一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法专利检索-原纤化纤维类专利检索查询-专利查询网

一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米 纤维的制备方法

阅读：496发布：2023-01-19

专利汇可以提供一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种可以用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，包括：通过静电纺丝法制备聚乙烯醇/聚乙烯亚胺(PVA/PEI)纳米纤维并用戊二醛蒸气交联处理，随后通过碳化二亚胺(EDC)/羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联反应制备LA-PEG-COOH并活化其表面羧基3h，加入到PVA/PEI纳米纤维膜中，摇床反应3d，再加入三乙胺和乙酸酐将纳米纤维膜表面剩余的氨基全部乙酰化处理，最后洗涤、干燥，即得乳糖酸功能化纳米纤维。本发明原料价格低廉，制备工艺简单，捕获癌细胞所需时间短、特异性强，有望在癌细胞检测领域获得应用。，下面是一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，包括：
(1)通过碳化二亚胺EDC/羟基琥珀酰亚胺NHS偶联反应制备LA-PEG-COOH；
(2)通过静电纺丝法制备聚乙烯醇/聚乙烯亚胺PVA/PEI纳米纤维并用戊二醛蒸气交联处理；
(3)活化步骤(1)得到的LA-PEG-COOH表面的羧基3h，加入到PVA/PEI纳米纤维膜中，摇床反应3d，再加入三乙胺和乙酸酐，最后洗涤、干燥，即得乳糖酸功能化纳米纤维LA-PEG-PVA/PEI-Ac，其中，LA-PEG-COOH与PVA/PEI纳米纤维所含氨基的摩尔比为1∶10。
2.根据权利要求1所述的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中偶联反应工艺为：以pH＝6.0的PBS缓冲液为溶剂，首先以摩尔比LA∶EDC∶NHS＝1∶1∶1活化乳糖酸LA的羧基，磁力搅拌3h；随后将其逐滴加入到NH2-PEG-COOH的缓冲液中，LA与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1.5∶1，反应3d；最后将上述反应体系转移到截留分子量为500的透析袋在纯水中透析3d，冷冻，干燥，制得LA-PEG-COOH粉末。
3.根据权利要求2所述的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述NH2-PEG-COOH的Mw为2000。
4.根据权利要求1所述的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中静电纺丝工艺条件为：纺丝液PVA/PEI的总质量百分比浓度为12wt％，其中PVA与PEI的质量比为3∶1，溶剂为水；电压18.6kV，流速0.3mL/h；接收距离为25cm；环境湿度40-50％。
5.根据权利要求1所述的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中PVA的分子量Mw为88000，PEI的Mw为25000。
6.根据权利要求1所述的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中PVA/PEI纳米纤维用25％戊二醛蒸气真空交联处理18h，得到水稳定性良好的纳米纤维。
7.根据权利要求1所述的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中活化LA-PEG-COOH表面的羧基时LA-PEG-COOH∶EDC∶NHS的摩尔比为1∶5∶5。
8.根据权利要求1所述的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中三乙胺∶乙酸酐∶PVA/PEI纳米纤维所含氨基总摩尔数的摩尔比为5∶5∶1。
9.根据权利要求1所述的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中洗涤为用去离子水洗涤3-5次。
10.根据权利要求1所述的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中干燥为真空干燥，干燥时间为12-24h。
11.根据权利要求1所述的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中得到的乳糖酸功能化纳米纤维LA-PEG-PVA/PEI-Ac应用于表面表达去唾液酸糖蛋白受体的肝癌细胞的特异性捕获。

说明书全文

一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米 纤维的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于靶向捕获癌细胞纳米材料的制备领域，特别涉及一种用于捕获肝癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法。

背景技术

[0002] 癌症已成为影响人体健康的罪魁祸首，对癌症的早期诊断和治疗成为各国生物医学领域研究者的关注对象。早在1869年，Ashworth首次提出了循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)的概念。CTC是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，通过迁移、粘附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶，最终导致癌症。有研究表明很多肿瘤在一个毫米的情况下在血液里已经可以查到循环肿瘤细胞，传统方法采用密度梯度离心法、膜滤过法、荧光细胞分选法及免疫磁珠分离法对血液6 7
中癌细胞进行捕获并检测。但是，肿瘤患者血液中CTC含量极少，约每10 ～10 个白细胞中才会发现一个，这些方法容易造成癌细胞丢失，检测灵敏度差。

[0003] 纳米材料由于其尺寸较小(1-100nm)，具有特殊的光学、电子学和磁学等性质。这些性质使纳米材料能够有效地应用于各种医学研究，例如药物传递、癌症的靶向诊断和治疗、分子手术和医学成像。2011年，Chen等人制备了直径范围在50-100nm的硅纳米线阵列作为基底材料，并在表面固定细胞亲和的核酸适配体，结果证明纳米结构可以很好地促进其与细胞间的相互作用，大大提高了捕获效果。

[0004] 静电纺丝是一种有效地制备具有高比表面积的纳米或微米级纤维的生产技术，该方法具有以下特点：制备过程简易、纤维种类多样；所制得的纳米纤维具有极大的比表面积，能提供大量的细胞接触位点，使单位体积内捕获细胞的数量增加；大量研究表明纳米纤维易进行表面修饰，并且可以负载生物活性分子，如蛋白质、核酸、糖类及生长因子等；同时，纳米纤维能够很好地模拟天然细胞外基质(ECM)，为细胞的粘附、增殖及生理功能提供良好的微环境。

[0005] 为了进一步提高静电纺纳米纤维的使用性能，拓宽其应用领域，功能纳米纤维逐渐成为人们的研究重点，这主要可以通过对原有纳米纤维进行表面修饰，具体方法如层层自组装法、等离子体法、湿化学法以及同轴静电纺丝法等。通过改变纳米纤维表面的化学组成和结构，而使一些表面性质发生改变。目前，抗体、多肽、E-选择素等细胞配体已被功能化修饰至纳米纤维表面，并应用于癌细胞的特异性捕获。Zha等通过物理方法功能化固定抗体在胆固醇琥珀酸硅烷纳米纤维表面用于癌细胞的分离与检测[Zha ZB，Cohn C，Dai ZF,et al.Nanoﬁbrous lipid membranes capable of functionally immobilizing antibodies and capturing speciﬁc cells.Adv Mater.2011；23：3435-40.]。

[0006] 聚乙烯醇(PVA)具有优异的生物可降解性、生物相容性，在外科用缝合线、体内植入材料、药物载体及组织工程支架方面有着广泛的应用。PVA是一种半晶状聚合物，具备较高的化学稳定性和热稳定性。PVA无毒，对动物体没有负面影响，与皮肤接触不会造成任何损伤。聚乙烯亚胺(PEI)表面含有大量氨基，表面易修饰，且与PVA混纺可很容易实现表面交联，提高其水稳定性，目前正受到越来越广泛的关注。

[0007] 乳糖酸属于寡糖醛糖酸，多糖通过醚键化学连接到醛糖酸上，在体内可以酶促水解从而形成半乳糖和葡萄糖酸。哺乳动物肝癌细胞表面含有大量的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，研究表明，其与含有半乳糖的配体可特异性结合，除此之外，ASGPR可促进半乳糖配体或半乳糖配体修饰的共聚物有效地被癌细胞内吞。Guo等人将乳糖酸通过化学反应共价结合修饰到第五代树状大分子表面，结果显示所连接的乳糖酸小分子可以有效地靶向人肝癌细胞[Guo R，YaoY，Cheng G，et al.Synthesis of glycoconjugated poly(amindoamine)dendrimers for targeting human liver cancer cells.RSC Adv.2012；2：99-102.]。K.M.Kamruzzaman等人将乳糖酸修饰至磁性纳米颗粒表面作为肝癌诊断的MR成像对比剂。当将其注入兔子体内，磁共振成像显示通过注入乳糖酸修饰的磁性纳米颗粒，肝癌细胞的颜色明显变黑，而其他器官并没有变化，这说明该材料可以选择性地聚集在肝癌细胞中[Kamruzzaman SK，Ha YS，Kim SJ，et al.Surface modiﬁcation of magnetite nanoparticles using lactobionic acid and their interaction with hepatocytes.Biomaterials.2007；28：710-6.]。

[0008] 因此，将静电纺纳米纤维与细胞捕捉靶向基团进行连接，有望制备一种短时间内即具有增强的靶向特异性捕获癌细胞的材料，实现血液中癌细胞的分离与癌症早期检测。

[0009] 检索国内外相关文献和专利结果表明：用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，尚未见报道。

发明内容

[0010] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于捕获肝癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，该方法原料价格低廉，制备工艺简单，捕获癌细胞所需时间短、特异性强，有望在癌细胞检测领域获得应用。

[0011] 本发明的一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法，包括：

[0012] (1)通过碳化二亚胺EDC/羟基琥珀酰亚胺NHS偶联反应制备LA-PEG-COOH；

[0013] (2)通过静电纺丝法制备聚乙烯醇/聚乙烯亚胺PVA/PEI纳米纤维并用戊二醛蒸气交联处理；

[0014] (3)活化步骤(1)得到的LA-PEG-COOH表面的羧基3h，加入到PVA/PEI纳米纤维膜中，摇床反应3d，再加入三乙胺和乙酸酐，最后洗涤、干燥，即得乳糖酸功能化纳米纤维LA-PEG-PVA/PEI-Ac，其中，LA-PEG-COOH与PVA/PEI纳米纤维所含氨基的摩尔比为1∶10。

[0015] 所述步骤(1)中偶联反应工艺为：以pH＝6.0的PBS缓冲液为溶剂，首先以摩尔比LA∶EDC∶NHS＝1∶1∶1活化乳糖酸LA的羧基，磁力搅拌3h；随后将其逐滴加入到NH2-PEG-COOH的缓冲液中，LA与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1.5∶1，反应3d；最后将上述反应体系转移到截留分子量为500的透析袋在纯水中透析3d，冷冻，干燥，制得LA-PEG-COOH粉末。

[0016] 所述NH2-PEG-COOH的Mw为2000。

[0017] 所述步骤(2)中静电纺丝工艺条件为：纺丝液PVA/PEI的总质量百分比浓度为12wt％，其中PVA与PEI的质量比为3∶1，溶剂为水；电压18.6kV，流速0.3mL/h；接收距离为25cm；环境湿度40-50％。

[0018] 所述步骤(2)中PVA的分子量Mw为88000，PEI的Mw为25000。

[0019] 所述步骤(2)中PVA/PEI纳米纤维用25％戊二醛蒸气真空交联处理18h，得到水稳定性良好的纳米纤维。

[0020] 所述步骤(3)中活化LA-PEG-COOH表面的羧基时LA-PEG-COOH∶EDC∶NHS的摩尔比为1∶5∶5。

[0021] 所述步骤(3)中三乙胺∶乙酸酐∶PVA/PEI纳米纤维所含氨基总摩尔数的摩尔比为5∶5∶1。

[0022] 所述步骤(3)中洗涤为用去离子水洗涤3-5次。

[0023] 所述步骤(3)中干燥为真空干燥，干燥时间为12-24h。

[0024] 所述步骤(3)中得到的乳糖酸功能化纳米纤维LA-PEG-PVA/PEI-Ac应用于表面表达去唾液酸糖蛋白受体的肝癌细胞的特异性捕获。

[0025] 本发明基于乳糖酸功能化静电纺纳米纤维，通过培养去唾液酸糖蛋白受体高表达的人肝癌细胞(HepG2)及不表达的人宫颈癌细胞(Hela)在所制备材料及对照材料(不含有LA)上培养，对产品靶向捕获癌细胞性能进行评价。

[0026] 通过核磁共振(NMR)对LA-PEG-COOH的化学基团进行表征。借助扫描电镜(SEM)对戊二醛交联前后的纳米纤维和靶向分子修饰后的纤维形貌进行表征，利用傅里叶变换-红外光谱(FTIR)对其化学结构进行表征。通过紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)对纤维的溶血率进行表征。最后，通过在材料上培养细胞，借助共聚焦显微镜(CLSM)及细胞计数器，研究材料对癌细胞的特异捕获性能。

[0027] 和对照的未经靶向分子乳糖酸功能化纳米纤维捕获癌细胞的效果相比，本发明制备的材料能够显著地提高对人肝癌细胞(HepG2)的捕获能力，因此本发明制备的靶向分子乳糖酸功能化纳米纤维能够作为新型材料用于癌细胞的特异性捕获。

[0028] 核磁共振(NMR)、扫描电镜图(SEM)、傅里叶变换-红外光谱(FTIR)、紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、HepG2细胞及Hela细胞捕获定量试验、HepG2细胞捕获定性试验(激光共聚焦显微镜CLSM)结果分别如下：

[0029] (1)核磁共振(1H NMR)测试结果

[0030] 1H NMR图谱用于表征乳糖酸与聚乙二醇的结合效率。参见说明书附图1：3.9ppm处为LA的特征峰，由a表示。3.4～3.6ppm处为NH2-PEG-COOH中亚甲基的特征峰，由b表示。观察LA的结构，还存在4个LA的质子峰。计算得LA和NH2-PEG-COOH的摩尔比为0.79，证明LA-PEG-COOH已成功合成。

[0031] (2)扫描电镜图(SEM)结果

[0032] SEM图用于表征纳米纤维的形貌和直径大小，参见说明书附图2。所得到的PVA/PEI纳米纤维形貌规整，表面光滑，平均直径为439nm。经过戊二醛蒸气交联后，纤维平均直径有所增加，为525nm，而形貌仍然保持良好。同时，交联后纤维膜颜色由白变粉，这主要是因为PEI上的氨基与戊二醛上的醛基发生缩醛反应。

[0033] 参见说明书附图4，将LA-PEG-COOH和对照材料mPEG-COOH修饰到交联后的PVA/PEI纳米纤维表面后，纳米纤维形貌稍有卷曲，但仍然保持多孔结构，平均直径略有增加，分别为579nm和583nm，这主要是因为纤维在溶液中反应使其部分溶胀所致。

[0034] (3)傅里叶变换-红外光谱(FTIR)结果

[0035] FTIR结果表明，戊二醛已经成功交联了PVA/PEI纳米纤维，且LA-PEG-COOH和对照材料mPEG-COOH成功修饰到戊二醛交联后的PVA/PEI纳米纤维表面。参见说明书附图3。-1
3350cm 处是PVA羟基的特征峰，交联后的峰变宽变强，这主要是与PEI上的氨基、戊二醛-1 -1
的醛基的相互作用造成的。2940cm 处是-CH2-的特征峰。1650cm 处是氨基N-H键的特征峰，从该峰中可以发现交联后的纳米纤维上面仍保留有部分氨基，有利于后续进一步功-1
能化修饰纳米纤维。1600cm 处是交联前后的PVA/PEI纳米纤维主要的不同之处，这是交联后的纳米纤维的的新峰，这表示了C＝N键的生成，意味着PEI的部分氨基与戊二醛的醛基结合，进一步说明了交联的成功。

[0036] 经过LA-PEG-COOH和对照材料mPEG-COOH修饰后，在1620cm-1处均出现新的吸收峰，其为伯酰胺的特征峰，表明LA-PEG-PVA/PEI-Ac及mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维的成功制备。

[0037] (4)紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)测定纤维溶血率

[0038] UV-Vis表征经过LA-PEG-COOH和对照材料mPEG-COOH修饰后的纤维材料的血液相容性，测试结果参见说明书附图5所示。在400-800nm范围内，对照H2O中上清液的吸光值明显较高，这表明血红蛋白含量较高，即红细胞在水中完全涨破，出现严重的溶血现象，但是在LA-PEG-PVA/PEI-Ac、mPEG-PVA/PEI-Ac功能化纳米纤维以及对照PBS中，上清液吸光值很低，说明未发生红细胞涨破。从插图中也可以看出，Eppendorf管H2O组中红细胞基本上被全部破坏，而PBS和实验材料组不存在明显的溶血现象。通过计算得知，经过LA-PEG-COOH和对照材料mPEG-COOH修饰后的纤维材料的溶血率分别为1.66％和3.94％，均小于5％，证明所制备材料血液相容性良好。

[0039] (5)HepG2细胞及Hela细胞捕获定量试验结果

[0040] 以高表达去唾液酸糖蛋白受体的人肝癌细胞(HepG2)及不表达去唾液酸糖蛋白受体的人子宫颈癌细胞(Hela)两种模型细胞来定量检验两种材料LA-PEG-COOH和mPEG-COOH功能化纳米纤维特异性捕获细胞的效果。参见说明书附图6。试验结果表明，对于HepG2细胞而言，细胞捕获效率均随着时间的增加而提高。靶向材料与非靶向材料表现出明显差异。这种优势主要归因于LA介导的靶向捕获。对于Hela细胞而言，无论是LA-PEG-PVA/PEI-Ac，还是mPEG-PVA/PEI-Ac，其捕获细胞效率同样随着时间的增加而提高，但是，靶向材料与非靶向材料间并没有表现出明显的差别。这可能是因为随着时间的延长，细胞会非特异性粘附在纳米纤维表面。

[0041] (6)HepG2细胞捕获定性试验结果

[0042] 以具有去唾液酸糖蛋白受体高表达的人肝癌细胞(HepG2)为模型细胞来定性检验两种材料LA-PEG-COOH和mPEG-COOH功能化纳米纤维捕获HepG2细胞的效果。参见说明书附图7。PI标记的细胞均呈现红色荧光，与定量分析结果一致，LA-PEG-PVA/PEI-Ac(图7(a))在各个时间点捕获癌细胞的数量明显多于mPEG-PVA/PEI-Ac(图7(b))纳米纤维。

[0043] 本发明采用静电纺丝法制备PVA/PEI纳米纤维，充分利用纳米纤维与细胞表面成分(如微绒毛及丝状伪足)及细胞外基质具有相类似的结构，可促进细胞在其表面的粘附及增值；同时，纳米纤维比表面积大、孔隙率高，可提供足够的细胞接触位点；并且纳米纤维易于表面修饰的优势。结合靶向分子的与细胞间的特异结合能力，可达到短时间内特异性捕获癌细胞的目的。

[0044] 有益效果

[0045] (1)本方法制备的靶向分子乳糖酸功能化纳米纤维材料具有良好的形貌、结构稳定性及血液相容性；

[0046] (2)本发明制备的癌细胞捕获材料具有原料价格低廉，制备工艺简单，捕获癌细胞所需时间短、特异性强等优点，在血液中癌细胞分离与癌症早期检测方面具有很好的应用前景。

附图说明

[0047] 图1为本发明制备的LA-PEG-COOH的核磁共振氢谱图；

[0048] 图2为本发明制备的PVA/PEI纳米纤维(a)，戊二醛交联后的PVA/PEI纳米纤维(b)的形貌及直径分布

[0049] 图3为本发明制备PVA/PEI纳米纤维、戊二醛交联后纳米纤维、LA-PEG-COOH和mPEG-COOH功能化纳米纤维以及LA-PEG-COOH的红外图谱；

[0050] 图4为本发明制备的LA-PEG-COOH(a)和对照材料mPEG-COOH(b)修饰后的纳米纤维的扫描电镜图及其直径分布；

[0051] 图5为H2O、PBS及本发明制备的LA-PEG-COOH和mPEG-COOH功能化纳米纤维在人红细胞悬液中处理2h后的紫外吸收图谱(插图为反映其溶血现象的数码照片)；

[0052] 图6为本发明制备的LA-PEG-COOH和mPEG-COOH功能化纳米纤维在不同时间内捕获HepG2细胞(a)及Hela细胞(b)的效率；

[0053] 图7为本发明制备的LA-PEG-COOH(a)和mPEG-COOH(b)功能化纳米纤维对HepG2细胞捕获的共聚焦显微镜图片。

具体实施方式

[0054] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0055] 实施例1

[0056] 首先配置pH＝6的PBS缓冲液(0.2M的磷酸氢二钠2.46mL和0.2M的磷酸二氢钠17.54mL，加180mL水稀释10倍)，作为LA-PEG-COOH合成的反应溶剂。称取NH2-PEG-COOH202.4mg，溶于7mL的PBS中。以摩尔比NH2-PEG-COOH∶LA＝1∶1.5计算所需LA的质量为54.39mg，溶于5mL PBS中。以摩尔比LA∶EDC∶NHS＝1∶1∶1计算所需的EDC和NHS分别为30.48mg和18.30mg，分别溶于1mL PBS中。通过EDC和NHS活化LA中的羧基，反应时间为3h。活化羧基3h后的LA，加入到NH2-PEG-COOH中，在磁力搅拌器上混合反应3d。

[0057] 反应结束后，将反应产物转移至截留分子量为500的透析袋中，在蒸馏水中透析3d(6×2L)。然后进行冷冻干燥处理，得到LA-PEG-COOH反应产物。

[0058] NMR结果显示(图1)，3.9ppm处为LA的特征峰，由a表示。3.4～3.6ppm处为NH2-PEG-COOH中亚甲基的特征峰，由b表示。观察LA的结构，还存在4个LA的质子峰。计算得LA和NH2-PEG-COOH的摩尔比为0.79，证明LA-PEG-COOH已成功合成。

[0059] 实施例2

[0060] 称取9.68732g PVA，将其溶解在71.04g超纯水中，用玻璃棒缓慢搅拌约30min直至PVA粉末完全溶胀，随后放置在磁力搅拌器上80℃水浴加热搅拌3h，得到均匀的浓度为12wt％的PVA溶液，冷却至室温存储在4℃冰箱待用。称取15g已配置好的12wt％的PVA纺丝液，其中PVA的量为1.8g，根据设定混合溶液中PVA与PEI的质量比为3∶1，称取0.6gPEI加入到15g12wt％的PVA纺丝液中，继续加入4.4g水，涡旋混合仪混合后超声处理30min使其分散均匀，磁力搅拌过夜，得到纺丝液中PVA/PEI的总质量百分比浓度为12wt％。采用静电纺丝法制备PVA/PEI纳米纤维，所采用纺丝工艺条件为：纺丝的电压18.6kV；流速0.3mL/h；接收距离为25cm；环境湿度40-50％。

[0061] SEM结果显示所得到的PVA/PEI纳米纤维形貌规整，表面光滑，平均直径为439nm(图2(a))。

[0062] 实施例3

[0063] 将实施例2制备的PVA/PEI纳米纤维毡套在盛有25％的戊二醛溶液的培养皿上方，将两者一起放入干燥器中，抽真空交联18h。

[0064] SEM结果显示，经过戊二醛蒸气交联后，纤维平均直径有所增加，为525nm，而形貌仍然保持良好。同时，交联后纤维膜颜色由白变粉，这主要是因为PEI上的氨基与戊二醛上的醛基发生缩醛反应(图2(b))。FTIR结果表明，戊二醛已成功交联了纳米纤维(图3)。

[0065] 实施例4

[0066] 纳米纤维中质量比PVA∶PEI＝3∶1，所以在131.7mg的纳米纤维膜中，PEI的质量为32.93mg，可以参与酰胺化反应的氨基为0.615mol。以摩尔比羧基∶氨基＝1∶10计算，所需的LA-PEG-COOH为0.0615mol，质量为140.79mg。用EDC和NHS活化羧基的方法对LA-PEG-COOH中的羧基进行活化，以摩尔比LA-PEG-COOH∶EDC∶NHS＝1∶5∶5计算，EDC的量为58.95mg，NHS的量为45.67mg，分别溶于10mL水中，缓慢逐滴加入到含有140.79mg LA-PEG-COOH的10mL水溶液中，从而以总体积为30mL的反应体系进行活化反应。
3小时后，将30mL的LA-PEG-COOH反应液加到PVA/PEI纳米纤维膜的培养皿中，摇床反应
3d。

[0067] 以5倍过量进行乙酰化处理，本实验中三乙胺的密度为0.727g/mL，计算所需的体积为428μL，搅拌30-60min，乙酸酐的密度为1.08g/mL，计算所需的体积为290.67μL，反应12-24h，对纤维表面氨基进行乙酰化处理，以中和纤维表面氨基。

[0068] 扫描电镜结果表明LA-PEG-COOH功能化纳米纤维表面后，纤维的形貌发生卷曲，并且平均直径略有增加，为579nm(图4(a))，这主要是因为纤维在溶液中反应使其部分溶胀所致。FTIR(图3)表明LA-PEG-COOH已成功修饰到纳米纤维表面。

[0069] 实施例5

[0070] 取肝素锂稳定的健康成年人全血5mL，离心3min(转速为3000r/min)，用PBS洗涤沉淀3次，得红细胞。用PBS按照1∶35的比例配置成人红细胞悬液，于4℃冰箱中备用。对照组将0.2mL人红细胞悬液分别溶于0.8mLPBS中和0.8mL蒸馏水中。然后，将所配置的人红细胞悬浊液再稀释5倍，按照纤维毡质量与稀释5倍后人红细胞悬液体积之比为2mg/mL将LA-PEG-PVA/PEI-Ac及mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维浸入稀释5倍后人红细胞悬液中，取4个平行样，在37℃环境下孵育2h。然后，将两个对照组及浸泡过纤维毡的人红细胞悬液离心1min(1000rpm)，取上清液并用Lamada 25型紫外分光光度计测试上清液在400-800nm范围内的吸光值。

[0071] UV-Vis表征结果显示(图5)，在阳性对照组H2O中出现了严重的溶血现象，但是在LA-PEG-PVA/PEI-Ac、mPEG-PVA/PEI-Ac功能化纳米纤维以及阴性对照组PBS中，未发生红细胞涨破。通过计算得知，经过LA-PEG-COOH和对照材料mPEG-COOH修饰后的纤维材料的溶血率分别为1.66％和3.94％，均小于5％，证明所制备材料血液相容性良好。

[0072] 实施例6

[0073] 以具有去唾液酸糖蛋白受体高表达的人肝癌细胞(HepG2)为模型细胞来定量检验实施例4制备的LA-PEG-COOH功能化纳米纤维及对比例1制备的mPEG-COOH功能化纳米纤维特异性捕获HepG2细胞的效果。HepG2细胞培养于MEM培养液中。培养液中添加10％胎牛血清(FBS)及1％双抗(青-链霉素)，并培养于37℃、5％CO2的恒温培养箱，每2天或3天更换一次培养液。将LA-PEG-PVA/PEI-Ac及mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维剪成圆形(Φ＝14mm)，放入24孔培养板，用钢环固定。随后加入1mL 75％酒精浸泡，并同时紫外照射杀菌2h。吸出酒精，用PBS溶液浸泡漂洗3次，每次20分钟。最后用400μL纯的DMEM培养基浸泡，放入恒温培养箱过夜。

[0074] 取培养好的HepG2细胞接种于24孔培养板，按照105个/孔的密度接种，每孔体积400μL，“8”字形摇匀。在培养箱中培养一定时间后(20min、40min、60min、120min、240min)，吸取上清液，用PBS将纤维毡清洗三遍，并与上清液混合，用细胞计数器测定该培养液中剩余细胞的个数，每个时间点设置4个平行孔。计算得知两种材料对肝癌细胞的捕获效率。

[0075] 细胞计数试验结果表明(图6(a))，细胞捕获效率均随着时间的增加而提高。靶向材料与非靶向材料表现出明显差异。这种优势主要归因于LA介导的靶向捕获作用。

[0076] 实施例7

[0077] 以人肝癌细胞(HepG2)为模型细胞来定性检验实施例4制备的LA-PEG-COOH功能化纳米纤维及对比例1制备的mPEG-COOH功能化纳米纤维特异性捕获HepG2细胞的效果。如实施例6所示，在纤维毡上培养HepG2细胞一定时间后(20min、40min、60min、120min、
240min)，用PBS缓冲溶液洗涤3遍，并用2.5％的戊二醛溶液在4℃条件下固定15min。取
20μL碘化丙啶(1mg/mL)在37℃条件下染色15min。采用共聚焦显微镜(10×)观察细胞在纳米纤维表面的分布。

[0078] 激光共聚焦结果表明(图7)，PI标记的细胞均呈现红色荧光，与定量分析结果一致，LA-PEG-PVA/PEI-Ac(图7(a))在各个时间点捕获癌细胞的数量明显多于mPEG-PVA/PEI-Ac(图7(b))纳米纤维。

[0079] 对比例1

[0080] 纳米纤维中质量比PVA∶PEI＝3∶1，所以在126.1mg的纳米纤维膜中，PEI的质量为31.525mg，可以参与酰胺化反应的氨基为0.5889mol。以摩尔比羧基∶氨基＝1∶10计算，所需的mPEG-COOH为0.059mol，质量为118mg。用EDC和NHS活化羧基的方法对mPEG-COOH中的羧基进行活化，以摩尔比mPEG-COOH∶EDC∶NHS＝1∶5∶5计算，EDC的量为56.55mg，NHS的量为33.95mg分别溶于10mL水中，缓慢逐滴加入到含有118mg mPEG-COOH的10ml水溶液中，从而以总体积为30mL的反应体系进行活化反应。3h后，将
30mL的mPEG-COOH反应液加到PVA/PEI纳米纤维膜的培养皿中，摇床反应3d。

[0081] 以5倍过量进行乙酰化处理，本实验中三乙胺的密度为0.727g/mL，计算所需的体积为409.8μL，乙酸酐的密度为1.08g/mL，计算所需的体积为278.34μL。其操作过程为，先加入三乙胺，搅拌30-60min，再加入乙酸酐，反应12-24h，使纳米纤维表面的氨基全部乙酰化。

[0082] 扫描电镜结果表明mPEG-COOH功能化纳米纤维表面后，纤维的形貌发生卷曲，并且平均直径略有增加，为583nm(图4(b))，这主要是因为纤维在溶液中反应使其部分溶胀所致。FTIR(图3)表明mPEG-COOH已成功修饰到纳米纤维表面。

[0083] 对比例2

[0084] 以不表达去唾液酸糖蛋白受体的人子宫颈癌细胞(Hela)为模型细胞来检验实施例4制备的LA-PEG-COOH功能化纳米纤维及对比例1制备的mPEG-COOH功能化纳米纤维捕获不含靶向配体的Hela细胞的效果。材料处理方法同实施例6。所用培养基为DMEM。

[0085] 细胞计数试验结果表明(图6(b))，无论是LA-PEG-PVA/PEI-Ac还是mPEG-PVA/PEI-Ac纳米纤维，其捕获细胞效率同样随着时间的增加而提高，但是，靶向材料与非靶向材料间并没有表现出明显的差别。这可能是因为随着时间的延长，细胞会非特异性粘附在纳米纤维表面。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种纤维原纤化的测试方法	2020-05-12	145
具有原纤化纤维的过滤介质	2020-05-12	179
一种评价纤维原纤化性能的方法	2020-05-12	780
天丝纤维织物的原纤化处理工艺	2020-05-12	772
可溶化胶原纤维棉球	2020-05-11	584
原纤化纤维素酯纤维及其制造方法	2020-05-11	646
一种化纤原料研磨装置	2020-05-13	22
一种化纤原料筛选装置	2020-05-13	717
化纤原料烘干锅	2020-05-11	924
一种化纤原料筛选筒	2020-05-13	289

一种用于捕获癌细胞的乳糖酸功能化纳米纤维的制备方法