刷擦刷以增加可供细菌结合
的钢表面积。与晶片连接的铜线代表阳极。将来自每个晶片的铜线拉引穿过之前是该装置
的真空口的部分。将铜线连接到电压/电流测量装置。每个孔可容纳至多15ml的培养基；
在这些实验中，使用7ml的培养基。在十二个与所述孔紧密配合的6级橡胶塞中的每一个
中钻两个洞。将一根8英寸的铜线放置在橡胶塞的主洞中，所述铜线有0.25英寸延伸进阳
极的培养基中。该铜线代表阴极。该高通量装置允许一次评估多达12个样品。一旦装配
好，各个孔具有成为独立微生物燃料电池的能力。
整个高通量微生物燃料电池原型装配好并通过装置顶部上的螺栓固定。实验中使用的每个
孔通过用乙醇处理来灭菌。移除乙醇并将装置在无菌层流罩中干燥。将LB+1%KNO3培养基
(7ml)放置在实验中使用的每个孔中。将每个细菌样品(野生型铜绿假单胞菌属、希瓦氏菌
属和突变菌株)的静止期生长的有氧培养物(70μl,1:100稀释液)添加到孔中的培养基
中。还准备一个仅有培养基的对照孔并进行监测。在将橡胶塞固定在孔中之前，将橡胶塞
和阴极铜线用乙醇处理。在厌氧条件下将该装置在37℃下孵育24小时。
抹乙醇。向每个孔添加LB+1%KNO3培养基(7ml)。重复记录过程。来自一个这种实验的结
果示于图1中。
缓冲放大器。这些放大器的输出然后连接到Labjack A/D的通道AIO-AI3输入。通过连接
穿过IK电流检测电阻器的LT1101仪表放大器来进行电流测量。通过测量穿过电阻器的电
压降并利用欧姆定律(I=E/R)，可以计算流经电池电路的电流。
两块较大的板用作面向Nafion膜中或面朝Nafion膜并增加了另外的96.2英寸表面积的
“腿”。因此估计的总表面积为大约294英寸。该两块较大的板给21块板组件提供支撑。从阳极室到阴极室的电极为不锈钢并且配有插入嵌在阴极内的相似配件的Swagelok配件。
氧室中接种有细菌的1升LB+1%KNO3中孵育24小时。
生物膜的阳极放置在大型微生物燃料电池组件中。将两个塑料盒(一个包含阳极，另一个
包含阴极)用LB+1%KNO3填充。将阳极室和阴极室用葡糖氧化酶进行处理。葡糖氧化酶将
葡萄糖转化成尿酸和H2O2。将H2O2用过氧化氢酶处理。葡糖氧化酶和过氧化氢酶反应降
低氧浓度。阳极在大约250-400mV(vs Ag/AgCI)下平衡。将Clark型或World Precision
Instrument O2电极与阳极和阴极部分连接。使用流速0.05ml/min的蠕动泵实现新鲜厌氧
培养基流动通过阳极室。
株。构建pilT bdlA nirS、bdlA lasI pilT、nirSlasI bdlA三中断突变菌株。构建pilT
bdlA nirS lasI四中断突变菌株。
araBAD-ftsZ背景下构建pilT bdlA、bdlA nirS、bdlA lasI、nirS pilT、nirS lasI和lasI pilT双中断突变体。在PAO1 araBAD-ftsZ背景下构建pilT bdlA nirS、bdlAlasI pilT和
nirS lasI bdlA三中断突变体。在PAO1 araBAD-ftsZ背景下构建pilT bdlA nirS lasI
四中断突变菌株。
pilT、bdlA、nirS和lasI单中断突变体。在PAO1 araBAD-ftsZ PA0730背景下构建pilT
bdlA、bdlA nirS、bdlA lasI、nirS pilT、nirS lasI和lasI pilT双中断突变体。在
PAO1araBAD-ftsZ PA0730背景下构建pilT bdlA nirS、bdlA lasI pilT和nirSlasI bdlA
三中断突变体。在PAO1 araBAD-ftsZ PA0730背景下构建pilT bdlA nirS lasI四中断突
变菌株。
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