流感病毒基质2蛋白的胞外域、其表达系统和应用
阅读：458发布：2021-05-12
专利汇可以提供流感病毒基质2蛋白的胞外域、其表达系统和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供多核苷酸、多肽、重组的改良型痘苗病毒安卡拉株(rMVA)和相关 疫苗 组合物以及用于 预防 和 治疗 流感 病毒感染 的方法。提供编码多拷贝M2流感病毒胞外域肽的分离多核酸或含所述多核苷酸的rMVA。还提供诱导对象针 对流 感病毒免疫响应的方法或治疗感染流感病毒引起或导致的 疾病 或症状的方法。，下面是流感病毒基质2蛋白的胞外域、其表达系统和应用专利的具体信息内容。
1.一种含编码多肽的编码区域的分离多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含至少5种流感病毒基质2蛋白(M2)胞外域肽。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意5种或更多下述氨基酸序列：
i.SEQ ID NO:1(M2e#1_C);
ii SEQ ID NO:2(M2e#2_C);
iii.SEQ ID NO:3(M2e#3_C);
iv.SEQ ID NO:4(M2e#4_C);
v.SEQ ID NO:5(M2e#5_C);
vi.SEQ ID NO:6(M2e#6_C);
vii SEQ ID NO:7(M2e#1_S);
viii.SEQ ID NO:8(M2e#2_S);
ix.SEQ ID NO:9(M2e#3_S);
x.SEQ ID NO:10(M2e#4_S);
xi.SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和
xii.SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。
3.一种含编码多肽的编码区域的分离多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含相对彼此以任何顺序排列的任意3种或更多下述M2胞外域肽：
i.SEQ ID NO:1(M2e#1_C);
ii.SEQ ID NO:2(M2e#2_C);
iii.SEQ ID NO:3(M2e#3_C);
iv.SEQ ID NO:4(M2e#4_C);
v.SEQ ID NO:5(M2e#5_C);
vi.SEQ ID NO:6(M2e#6_C);
vii SEQ ID NO:7(M2e#1_S);
viii.SEQ ID NO:8(M2e#2_S);
ix.SEQ ID NO:9(M2e#3_S);
x.SEQ ID NO:10(M2e#4_S);
xi.SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和
xii SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意3种或更多下述M2胞外域肽：
i.SEQ ID NO:1(M2e#1_C);
ii SEQ ID NO:2(M2e#2_C);
iii.SEQ ID NO:3(M2e#3_C);
iv.SEQ ID NO:4(M2e#4_C);
v.SEQ ID NO:5(M2e#5_C);和
vi.SEQ ID NO:6(M2e#6_C)。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意3种或更多下述M2胞外域肽：
i.SEQ ID NO:1(M2e#1_S);
ii.SEQ ID NO:2(M2e#2_S);
iii.SEQ ID NO:3(M2e#3_S);
iv.SEQ ID NO:4(M2e#4_S);
v.SEQ ID NO:5(M2e#5_S);和
vi.SEQ ID NO:6(M2e#6_S)。
6.如权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意4种或更多所述M2胞外域肽。
7.如权利要求3-6中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意5种或更多所述M2胞外域肽。
8.如权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意6种或更多所述M2胞外域肽。
9.如权利要求1-5、7和8中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的下述M2胞外域肽：SEQ ID NO:1(M2e#1_C),SEQ ID NO:2M2e#2_C),SEQ ID NO:3(M2e#3_C),SEQ ID NO:4(M2e#4_C),SEQID NO:5(M2e#5_C),和SEQ ID NO:6(M2e#6_C)。
10.如权利要求1-4、5、7和8中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的下述M2胞外域肽：SEQ ID NO:7(M2e#1_S),SEQ ID NO:8(M2e#2_S),SEQ ID NO:9(M2e#3_S),SEQ ID NO:10(M2e#4_S),SEQ ID NO:11(M2e#5_S),和SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。
11.如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽诱导针对流感病毒的免疫响应。
12.如权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述至少2种基质2蛋白(M2)胞外域肽融合在一起而之间没有插入接头肽。
13.如权利要求1-12中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述至少2种M2胞外域肽之间插有接头肽。
14.如权利要求13所述的多核苷酸，其特征在于，所述接头肽包含至少5种氨基酸。
15.如权利要求13或14所述的多核苷酸，其特征在于，所述接头肽与低等生物中发现的氨基酸序列具有同源性。
16.如权利要求13-15中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述接头肽与灵长类动物中发现的氨基酸序列不具有同源性。
17.如权利要求16所述的多核苷酸，其特征在于，所述一种或多种接头肽包含选自SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和其任何组合的氨基酸序列。
18.如权利要求1-17中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽还包含至少一种T细胞表位。
19.如权利要求18所述的多核苷酸，其特征在于，所述至少一种T细胞表位包含一种或多种SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
20.如权利要求1-19中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含SEQID NO:16的氨基酸序列[METR_C形式-全长]。
21.如权利要求1-19中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含SEQID NO:18的氨基酸序列[METR_S形式-全长]。
22.如权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码区域经密码子优化用于在人中表达。
23.如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码区域还包含可操作连接所述流感病毒基质2蛋白(M2)胞外域肽编码区域的启动子。
24.如权利要求23所述的多核苷酸，其特征在于，所述启动子包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码区域还包含其他多肽。
26.如权利要求25所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽为血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质1蛋白(M1)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亚基(PA)、RNA聚合酶PB1亚基(PB1)、RNA聚合酶PB2亚基(PB2)、或两种或更多所述流感多肽或其片段的组合。
27.如权利要求26所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽是HA或其片段。
28.如权利要求27所述的多核苷酸，其特征在于，所述HA包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
29.如权利要求26所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽是NP或其片段。
30.如权利要求29所述的多核苷酸，其特征在于，所述NP包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
31.如权利要求25所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽是His-标签、泛素标签、NusA标签、壳多糖结合域、ompT、ompA、pelB、DsbA、DsbC、c-myc、KSI、聚天冬氨酸、(AIa-Trp-Trp-Pro)n(SEQ ID NO:28)、聚苯丙氨酸、聚胱氨酸、聚精氨酸、B-标签、HSB-标签、绿色荧光蛋白(GFP)、钙调蛋白结合蛋白(CBP)、半乳糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)、纤维素结合蛋白(CBD's)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、链球菌蛋白G、葡萄球菌蛋白A、T7genelO、亲和素/链霉亲和素/iStrep-标签、trpE、氯霉素乙酰基转移酶、lacZ(D-半乳糖苷酶)、His-修补硫氧还蛋白、硫氧还蛋白、FLAGTM肽、S-标签、T7-标签、或两种或更多所述多肽的组合。
32.一种包含权利要求1-31中任一项所述多核苷酸的载体。
33.如权利要求32所述的载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。
34.如权利要求33所述的载体，其特征在于，所述病毒载体选自下组：痘苗病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和逆转录病毒载体。
35.如权利要求34所述的载体，其特征在于所述痘苗病毒载体包含改良的痘苗病毒安卡拉株（MVA）。
36.如权利要求35所述的载体，其特征在于，所述载体还表达其他多肽。
37.如权利要求36所述的载体，其特征在于，所述其他多肽为血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质1蛋白(M1)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亚基(PA)、RNA聚合酶PB1亚基(PB1)、RNA聚合酶PB2亚基(PB2)、或两种或更多所述流感多肽或其片段的组合。
38.如权利要求37所述的载体，其特征在于，所述其他多肽是HA或其片段。
39.如权利要求38所述的载体，其特征在于，所述HA包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
40.如权利要求37所述的载体，其特征在于，所述其他多肽是NP或其片段。
41.如权利要求40所述的载体，其特征在于，所述NP包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
42.如权利要求35-41中任一项所述的载体，其特征在于，所述MVA能在禽类细胞中复制。
43.如权利要求42所述的载体，其特征在于，所述禽类细胞是永生的。
44.如权利要求42或43所述的载体，其特征在于，所述禽类细胞是鸭细胞。
45.如权利要求44所述的载体，其特征在于，所述鸭细胞是栖鸭属视网膜细胞系或胚胎来源的细胞系。
46.如权利要求44或45所述的载体，其特征在于，所述鸭细胞是AGE1cr、AGE.pIX或EB66。
47.如权利要求35-46中任一项所述的载体，其特征在于，所述多核苷酸插入所述MVA基因组中天然产生的缺失位点内。
48.如权利要求47所述的载体，其特征在于，所述天然产生的缺失位点是缺失位点3。
49.如权利要求35-48中任一项所述的载体，其特征在于，所述多核苷酸插入所述MVA基因组的开放阅读框（ORF）。
50.如权利要求32-49中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体给予需要的对象时诱导针对流感病毒的免疫响应。
51.如权利要求50所述的载体，其特征在于，所述免疫响应是体液免疫响应、细胞介导的免疫响应或体液和细胞介导的免疫响应的组合。
52.如权利要求32-51中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体能预防、缓解或治疗有关流感病毒的疾病或病症。
53.一种含权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸或权利要求32-52中任一项所述的载体的宿主细胞。
54.如权利要求53所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还包含其他重组MVA，所述MVA包含编码至少一种流感病毒蛋白或其片段的多核苷酸。
55.如权利要求54所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是禽类细胞。
56.如权利要求56-55中任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是永生的。
57.如权利要求56-56中任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是鸭细胞。
58.如权利要求57所述的宿主细胞，其特征在于，所述鸭细胞是栖鸭属视网膜细胞或胚胎来源干细胞。
59.如权利要求58所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是AGE1cr、AGE1cr.pIX或EB66。
60.一种由权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸或权利要求32-52中任一项所述的载体或权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞所编码的多肽。
61.一种生产流感病毒多肽的方法，所述方法包括培养权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞并回收所述多肽。
62.一种含权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求32-52中任一项所述的载体、权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞或权利要求60所述的多肽和药学上可接受运载体的组合物。
63.如权利要求62所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。
64.如权利要求63所述的组合物，其特征在于，所述佐剂选自下组：明矾、膨润土、胶乳和丙烯酸颗粒、普流罗尼克嵌段聚合物、鲨烯、贮存形成剂、表面活性材料、溶血卵磷脂、视黄醛、Quil A、脂质体、和普流罗尼克聚合物制剂;巨噬细胞刺激物、交替途径补充活化剂、非离子型表面细菌组分、铝基盐;钙基盐;二氧化硅;多核苷酸;类毒素;血清蛋白、病毒和病毒衍生的材料、毒剂、毒液、咪唑喹啉化合物、泊洛沙姆、toll-样受体(TLR)激动剂、mLT、CpG、MPL、阳离子脂质、Qs21、和两种或更多所述佐剂的组合。
65.如权利要求62-64中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含其他流感病毒疫苗。
66.如权利要求65所述的组合物，其特征在于，所述其他流感疫苗包含MVA，所述MVA编码相对彼此以任何顺序排列的一种或多种下述蛋白或其片段：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质1蛋白(M1)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亚基(PA)、RNA聚合酶PB1亚基(PB1)、RNA聚合酶PB2亚基(PB2)。
67.如权利要求66所述的组合物，其特征在于，所述蛋白是HA或其片段。
68.如权利要求67所述的组合物，其特征在于，所述HA包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
69.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，所述蛋白是NP或其片段。
70.如权利要求69所述的组合物，其特征在于，所述NP包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
71.一种药盒，所述药盒包括：(a)权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求
32-52中任一项所述的载体、权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞、权利要求60所述的多肽或权利要求62-70中任一项所述的组合物；和(b)给予所述多核苷酸、载体、MVA、宿主细胞、多肽组合物或其任何组合的方法。
72.一种诱导需要的对象中针对流感病毒的免疫响应的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求32-52中任一项所述的载体、权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞、权利要求60所述的多肽或权利要求62-70中任一项所述的组合物，或其任何组合。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述免疫响应包含抗体应答。
74.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述免疫响应包含细胞介导的免疫响应。
75.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述免疫响应包含细胞介导的免疫响应和抗体应答。
76.如权利要求72-75中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫响应是粘膜免疫响应。
77.一种治疗、预防、或减少需要的对象中流感病毒感染的症状或流感病毒感染相关病症的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求32-52中任一项所述的载体、权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞、权利要求60所述的多肽或权利要求62-70中任一项所述的组合物，或其任何组合。
78.一种减弱或改善需要的对象中流感病毒感染引起的症状或流感病毒感染相关病症的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求32-52中任一项所述的载体、权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞、权利要求60所述的多肽或权利要求62-70中任一项所述的组合物，或其任何组合。
79.一种针对流感病毒感染对需要的对象进行疫苗接种的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求
32-52中任一项所述的载体、权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞、权利要求60所述的多肽或权利要求62-70中任一项所述的组合物，或其任何组合。
80.如权利要求72-79中任一项所述的方法，其特征在于，所述流感病毒是A型流感病毒。
81.如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述A型流感病毒包含H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7或H9型血凝素。
82.如权利要求72-81中任一项所述的方法，其特征在于，所述流感病毒选自鸟或哺乳动物。
83.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
84.如权利要求72-83中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象是动物。
85.如权利要求72-84中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象是脊椎动物。
86.如权利要求72-85中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。
87.如权利要求86所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
88.如权利要求72-87中任一项所述的方法，其特征在于，所述给予通过硬膜内注射、皮下注射、静脉注射、口服给予、粘膜给予、鼻内给予或经肺给予进行。
89.如权利要求72-88中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象有感染流感病毒的风险。
90.如权利要求72-89中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给予至少一次初免的步骤。
91.如权利要求90所述的方法，其特征在于，所述初免包括给予疫苗组合物。
92.如权利要求91所述的方法，其特征在于，所述疫苗组合物是DNA疫苗或多肽疫苗。
93.如权利要求72-89中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给予至少一次加强免疫的步骤。
94.如权利要求93所述的方法，其特征在于，所述加强免疫包括给予疫苗组合物。
95.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述疫苗组合物是DNA疫苗或多肽疫苗。
96.如权利要求90、91、93或94所述的方法，其特征在于，所述疫苗组合物包含权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求32-52中任一项所述的载体、权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞、权利要求60所述的多肽、权利要求62-70中任一项所述的组合物，或其任何组合。
97.一种生产针对流感病毒的疫苗的方法，所述方法包括：(a)培养权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞和(b)从所述宿主细胞中分离所述MVA。
98.如权利要求13所述的载体，其特征在于，所述M2胞外域肽之间插有接头肽。
流感病毒基质2蛋白的胞外域、其表达系统和应用
技术背景
[0001] 流感病毒是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）家族的负义RNA成员，引起人和动物疾病。流感病毒感染常见且可为流行性或季节性。尽管流感病毒感染不常引起感染个体的死亡，但发病率严重。因此，流感病毒流行可导致重大经济损失。此外，流感病毒感染对某些个体群可能更危险，如心脏病患者、C.A.R.A.患者或年长者。
[0002] 流感病毒以复发方式引起疾病，这是由于许多复杂的因素，包括：1)水鸟和水禽中存在不同亚型流感A病毒的已建立储器;2)禽流感病毒与其他动物如猪的流感病毒重组的能力，该过程称为‘抗原转移’;3)由于缺乏病毒RNA聚合酶的校对活性而在病毒基因产物中积累的突变，该过程称为‘抗原漂移’(Tollis,M.和L.Di Trani,Vet.J.164:202-215(2002))。抗原转移、抗原漂移和禽流感病毒感染其他宿主如猪和人的能力产生导致人严重疾病的新病毒。这些重配和突变事件组合引起病毒两种表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)中良好表征的抗原可变性，其为所述病毒提供逃逸先前感染或接种疫苗诱导所产生的免疫响应（尤其是中和抗体）的机制。(Palese,P.和J.F.Young,Science 215:1468-1474;Gorman,O.T., 等，Curr.Top.Microbiol.Immunol176:75-97;和Yewdell,J.W.,等，Nature 279:246-248)。
[0003] 为了预测可能对人类健康具有全球影响的特定流感亚型，必须依赖监督程序生产流感疫苗。生产亚型匹配疫苗（由灭活的或‘裂解的’病毒颗粒组成）的时间一般最少需要6-8个月。面对病毒亚型引起的严重流感病毒流行时，这种时间延迟可能导致全国或全球传播，发病率和死亡率极高。因此，非常需要对不同亚型流感病毒有效的流感疫苗。
[0004] 流感病毒包含单链RNA的8个区段-形成该病毒的遗传指令。其表面覆盖有一层两种不同糖蛋白：一种由血凝素（HA）分子构成，另一种由神经氨酸酶（NA）构成。病毒衣壳由病毒核糖核酸和若干所谓的“内部”蛋白（聚合酶（PB1、PB2和PA）、基质蛋白（M1）和核蛋白（NP））构成。由于传统上已证实针对HA和NA的抗体在对抗感染方面最有效，很多研究都集中在这些分子的结构、功能和遗传变异方面。
[0005] 不同于HA和NA，跨膜病毒M2蛋白（M2e）的外部结构域高度保守且针对该表位的抗体在小鼠中具有保护性(Treanor,J.J.，等，J.Virol.64:1375-1377(1990);Frace,A.M.,等，Vaccine 17:2237-2244(1999);Wanli,L.，等，Immunol.Lett.93:131-136(2004);和Fan,J.,等，Vaccine 22:2293-3003(2004))。所述M2蛋白是A型流感病毒的整合膜蛋白，在病毒感染细胞的质膜上表达。由于病毒中该蛋白丰度低，所以针对该表位的抗体应答的保护机制不是通过病毒中和介导，而是通过抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性。
(Jegerlehner,A.,等，J.Immunol.172:5598-5605(2004))。
(Jegerlehner,A.,等，J.Immunol.172:5598-5605(2004))。
[0006] 开发诱导免疫响应疫苗的主要障碍是选择合适的递送形式。单独使用或一起使用的DNA质粒疫苗和病毒载体，以及重组蛋白或肽是合理的疫苗递送形式，但是，各种形式有其优点和缺点。例如，DNA疫苗容易生产且给予安全，但效力不足，尤其是临床试验中，需要给予大（毫克）剂量。Liu,M.A.J.Intern.Med.253:402-410(2003)。使用病毒载体递送疫苗已引发关注，通常涉及安全性和对载体的预存免疫性。因此，非常需要开发安全有效的新流感疫苗。发明内容
[0007] 本发明提供一种含编码多肽的编码区域的分离多核苷酸，其中所述多肽包含至少5种流感病毒基质2蛋白(M2)胞外域肽。在一个实施方式中，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的下述氨基酸序列的任何5种或更多：(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii).SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii)SEQ ID NO:7(M2e#1_S);(viii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(ix)SEQ ID NO:9(M2e#3_S);(x)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(xi)SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和(xii)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。
[0008] 还提供含编码多肽的编码区域的分离多核苷酸，其中所述多肽包含相对彼此以任何顺序排列的下述M2胞外域肽的任何3种或更多：(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQ ID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii)SEQID NO:7(M2e#1_S);(viii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(ix)SEQ ID NO:9(M2e#3_S);(x)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(xi)SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和(xii)SEQ ID NO:12(M2e#6_S).在一个实施方式中，所述多核苷酸包含编码多肽的编码区域，所述多肽含相对彼此以任何顺序排列的下述6种M2胞外域肽：(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);和(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C)或(i)SEQ ID NO:7(M2e#1-S);(ii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(iii)SEQID NO:9(M2e#3_S);(iv)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(v)SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和(vi)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)的氨基酸序列。
[0009] 在某些实施方式中，本发明多核苷酸编码多肽，所述多肽含相对彼此以任何顺序排列的6种M2胞外域肽，在至少两种M2胞外域肽之间插有至少一种接头肽，且任选地在至少两种M2胞外域肽之间插有表位。所述表位可为T细胞表位或B细胞表位。
[0010] 在一些实施方式中，本发明针对含编码多肽的多核苷酸的载体，所述多肽含多拷贝的M2胞外域肽。所述载体可为病毒载体，如痘苗病毒载体，如改良的痘苗病毒安卡拉株(MVA)。本发明载体还可表达其他多肽，如流感病毒蛋白或其片段。所述其他多肽可选自下组：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质1蛋白(M1)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亚基(PA)、RNA聚合酶PB1亚基(PB1)、RNA聚合酶PB2亚基(PB2)、或其两种或更多组合。在其他实施方式中，本发明是含所述载体和所述多核苷酸所编码分离多肽的宿主细胞。
[0011] 还包括含所述多核苷酸、所述载体如MVA、所述宿主细胞或所述多核苷酸以及药学上可接受运载体的组合物。在一个实施方式中，本发明的疫苗组合物还包括其他流感疫苗组合物。其他流感疫苗可包括表达流感病毒或其片段的MVA。
[0012] 在其他实施方式中，本发明包括诱导需要的对象中针对流感病毒的免疫响应的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述多肽或所述组合物，或其任何组合。还提供治疗、预防、或减少需要的对象中流感病毒感染的症状或有关流感病毒感染的病症的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述多肽或所述组合物，或其任何组合。本发明还涉及减弱或改善需要的对象中流感病毒感染引起的症状或有关流感病毒感染的病症的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述多肽或所述组合物，或其任何组合。在其他实施方式中，本发明包括为需要的对象针对流感病毒感染进行疫苗接种的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述多肽或所述组合物，或其任何组合。
[0013] 本文所用的鉴定序列如下：
[0014] SEQ ID NO:1:具有半胱氨酸的M2胞外域#1的氨基酸序列(M2e#1_C)
[0015] SEQ ID NO:2:具有半胱氨酸的M2胞外域#2的氨基酸序列(M2e#2_C)
[0016] SEQ ID NO:3:具有半胱氨酸的M2胞外域#3的氨基酸序列(M2e#3_C)
[0017] SEQ ID NO:4:具有半胱氨酸的M2胞外域#4的氨基酸序列(M2e#4_C)
[0018] SEQ ID NO:5:具有半胱氨酸的M2胞外域#5的氨基酸序列(M2e#5_C)
[0019] SEQ ID NO:6:具有半胱氨酸的M2胞外域#6的氨基酸序列(M2e#6_C)
[0020] SEQ ID NO:7:具有丝氨酸取代的M2胞外域#1的氨基酸序列(M2e#1_S)
[0021] SEQ ID NO:8:具有丝氨酸取代的M2胞外域#2的氨基酸序列(M2e#2_S)
[0022] SEQ ID NO:9:具有丝氨酸取代的M2胞外域#3的氨基酸序列(M2e#3_S)
[0023] SEQ ID NO:10:具有丝氨酸取代的M2胞外域#4的氨基酸序列(M2e#4_S)
[0024] SEQ ID NO:11:具有丝氨酸取代的M2胞外域#5的氨基酸序列(M2e#5_S)
[0025] SEQ ID NO:12:具有丝氨酸取代的M2胞外域#6的氨基酸序列(M2e#6_S)
[0026] SEQ ID NO:13:编码流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的基质2（M2）蛋白的核酸序列
[0027] SEQ ID NO:14:流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的基质2（M2）蛋白的氨基酸序列
[0028] SEQ ID NO:15：编码METR_C多肽的核酸序列
[0029] SEQ ID NO:16：METR_C多肽的氨基酸序列
[0030] SEQ ID NO:17：编码METR_S多肽的核酸序列
[0031] SEQ ID NO:18：METR_S多肽的氨基酸序列
[0032] SEQ ID NO:19：编码NP共有序列的核酸序列
[0033] SEQ ID NO:20：NP共有序列的氨基酸序列
[0034] SEQ ID NO:21-25:接头肽
[0035] SEQ ID NO:26-27:T细胞表位
[0036] SEQ ID NO:28：人工序列
[0037] SEQ ID NO:29-30:启动子
[0039] SEQ ID NO:32-50:引物
[0040] SEQ ID NO:51:编码流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的HA蛋白的核酸序列[0041] SEQ ID NO:52:编码流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的HA蛋白的氨基酸序列
[0042] SEQ ID NO:53:编码流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的M2蛋白的跨膜结构域的核酸序列
[0043] SEQ ID NO:54:流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的M2蛋白的跨膜结构域的氨基酸序列
[0044] SEQ ID NO:55：METR_C多肽的氨基酸序列
[0045] SEQ ID NO:56：METR_S多肽的氨基酸序列
[0047] 图1是重组载体vEM011的示意载体图。缩写如下：术语“AmpR”代表用于在细菌中选择的氨苄青霉素抗性基因；术语“侧接(Flank)1/侧接2Del III”代表与MVA基因组中缺失位点III的侧接区域同源的序列;术语“Ps”表示强合成启动子;BsdR表示编码杀稻瘟菌素抗性的基因;术语“GFP”表示编码绿色荧光蛋白的基因;术语“F1Del 3rpt”代表侧接1Del III的后部重复;术语“LacZ”表示用于检测细菌的大肠杆菌（E.coli）Lac Z基因。
[0048] 图2显示含流感病毒A基因的重组载体的示意载体图：(A)vEM47编码NP共有序列;(B)vEM57编码M2胞外域串联重复(METR_C)肽;(C)vEM58编码M2胞外域串联重复-丝氨酸取代的(METR_S)肽;(D)vEM61编码流感病毒A/Puerto Rico/8/34的全长基质2结构域(Pr8M2);(E)vEM62编码源自流感病毒A/Puerto Rico/8/34的基质2结构域的跨膜结构域(Pr8M2e-TML);和(F)vEM65编码流感病毒A/Puerto Rico/8/34的血凝素蛋白(Pr8HA)。
[0049] 图3显示各种MVAtor的PCR产物:(A)MVAtor-NP共有(mEM10);(B)MVAtor-METR_C(mEM18);(C)MVAtor-METR_S(mEM19); 以 及 (D)MVAtor-Pr8M2(mEM22),MVAtor-Pr8M2e_TML(mEM23)和MVAtor-Pr8HA(mEM17)。
[0050] 图4显示示例性PCR片段的示意图。缩写如下：术语“侧接1Del3”表示插入位点缺失3的侧接序列1；术语“Ps”表示痘苗病毒强合成启动子;术语“flu基因”表示编码感兴趣基因的基因，即分别为HA、NP、M2e、M2e_TML和METR;和术语“侧接2Del3”代表缺失3的侧接序列2。
[0051] 图5代表以下各种MVAtor表达的流感病毒蛋白的Western印迹分析：MVAtor-NP共有(mEM10)、MVAtor-METR_C(mEM18)和MVAtor-METR_S(mEM19)。
[0052] 图6代表用MVAtor-Pr8HA(MVAtor-Pr8)感染的CEF细胞、模拟感染的CEF细胞和用MVAtor(MVAtor)感染的CEF细胞的血球吸附试验(HAD)。
[0053] 图7代表用于检测CEF细胞中Pr8M2的免疫试验：(A)用MVAtor-Pr8M2感染的细胞;和(B)用MVAtor-Pr8M2e_TML感染的细胞。
[0054] 图8代表用以下表达流感病毒蛋白的MVAtor免疫后的体重变化百分比：Pr8M2(灰色,大实心圆)、Pr8M2e-TML(黑色,星号)、METR-C(灰色,小空心圆)、METR-S(灰色,实心菱形)、NP共有(黑色,实心三角)、MVAtor(黑色,大空心圆),和PBS(黑色,小实心圆)。
[0055] 图9表示免疫小鼠中的病毒负荷。获取每组四个小鼠中每个的肺重量以表示50％组织培养感染剂量(TCID50)/肺重量。
[0056] 图10表示来自用MVA疫苗免疫的小鼠的血清的ELISA，使用小鼠IgG抗-M2e抗体(14C2)。本实验中使用的M2e肽(M2e#1(第4行)、M2e#4(第3行)、M2e#5(第2行)和M2e#6(第1行))示于表1。
[0057] 图11显示鼻内(IN)递送（图11A）和肌肉内（IM）递送（图11B）的MVA疫苗免疫小鼠的体重减少。
[0058] 图12代表鼻内递送（左柱）和肌肉内递送（右柱）的MVA疫苗免疫小鼠的病毒负荷。
[0059] 图13表示用表达流感病毒蛋白的MVAtor免疫后小鼠的体重变化百分比：HA(灰色,实心方块)、NP(灰色,实心三角)、M2(灰色,实心菱形),和M2+NP(灰色,星号)以及对照:MVAtor(黑色,实心菱形)和非致死的H1N1 PR8(黑色,实心圆)。
[0060] 图14的ELISA结果显示免疫有1d21 MVA、2d21 MVA、1d21 MVA+NP、2d21 MVA+NP、1d21 MVA-M2eA+MVA-NP、2d21 MVA-M2eA+MVA-NP、1d21非致死H1N1 PR8和2d21非致死H1N1 PR8MVA的小鼠的抗-NP(IgG抗-NP)免疫响应，使用第42天血清（攻击前）。
[0061] 图15表示H1N1 PR8病毒攻击后第2天（左柱）和第4天（右柱），免疫有MVA、MVA-HA、MVA-NP、MVA-M2eA、MVA-M2e+NP和A/PR/8/34的小鼠的病毒负荷。获取各小鼠中每个的肺重量以表示50％组织培养感染剂量(TCID50)/肺重量。
[0062] 图16A表示用表达流感病毒蛋白的MVAtor免疫后的体重变化百分比：MVA-PR8HA(黑色,小实心菱形),MVA-PR8-M2+NP(黑色,实心方形),和MVA-PR8-C+NP(灰色,大实心菱形)以及对照:PBS(黑色,三角)。
[0063] 图16B代表用表达表9所示全部流感病毒蛋白以及阴性对照的MVAtor免疫后的体重变化百分比。
[0064] 图17的ELISA结果显示免疫有ConsNP,PR9M2+ConsNP、PR8M2e-TML+ConsNP、METR-C+ConsNP和METR-S+ConsNP的小鼠抗-NP(IgG抗-NP)免疫响应，使用第42天血清（攻击前）。
[0065] 图18的ELISA结果显示免疫有M2、M2-TML、METR-C、METR-S、M2+NP、M2-TML+NP、METR-C+NP和METR-S+NP的小鼠抗-M2(IgG抗-M2e肽)免疫响应，使用第42天血清（攻击前）。
[0066] 图19表示用H1N1 PR8病毒攻击3天后鼻内（左柱）或肌肉内（右柱）免疫有PBS(IN)、MVAtor、NP、M2、M2e-TML、METR-C、METR-S,HA和亚致死性PR8(IN)的小鼠肺中的病毒负荷。获取每只小鼠的肺重量以表示50％组织培养感染剂量(TCID50)/肺重量。
[0067] 图20A表示用表达流感病毒蛋白的MVAtor免疫后的体重变化百分比：M1+NP+METR-C(黑色,实心方块)、M1+NP+M2(灰色,空心三角)、M2+NP(灰色,X)、M1(黑色,星号)和M1+NP(灰色,实心圆)以及对照:Flulaval(黑色,实心菱形)、MVAtor(黑色,小实心方块)和PBS(黑色,实心三角)。
[0068] 图20B显示用表达流感病毒蛋白的MVAtor免疫的小鼠的存活数据百分比：M1+NP+METR-C(灰色,实心方块)、M1+NP+M2(灰色,空心三角)、M2+NP(灰色,X)、M1(黑色,星号)和M1+NP(灰色,实心圆)以及对照:Flulaval(黑色,空心菱形)、MVAtor(黑色,实心方块)和PBS(黑色,实心菱形)。
[0069] 图21的ELISA结果显示免疫有PBS,MVAtor,M1+NP+METRC,M1+NP+M2,M2+NP,M1,M1+NP和Flulaval的小鼠抗-NP(左半边)和抗M2（右半边）免疫响应，使用第39天血清（攻击前）。水平线表示组平均值。未就M1治疗组评估IgG抗-M2水平。
[0070] 图22A的ELISA结果显示免疫有PBS、MVAtor、M1+NP+METRC、M1+M2+NP、M2+NP、M1、M1+NP和Flulaval的小鼠抗-M1免疫响应，使用第39天血清（攻击前）。水平线表示组平均值。
[0071] 图22B的ELISA结果显示免疫有MVAtor、M1+M2+NP、M2+NP、M1和M1+NP的小鼠抗-MVA免疫响应，使用第21天（初免后）（左半边）和第39天（攻击前）（右半边）血清。水平线表示组平均值。
[0072] 图23表示用sH1N1 A/Mx/4108/09病毒攻击后第2天（左柱）或第4天（右柱），用PBS、MVAtor、M1+NP+METRC、M1+NP+M2、M2+NP、M1、M1+NP、和Flulaval免疫的小鼠肺的病毒负荷。
[0073] 图24表示用sH1N1 A/Mx/4108/09病毒攻击后第2天（左柱）或第4天（右柱），用PBS、MVAtor、M1+NP+METRC、M1+NP+M2、M2+NP、M1、M1+NP、和Flulaval免疫的小鼠鼻甲的病毒负荷。
[0074] 发明详述
[0075] 本发明提供编码多拷贝流感病毒基质2蛋白胞外域的多核苷酸、含所述多核苷酸的载体（如MVA）、所述多核苷酸编码的多肽和相关组合物以及给予所述多核苷酸、载体（如MVA）、多肽或组合物以预防或治疗流感病毒感染的方法。
[0076] 制备和使用本发明的方法包括所有分子生物学、微生物学、免疫学和疫苗接种的常规技术。所述技术示于包括但不限于下述的文献：Sambrook MolecularCloning;A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》）,第二版(1989)和第三版(2001);Genetic Engineering:Principles and Methods,（遗传工程：原理和方法）1-25卷(J.K.Setlow编,1988);DNA Cloning（《DNA克隆》）I和II卷(D.N Glover编.1985);Oligonucleotide Synthesis（《寡核苷酸合成》）(M.J.Gait编,1984);Nucleic Acid Hybridization（《核酸杂交》）(B.D.Hames和S.J.Higgins编.1984);Transcription and Translation（《转录和翻 译》）(B.D.Hames和S.J.Higgins编.1984);Animal Cell Culture（《动物 细胞培养》）(R.I.Freshney编.1986);ImmobilizedCells and Enzymes（《免疫细胞和酶》）(IRL出版公司（IRL Press）,1986);B.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning（《分子克隆实用指南》）(1984);the Methodsin Enzymology series（《酶学方法》丛书）(学术出版社公司（Academic Press,Inc.）),具体为154和155卷;Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（《哺乳动物细胞的基因转移载体》）(J.H.Miller和M.P.Calos编.1987,冷泉港实验室（ColdSpring Harbor Laboratory）);Mayer和Walker, 编 .(1987),Immunochemical Methodsin Cell and Molecular Biology（细胞和分子生物学中的免疫化学方法）(伦敦的学术出版社);Scopes,(1987)Protein Purification:Principles and Practice,Second Edition（《蛋白纯化：原理和实践》）第二版(施普林格出版社（Springer-Verlag）,纽约),和Handbook of Experimental Immunology（《实验免疫学手册》）I-IV卷，(D.M.Weir和C.C.Blackwell编1986).(Sambrook等(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual 2nd ed.,（《分子克隆：实验室手册》）第二版，冷泉港实验室出版社和Ausubel等编.(1997)Current Protocols in Molecular Biology,（《新编分子生物学实验指南》）（约翰韦利森公司（John Wiley & Sons,Inc.）)。
[0077] 定义
[0078] 应注意，术语“一个”或“一种”物质指一种或多种该物质；例如，“一种多核苷酸”应理解为代表一种或多种多核苷酸。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。
[0079] 本文所用的术语“分离”表示多核苷酸、多肽或其片段、变体或衍生物以及改良的痘苗病毒安卡拉株(MVA)已从其天然结合的其他生物材料中移出。分离多核苷酸的示例是载体中含有的重组多核苷酸。分离的多核苷酸的其它例子包括保持于异源宿主细胞的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或基本上纯化)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的经分离多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。
[0080] 本文所用的术语“分离病毒”表示病毒、其衍生物或变体从其天然结合的其他生物材料中移出，或被重组操纵以包括非天然产生的物质。分离病毒的示例是含来自不同物种的多核苷酸的病毒，所述多核苷酸重组插入病毒基因组。分离病毒的其它例子包括含异源多核苷酸并保持于宿主细胞中的病毒或溶液中的纯化(部分或基本上纯化)病毒。
[0081] 本文所用的术语“纯化”表示多核苷酸、多肽、病毒或其片段、变体或衍生物基本不含其天然结合的其他生物材料，或不含源自例如重组宿主细胞的其他生物材料，所述重组宿主细胞被遗传改造以复制本发明病毒。例如，本发明的纯化病毒包括至少70-100%纯度的病毒，即组合物中存在的病毒构成总组合物重量的70-100%。在一些实施方式中，本发明所述的纯化病毒纯度为75%-99%重量、纯度为80%-99%重量、纯度为90-99%重量或纯度为95%-99%重量。本发明病毒的相对纯度可通过熟知方法容易确定。
[0082] 术语“核酸”、“核苷酸”或“核酸片段”指多核苷酸或构建体中存在的任何一种或多种核酸区段，如DNA或RNA片段。本发明的两个或多个核酸可存在于在单一多核苷酸构建物中，例如在单一质粒上，或者在单独（不相同）多核苷酸构建物中，例如在单独质粒上。此外，任何核酸或核酸片段可编码单一多肽，如单一抗原、细胞因子或调控多肽，或可编码多于一种多肽，如核酸可编码两种或更多多肽。此外，核酸可编码调节元件如启动子或转录终止子，或可编码多肽或蛋白的专门元件或基序如分泌信号肽或功能结构域。除非另有说明，具体核酸序列也隐含其保守修饰变体(如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体说，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代(Batzer等(1991)，Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等(1985)，J.Biol.Chem.260:2605-2608；Cassol等(1992);Rossolini等(1994)，Mol.Cell.Probes 8:91-98)。术语核酸涵盖多核苷酸、基因、cDNA、信使RNA（mRNA）、质粒DNA（pDNA）或pDNA的衍生物（如(Darquet,A-M等，GeneTherapy4:1341-1349(1997)中所述的小环）。核酸可以线性（如mRNA）、环形（如质粒）或分支形式以及双链或单链形式提供。核酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(如酰胺键，如肽核酸(PNA)中的酰胺键)。术语核酸、核苷酸、多核苷酸、DNA和基因在本文中可互换使用。
[0083] 术语"多核苷酸"旨在涵盖单数核酸或核酸片段以及复数核酸或核酸片段，且指分离的分子或构建体,如病毒基因组(如非感染性病毒基因组)、信使RNA(mRNA)、质粒DNA(pDNA)或pDNA衍生物(如(Darquet,A-M等，Gene Therapy4:1341-1349(1997)所述的含多核苷酸的小环)。多核苷酸可以线性（如mRNA）、环形（如质粒）或分支形式以及双链或单链形式提供。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(如酰胺键，如肽核酸(PNA)中的酰胺键)。
[0084] 本文所用的术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并包含两种或更多氨基酸的任一链或多条链。因此，本文所用的术语包括但不限于“肽”、“二肽”、“三肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或其它任何用于指两种或多种氨基酸的一条或多条链的术语，所述术语均包含于“多肽”的定义内，术语“多肽”可与任何这些术语替代或互换使用。所述术语还包括经过翻译后修饰的多肽，所述修饰例如已知保护/阻断基团的糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化作用，蛋白水解切割或非天然产生的氨基酸的修饰。
[0085] “密码子优化”在本文中定义为通过用宿主基因中所用的更频繁或最频繁的密码子替换至少一种、多于一种或大量天然序列的密码子而修饰核酸序列以提高其在具体宿主细胞中的表达。各物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定偏好。
[0086] 本文所用的术语“其他”指不同于对象生物组分的任何生物组分。所述其他组分可为宿主细胞、病毒、多肽、多核苷酸、基因或调节区域如启动子。应理解所述对象组分可源自流感病毒、MVA、M2胞外域肽或适当编码所述M2胞外域肽的多核苷酸。例如，流感病毒的M2胞外域基因的“其他多核苷酸”或“其他核酸”或“其他基因”或“其他序列”或“外源DNA区段”可为来自不同病毒如细胞巨化病毒的启动子或相同流感病毒的血凝素。所述术语流感病毒的M2胞外域的“其他多肽”、“其他氨基酸序列”、“其他抗原”或“其他蛋白”可为His标签或任何流感病毒多肽、其片段、变体、衍生物或类似物。在某些实施方式中，其他多肽可为流感病毒多肽、其片段、变体、衍生物或类似物。在其他实施方式中，其他多肽可为M2胞外域多肽、其片段、变体、衍生物或类似物。
[0087] 本文所用的术语“流感病毒多肽”或"流感病毒抗原"涵盖流感病毒内存在的任何全长或成熟多肽，和流感病毒内存在的全长或成熟多肽的其他变体，流感病毒内存在的全长或成熟多肽的片段，流感病毒内存在的全长或成熟多肽片段的血清型、等位基因和其他变体，流感病毒内存在的全长或成熟多肽的衍生物，流感病毒内存在的全长或成熟多肽片段的衍生物，流感病毒内存在的全长或成熟多肽的类似物，流感病毒内存在的全长或成熟多肽片段的类似物，和含流感病毒内存在的全长或成熟多肽或流感病毒内存在的一种或多种全长或成熟多肽片段的嵌合和融合多肽。流感病毒多肽的非限制性示例是血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质1蛋白(M1)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、或一种或多种RNA聚合酶亚基即PA、PB1和PB2。
[0088] 在本发明所述的一个实施方式中，流感病毒多肽是流感HA蛋白、其片段、变体、衍生物或类似物，如含与已知HA序列如SEQ ID NO:52有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽被特异结合HA序列的抗体识别。所述HA序列可为全长HA蛋白，其主要由HA或胞外结构域（ECD）（HA1和HA2）、跨膜（TM）结构域和胞质（CYT）结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HA1结构域和HA2结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HA1、HA2和TM结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由CYT结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由TM结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HA1结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HA2结构域组成。所述HA序列还可包括HA1/HA2切割位点。所述HA1/HA2切割位点优选位于HA1和HA2序列之间，但也可相对于所述多核苷酸或多肽构建体的其他序列以任何顺序排列。流感病毒HA序列可来自致病性病毒株。
[0089] 在另一实施方式中，流感病毒多肽是流感病毒核蛋白（NP）序列、其片段、变体、衍生物或类似物，例如包含与已知NP多肽至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述NP多肽的抗体识别。在其他实施方式中，所述流感NP序列包括NP共有序列如SEQ ID NO:20、主要由其组成或由其组成。
[0090] 流感病毒多肽可为神经氨酸酶（NA）蛋白、其片段、变体、衍生物或类似物。已知定位于流感病毒包膜上的NA蛋白催化末端唾液酸残基从病毒和细胞糖偶联物中移除。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的NA蛋白具有454氨基酸，Genbank登录号为AAM75160.1，其通过引用全文纳入本文。NA蛋白由胞质结构域（氨基酸1-6）、跨膜结构域（氨基酸7-35）和胞外结构域（氨基酸36-454）组成。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒神经氨酸酶（NA）序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成的，其中所述多肽由特异结合所述NA蛋白的抗体识别。所述NA序列可为全长NA蛋白，其主要由NA组成。所述NA序列可为包括NA序列的胞外结构域、跨膜（TM）结构域或胞质（CYT）结构域、主要由其组成、或由其组成的多肽。
流感病毒NA序列可来自致病性病毒株。
流感病毒NA序列可来自致病性病毒株。
[0091] 流感病毒多肽可为基质1（M1）蛋白、其片段、变体、衍生物或类似物。基质1蛋白在病毒复制中起关键作用。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的M1具有252氨基酸，Genbank登录号为AAM75161.1，其通过引用全文纳入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒M1序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述M1蛋白的抗体识别。所述M1序列可为包括NA序列片段、主要由其组成、或由其组成的多肽。
[0092] 在其他实施方式中，流感病毒多肽可为非结构（NS）蛋白、其片段、变体、衍生物或类似物。非结构蛋白（NS）抑制细胞前体mRNA的转录后加工，这是通过结合并抑制细胞前体mRNA 3'-末端加工所需的两种细胞蛋白：30kDa切割和多聚腺苷酸化特异性因子（CPSF4）和聚(A)-结合蛋白2（PABPN1）。流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)的NS蛋白具有230氨基酸，Genbank登录号为AAM75163.1，其通过引用全文纳入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒NS序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述NS蛋白的抗体识别。所述NS序列可为包括NS序列片段、主要由其组成、或由其组成的多肽。
[0093] 在一些实施方式中，流感病毒多肽是RNA聚合酶PA（聚合酶酸性蛋白）亚基、其片段、变体、衍生物或类似物。PA多肽在病毒RNA合成中显示伸长因子活性。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的PA蛋白具有716氨基酸，Genbank登录号为AAM75157.1，其通过引用全文纳入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒PA序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述PA蛋白的抗体识别。所述PA序列可为包括PA序列片段、主要由其组成、或由其组成的多肽。
[0094] 在某些实施方式中，本文所用流感病毒多肽是RNA聚合酶PB1（聚合酶碱性蛋白1）亚基、其片段、变体、衍生物或类似物。PB1蛋白负责病毒区段的复制和转录。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的PB1蛋白具有757氨基酸，Genbank登录号为AAM75156.1，其通过引用全文纳入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒PB1序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述PB1蛋白的抗体识别。所述PB1序列可为包括PB1序列片段、主要由其组成、或由其组成的多肽。
[0095] 在其他实施方式中，流感病毒多肽可为RNA聚合酶PB2（聚合酶碱性蛋白2）亚基、其片段、变体、衍生物或类似物。PB2蛋白涉及转录起始和帽偷窃（cap-stealing）机制，其中细胞加帽的前体mRNA用于生成病毒转录的引物。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的PB2具有759氨基酸，Genbank登录号为AAM75155.1，其通过引用全文纳入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒PB2序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述PB2蛋白的抗体识别。所述PB2序列可为包括PB2序列片段、主要由其组成、或由其组成的多肽。
[0096] 本文所用的术语“编码区”指由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但它可被认为是编码区的一部分，而任何侧接序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止子等均在编码区之外。
[0097] 术语“片段”、“类似物”、“衍生物”或“变体”指流感病毒多肽时，包括保留天然产生的流感病毒蛋白的至少一些免疫原性或抗原性的任何多肽。本发明的流感病毒多肽片段包括蛋白水解片段、缺失片段且尤其是在表达、纯化和或给予动物期间表现出溶解性增加的流感病毒多肽片段。流感病毒多肽的片段还包括递送给对象时表现出病原性下降的蛋白水解片段或缺失片段。多肽片段还包括任何包含天然多肽的抗原性或免疫原性表位的多肽部分，包括线性及三维表位。
[0098] 多肽抗原的“表位片段”是含表位的抗原部分。“表位片段”可包含但不需要包含一种或多种表位以外的氨基酸序列。
[0099] 本文所用术语“变体”指由于氨基酸取代、缺失、插入、和/或修饰而不同于所指多肽的多肽。变体可天然产生，如亚型变体。术语"亚型变体"指不同流感病毒亚型中存在的多肽或多核苷酸，所述病毒亚型包括但不限于，人A/PuertoRico/8/34(H1N1)、人A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)、人A/Hong Kong/156/97(H5N1)、人A/Hong Kong/483/97(H5N1)、人 A/Hong Kong/1073/99(H9N2)、 禽 类 A/ 鸡 /HK/G9/97(H9N2)、 猪 A/ 猪 /Hong Kong/10/98(H9N2)、禽类A/FPV/Rostock/34(H7N 1)、禽类A/火鸡/Italy/4620/99(H7N1)、 禽 类 A/FPV/Weybridge/34(H7N7)、 人 A/New Caledonia/20/99(H1N1)、 人 A/Hong Kong/1/68(H3N2)、人 A/Shiga/25/97(H3N2)、人A/Singapore/1/57(H2N2)、人A/Leningrad/134/57(H2N2)、人A/AnnArbor/6/60(H2N2)、人A/Brevig Mission/1/18(H1N1)、猪 A/ 猪 /Wisconsin/464/98(H 1N 1)、 人 A/Netherlands/219/03(H7N7) 和 人 A/Wyoming/3/2003(H3N2)。亚型变体是天然产生的变体，但其也可用本领域已知的诱变技术生产。
[0100] 可使用本领域已知的诱变技术生成非天然产生变体。在一个实施方式中，变体多肽通过取代、缺失或添加5个或更少氨基酸而不同于已鉴定的序列。所述变体通常可通过修饰多肽序列并用例如本文所述代表性过程评估修饰多肽的抗原特性来鉴定。
[0101] 多肽变体与已鉴定的多肽有至少约60-70%、例如75%、80%、85%、90%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%的序列相同性。变体多肽可包含保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。多肽衍生物是被改变从而表现出天然多肽上没有发现的其他特征的多肽。例子包括融合蛋白。类似物是本发明多肽的其他形式。一个示例是通过切割前蛋白产生活性成熟多肽而可激活的前蛋白。
[0102] 变体还可或另外包含其他修饰，例如多肽可偶联或耦合如融合其他多肽如蛋白N末端的信号（或前导）序列，所述序列共翻译或翻译后指导蛋白转移。所述多肽还可偶联或生成耦合于接头或其他序列以便于合成、纯化或鉴定所述多肽（如6-His）或增强多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可偶联或耦合免疫球蛋白Fc区域。所述多肽还可偶联或耦合某序列，所述序列赋予或调控对所述多肽（如T细胞表位、B细胞表位、细胞因子、趋化因子等）的免疫响应和/或通过抗原呈递细胞或其他免疫系统细胞提高所述多肽的摄入和/或加工。所述多肽还可偶联或耦合来自流感病毒和/或来自其他细菌和/或其他病毒的其他多肽/表位以生成杂交免疫原性蛋白，其单独或与各种佐剂组合能引发对其他病原生物体的保护免疫。
[0103] 本文所用的术语“序列相同性”指两种或更多种多核苷酸序列之间或两种或更多种多肽序列之间的关系。当一个序列中的位置被对比序列的相应位置中相同核酸碱基或氨基酸残基占据时，所述序列被称为在该位置“相同”。“序列相同性”百分比通过测定两个序列中出现的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目来计算，得到“相同”位置的数目。然后“相同”位置的数目除以对比窗中的位置总数并乘以100，得到“序列相同性”百分比。“序列相同性”百分比通过比较对比窗中两种最优比对序列来测定。为了最优化比对用于比较的序列，比较窗中多核苷酸或多肽序列的部分可包含称为缺口的添加或缺失，而参考序列保持不变。最优化的比对是即使有缺口仍在参考和比较序列之间产生最大可能数目的“相同”位置的比对。术语“序列相同性”和“相同”在本文中可互换使用。因此，共有“序列相同性”百分比的序列应理解为“相同”百分比一样。两种序列之间的“序列相同性”百分比可用程序“BLAST 2序列”版本测定，所述程序2004年9月1日起可获自国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information），包括程序BLASTN (用于核苷酸序列比较)和BLASTP(用于多肽序列比较)，基于Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(12):5873-5877,1993)。使用“BLAST 2序列”时，2004年9月1日起的标准参数可用于字长(3)、缺口开放罚分(11)、延伸缺口罚分(1)、缺口降低(50)、期望值(10)和任何其他需要的参数，包括但不限于基质选择。
[0104] 本文所用的术语“表位”指动物中具有抗原或免疫原性活性的多肽部分，例如哺乳动物，例如人。本文所用的“免疫原性表位”定义为引发动物中免疫响应的蛋白部分，如本领域任何已知方法所测。本文所用的术语“抗原表位”定义为抗体或T细胞受体能免疫特异结合其抗原的蛋白部分，如本领域任何已知方法所测。免疫特异结合不包括非特异结合但不必然排除与其他抗原的交叉反应。虽然所有免疫原性表位为抗原性的，但抗原表位不需要为免疫原性。
[0105] “有效量”是以单剂量或一系列剂量的一部分而给予个体能有效进行治疗或预防的量。例如，如感染性流感病毒攻击2周后所测，当给予量使流感病毒感染发生率相对未治疗个体降低时，所述量有效。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、所治疗个体的分类组（例如，人、非人灵长动物、灵长动物等）、个体免疫系统的响应能力、所需的保护程度、疫苗配方、医疗情况的专家评估和其它相关因素而变化。预计所述有效量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。通常单一剂量为约10μg-10mg MVA/kg体重或修饰的运载生物体或宿主细胞的量，足以提供重组表达流感病毒多肽的可比数量。
[0106] 术语“对象”表示需要诊断、预后、免疫或治疗的任何对象，尤其是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括但不限于人，家养动物，农场动物，动物园动物如熊，运动类动物，宠物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊、奶牛；灵长类如猿、猴、猩猩和大猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮和虎；马科动物如马、驴和斑马；食用动物如奶牛、猪和羊；有蹄类如鹿和长颈鹿；啮齿类如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。在某些实施方式中，所述动物是人对象。
[0107] 术语“动物”旨在包含单数“动物”以及复数“动物”且包括哺乳动物和鸟，以及鱼、爬行类和两栖类。术语动物也涵盖模式动物如疾病模式动物。在一些实施方式中，术语动物包括有经济或其他价值的动物，如经济上重要的饲养动物、比赛动物、表演动物、祖传动物、稀有或濒危动物、或伴侣动物。具体地，所述哺乳动物可为人对象、食用动物或伴侣动物。
[0108] 如本文所用，“需要其的对象”指需要治疗即预防、治愈、阻止或降低流感病毒感染严重性，和/或在特定时间中使流感病毒感染症状不加重的个体。
[0109] 本文所用的术语“初次”或“首次”或“初免”和“加强”或“加强免疫”分别指第一次和后续免疫，即根据这些术语在免疫学中的常用定义。然而，在某些实施方式中，例如初免组分和加强免疫组分为单一制剂时，第一次和后续免疫可能并非必要，因为“初次”和“加强”组合物同时给予。
[0110] 术语“被动免疫”指宿主动物发展出对抗原的免疫，所述宿主动物被给予另一动物产生的抗体而不是生成针对该抗原的其自身抗体。术语“主动免疫”指宿主动物由于存在靶抗原而产生抗体。
[0111] 本文所用的“免疫响应”指受体对引入多核苷酸、多肽、减毒痘病毒如MVA、或本发明组合物的响应，通常表征为但不限于产生抗体和/或T细胞。通常，免疫响应可为细胞响应如对流感病毒M2胞外域或M2胞外域串联重复（METR）特异的CD4+T细胞或CD8+T细胞或二者的诱导或活化、对流感病毒M2胞外域特异性或METR特异性抗体生产增加的体液响应，或细胞和体液响应二者。由含本发明MVA的疫苗建立的免疫响应包括但不限于MVA进入宿主细胞后对宿主细胞所表达蛋白的响应。本发明中，传染性病原（如A型流感病毒）后续攻击后，免疫响应阻止流感病毒颗粒的形成或发展。免疫响应还可包括粘膜响应，如粘膜抗体响应例如S-IgA生产，或粘膜细胞介导的响应例如T细胞响应。
[0112] 本文所用的“疫苗”是含免疫原性试剂和药学上可接受稀释剂并组合赋形剂、佐剂、添加剂和/或保护剂的组合物。免疫原可由完整传染剂或所述传染剂的分子亚组（由所述传染剂合成或重组生产，包括但不限于多肽或多核苷酸）构成。例如，本文所用的“MVA疫苗”表示含分离MVA的组合物，所述MVA包含编码多重拷贝M2胞外域肽（如M2e串联重复）和药学上可接受稀释剂并组合赋形剂、佐剂、添加剂和/或保护剂的至少一种多核苷酸。疫苗给予对象时，免疫原刺激免疫响应，所述免疫响应在用传染剂后续攻击后会保护对象免于疾病或减轻该试剂引起的病理学、症状或临床表现。根据本发明所述疫苗可为治疗性或预防性。治疗性（治疗）疫苗在感染后给予，旨在降低或抑制疾病进展。预防性（预防）疫苗旨在阻止首次感染或降低感染负荷。针对流感相关疾病的疫苗中使用的试剂可为减毒流感病毒，或与流感病毒有关的纯化或人工加工的分子，如重组蛋白、合成肽、DNA质粒和表达流感病毒蛋白的重组病毒或细菌。本领域技术人员容易理解，疫苗还可包括其他组分如赋形剂、稀释剂、运载剂、防腐剂、佐剂或其他免疫增强剂、或其组合。
[0113] 多价疫苗指从两种或更多种痘病毒中制备的任何疫苗，如MVA，其各表达不同抗原，如不同流感病毒抗原。或者，多价疫苗包括单一分离痘病毒如MVA包括编码两种或更多抗原（如不同的流感病毒抗原）的多核苷酸。所述两种或更多抗原如流感病毒抗原可源自相同多肽，但含有可诱导非交叉反应性免疫响应的不同表位。
[0114] 本文所用的术语“免疫原性运载体”指第一多肽或其片段、变体或衍生物，其增强第二多肽如抗原表位、其片段、变体或衍生物的免疫原性。
[0115] 术语“佐剂”指具有下述能力的任何材料：(1)改变或增加对具体抗原的免疫响应或(2)增加或辅助药物试剂的效果。如本文所用，可能增加本发明MVA的表达、抗原性或免疫原性的任何化合物是潜在的佐剂。在一些实施方式中，术语佐剂指TLR刺激佐剂，其中所述TLR佐剂包括刺激TLR受体（如TLR1-TLR13）从而使针对本发明疫苗组合物的免疫系统响应增强的化合物。TLR佐剂包括但不限于CpG和MPL。
[0116] 本文所用的术语“减毒”包括使传染剂例如痘病毒如MVA不能在至少一种宿主细胞例如任何哺乳动物细胞如任何人细胞中复制。减毒的MVA在某些哺乳动物细胞如BS-C-1和CV-1细胞中仍可具有有限的复制能力。虽然在某些哺乳动物细胞中不能复制，MVA仍可保留在其他哺乳动物细胞（如BHK-21细胞）以及禽类细胞中复制的完全能力，例如初级或永生鸡或鸭细胞，如AGE1cr、AGE1cr.pIX或 减毒MVA的细胞复制周期可在其生命周期的任何阶段阻断。例如，减毒MVA的细胞复制周期在后期被阻断，阻止新病毒生成和释放。本文所用的术语“复制”或“复制的”指在病毒生命周期某些部分进展的能力，如病毒基因产物的转录和翻译以及核酸复制，以及一些情况中生成或发展出成熟感染病毒颗粒的能力。
[0117] 多核苷酸
[0118] 本发明提供含编码区域的分离多核苷酸，所述编码区域编码含多拷贝流感病毒基质2蛋白胞外域的多肽以诱导针对流感病毒的免疫响应。
[0119] 流感病毒基质2蛋白(″M2″)是质子选择性离子通道蛋白，其整合在流感A病毒的病毒包膜中。通道本身是同源四聚体，其中所述单元形成由两个二硫键稳定的螺旋。M2蛋白单元由三种蛋白结构域组成：N末端具有24个氨基酸的暴露于外部环境的胞外域、具有19个疏水氨基酸的跨膜区域、和C末端具有54个氨基酸的胞质结构域。M2蛋白在A型流感病毒生命周期中有重要作用。所述蛋白定位在病毒包膜中，使氢离子从内涵体进入病毒颗粒（病毒粒子），从而降低病毒内的pH，这使病毒基质蛋白M1从核蛋白RNP中分离。这是病毒去包被和将其内容物暴露于宿主细胞胞质中的关键步骤。
[0120] 本发明提供分离多核苷酸，其包含编码多肽的编码区，其中所述多肽含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个流感病毒基质2蛋白（M2）胞外域肽、其变体、片段、衍生物或类似物。其中M2胞外域肽可相对彼此以任何顺序排列或组合。在一个实施方式中，本发明多核苷酸包含编码多肽的编码区，其包含至少
6个M2胞外域肽、其片段、变体、片段、衍生物或类似物，其中所述至少6个M2胞外域肽相对彼此以任何顺序排列或组合。术语“多拷贝的M2胞外域肽”在本文中也可与“M2e串联重复”、“M2胞外域串联重复”或“METR”互换使用。
6个M2胞外域肽、其片段、变体、片段、衍生物或类似物，其中所述至少6个M2胞外域肽相对彼此以任何顺序排列或组合。术语“多拷贝的M2胞外域肽”在本文中也可与“M2e串联重复”、“M2胞外域串联重复”或“METR”互换使用。
[0121] 本发明所用基质2(M2)蛋白可获自A型流感肝病毒，所述病毒包括但不 限 于 人 A/Puerto Rico/8/34(H1N 1)、 人 A/Viet Nam/1203/2004(H5N 1)、人 A/VietNam/DT-036/2005(H5N1)、 人 A/ /Novoslbirsk/29/2005(H5N1)、
禽 类 A/ 斑 头 雁 /Mongolia/1/05(H5N 1)、A/ 猫 /Thailand/KU-02/04(H5N 1)、人 A/Hong Kong/213/03(H5N1)、 禽 类 A/ 鸡 /Guandong/174/04(H5N1)、 人 A/Hong Kong/156/97(H5N1)、 人 A/Hong Kong/483/97(H5N1)、 禽 类 A/ 鹌 鹑 /Hong Kong/G1/97(H9N2)、禽 类 A/ 鸭 /Hong Kong/Y260/97(H9N2)、禽 类 A/ 鸡 HK/FY23/03(H9N2)、禽类A/火鸡/Germany/3/91(H1N1)、人A/Hong Kong/1073/99(H9N2)、禽 类 A/ 鸡 /HK/G9/97(H9N2)、 猪 A/ 猪 /Hong Kong/10/98(H9N2)、 猪 A/ 猪 /Saskatchewan/18789/02(H1N1)、 禽 类 A/ 野 鸭 /Alberta/1302003(H1N1)、 禽类 A/野 鸭 /NY/6750/78(H2N2)、禽 类 A/野 鸭 /Potsdam/177-4/83(H2N2)、禽 类 /A/ 鸭 /Hokkaldo/95/2001(H2N2)、 禽 类 A/ 鸭 /Korea/S9/2003(H3N2)、 猪 A/ 猪 /Shandong/2/03(H5N1)、 禽 类 A/ 鸡 /California/0139/2001(H6N2)、 禽 类 A/ 海雀 /Sweden/3/2000(H6N2)、禽 类 A/ 鹅 /Hong Kong/W 217/97(H6N9)、禽 类 A/ 鸡 /British Columbia/04(H7N3)、禽 类 A/ 水 鸟 /Delaware/9/96(H9N2)、禽 类 A/ 鸭 /Hong Kong/Y439/97(H9N2)、 禽 类 A/ 短 颈 野 鸭 /Hong Kong/W312/97(H6N1)、猪 A/ 猪 /Korea/S452/2004(H9N2)、 禽 类 A/ 鸡 /Netherlands/1/2003(H7N7)、 禽类 A/ 野 鸭 /Alberta/2001(H1N1)、禽 类 A/ 鸭 /Hunan/114/05(H5N1)、猪 A/ 猪 /Cotes d'Armor/1482/99(H1N1)、猪 A/ 猪 Belzig/2/2001(H1N1)、禽 类 A/ 火 鸡 /Italy/220158/2002(H7N3)、禽类A/HK/2108/2003(H9N2)、禽类A/FPV/Rostock/34(H7N1)、禽类A/火鸡/Italy/4620/99(H7N1)、禽类A/FPV/Weybridge/34(H7N7)、禽类A/FPV/Dobson/27(H7N7)、 人 A/New Caledonia/20/99(H1N1)、 人 A/Hong Kong/1/68(H3N2)、人 A/Charlottesville/03/2004(H3N2)、 人 A/Canterbury/129/2005(H3N2)、 人 A/Shiga/25/97(H3N2)、人A/Singapore/1/57(H2N2)、人A/Leningrad/134/57(H2N2)、人A/Ann Arbor/6/60(H2N2)、人A/Brevig Mission/1/18(H1N1)、人A/Canada/720/05(H2N2)、猪A/猪/Wisconsin/464/98(H1N1)、猪A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)、禽类A/火鸡/Ohio/313053/2004(H3N2)、禽类A/火鸡/North Carolina/12344/03(H3N2)、禽类A/鹅/Guangdong/1/98(H5N1)、人A/Netherlands/219/03(H7N7)、人A/Willson-Smith/33(H1N1)、人 A/New Caledonia/20/99(H1N1)、 人 A/Japan/305/57(H2N2)、 禽 类 A/ 鸡 /Iran/16/2000(H9N2)、禽 类A/ 野 鸭 /MN/1/2000(H5N2)、A/Leiden/01272/2006(H3N2)、A/Tilburg/45223/2005(H3N2)、A/Pennsylvania/PIT25/2008(H3N2)、A/NYMC X-1
71A(PuertoRico/8/1934-Brisbane/10/2007)(H3N2)、A/Managua/26/2007(H3N2)、A/HongKong/1-1-MA-20D/1968(H3N2)、A/Czech Republic/1/1966(H2N2)、
A/ 鸡 /Shanghai/2/1999(H9N2))]、A/Myanmar/M187/2007(H3N2)、A/ 珠 鸡 /NewYork/101276-1/2005(H7N2)、禽类A/美洲家鸭/New York/87493-3/2005(H7N2)、禽类A/火鸡/New York/122501-2/2005(H7N2)、禽类A/野鸭/Italy/4223-2/2006(H5N2)和人A/Wyoming/3/2003(H3N2)。
禽 类 A/ 斑 头 雁 /Mongolia/1/05(H5N 1)、A/ 猫 /Thailand/KU-02/04(H5N 1)、人 A/Hong Kong/213/03(H5N1)、 禽 类 A/ 鸡 /Guandong/174/04(H5N1)、 人 A/Hong Kong/156/97(H5N1)、 人 A/Hong Kong/483/97(H5N1)、 禽 类 A/ 鹌 鹑 /Hong Kong/G1/97(H9N2)、禽 类 A/ 鸭 /Hong Kong/Y260/97(H9N2)、禽 类 A/ 鸡 HK/FY23/03(H9N2)、禽类A/火鸡/Germany/3/91(H1N1)、人A/Hong Kong/1073/99(H9N2)、禽 类 A/ 鸡 /HK/G9/97(H9N2)、 猪 A/ 猪 /Hong Kong/10/98(H9N2)、 猪 A/ 猪 /Saskatchewan/18789/02(H1N1)、 禽 类 A/ 野 鸭 /Alberta/1302003(H1N1)、 禽类 A/野 鸭 /NY/6750/78(H2N2)、禽 类 A/野 鸭 /Potsdam/177-4/83(H2N2)、禽 类 /A/ 鸭 /Hokkaldo/95/2001(H2N2)、 禽 类 A/ 鸭 /Korea/S9/2003(H3N2)、 猪 A/ 猪 /Shandong/2/03(H5N1)、 禽 类 A/ 鸡 /California/0139/2001(H6N2)、 禽 类 A/ 海雀 /Sweden/3/2000(H6N2)、禽 类 A/ 鹅 /Hong Kong/W 217/97(H6N9)、禽 类 A/ 鸡 /British Columbia/04(H7N3)、禽 类 A/ 水 鸟 /Delaware/9/96(H9N2)、禽 类 A/ 鸭 /Hong Kong/Y439/97(H9N2)、 禽 类 A/ 短 颈 野 鸭 /Hong Kong/W312/97(H6N1)、猪 A/ 猪 /Korea/S452/2004(H9N2)、 禽 类 A/ 鸡 /Netherlands/1/2003(H7N7)、 禽类 A/ 野 鸭 /Alberta/2001(H1N1)、禽 类 A/ 鸭 /Hunan/114/05(H5N1)、猪 A/ 猪 /Cotes d'Armor/1482/99(H1N1)、猪 A/ 猪 Belzig/2/2001(H1N1)、禽 类 A/ 火 鸡 /Italy/220158/2002(H7N3)、禽类A/HK/2108/2003(H9N2)、禽类A/FPV/Rostock/34(H7N1)、禽类A/火鸡/Italy/4620/99(H7N1)、禽类A/FPV/Weybridge/34(H7N7)、禽类A/FPV/Dobson/27(H7N7)、 人 A/New Caledonia/20/99(H1N1)、 人 A/Hong Kong/1/68(H3N2)、人 A/Charlottesville/03/2004(H3N2)、 人 A/Canterbury/129/2005(H3N2)、 人 A/Shiga/25/97(H3N2)、人A/Singapore/1/57(H2N2)、人A/Leningrad/134/57(H2N2)、人A/Ann Arbor/6/60(H2N2)、人A/Brevig Mission/1/18(H1N1)、人A/Canada/720/05(H2N2)、猪A/猪/Wisconsin/464/98(H1N1)、猪A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)、禽类A/火鸡/Ohio/313053/2004(H3N2)、禽类A/火鸡/North Carolina/12344/03(H3N2)、禽类A/鹅/Guangdong/1/98(H5N1)、人A/Netherlands/219/03(H7N7)、人A/Willson-Smith/33(H1N1)、人 A/New Caledonia/20/99(H1N1)、 人 A/Japan/305/57(H2N2)、 禽 类 A/ 鸡 /Iran/16/2000(H9N2)、禽 类A/ 野 鸭 /MN/1/2000(H5N2)、A/Leiden/01272/2006(H3N2)、A/Tilburg/45223/2005(H3N2)、A/Pennsylvania/PIT25/2008(H3N2)、A/NYMC X-1
71A(PuertoRico/8/1934-Brisbane/10/2007)(H3N2)、A/Managua/26/2007(H3N2)、A/HongKong/1-1-MA-20D/1968(H3N2)、A/Czech Republic/1/1966(H2N2)、
A/ 鸡 /Shanghai/2/1999(H9N2))]、A/Myanmar/M187/2007(H3N2)、A/ 珠 鸡 /NewYork/101276-1/2005(H7N2)、禽类A/美洲家鸭/New York/87493-3/2005(H7N2)、禽类A/火鸡/New York/122501-2/2005(H7N2)、禽类A/野鸭/Italy/4223-2/2006(H5N2)和人A/Wyoming/3/2003(H3N2)。
[0122] 在一个实施方式中，本发明的基质2蛋白的胞外域源自流感病毒A/PuertoRico/8/34(H1N1)。流感病毒人A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的全长M2蛋白含97个氨基酸，如SEQ ID NO:14所示。编码所述M2蛋白（SEQ ID NO:14）的核酸在本文中如SEQ ID NO:13所示。流感病毒表面暴露的N末端序列是没有N末端甲硫氨酸的23个氨基酸或具有N末端甲硫氨酸的24个氨基酸（下述SEQ ID NO:14的带下划线序列）且鉴定为胞外域（"M2e"）。
[0123] 流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的基质2蛋白序列
[0124] (SEQ ID NO:14)
[0125] 0 MSLLTEVETP IRNEWGCRCN GSSDPLTIAA NIIGILHLTL WILDRLFFKC
[0126] 50 IYRRFKYGLK GGPSTEGVPK SMREEYRKEQ QSAVDADDGH FVSIELE
[0127] 本文所用M2胞外域肽、其变体、衍生物、片段或类似物可包含位于M2胞外域肽中的抗体表位，其中所述M2胞外域肽包含约8-39个氨基酸、约9-38个氨基酸、约10-37个氨基酸、约11-36个氨基酸、约12-35个氨基酸、约13-34个氨基酸、约14-33个氨基酸、约15-32个氨基酸、约16-31个氨基酸、约17-30个氨基酸、约18-29个氨基酸、约19-28个氨基酸、约20-27个氨基酸、约21-26个氨基酸、约22-25个氨基酸、或约23-24个氨基酸，主要由其组成，或由其组成。在一个具体实施方式中，M2胞外域肽主要由或由23个氨基酸组成。抗体表位的非限制性示例包括选自EVETPTRN(SEQ ID NO:1的氨基酸5-12)、SLLTEVETPT(SEQ ID NO:1的氨基酸1-10)、ETPTRNEWECK(SEQ ID NO:2的氨基酸7-17)、EVETPIRNEW(SEQ ID NO:3的氨基酸5-14)和LTEVETPIRNEWGCRCN(SEQID NO:3的氨基酸3-19)的氨基酸序列，主要由其组成，或由其组成。
[0128] 或者，M2胞外域肽可为其变体、衍生物或类似物，其可被特异结合由SEQ IDNO:1、2、3、4、5或6所组成肽的抗体识别。例如，所述M2胞外域肽的变体、衍生物或类似物与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6(M2e#3_C)有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性，其中所述变体、衍生物或类似物被特异结合由SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6所组成肽的抗体识别。特异结合由SEQ ID NO:3所组成肽的抗体示例为单克隆抗体14C2，如美国专利号
5,290,686所述，其通过引用全文纳入本文。M2胞外域肽的非限制性示例列于表1。
5,290,686所述，其通过引用全文纳入本文。M2胞外域肽的非限制性示例列于表1。
[0129] 表1METR疫苗中使用的6种M2e肽（C）形式的列表
[0130]
[0131]
[0132] 此外，本文所用的M2胞外域肽，其变体、片段、衍生物或类似物可包括但不限于M2胞外域肽变体，其中M2胞外域肽中的半胱氨酸（C）被丝氨酸（S）取代。该取代阻止了两个半胱氨酸之间形成二硫键，但不影响M2胞外域肽的免疫原性。丝氨酸取代的M2胞外域肽的非限制性示例示于表2。
[0133] 表2METR疫苗中使用的6种M2e肽（S）形式的列表
[0134]M2e肽的氨基酸序列 肽名称 SEQ ID NO:
SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSD M2e#1_S SEQ ID NO:7
SLLTEVETPTRNEWESKSIDSSD M2e#2_S SEQ ID NO:8
SLLTEVETPIRNEWGSRSNGSSD M2e#3_S SEQ ID NO:9
SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD M2e#4_S SEQ ID NO:10
SLLTEVETLTRNGWESRSSDSSD M2e#5_S SEQ ID NO:11
SLLTEVETPTRNGWESKSSDSSD M2e#6_S SEQ ID NO:12
SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSD M2e#1_S SEQ ID NO:7
SLLTEVETPTRNEWESKSIDSSD M2e#2_S SEQ ID NO:8
SLLTEVETPIRNEWGSRSNGSSD M2e#3_S SEQ ID NO:9
SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD M2e#4_S SEQ ID NO:10
SLLTEVETLTRNGWESRSSDSSD M2e#5_S SEQ ID NO:11
SLLTEVETPTRNGWESKSSDSSD M2e#6_S SEQ ID NO:12
[0135] 在一个实施方式中，本发明的多核苷酸编码蛋白，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12以及SEQ ID NO:7、8、11和12的组合。
[0136] 本发明涉及含编码多肽的编码区域的分离多核苷酸，其中所述多肽包含相对彼此以任何顺序排列的至少3种下述M2胞外域肽：(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQ ID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii)SEQID NO:7(M2e#1_S);(viii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(ix)SEQ ID NO:9(M2e#3_S);(x)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(xi)SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和(xii)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。在一个实施方式中，所述多核苷酸包含相对彼此以任何顺序排列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、或至少12个M2胞外域肽。
[0137] 在另一实施方式中，本发明多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包含相对彼此以任何顺序排列的至少6个下述M2胞外域肽：(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii)SEQ ID NO:7(M2e#1_S);(viii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(ix)SEQ ID NO:9(M2e#3_S);(x)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(xi)SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和(xii)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。在一个具体实施方式中，本发明中的M2胞外域肽包含相对彼此以任何顺序组合或排列的下述氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);和(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C)或选自下组的氨基酸序列:(i)SEQ ID NO:7(M2e#1-S);(ii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(iii)SEQ ID NO:9(M2e#3_S);(iv)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(v)SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和(vi)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。在一个特定实施方式中，本发明的分离多核苷酸包含编码多肽的编码区域，其包含相对彼此以任何顺序排列的下述氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQID NO:4,SEQ ID NO:5,和SEQ ID NO:6或(b)SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,和SEQ ID NO:12。在另一特定实施方式中，含多拷贝的M2胞外域肽（METR）序列的本发明多肽包含SEQ ID NO:1-6、主要由其组成、或由其组成。在另一特定实施方式中，所述METR序列包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:55、主要由其组成、或由其组成。
[0138] METR_C序列(SEQ ID NO:16)
[0139] SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD GSASG
[0140] SLLTEVETPTRNEWECKCIDSSD SGSGA
[0141] SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD SAGSG
[0142] SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD QVHFQPLPPAVVKL
[0143] SLLTEVETLTRNGWECRCSDSSD QFIKANSKFIGITE
[0144] ALLTEVETPTRNGWECKCSDSSD
[0145] METR_C序列(SEQ ID NO:55)
[0146] SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD GSASG
[0147] SLLTEVETPTRNEWECKCIDSSD SGSGA
[0148] SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD SAGSG
[0149] SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD GSASG
[0150] SLLTEVETLTRNGWECRCSDSSD SGSGA
[0151] SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD
[0152] 在其他实施方式中，含METR序列的多肽包含SEQ ID NO:7-12、主要由其组成、或由其组成。在一个具体实施方式中，所述METR序列包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:56、主要由其组成、或由其组成。
[0153] METR_S序列(SEQ ID NO:18)
[0154] SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSD GSASG
[0155] SLLTEVETPTRNEWESKSIDSSD SGSGA
[0156] SLLTEVETPIRNEWGSRSNGSSD SAGSG
[0157] SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD QVHFQPLPPAVVKL
[0158] SLLTEVETLTRNGWESRSSDSSD QFIKANSKFIGITE
[0159] SLLTEVETPTRNGWESKSSDSSD
[0160] METR_S序列(SEQ ID NO:56)
[0161] SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSD GSASG
[0162] SLLTEVETPTRNEWESKSIDSSD SGSGA
[0163] SLLTEVETPIRNEWGSRSNGSSD SAGSG
[0164] SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD GSASG
[0165] SLLTEVETLTRNGWESRSSDSSD SGSGA
[0166] SLLTEVETPTRNGWESKSSDSSD
[0167] 还提供含编码区域的分离多核苷酸，其编码流感病毒核蛋白（NP）共有序列。流感NP蛋白与流感基因（RNA）区段结构上相关且具有498个氨基酸长度。NP的主要功能是使病毒基因组衣壳化以用于RNA转录、复制和包装。NP基因相对非常保守，最大氨基酸差异小于11%(Shu,L.L.,等，Nucleic Acids Res.22:5047-5053(1993))。本发明流感病毒NP共有序列可通过比较700个最常见NP流感病毒A序列和流感病毒序列数据库（www.flu.lanl.gov/）中公开的近期（2004-2007）所出现病毒的比对来获得。NP共有序列可诱导针对流感病毒的免疫响应。NP共有序列的示例性序列包括SEQ ID NO:20、主要由其组成、或由其组成。
[0168] NP共有序列(SEQ ID NO:20)
[0169] 0 MASQGTKRSY EQMETDGDRQ NATEIRASVG KMIDGIGRFY IQMCTELKLS
[0170] 50 DHEGRLIQNS LTIEKMVLSA FDERRNKYLE EHPSAGKDPK KTGGPIYRRV
[0171] 100 DGKWMRELVL YDKEEIRRIW RQANNGEDAT AGLTHIMIWH SNLNDATYQR
[0172] 150 TRALVRTGMD PRMCSLMQGS TLPRRSGAAG AAVKGIGTMV MELIRMVKRG
[0173] 200 INDRNFWRGE NGRKTRSAYE RMCNILKGKF QTAAQRAMVD QVRESRNPGN
[0174] 250 AEIEDLIFLA RSALILRGSV AHKSCLPACA YGPAVSSGYD FEKEGYSLVG
[0175] 300 IDPFKLLQNS QIYSLIRPNE NPAHKSQLVW MACHSAAFED LRLLSFIRGT
[0176] 350 KVSPRGKLST RGVQIASNEN MDNMGSSTLE LRSGYWAIRT RSGGNTNQQR
[0177] 400 ASAGQTSVQP TFSVQRNLPF EKSTIMAAFT GNTEGRTSDM RAEIIRMMEG
[0178] 450 AKPEEVSFRG RGVFELSDEK ATNPIVPSFD MSNEGSYFFG DNAEEYDN
[0179] 在某些实施方式中，本发明多核苷酸编码的多肽还包含任何两种M2胞外域肽中插入的接头。在一个实施方式中，所述多肽中存在的任何M2胞外域肽在其和毗邻的M2胞外域肽之间插有接头肽。通常，任何给定的多肽可不具有接头、具有一个接头或多个接头肽。当所述多肽中存在多于一个接头肽时，所述接头可相同或不同。多肽可包含至少2个、至少
3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个接头肽。所述接头肽可为至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个氨基酸。在一个实施方式中，所述接头肽长度为5个氨基酸。在其他实施方式中，所述接头肽具有对宿主的低或最小免疫原性、疏水性或亲水性。
3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个接头肽。所述接头肽可为至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个氨基酸。在一个实施方式中，所述接头肽长度为5个氨基酸。在其他实施方式中，所述接头肽具有对宿主的低或最小免疫原性、疏水性或亲水性。
[0180] 在其他实施方式中，所述接头肽与低等生物体中发现的氨基酸序列同源。在其他实施方式中，所述接头肽与灵长类中发现的氨基酸序列不同源。若这些接头肽具有免疫原性并引起抗体生产，这些抗体会在宿主中循环，有机会结合任何同源抗原。若可能的抗原是自身蛋白，则不需要所述免疫原性。若可能的抗原与病原体或其他微生物同源，则所述免疫原性可能有益。
[0181] 在某些实施方式中，本发明所用接头肽可与下述物种中发现的氨基酸序列同源：伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）H160、钝顶节旋藻（Arthrospira maxima）CS-328、棉铃虫（Helicoverpa armigera）SNPV、新凶手弗朗西丝氏菌（Francisellanovicida）FTG、加州白足鼠（Peromyscus californicus insignis）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）G27、杀鲑弧菌（Aliivibrio salmonicida）LFI1238、潘那利番茄（Solanum pennellii）、酿酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae）AWRI 1631、人隐孢 子虫（Cryptosporidium hominis）、跳跃波陀虫（Bodo saltans）、海洋亚硝化球菌（Nitrosococcus oceani）C-27、β变形菌（beta-proteobacterium）KB13、弯曲菌（Campylobacterales）GD 1、远洋杆菌（Candidatus Pelagibacter sp.）HTCC7211、高温脱硫弧菌（Thermodesulfovibrio yellowstonii）DSM 11347、蜡 样 芽 胞 杆 菌（Bacillus cereus）AH1134、红 杆 菌（Rhodobacterales）Y4I、钩端螺菌（Leptospirillumsp.）II组'5-方向CG'、双色蜡蘑（Laccaria bicolor）S238N-H82、巴氏 梭菌（Clostridium bartlettii）DSM 16795、麦角菌（Claviceps purpurea）、绿河豚（Tetraodon nigroviridis）、必需多核杆菌(Polynucleobacter necessarius)STIR1、促瘤胃真菌（Piromyces rhizinflatus）、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/鸡/Iran/16/2000(H9N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/野鸭/MN/1/2000(H5N2))]、大肠杆菌（Escherichia coli）O157:H7株系EC4045、S1糖蛋白[感染性支气管炎病毒]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/Leiden/01272/2006(H3N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/Tilburg/45223/2005(H3N2))]、神经氨酸酶[A型
流感病毒(A/Pennsylvania/PIT25/2008(H3N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/NYMCX-171A(Puerto Rico/8/1934-Brisbane/10/2007)(H3N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/Managua/26/2007(H3N2))]、神经氨酸酶[A 型流感病毒(A/HongKong/1-1-MA-
20D/1968(H3N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/CzechRepublic/1/1966(H2N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/鸡/Shanghai/2/1999(H9N2))]、神经氨酸酶[B型流感病毒(B/Myanmar/M170/2007)]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/Myanmar/M187/2007(H3N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/珠鸡/New York/101276-1/2005(H7N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/美洲家鸭/New York/87493-3/2005(H7N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/火鸡/NewYork/122501-2/2005(H7N2))]、和/或神经氨酸酶[A型流感病毒(A/野鸭/Italy/4223-2/2006(H5N2))]。在一个具体实施方式中，本发明所用接头肽是Gly-Ser-Ala-Ser-Gly(GSASG)(SEQ ID NO:21)。
流感病毒(A/Pennsylvania/PIT25/2008(H3N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/NYMCX-171A(Puerto Rico/8/1934-Brisbane/10/2007)(H3N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/Managua/26/2007(H3N2))]、神经氨酸酶[A 型流感病毒(A/HongKong/1-1-MA-
20D/1968(H3N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/CzechRepublic/1/1966(H2N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/鸡/Shanghai/2/1999(H9N2))]、神经氨酸酶[B型流感病毒(B/Myanmar/M170/2007)]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/Myanmar/M187/2007(H3N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/珠鸡/New York/101276-1/2005(H7N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/美洲家鸭/New York/87493-3/2005(H7N2))]、神经氨酸酶[A型流感病毒(A/火鸡/NewYork/122501-2/2005(H7N2))]、和/或神经氨酸酶[A型流感病毒(A/野鸭/Italy/4223-2/2006(H5N2))]。在一个具体实施方式中，本发明所用接头肽是Gly-Ser-Ala-Ser-Gly(GSASG)(SEQ ID NO:21)。
[0182] 在其他实施方式中，所述接头肽与金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）噬菌体phi2958PVL、土霉菌（Streptomyces rimosus）、跳跃波陀虫（Bodo saltans）、解蛋白嗜热粪杆菌（Coprothermobacter proteolyticus）DSM 5265和/或钩端螺菌（Leptospirillum sp.）II组'5-方向CG'中发现的氨基酸序列同源。在具体实施方式中，本发明所用接头肽是Ser-Gly-Ser-Gly-Ala(SGSGA)(SEQ ID NO:22)。
[0183] 在其他实施方式中，所述接头肽与蒙大拿果蝇（Drosophila montana）中发现的氨基酸序列、多聚蛋白[番茄灼烧病毒]、免疫球蛋白重链可变区[家犬（Canis lupusfamiliaris）]、多聚蛋白[登革热病毒1]或氧甾酮(oxysterol)结合蛋白[小家鼠（Musmusculus）]同源。在一个具体实施方式中，本发明所用接头肽是Ser-Ala-Gly-Ser-Gly(SAGSG)(SEQ ID NO:23)。
[0184] 本发明所用接头肽可为本领域已知的任何接头，例如用于单链蛋白如scFv的scFv接头。在一个实施方式中，所述接头肽是序列(Gly)n。在另一实施方式中，所述接头肽包括序列(GlyAla)n。在其他实施方式中，所述接头肽包括序列(GGS)n、(GGGS)n、(SEQ ID NO:24)或(GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO:25)，其中n是1-10、5-20、10-30、20-50、40-80或50-100的整数。
[0185] 本发明还提供编码含编码区域的融合蛋白的分离多核苷酸，所述编码区域编码含多拷贝M2胞外域肽（METR）的多肽，其中所述多肽还包括一种或多种表位。在一个实施方式中，所述多肽还包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个表位。在另一实施方式中，所述表位长度为至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个氨基酸。
在一个实施方式中，所述多肽中存在的任何M2胞外域肽在其和毗邻的M2胞外域肽之间插有表位。在另一实施方式中，所述多肽还包括M2胞外域肽之间插入的一种表位或多于一种表位。存在多于一种表位时，所述表位可相同或不同。
在一个实施方式中，所述多肽中存在的任何M2胞外域肽在其和毗邻的M2胞外域肽之间插有表位。在另一实施方式中，所述多肽还包括M2胞外域肽之间插入的一种表位或多于一种表位。存在多于一种表位时，所述表位可相同或不同。
[0186] 所述表位可为B细胞表位或T细胞表位。本发明所用的B细胞表位可源自M2蛋白，例如位于M2胞外域的N末端19-20氨基酸内的抗体表位。B-细胞表位的非限制性示例为SEQ ID NO:1的氨基酸5-12、SEQ ID NO:1的氨基酸1-10、SEQ IDNO:2的氨基酸7-17、SEQ ID NO:3的氨基酸5-14或SEQ ID NO:3的氨基酸3-19。B细胞表位可源自M2蛋白的其他结构域，例如跨膜结构域或胞质结构域。或者，B细胞表位可获自任何流感病毒蛋白或其片段，如血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质1蛋白(M1)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亚基(PA)、RNA聚合酶PB1亚基(PB1)、RNA聚合酶PB2亚基(PB2)。
[0187] 本发明所用T细胞表位可包含任何数量的氨基酸并且源自任何已知的抗原或免疫原。在一个实施方式中，T细胞表位可源自任何流感病毒蛋白或其片段，如血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质1蛋白(M1)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亚基(PA)、RNA聚合酶PB1亚基(PB1)、或RNA聚合酶PB2亚基(PB2)。在一个具体实施方式中，T辅助细胞表位可包含在总计15个氨基酸的两侧各具有3个侧接氨基酸的9个核心氨基酸。其与主要组织相容性复合物（小鼠中MHC，人中HLA）的缺口的结合可通过已知方法计算。预测高评分肽为HLA分子的那些MHC的配体。
[0188] 在一个具体实施方式中，本发明所用T细胞表位包含选自SEQ ID NO:26、SEQID NO:27或二者的氨基酸序列，所述序列描述于美国专利号6,663,871，其通过引用全文纳入本文。
[0189] 本发明包括多拷贝的M2胞外域肽、两种或更多M2胞外域肽之间插入的一种或多种任选的接头肽、和/或两种或更多M2胞外域肽之间插入的一种或多种任选的表位。在一个实施方式中，本发明的多核苷酸编码含至少6种M2胞外域肽（M2e#1、M2e#2、M2e#3、M2e#4、M2e#5和M2e#6）的多肽、任何两种或更多M2胞外域肽(如M2e#1-M2e#2、M2e#2-M2e#3、M2e#3-M2e#4、M2e#4-M2e#5或M2e#5-M2e#6)之间插入的一种或多种接头肽、和任何两种或更多M2胞外域肽之间插入的一种或多种表位。在一个具体实施方式中，所述多肽包括6种M2胞外域肽、其间插入的3种接头肽和其间插入的两种表位，其中：
[0190] (1)所述第一M2胞外域肽(M2e#1)和第一M2胞外域肽(M2e#2)之间插入的第一接头肽；
[0191] (2)所述第二M2胞外域肽(M2e#2)和第三M2胞外域肽(M2e#3)之间插入的第二接头肽；
[0192] (3)所述第三M2胞外域肽(M2e#3)和第四M2胞外域肽(M2e#4)之间插入的第三接头肽；
[0193] (4)所述第四M2胞外域肽(M2e#4)和第五M2胞外域肽(M2e#5)之间插入的第一表位；和
[0194] (5)所述第五M2胞外域肽(M2e#5)和第六M2胞外域肽(M2e#6)之间插入的第二表位。
[0195] 在一些实施方式中，本发明的分离多核苷酸包括编码多肽的编码区域，所述多肽包括多拷贝的M2胞外域肽，其中所述编码区域还包括其他核酸序列。在某些实施方式中，所述其他核酸可编码其他多肽，任选地融合本发明多肽。所述其他多肽可包括流感病毒的至少一种免疫原性表位，其中所述表位引发B细胞（抗体）响应、T细胞响应或二者。
[0196] 各种其他核酸可用于编码其各自的其他多肽。在一个实施方式中，所述其他多肽融合本发明的METR多肽。在其他实施方式中，所述其他多肽不融合本发明的METR多肽，但在表达METR多肽的相同载体中生成。所述其他核酸序列的非限制性示例为编码流感蛋白、其变体、衍生物、类似物或片段的核酸序列。所述流感病毒蛋白可选自下组：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质1蛋白(M1)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亚基(PA)、RNA聚合酶PB1亚基(PB1)、或RNA聚合酶PB2亚基(PB2)。
[0197] 在一些实施方式中，其他多肽选自下组：赋予稳定性、分泌性或简单纯化的N-或C-末端肽，即His-标签、泛素标签、NusA标签、几丁质结合域、ompT、ompA、pelB、DsbA、DsbC、c-myc、KSI、聚天冬氨酸、(Ala-Trp-Trp-Pro)n(SEQ ID NO:28)、聚苯丙氨酸、聚胱氨酸、聚精氨酸、B-标签、HSB-标签、绿色荧光蛋白(GFP)、血凝素流感病毒(HAI)、钙调蛋白结合蛋白(CBP)、半乳糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)、纤维素结合域(CBD's)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、链球菌蛋白质G、葡萄球菌蛋白A、T7genelO、亲和素/链霉亲和素/Strep-标签、trpE、氯霉素乙酰基转移酶、TMlacZ(β-半乳糖苷酶)、His-修补（patch）的硫氧还蛋白、硫氧还蛋白、FLAG 肽(西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))、S-标签,和T7-标签。参见例如，Stevens,R.C.,Structure,8:R177-R185(2000)。所述异源多肽还可包括任何前序列和/或预序列，其有利于METR序列或任何有用免疫原性序列的转运、移位、加工和/或表达，包括但不限于编码微生物病原体的T细胞表位或其他免疫原性蛋白和/或表位。其他合适的其他多肽可包括前导序列或信号序列。
[0198] 密码子优化
[0199] 本发明范围中还包括密码子优化的多核苷酸，其编码含多拷贝M2胞外域肽序列的多肽。本领域技术人员容易实现编码所述多肽的核酸的修饰，例如通过编码多肽的多核苷酸的寡核苷酸定向定点诱变。该修饰的多肽可由密码子优化的核苷酸序列编码。该修饰产生一种或多种氨基酸取代、插入、缺失和/或修饰以表达包括片段、变体和衍生物的多肽。所述修饰可提高抗原的免疫原性，例如与未修饰的多肽相比增加细胞免疫响应。所述修饰可提高多肽的溶解度。或者，所述修饰可无效。例如，M2胞外域肽可通过抗原呈递细胞中蛋白水解酶活性的具体切割位置的引入、缺失、或修饰，以增强对具体表位的免疫响应。
[0200] 本领域普通技术人员应理解，由于遗传密码的冗余性，各种核酸编码区域会编码相同的多肽。包括编码任何多肽链氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差允许编码基因的序列有变化。由于各密码子由三个核苷酸组成，且含DNA的核苷酸局限于四种特定碱基，所以有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸（剩余三种密码子编码信号末端翻译）。显示哪种密码子编码哪种氨基酸的“遗传密码”在本文中示于表3。因此，许多氨基酸被多于一种密码子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由4种三联体编码、丝氨酸和精氨酸由6种编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性使DNA碱基组合物在较广的范围内不同，而不改变DNA编码的多肽的氨基酸序列。
[0201] 表3：标准遗传密码
[0202]
[0203]
[0204] 应理解任何编码本发明所述多肽的多核苷酸都落入本发明范围内，不论所用的密码子如何。
[0205] 许多生物体对具体密码子的使用显示出偏好，用于编码生长的多肽链中具体氨基酸的插入。密码子优先或密码子偏好，生物体之间密码子使用的差异，由遗传密码的简并性提供，且在许多生物体之间已详细记载。密码子偏好常和信使RNA（mRNA）的翻译效率相关，继而认为其依赖（但不限于）被翻译的密码子性质和具体转移RNA（tRNA）分子的有效性等。所选tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中使用最频繁的密码子。因此，可基于密码子优化就给定生物体中最佳的基因表达来调节基因。
[0206] 本发明提供分离多核苷酸，其包括含编码最优化编码区域、主要由其组成或由其组成的多核苷酸，所述编码区域编码本文公开的流感病毒蛋白如METR。在该实施方式中，密码子使用适于给定原核生物或真核生物的细胞中的最优表达。
[0207] 通过将优选用于给定物种基因的密码子纳入DNA序列来制备多核苷酸。还提供含密码子优化编码区域的核酸片段的多核苷酸表达构建体、载体和宿主细胞，所述编码区域编码流感病毒多肽如METR，以及所述多核苷酸表达构建体、载体和宿主细胞用于治疗或预防动物中流感病毒感染的各种方法。
[0208] 鉴于各种动物、植物和微生物物种可获得的大量基因序列，可计算密码子使用的相对频率。密码子使用表可在例如获自www.kazusa.or.jp/codon/（2006年5月30日访问）“密码子使用数据库”上获得，这些表可适用于许多方面。参见Nakamura,Y.,等，“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:statusfor the year 2000（国际DNA序列数据库制表所得的密码子使用：2000年状态）”Nucl.Acids Res.28:292(2000)。从GenBank发布151.0计算的密码子使用表示于表4(来自www.kazusa.or.jp/codon/同上)。这些表使用mRNA命名法，因此表中使用RNA中发现的尿嘧啶(U)，而不是DNA中发现的胸腺嘧啶(T)。所述表经过调整，从而频率针对各氨基酸计算，而不是所有64个密码子。
[0209] 表4：人基因（智人（Homo sapiens））的密码子使用表
[0210]
[0211]
[0212] 通过使用这些或相似的表，本领域普通技术人员可将所述频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码区域的核酸片段，所述编码区域编码多肽但使用对给定物种最优的密码子。
[0213] 合成上述任何方法所设计密码子优化的编码区域有很多选择，使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规分子生物学操作。在一个方法中，用标准方法合成一系列各长80-90核苷酸分子并跨越所需序列长度的互补寡核苷酸对。合成这些寡核苷酸对，从而其在退火后形成80-90碱基对的双链片段，包含黏性末端，如所述对中的各寡核苷酸合成为比该对中与另一寡核苷酸互补的区域延伸超出3、4、5、6、7、8、9、10或更多碱基。各对寡核苷酸的单链末端设计成与另一对寡核苷酸的单链末端退火。使该寡核苷酸对退火，然后约5-6种这些双链片段通过黏性单链末端一起退火，然后其连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，如获自例如加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司（Invitrogen Corporation）的TOPO载体。然后该构建体由标准方法测序。制备制备由5-6种80-90个碱基对片段连接在一起的片段组成的数种这些构建体，即约500碱基对的片段，从而完整的所需序列在一系列质粒构建体中呈现。然后用合适的限制性酶切割这些质粒的插入物并连接在一起形成最终构建体。然后将最终构建体克隆到标准细菌克隆载体中，并测序。本领域技术人员可立即清楚了解其他方法。此外，基因合成易市售获得。
[0214] 载体
[0215] 本发明涉及遗传工程改造中常规使用的载体如质粒、粘粒、病毒和细菌噬菌体，所述载体含编码流感病毒抗原或多肽的多核苷酸，所述多肽含相对彼此以任何顺序排列的多拷贝M2胞外域肽，如METR。
[0216] 在一个实施方式中，所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。在另一个实施方式中，所述载体是病毒载体。源自病毒如逆转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于递送本发明多核苷酸或载体到靶细胞群中。本领域技术人员熟知的方法可用于构建重组病毒载体；参见例如，Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual（《分子克隆实验室手册》）,纽约的冷泉港实验室(1989)和Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology（《新编分子生物学新方法》）,纽约的格林出版联合公司和韦利出版公司（GreenPublishing Associates and Wiley Interscience）(1994)所述的技术。或者，本发明的多核苷酸和载体可重组到脂质体中以用于递送至靶细胞。含本发明多核苷酸（如多拷贝的M2胞外域序列（METR））的载体可通过熟知方法（根据细胞宿主类型而不同）转入宿主细胞。例如，氯化钙转染通常用于原核生物细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主，参见Sambrook，如上。通常，与本发明相容的载体包含选择性标记物、有利于克隆所需基因的合适限制性位点和进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
[0217] 在某些实施方式中，本发明涉及痘病毒如痘苗病毒如改良的痘苗病毒安卡拉株(MVA)，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含流感病毒多肽如多拷贝的M2胞外域（METR）、NP或二者。MVA是高度减毒的痘苗病毒株，为痘病毒科正痘病毒属的成员。痘病毒包括四个痘病毒属，即正痘病毒属、副痘病毒属、亚塔痘病毒属和软疣痘病毒属。正痘病毒包括但不限于，天花病毒(引起天花的介质)、痘苗病毒、牛痘病毒、猴痘病毒和浣熊痘病毒；副痘病毒包括但不限于羊痘病毒、伪牛痘和牛流行口炎病毒;亚塔痘病毒包括但不限于塔那痘病毒（tanapox virus）和亚巴（yaba）猴肿瘤病毒;和软疣痘病毒包括传染性软疣病毒(MCV)。
[0218] 痘苗病毒用作活疫苗来针对人天花疾病免疫或工程改造病毒载体以用于重组基因表达或潜在用作重组活疫苗(Mackett,M.等，1982 PNAS USA 79:7415-7419;Smith,G.L.等，1984 Biotech GenetEngin Rev 2:383-407)。工程改造的病毒载体可在DNA重组技术的帮助下包含编码外源抗原如流感病毒多肽的DNA序列（基因）。若所述基因在对病毒生命周期不必需的病毒基因组中位置整合，则新产生的纳入外源基因的重组痘苗病毒可能感染宿主细胞并因此诱导所述外源基因在宿主细胞中表达。（美国专利号5,110,587;83,286;和110,385，其通过引用全文纳入本文）。该方法制备的重组痘苗病毒（如MVA）根据本发明使用作为针对体内预防传染性流感疾病的活疫苗。
[0219] 在一个实施方式中，本文所用痘苗病毒菌株的示例为高度减毒的改良痘苗病毒安卡拉株（MVA）。MVA通过鸡胚成纤维细胞上痘苗病毒（CVA）的安卡拉株长期连续传代生成（参见Mayr,A.等1975 Infection 3:6-14;瑞士专利号568,392）。MVA病毒可公开获得，如来自美国典型培养物保藏中心（American Type CultureCollection），ATCC编号:VR-1508。MVA根据其减毒程度区分，如某些哺乳动物细胞中减弱的毒力和受限的再生传染性病毒粒子的能力，同时维持良好的免疫原性和在禽类细胞中复制和生成传染性病毒粒子的完全能力。MVA病毒在其基因组中具有诱导相对母体CVA株系减毒的改变。已鉴定基因组DNA的6种主要缺失（缺失I、II、III、IV、V和VI）总计31,000碱基对（约其基因组的10％）（Meyer,H.等1991 J Gen Virol 72:1031-1038，其通过引用全文纳入本文）。得到的MVA病毒在哺乳细胞中变得极度减毒。由于其减毒，本发明的MVA甚至在免疫抑制个体中可无毒且在针对传染性流感疾病的活疫苗中与使用MVA相关的副作用非常小。
[0220] 所述载体如本发明的MVA在人细胞中可经过有限的复制，这是由于其复制在感染的后期被阻断。有限的复制阻止成熟的传染性病毒粒子装配。然而，载体例如本发明的MVA甚至在非允许的细胞中能以高水平表达病毒和重组基因并能作为有效和安全的基因表达载体。
[0221] 在本发明的一个实施方式中，编码流感病毒多肽的分离多核苷酸序列如METR融合与天然产生的缺失毗邻的MVA侧接序列，所述缺失如缺失I、缺失II、缺失III、缺失IV、缺失V或缺失VI，或MVA基因组中所述多核苷酸5'或3'末端存在的其他非必须位点。MVA基因组的非必须区域包括但不限于基因间区域和天然产生的缺失区域以及复制不需要的其他基因如tk基因。载有编码一种或多种流感病毒抗原如METR的多核苷酸序列的DNA序列可为线性或环形，为聚合酶链式反应产物或质粒，且还可包括调节序列如可操作性连接编码至少一种流感病毒多肽的编码区域的启动子。所述调节元件的非限制性示例包括EP-A-198,328所述的痘苗11ka基因和7.5kDa基因（EP-A-110,385），各通过引用全文纳入本文。
[0222] 在一些实施方式中，本发明提供含多核苷酸的重组MVA，所述多核苷酸包括可操作连接编码流感病毒多肽抗原如METR的编码区域的启动子。在一个具体实施方式中，所述启动子是病毒启动子（如痘苗病毒或改良的安卡拉痘苗病毒启动子）。在其他具体实施方式中，所述启动子为合成启动子。在其他实施方式中，该启动子是强启动子。在一个具体实施方式中，所述启动子是强合成启动子。在一个具体实施方式中，所述启动子是具有序列AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA(SEQ ID NO:29)的PS启动子(Chakrabarti,Sisler和Moss(1997).Biotechniques 23:1094-1097)。在其他具体实施方式中，所述启动子是具有序列AAAAAATGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATT(SEQ ID NO:30)的修饰的H5启动子(Rosel等(1986).J.Virol.60(2):236-249)。
[0223] 痘病毒转录控制区域包括启动子和转录终止信号。痘病毒中的基因表达随时间调节，且早期、中期和晚期基因的启动子含不同结构。某些痘病毒基因组成型表达，且这些“早-晚”基因的启动子带有杂交结构。也已开发合成的早-晚启动子。参见Hammond J.M., 等 ,J.Virol.Methods 66:135-8(1997);Chakrabarti S., 等 ,Biotechniques23:1094-7(1997)。因此，本发明中可使用任何痘病毒启动子如早期、晚期或组成型启动子。
[0224] 早期启动子的非限制性示例包括7.5-kD启动子(也是晚期启动子)、DNA pol启动子、tk启动子、RNA pol启动子、19-kD启动子、22-kD启动子、42-kD启动子、37-kD启动子、87-kD启动子、H3’启动子、H6启动子、D1启动子、D4启动子、D5启动子、D9启动子、D12启动子、I3启动子、M1启动子和N2启动子。参见例如Moss,B.,“Poxviridae and their Replication（《痘病毒科和其复制》）”，收录于Virology （《病毒学》）第二版，B.N.Fields,D.M.Knipe等编，拉文出版社（Raven Press）2088页(1990)。痘苗病毒和其他痘病毒中转录的早期基因识别转录终止信号TTTTTNT(SEQ ID NO:31)，其中N可为任何核苷酸。转录通常终止于该信号上游约50bp。因此，若异源基因由痘病毒早期启动子表达，必须小心消除该信号在所述基因编码区域中的存在。参见例如Earl,P.L.,等，J.Virol.64:2448-51(1990)。
[0225] 晚期启动子示例包括但不限于7.5-kD启动子、MIL启动子、37-kD启动子、11-kD启动子、11L启动子、12L启动子、13L启动子、15L启动子、17L启动子、28-kD启动子、H1L启动子、H3L启动子、H5L启动子、H6L启动子、H8L启动子、D11L启动子、D12L启动子、D13L启动子、A1L启动子、A2L启动子、A3L启动子和P4b启动子。参见例如Moss,B.,“Poxviridae and their Replication（《痘病毒科和其复制》）”，收录于Virology （《病毒学》）第二版,B.N.Fields,D.M.Knipe等编，拉文出版社（Raven Press）2090页(1990)。晚期启动子似乎不识别早期启动子所识别的转录终止信号。
[0226] 本发明所用的组成型启动子的非限制性示例包括Hammond和Chakrabarti所述的合成的早-晚期启动子、MH-5早-晚期启动子和7.5-kD或“p7.5”启动子。
[0227] 本发明还涉及包括本发明多核苷酸的载体如MVA，和其他核酸序列。所述其他核酸序列可插入与编码多拷贝M2胞外域肽（METR）的多核苷酸序列插入的位点相同或不同的插入位点。所述其他核酸序列可包括编码其他多肽的编码区域。所述其他核酸序列还可与启动子连接。在一个实施方式中，本发明载体如MVA编码两种或更多抗原或免疫原，一种抗原是METR或NP共有序列，另一种抗原是其他多肽。所述其他多肽可为本文所用流感病毒蛋白、其变体、片段、衍生物或类似物。
[0228] 在一个具体实施方式中，本发明载体如MVA表达至少两种流感病毒抗原如METR和HA、METR和NP、HA和NP，和至少3种流感病毒抗原如METR、HA和NP。在某些实施方式中，本发明载体表达至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种流感病毒抗原。
[0229] 本发明还提供生产载体如MVA的方法，所述方法包括将分离多核苷酸（DNA）构建体引入感染有载体如MVA的宿主细胞，所述构建体含编码多拷贝M2胞外域肽（METR）的多核苷酸以允许同源重组。一旦编码METR多肽的DNA构建体引入宿主细胞且外源DNA序列用病毒DNA重组，得到的重组MVA病毒包含编码METR多肽的多核苷酸。本发明还提供用已知方法如标记物协助来分离所得MVA。载有METR多肽基因的DNA构建体还可通过转染引入MVA感染细胞，例如通过磷酸钙沉淀（Graham等1973Virol 52:456-467;Wigler等1979Cell 16:777-785）、通过电穿孔（Neumann等1982EMBO J.1:841-845）、通过微注射（Graessmann等1983Meth Enzymol 101:482-492）、通过脂质体（Straubinger等1983 Meth Enzymol101:512-527）、通过原生质体（Schaffher 1980 PNAS USA 77:2163-2167）或通过本领域技术人员已知的其他方法。本文所列转染方法的参考文献通过引用全文纳入本文。
[0230] 根据本发明，重组MVA痘苗病毒可通过数种熟知技术分离，例如基于K1L基因的选择方案。作为非限制性示例，DNA构建体可包含编码痘苗病毒K1L蛋白或K1L衍生多肽作为标记物的DNA序列，和编码METR多肽的DNA序列，所述METR多肽两端均被侧接MVA基因组内非必须位点如天然产生的缺失如缺失III的DNA序列所侧接。
[0231] 本发明所用的宿主细胞包括但不限于真核细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞或人细胞。真核细胞的非限制性示例为BHK-21(ATCC CCL-10)、BSC-1(ATCCCCL-26)、CV-1(ECACC87032605)或MA104(ECACC 85102918)。在一种实施方式中，宿主细胞是禽类细胞，包括但不限于鸡细胞、鸭细胞或鹌鹑细胞。禽类细胞的非限制性示例是鸡成纤维细胞、鹌鹑成纤维细胞、QT9细胞、QT6细胞、QT35细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、鸡胚衍生的LSCC-H32细胞、鸡DF-1细胞、或初级鸡胚成纤维(CEF)细胞。在其他实施方式中，本发明中用作宿主细胞的禽类细胞是永生的。所述永生禽类细胞可为永生鸭细胞，包括但不限于美国专利申请号US 2008/0227146A1和国际公开号WO 2007/054516A1所述的AGE1cr细胞和AGE1cr.pIX细胞，其通过引用全文纳入本文。本文所用其他永生鸭细胞包括美国专利申请号US
2010/062489A1中所述的胚胎来源干细胞如 细胞，其通过引用全文纳入本文。其他有用的禽类细胞系如PCT申请公开号WO 2006/1088646A2、美国申请公开号2006/0233834A1、和美国专利号5,830,510和6,500,668所述，其都通过引用全文纳入本文。
2010/062489A1中所述的胚胎来源干细胞如 细胞，其通过引用全文纳入本文。其他有用的禽类细胞系如PCT申请公开号WO 2006/1088646A2、美国申请公开号2006/0233834A1、和美国专利号5,830,510和6,500,668所述，其都通过引用全文纳入本文。
[0232] 多肽
[0233] 本发明还包括含多拷贝M2胞外域肽（METR）的多肽。在一个实施方式中，本发明是含相对彼此以任何顺序排列的至少5种下述流感病毒基质2蛋白胞外域肽的分离多肽：(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQ ID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii)SEQ ID NO:7(M2e#1_S);(viii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(ix)SEQ ID NO:9(M2e#3_S);(x)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(xi)SEQID NO:11(M2e#5_S);和(xii)SEQ ID NO:12(M2e#6_S).[0234] 在一个实施方式中，本发明提供含相对彼此以任何顺序排列的至少3种下述M2胞外域肽的分离多肽：(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQ ID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQID NO:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii)SEQ ID NO:7(M2e#1_S);(viii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(ix)SEQ ID NO:9(M2e#3_S);(x)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(xi)SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和(xii)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。在另一实施方式中，所述多肽含至少4、5、6、7、8、9、10、11或12种M2胞外域肽。在一些实施方式中，本发明多肽是融合蛋白且诱导针对流感病毒的免疫响应。在某些实施方式中，本发明多肽含相对彼此以任何顺序排列的至少3种下述M2胞外域肽：(a)(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQ ID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);和(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C)或(b)(i)SEQ ID NO:7(M2e#1-S);(ii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(iii)SEQ ID NO:9(M2e#3_S);(iv)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(v)SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和(vi)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。
[0235] 在一个具体实施方式中，本发明的多肽包含相对彼此以任何顺序排列的下述6种氨基酸序列：(a)(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQ ID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);和(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);或(b)(i)SEQ ID NO:7(M2e#1-S);(ii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(iii)SEQ ID NO:9(M2e#3_S);(iv)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(v)SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和(vi)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。在其他实施方式中，本发明多肽含SEQ ID NO:20的NP共有序列。
[0236] 本发明多肽可为融合蛋白，所述蛋白还包括其他多肽。所述其他多肽的非限制性示例为其他流感病毒多肽、其变体、衍生物、类似物或片段。其他多肽可为免疫原性或抗原性且可为任何已知抗原。
[0237] 组合物
[0238] 含免疫学有效量的分离多核苷酸、多肽或载体如MVA的组合物如药物或疫苗组合物是本发明的其他实施方式。该组合物可包括例如脂肽(如Vitiello,A.等，J.Clin.Invest.95:341,1995),包被多肽如在聚(DL-丙交酯-乙交酯共聚物)(“PLG”)微球中( 参 见 例 如 Eldridge, 等，Molec.Immunol.28:287-294,1991:Alonso等，Vaccine12:299-306,1994;Jones等，Vaccine 13:675-681,1995)；免疫刺激复合物(ISCOM)中含有的多肽组合物(参见例如Takahashi等，Nature 344:873-875,1990;Hu,等，Clin Exp Immunol.113:235-243,1998);多抗原肽系统(MAP)(参见例如Tam,J.P.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5409-5413,1988;Tam,J.P.,J.Immunol.Methods 196:17-32,1996); 病 毒或合成来源的颗粒(如Kofler,N.等，J.Immunol.Methods.192:25,1996;Eldridge,J.H. 等，Sem.Hematol.30:16,1993;Falo,L.D.,Jr. 等，Nature Med.7:649,1995); 佐剂( 如 不 完 全 弗 氏 佐 剂)(Warren,H.S.,Vogel,F.R., 和 Chedid,L.A.Annu.Rev.Immunol.4:369,1986;Gupta,R.K.等，Vaccine11:293,1993);或脂 质体 (Reddy,R.等，J.Immunol.148:1585,1992;Rock,K.L.,Immunol.Today 17:131,1996)。所述组合物可为药物、抗原、免疫原或疫苗组合物。
[0239] 本发明组合物如疫苗组合物可用已知方法配制。合适的制备方法描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences（《雷明顿药物科学》）第16版,A.Osol编,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.Easton,PA)(1980)和Remington’s Pharmaceutical Sciences（《雷明顿药物科学》）第16版,A.R.Gennaro编,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(1995)，二者通过引用全文纳入本文。尽管所述组合物作为水溶液给予，但其还可配制为乳剂、凝胶、溶液、悬液、冻干形式、或本领域任何其他已知形式。此外，所述组合物可包括药学上可接受的添加剂，包括例如稀释剂、粘合剂、稳定剂和防腐剂。一旦配制好，可将本发明组合物直接给予对象。所述待治疗对象可以是动物；具体为人。
[0240] 本发明组合物中多核苷酸、多肽或载体如MVA的浓度可广泛变化，即以重量计，从低于约0.1%，通常为2%或至少约2%，至高达20%-50%或更高；主要通过液体体积、粘度等，按照所选的具体给药方式进行选择。
[0241] 在一个实施方式中，本发明组合物包括含编码序列的分离多核苷酸，所述编码序列编码的多肽含相对彼此以任何顺序排列的多拷贝例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种下述M2胞外域肽：(i)SEQ ID NO:1(M2e#1_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQ ID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQID NO:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii)SEQ ID NO:7(M2e#1_S);(viii)SEQ ID NO:8(M2e#2_S);(ix)SEQ ID NO:9(M2e#3_S);(x)SEQ ID NO:10(M2e#4_S);(xi)SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和(xii)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。在另一实施方式中，组合物如本发明的疫苗组合物包括一种或多种含多核苷酸的载体如MVA，所述多核苷酸编码多拷贝的M2胞外域肽（METR）或NP共有序列。在一些实施方式中，含本发明多肽的组合物包括多拷贝的M2胞外域肽。
[0242] 在一些实施方式中，具有含本发明多核苷酸的载体的宿主细胞纳入组合物，如Eko,等，J.Immunol.,173:3375-3382,2004所述。
[0243] 某些组合物还可在所述多核苷酸、多肽或载体如MVA之前、之后或同时包括一种或多种佐剂。多种料通过各种机制表现出佐剂活性。根据本发明就其提高免疫响应的能力筛选的可能佐剂包括但不限于：惰性运载体如铝、膨润土、胶乳和丙烯酸颗粒;普流罗尼克嵌段聚合物如 (嵌段共聚物CRL-8941、鲨烯(可代谢油)和微粒二氧化硅稳定剂)，贮存形成剂如弗氏佐剂，表面活性材料如皂苷、溶血卵磷脂、视黄醛、Quil A、脂质体和普流罗尼克聚合物制剂;巨噬细胞刺激物如细菌脂多糖;聚阳离子聚合物如壳聚糖;替代途径补充活化剂如胰岛素、酵母聚糖、内毒素和左旋咪唑;和非离子表面活性剂如泊洛沙姆、聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)三嵌段共聚物、细胞因子和生长因子;细菌组分(如内毒素，具体为超抗原；外毒素和细胞壁组分);铝基盐如氢氧化铝;钙基盐;二氧化硅;多核苷酸;类毒素;血清蛋白、病毒和病毒来源的材料、毒剂、毒液、咪唑喹啉化合物、泊洛沙姆、mLT和阳离子脂质。通过引用纳入本文的国际专利申请PCT/US95/09005描述了产肠毒素大肠杆菌（E.coli)(“mLT”)的热不稳定毒素突变形式作为佐剂的应用。通过引用纳入本文的美国专利号5,057,540描述了佐剂Qs21。在一些实施方式中，所述佐剂是toll样受体(TLR)刺激佐剂。参见例如Science 312:184-187(2006)。TLR佐剂包括刺激TLR（如TLR1-TLR17）的化合物，引起对本发明疫苗组合物的免疫系统响应提高。TLR佐剂包括但不限于CpG (科雷制药集团公司(ColeyPharmaceutical Group Inc.)和MPL(克里萨公司(Corixa))。CpG佐剂的一个示例是WO 98/018810、美国专利申请号2002/0164341A、美国专利号6,727,230和国际公开号WO98/32462所述的CpG7909，其通过引用全文纳入本文。
[0244] 佐剂剂量可根据具体佐剂而不同。例如，在一些方面，剂量范围可包括：就CpG而言，10μg/剂量-500μg/剂量或50μg/剂量-200μg/剂量。剂量范围可包括:就MPL而言，2μg/剂量-100μg/剂量或10μg/剂量-30μg/剂量。剂量范围可包括:就氢氧化铝而言，10μg/剂量-500μg/剂量或50μg/剂量-100μg/剂量。初免-加强方案中，如本文他处所述，佐剂可与初次免疫、加强免疫或二者联用。
[0245] 在某些佐剂组合物中，所述佐剂是细胞因子。本发明的某些组合物包括一种或多种细胞因子、趋化因子或诱导产生细胞因子和趋化因子的化合物，或编码一种或多种细胞因子、趋化因子或诱导产生细胞因子和趋化因子的化合物的多核苷酸。细胞因子的示例包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、集落刺激因子(CSF)、促红细胞生成素(EPO)、白介素2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素8(IL-8)、白介素9(IL-9)、白介素10(IL-10)、白介素11(IL-11)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素14(IL-14)、白介素15(IL-15)、白介素16(IL-16)、白介素17(IL-17)、白介素18(IL-18)、干扰素α(IFN)、干扰素β(IFN)、干扰素γ(IFN)、干扰素ω(IFN)、干扰素τ(IFN)、干扰素γ诱导因子I(IGIF)、转化生长因子β(TGF-)、RANTES(活化后调节、正常T-细胞表达和推测分泌)、巨噬细胞炎症蛋白(如MIP-1α和MIP-1β)、利什曼虫（Leishmania）延伸起始因子(LEIF)和Flt-3配体。
[0246] 佐剂增加对抗原免疫响应的能力通常由免疫介导反应的显著增加或疾病症状的减轻来表现。例如，体液免疫的增加通常表现为针对抗原产生的抗体效价显著增加来，T细胞活性的增加通常表现为细胞增殖或细胞毒性或细胞因子分泌增加。佐剂还可改变免疫响应，例如通过将初级体液或Th2响应变为初级细胞或Th1响应。给定抗原的免疫响应可通过本领域普通技术人员熟知和/或本文他处所述的各种免疫试验测试。
[0247] 此外，多拷贝的M2胞外域肽（METR）多肽可偶联细菌类毒素，如来自白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌（H pylori）或其他病原体的毒素。此外，METR多肽可偶联细菌多糖，如来自奈瑟球菌（Neisseria spp.）、肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae spp.）或b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）细菌的荚膜多糖。
[0248] 对于固体组合物，可使用常规无毒固体载体，包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬质酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给予，药学上可接受的无毒组合物通过纳入任何正常使用的赋形剂如前面所列运载体和一般10-95%的活性成分，即一种或多种本发明多肽（通常浓度为25%-75%）来形成。
[0249] 在一些实施方式中，本发明涉及多价疫苗。例如，本发明的多价疫苗以有效量给予需要的对象时，可包括多核苷酸、多肽或载体如MVA，其中所述多核苷酸或载体如MVA编码两种或更多流感病毒表位或所述多肽包含两种或更多流感病毒表位。两种或更多流感病毒表位可源自相同或不同抗原。在某些实施方式中，所述多价疫苗诱导针对流感病毒基质2蛋白和其他流感病毒蛋白或其片段的免疫响应。在一个具体实施方式中，本发明组合物包括本发明的两种或更多种多核苷酸、多肽或载体如MVA。作为具体示例，本发明可包括含两种或更多MVA群的组合物，其中第一MVA包括含编码区域的多核苷酸，所述编码区域编码本发明的多拷贝M2胞外域肽（METR），而第二MVA包括编码其他抗原如其他流感病毒蛋白或其片段的多核苷酸。在一个实施方式中，所述其他抗原是HA、NP共有序列、其变体、衍生物、类似物或片段。在另一实施方式中，所述第二MVA中的其他抗原是含多拷贝M2e胞外域的多肽，所述胞外域与所述第一MVA中表达的METR序列不同。
[0250] 在某些实施方式中，本发明的多价疫苗组合物包括所述多核苷酸、多肽或载体如MVA，其中所述多核苷酸、多肽或载体如MVA以有效量给予需要的患者时，针对流感病毒和引发对一种或多种其他生物体和/或病毒发生免疫反应的多肽诱导免疫响应，所述其他生物体和/或病毒例如b型流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）、乙肝病毒、甲肝病毒、丙肝病毒、白喉棒状杆菌（Corynebacteriumdiphtheriae）、破伤风梭菌（Clostridium tetani）、脊髓灰质炎病毒（Polio virus）、麻疹病毒（Rubeola virus）、风疹病毒（Rubella virus）、粘液病毒(myxovirus）、奈瑟球菌(Neisseria）如淋球菌(N.gonnorrheae）、杜氏嗜血菌(Haemophilusducrey）、腹股沟肉芽肿菌（Granuloma inguinale）、肉芽肿荚膜杆菌(Calymmatobacterium granulomatis）、I型和II型人乳头瘤病毒(human papillomavirus(HPV)）、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum）、人型支原体(Mycoplasmahominis）、苍白密螺旋体(Treponema pallidum）、软疣痘病毒属的痘病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒或水痘-带状疱疹病毒。
[0251] 本发明的多价疫苗可包括多核苷酸、多肽或载体如MVA以及相容疫苗，其中本发明的两种疫苗和所述相容疫苗靶向相似患者群如免疫受损群、儿童、婴儿或老年人。
[0252] 治疗/预防的方法和方案
[0253] 还提供治疗或预防对象中流感病毒感染或流感病毒感染相关病症的方法，所述方法包括：给予需要的对象含本发明多核苷酸、多肽或载体如MVA的组合物。在某些实施方式中，所述对象是脊椎动物如哺乳动物，例如灵长类如人。在一些实施方式中，本发明涉及诱导对象如宿主动物中针对流感病毒的免疫响应的方法，所述方法包括给予有效量的含本发明任何一种或多种多核苷酸、多肽或载体如MVA的组合物。
[0254] 在一些实施方式中，可用所述多核苷酸、多肽或载体如MVA或组合物预防性处理动物如作为预防疫苗以在健康动物暴露于流感病毒或感染流感病毒症状前建立或提高其针对一种或多种流感病毒种的免疫，从而阻止疾病或降低疾病症状的严重性。本发明的一种或多种多核苷酸、多肽、载体如MVA或组合物还可用于治疗已暴露于流感病毒或已患流感病毒相关症状的动物，以进一步刺激所述动物的免疫系统，从而降低或消除与所述暴露相关的症状。本文所定义的“治疗动物”指用一种或多种多核苷酸、多肽或载体如MVA或含所述多核苷酸、多肽或载体如MVA的组合物预防、治愈、延迟或减轻动物中流感病毒如flu感染引起的症状的严重性和/或使所述症状在特定时间段内不加重。不需要本发明的的任何多核苷酸、多肽、载体如MVA或组合物提供针对流感病毒感染的完全保护或完全治愈或消除所有有关流感病毒感染的症状。本文所用的“需要治疗和/或预防免疫的动物”指需要治疗即预防、治愈、延迟或减轻流感病毒感染相关症状的严重性和/或使所述症状在特定时间段内不加重的动物。
[0255] 用含所述多核苷酸、多肽或载体如MVA的药物组合物治疗可与其他治疗分别进行或合适时联合进行。
[0256] 在治疗应用中，本发明的多核苷酸、多肽、载体如MVA或组合物给予患者的量足以引发针对流感病毒来源多肽的有效CTL响应，从而治愈或至少部分阻止症状和/或并发症。适于完成此的量定义为“治疗有效剂量”或“单位剂量”。该用途的有效量取决于例如本发明的多核苷酸、多肽、载体如MVA或组合物，给药方式，治疗疾病的阶段和严重性，患者体重和总体健康状态，和处方医师的判断。通常，MVA疫苗初免的范围为(用于治疗或预防给药)
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约100pfu-约1x10 pfu的MVA，在一些实施方式中为约10pfu-约10pfu的MVA，然后加
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强免疫的剂量为约10pfu-约10pfu，在一些实施方式中为10pfu-约10pfu的MVA，按照加强免疫方案持续数周至数月，这取决于通过测量患者血液中特异CTL活性所得的患者响应和情况。在其他实施方式中，人初免的剂量范围就70kg患者而言一般为(用于治疗或预
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防给药)约10pfu-约1x10 pfu的MVA，在一些实施方式中为1000pfu、5x10pfu、10pfu、
5 6 6 7 7 8 8 9 10
5x10pfu、10pfu、5x10pfu、10pfu、5x10pfu、10pfu、5x10pfu、10pfu或10 pfu，然后以相同剂量范围加强免疫，按照加强免疫方案持续数周至数月，这取决于通过测量患者血液中特异CTL（细胞毒性T淋巴细胞）活性所得的患者响应和情况。在一个本发明的具体非限
15
制性实施方式中，给予宿主约10pfu–约1x10 pfu的本发明MVA、或其片段、衍生物、变体
4 10 7 9
或类似物，或在一些实施方式中为10pfu–约1x10 pfu或10pfu-10pfu。
15 5 9
约100pfu-约1x10 pfu的MVA，在一些实施方式中为约10pfu-约10pfu的MVA，然后加
3 8 6 9
强免疫的剂量为约10pfu-约10pfu，在一些实施方式中为10pfu-约10pfu的MVA，按照加强免疫方案持续数周至数月，这取决于通过测量患者血液中特异CTL活性所得的患者响应和情况。在其他实施方式中，人初免的剂量范围就70kg患者而言一般为(用于治疗或预
20 4 5
防给药)约10pfu-约1x10 pfu的MVA，在一些实施方式中为1000pfu、5x10pfu、10pfu、
5 6 6 7 7 8 8 9 10
5x10pfu、10pfu、5x10pfu、10pfu、5x10pfu、10pfu、5x10pfu、10pfu或10 pfu，然后以相同剂量范围加强免疫，按照加强免疫方案持续数周至数月，这取决于通过测量患者血液中特异CTL（细胞毒性T淋巴细胞）活性所得的患者响应和情况。在一个本发明的具体非限
15
制性实施方式中，给予宿主约10pfu–约1x10 pfu的本发明MVA、或其片段、衍生物、变体
4 10 7 9
或类似物，或在一些实施方式中为10pfu–约1x10 pfu或10pfu-10pfu。
[0257] 本发明的非限制性实施方式中，有效量的本发明组合物使抗体效价上升至给药前抗体效价的至少2或3倍。
[0258] 应注意本发明的多核苷酸、多肽、载体如MVA和组合物一般可用于严重疾病状态，即危及生命或可能危及生命的情况。在该情况中，考虑到外源物质最小化和所述多肽的相对无毒性，治疗医师可能且会认为适合给予大量过量的这些多肽组合物。
[0259] 对于治疗应用，需在流感病毒感染的第一信号时开始给予。这之后是加强剂量直到至少症状基本消除并在之后持续一段时间。在慢性感染中，加载剂量后可能需要加强剂量。
[0260] 用本发明组合物治疗感染个体可加快解决急性感染个体中的感染。对于容易发展出慢性感染（或有此倾向）的那些个体，所述组合物在阻止急性发展为慢性感染的方法中尤其有用。如本文所述，在感染前或感染中鉴定到易感个体时，所述组合物可靶向其，使给予更大群体的需求最小化。
[0261] 更具体地，本发明组合物可给予动物的任何组织，包括但不限于肌肉、皮肤、脑组织、肺组织、肝组织、脾组织、骨髓组织、胸腺组织、心脏组织如心肌、心内膜和心包膜、淋巴组织、血液组织、骨组织、胰腺组织、肾脏组织、胆囊组织、胃组织、肠组织、睾丸组织、卵巢组织、子宫组织、阴道组织、直肠组织、神经系统组织、眼组织、腺组织、舌组织或结缔组织如软骨。
[0262] 此外，本发明组合物可给予脊椎动物的任何内腔，包括但不限于肺、口、鼻腔、胃、腹腔、肠、任何心室、静脉、动脉、毛细血管、淋巴腔、宫腔、阴道腔、直肠腔、关节腔、脑室、脊髓内椎管、眼腔、唾腺管道内腔、或肝脏。本发明组合物给予唾腺管道内腔或肝脏时，所需的多肽在各唾腺和肝脏中编码从而所述多肽从各唾腺和肝脏递送到脊髓动物的血流中。使用唾腺、肝脏和胰腺给予胃肠系统的分泌器官以释放所需多肽到血流中的某些方法在美国专利号5,837,693和6,004,944中公开，二者均通过引用全文纳入本文。
[0263] 在某些实施方式中，本发明的一种或多种组合物通过本文所述方法递送给动物，从而实现有效免疫响应和/或有效治疗或预防性免疫响应。可使用任何给药方式，只要所述方式使所需多肽以充足量递送到需要的组织中或在其中表达从而在需要这种响应的动物中产生对流感病毒的免疫响应和/或产生对流感病毒的预防性或治疗性免疫响应。根据公开的方法，本发明组合物可通过下述方法给予：粘膜递送、经皮递送、皮下注射、静脉注射、口服给予、经肺给予、肌肉内（i.m.）给予或通过硬膜内注射。其他合适的给药途径包括但不限于气管内、透皮、眼内、鼻内、吸入、腔内、管内（如胰腺中）和实质内（即任何组织中）给予。透皮递送包括但不限于皮内(如真皮或表皮内)、透皮(如经皮)和经粘膜递送(即进入或通过皮肤或粘膜组织)。腔内给予包括但不限于口服、阴道、直肠、鼻、腹膜或肠腔以及鞘内(即椎管中)、室内(即脑室或心室内)、房内(即心房内)和蛛网膜下腔(即脑的蛛网膜下腔空间)给药。
[0264] 可使用任何给药方式，只要所述方式使所需多肽以充足量递送到需要的组织中或在其中表达从而在需要这种响应的动物中产生对流感病毒的免疫响应和/或产生对流感病毒的预防性或治疗性免疫响应。本发明的给药方法包括针注射、导管输注、生物射弹注射器、颗粒加速器(如“基因枪”或充气“无针”注射器)Med-E-Jet(Vahlsing,H.,等，J.Immunol.Methods 171,11-22(1994))、Pigjet(Schrijver,R., 等，Vaccine15,1908-1916(1997)),Biojector（生物喷射器）(Davis,H.,等，Vaccine 12,1503-150
9(1994);Gramzinski,R., 等，Mol.Med.4,109-118(1998))、AdvantaJet(Linmayer,I.,等，Diabetes Care 9:294-297(1986))、Medi-jector(Martins,J.,andRoedl,E.J.Occup.Med.21:821-824(1979))、明胶海绵储剂、其他市售可得的储存材料(如水凝胶)、渗透泵(如Alza微泵)、口服或尿道固体(片剂或丸剂)药物制剂、局部皮肤霜剂、和手术中倾滗（decanting）使用多核苷酸包被缝合(Qin,Y.，等，LifeSciences 65,2193-2203(1999))或局部应用。给药的某些方法是肌肉内基于针的注射和通过导管输注的肺部应用。本段中引用的各参考文献通过引用全文纳入本文。
9(1994);Gramzinski,R., 等，Mol.Med.4,109-118(1998))、AdvantaJet(Linmayer,I.,等，Diabetes Care 9:294-297(1986))、Medi-jector(Martins,J.,andRoedl,E.J.Occup.Med.21:821-824(1979))、明胶海绵储剂、其他市售可得的储存材料(如水凝胶)、渗透泵(如Alza微泵)、口服或尿道固体(片剂或丸剂)药物制剂、局部皮肤霜剂、和手术中倾滗（decanting）使用多核苷酸包被缝合(Qin,Y.，等，LifeSciences 65,2193-2203(1999))或局部应用。给药的某些方法是肌肉内基于针的注射和通过导管输注的肺部应用。本段中引用的各参考文献通过引用全文纳入本文。
[0265] 用本发明多核苷酸、多肽、载体如MVA或组合物免疫后，宿主的免疫系统通过生成大量对所需抗原特异的HTL（辅助T淋巴细胞）和/或CTL（细胞毒性T淋巴细胞）来响应所述疫苗。因此，宿主变得对后期感染至少部分免疫或对发展中的慢性感染有至少部分抗性。
[0266] 在一些实施方式中，本发明的多核苷酸、多肽、载体如MVA或组合物刺激足以保护动物抵御流感病毒感染的细胞介导的免疫响应。在其他实施方式中，本发明的多核苷酸、多肽、载体如MVA或组合物诱导体液免疫响应。在某些实施方式中，本发明的多核苷酸、多肽、载体如MVA或组合物刺激体液和细胞介导的响应，其组合足以保护动物抵御流感病毒感染。
[0267] 在其他实施方式中，诱导T细胞响应的组分与诱导针对感兴趣靶抗原的抗体响应的组分联合。因此，在本发明某些实施方式中，本发明疫苗组合物与诱导或协助中和针对感兴趣抗原的抗体响应的多肽或多核苷酸联合。该组合物的一个实施方式包括本发明的I类表位，以及 (加利福尼亚州圣地亚哥的表观免疫公司（Epimmune）)分子(例如在美国专利号5,736,142中所述，其通过引用全文纳入本文。)
[0268] 多核苷酸、多肽、载体如MVA或含所述多核苷酸、多肽、载体如MVA的组合物可体内纳入动物细胞，并体内生成抗原量的流感M2源性多肽、其片段、变体或衍生物。根据本方法给予组合物后，METR多肽以足以引发免疫响应的量在动物中表达。该免疫响应可用来例如生成针对流感病毒的抗体以用于诊断试验或用作实验室试剂。
[0269] 本发明还提供生成、增强或调控针对动物中流感病毒的预防和/或治疗性免疫响应的方法，所述方法包括给予需要治疗和/或预防性免疫的动物一种或多种本文所述组合物。在一些实施方式中，所述组合物包括含多核苷酸的重组MVA，所述多核苷酸含编码本发明多肽的密码子优化的编码区域，其就给定的宿主生物体如人的表达而优化，或含该编码区域的片段，编码其片段、变体或衍生物。所述重组MVA体内纳入动物细胞且体内生成免疫有效量的流感病毒多肽或片段或变体。根据本方法给予所述组合物后，流感病毒衍生的多肽以治疗或预防有效量在动物中表达。
[0270] 本发明的组合物可在给予其的动物生命周期中任何时间给予该动物。例如，所述组合物可在出生后不久给予。在人中，可在其他疫苗给予时例如于出生时、2个月、4个月、6个月、9个月、1岁、5岁或青春期开始给予本发明的组合物。在一些实施方式中，本发明组合物的给予可在免疫抑制治疗开始前进行。
[0271] 此外，本发明组合物可用于任何需要的免疫或给药方案;如单次给予或作为定期疫苗接种如每年接种的一部分，或用于初免-加强方案中，其中本发明多肽或多核苷酸在给予相同或不同多肽或多核苷酸之前或之后给予。
[0272] 近期研究表明初免-加强方案通常是给予疫苗的合适方法。在初免-加强方案中，一种或多种本发明组合物可用于“初免加强”方案。“初免-加强”方案的示例可见Yang,Z.等J.Virol.77:799-803(2002)，其通过引用全文纳入本文。在非限制性示例中，将含本发明的多核苷酸、多肽或载体如MVA的一种或多种疫苗组合物递送到动物中，从而引起所述动物对流感病毒M2多肽的免疫响应，然后使用第二免疫原性组合物作为加强疫苗接种。
[0273] 在另一非限制性示例中，初免组合物和加强免疫组合物在单一组合物或单一制剂中组合。例如，单一组合物可包括分离多核苷酸或载体如含编码流感病毒蛋白、其片段、变体、衍生物或类似物的多核苷酸或者含流感病毒蛋白、其片段、变体、衍生物或类似物的分离多肽作为初免组分，和本发明的多核苷酸、多肽或载体如MVA作为加强免疫组分。在该实施方式中，所述组合物可包含于单一药瓶，其中初免组分和加强免疫组分混合在一起。通常，由于来自所述多核苷酸的多肽的表达水平峰值不在给药后期（如7-10天）发生，所述多核苷酸组分可提供对所分离多肽组分的加强。含初免组分和加强免疫组分的组合物在本文中称为“组合疫苗组合物”或“单一制剂异源初免-加强免疫疫苗组合物”。此外，所述初免组合物可在加强免疫组合物前给予，或如果预期所述加强免疫组合物要花较长时间起作用，初免组合物甚至在加强免疫组合物之后给予。
[0274] 在另一实施方式中，所述初免组合物可与加强免疫组合物同时给予，但在单独制剂中，其中分开所述初免组分和所述加强免疫组分。
[0275] 药盒
[0276] 本发明的多核苷酸、多肽或载体如MVA或组合物可以药盒形式与给予本发明重组MVA或组合物的方法一起提供。在一些实施方式中，所述药盒还可包括疫苗给予的说明。
[0277] 通常所述药盒包括在容器中如单位剂型的本发明所需组合物和给药说明。给予本发明组合物的方法可包括例如无菌注射器、喷雾器（如吸入或任何其他鼻部或肺部给药方法）、凝胶、霜剂、经皮贴片、经粘膜贴片（或任何其他口腔或舌下给药方法）或口服片剂。在一些实施方式中，本发明药盒含两种或更多给予本发明的多核苷酸、多肽、载体或组合物的方法如两种或更多注射器。
[0278] 在一些实施方式中，所述药盒还包含多于一种的容器，其含有本发明的多核苷酸、多肽或组合物。例如，在一些实施方式中，所述药盒可包括含本发明初免组分的容器，和含本发明加强免疫组分的分开容器。
[0279] 所述容器任选附有注意事项或印刷的说明书。例如，所述印刷说明书可为调控药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式，该告知书反映出生产、使用或销售管理机构批准本发明用于人体给药。“印刷说明书”可为例如书、小册、宣传册或传单之一。
[0280] 所述药盒还可包括储存药盒组分（如给药方法、含本发明重组MVA或组合物的容器、印刷说明等）的储存单元。所述储存单元可为例如适用于本发明的包、盒、封套或任何其他容器。例如，所述储存单元足够大以适应给予本发明方法所需的各组分。
[0281] 本发明还可包括递送本发明重组MVA或组合物给需要的动物如人的方法，所述方法包括(a)在计算机可读介质上登记允许给予本发明多核苷酸、多肽、载体或组合物的给药者(如医师、医师助手、执业护士、药剂师、兽医)的身份;(b)给人提供有关本发明多核苷酸、多肽、载体或组合物伴随性风险的咨询信息;(c)获得该人尽管存在伴随性风险而仍接受本发明多核苷酸、多肽、载体或组合物的知情同意书；和(e)允许其得到本发明的多核苷酸、多肽、载体或组合物。实施例
[0282] 实施例1重组载体构建
[0283] A型 流 感病 毒 基 因Pr8HA序 列 (SEQ ID NO:51-52)、NP共 有序 列 (SEQ IDNO:19-20)、Pr8M2(SEQ ID NO:13-14)、Pr8M2e_TML(SEQ ID NO:53-54)、METR_S(SEQ ID NO:17-18和56)和METR_C(SEQ ID NO:15-16和55)克隆到vEM11重组载体中(图1)。得到的重组载体vEM47(编码NP共有序列)、vEM58(编码METR_S肽)、vEM57(编码METR_C肽)、vEM61(编码Pr8M2)、vEM62(编码Pr8M2e-TML)和vEM65(编码Pr8HA)示于图2A-F。
[0284] 实施例2同源重组和重组病毒分离
[0285] 为了在改良的MVA病毒载体MVAtorTM(EBS公司（Emergent Biosolutions）)中插入流感病毒基因，用MVAtor感染CEF细胞并随后用图2A-F中所示的重组载体转染。各载体5
中进行2-3组平行设置。首先，6孔板的每孔中接种5X10CEF细胞并于37°C和5%CO2孵
6
育24小时。第二天，细胞密度假定为每孔10 细胞。MVAtor标准在每ml含4mM L谷氨酰
4
胺和2.5μg庆大霉素的Opti-Pro SFM中稀释，从而500μl含5X10TCID50，即工作浓度为
5
1X10TCID50/ml并产生0.05的moi。对于感染，从细胞中移除生长培养基，每孔加入500μl稀释的MVAtor标准并室温摇动孵育一小时。移除病毒接种体，并用Opti-Pro SFM洗涤细胞。转染反应建立时感染细胞留在2.0ml Opti-Pro SFM中。
中进行2-3组平行设置。首先，6孔板的每孔中接种5X10CEF细胞并于37°C和5%CO2孵
6
育24小时。第二天，细胞密度假定为每孔10 细胞。MVAtor标准在每ml含4mM L谷氨酰
4
胺和2.5μg庆大霉素的Opti-Pro SFM中稀释，从而500μl含5X10TCID50，即工作浓度为
5
1X10TCID50/ml并产生0.05的moi。对于感染，从细胞中移除生长培养基，每孔加入500μl稀释的MVAtor标准并室温摇动孵育一小时。移除病毒接种体，并用Opti-Pro SFM洗涤细胞。转染反应建立时感染细胞留在2.0ml Opti-Pro SFM中。
[0286] 所述转染反应在无菌5ml PS管中建立。约1.0-2.0μgDNA的重组载体和6μl转染试剂（FuGene HD）用于转染，根据供应商提供的FuGENE HD标准方案进行。所述细胞在培养箱中于37°C和5%CO2孵育48小时。
[0287] 孵育后，所述细胞在指示细胞内存在MVAtor和重组载体的荧光细胞上筛选。细胞在荧光灶上筛选且用最有效gfp表达的设置用于选择条件下重组MVAtor的2或3次传代。对于此传代，通过使用细胞铲（lifter）将感染的转染细胞刮入培养基中并移入1.5ml药瓶中。根据EPDD-SOP-EQU-033通过超声处理释放病毒。1/10–1/2的转染设置置于12孔板中接种的新鲜CEF细胞上，填充至1ml并每ml加入5μg杀稻瘟菌素。
[0288] 为了噬斑纯化重组MVAtors，将重组MVAtors在选择条件下（每ml Opti-ProSFM中5μg/ml杀稻瘟菌素）分别接种在6孔板和96孔板的系列稀释液中。用100μl移液管分离单一荧光斑块。分离的病毒移入1.5ml药瓶中并通过超声处理释放。用PCR在空载体上分析所述病毒（如下所述）且显示最弱空载体信号的分离物在接种于12孔板的新鲜CEF细胞上传代。重复噬斑纯化直到分离物没有空载体。一旦分离出纯克隆，所述病毒在没有杀稻瘟菌素下传代并分离没有选择/报告盒的非荧光病毒。
[0289] 为了删除选择盒，纯的重组病毒在没有杀稻瘟菌素下传代。分离没有荧光的斑块并在基因组中预期A型流感病毒基因的插入上测试。然后将重组MVAtor扩增到3xT175并在下述病毒原液中进行详细的初步测试（PCR、测序、表达、效价）：(1)MVAtor-NP 共 有 序 列 (mEM10),P21pp8,(2)MVAtor-METR_C(mEM18),P14pp8,(3)MVAtor-METR_S(mEM19),P18pp13,(4)MVAtor-Pr8M2(mEM22),P13pp3,(5)MVAtor-Pr8M2e_TML(mEM23),P14pp3,和(6)MVAtor-Pr8HA(mEM17)。所述病毒原液显示出具有100%正确序列读出且不含残留的空载体和功能。
[0290] 分离不含选择/报告盒的纯重组MVAtor后，将所述病毒在T225烧瓶中扩增。10个T225烧瓶的初级CEF细胞1:4分配到总量40T225烧瓶中，用于各个单独重组MVAtor的扩增。孵育2天后，一个烧瓶中的细胞进行胰蛋白酶消化并计数。39个T225烧瓶用0.1的moi感染并于37°C和5%CO2孵育72小时。收获烧瓶并收集所有烧瓶的内容物。通过超声处理用流动池设备进行收集病毒原液的均质化。含必须纯化的病毒原液的烧瓶置于冰上并连接流动池。所述超声流动池装置如下设置：振幅100%、循环1、泵速50ml/分钟即0.8并开启。声波处理后冷冻原液直到纯化。
[0291] 考虑效价，稀释纯化的原液并填充至每瓶最终填充体积600μl，其每ml含109TCID50（标称效价）。所述填充得到每种病毒的下述药瓶含量:(1)91xMVAtor-NP共有序列(mEM10);(2)35xMVAtor-METR_C(mEM18),(3)29xMVAtor-METR_S(mEM 19),(4)56xMVAtor-Pr8M2(mEM22),(5)38xMVAtor-Pr8M2e_TML(mEM23),和(6)30xMVAtor-Pr8HA(mEM17)。所有药瓶保存于-70°C直到进一步使用，即测试或运送。每种病毒的一个药瓶在-70°C样品存档中储存。
[0292] 实施例3用于排除空载体污染的PCR
[0293] 为了确认残留的非重组MVAtor完全从纯化病毒原液的填充药瓶中排除，对来自用于mEM10的纯化和填充MVAtor-NP、用于mEM18的MVAtor-METR_C、用于mEM19的MVAtor-METR_S、用于mEM22的MVAtor-Pr8M2、或用于mEM23的MVAtor-Pr8M2e_TML的DNA进行分离并用于PCR。使用重组载体vEM47作为重组病毒的阳性对照（vEM47）。使用从MVAtor分离的DNA作为空载体的阳性对照(MVA)。使用H2O和CEF细胞用作阴性对照。
[0294] 实施例4流感病毒基因和插入位点的侧接序列的测序
[0295] 分离各病毒的DNA并通过PCR扩增完整插入位点，使用引物5'--ggagctccactatttagttggtggtcgcc-3'(SEQ ID NO:32)(oVIV47)和5'-cgggtaccctagtttccggtgaatgtg-3'(SEQ ID NO:33)(oVIV89)。使用这些引物，扩增用于同源重组的已插入流感病毒基因以及侧接序列（图4）。
[0296] 纯化PCR片段并运至GATC公司测序。为了测序，选择的引物覆盖完整PCR片片段，如下所示：
[0297] 表5引物
[0298]
[0299]
[0300]
[0301]
[0302]
[0303]
[0304]
[0305]
[0306] 实施例5流感病毒多肽的表达分析
[0307] 进行Westerm印迹以分析MVAtor-NP以及两种-METR构建体的表达（用于METR_C多肽的SEQ ID NO:16和用于METR_S多肽的SEQ ID NO:18）。在6孔板中，在合适量的孔中5
每孔接种6x10 细胞。孔数量如下确定：重组MVAtor样品＋MVAtor对照＋CEF对照的数量。
用MVAtor和MVAtor-NP/-METR_S、-METR_C分别感染细胞，根据标准方案使用1的moi。感染24小时后，每孔加入300μl RIPA缓冲液（冰上预冷），且所述板在冰上孵育5分钟。将细胞刮入RIPA缓冲液并将细胞悬液各移到1.5ml药瓶中并置于冰上。各药瓶中加入0.5μl量的蛋白酶抑制剂混合物。将每样品60μl体积移入新的1.5ml药瓶中并加入22μl上样染料和8μl 2-巯基乙醇。使用5μl灭活流感病毒作为流感病毒阳性对照。加入8μl体积的RIPA缓冲液。所有样品在冰上孵育5分钟。之后所有样品在热混合仪中95°C加热
10分钟。
每孔接种6x10 细胞。孔数量如下确定：重组MVAtor样品＋MVAtor对照＋CEF对照的数量。
用MVAtor和MVAtor-NP/-METR_S、-METR_C分别感染细胞，根据标准方案使用1的moi。感染24小时后，每孔加入300μl RIPA缓冲液（冰上预冷），且所述板在冰上孵育5分钟。将细胞刮入RIPA缓冲液并将细胞悬液各移到1.5ml药瓶中并置于冰上。各药瓶中加入0.5μl量的蛋白酶抑制剂混合物。将每样品60μl体积移入新的1.5ml药瓶中并加入22μl上样染料和8μl 2-巯基乙醇。使用5μl灭活流感病毒作为流感病毒阳性对照。加入8μl体积的RIPA缓冲液。所有样品在冰上孵育5分钟。之后所有样品在热混合仪中95°C加热
10分钟。
[0308] 进行血球吸附试验（HAD）分析MVAtor-Pr8HA的表达。为此，用MVAtor和MVAtor-HA(mEM17)分别感染CEF细胞。另一组细胞进行模拟感染。感染后24小时，所述细胞用1%人血红细胞稀释液孵育（图6）。
[0309] 进 行 免 疫 试 验 分 析MVAtor-M2和 MVAtor-M2e-TML的 表 达（图 7）。 用MVAtor-Pr8M2(Fig.7A)和MVAtor-Pr8M2e-TML感染细胞(图7B)。平行地，用MVAtor感染细胞或无感染孵育。
[0310] 实施例6MVA疫苗的体内功效-体重和病毒负荷
[0311] 表达METR-C(SEQ ID NO:16)或METR-S(SEQ ID NO:18)的MVAtor就其体内功效进行测试。MVA疫苗的功效通过以下评估来观察：1)攻击组小鼠相比对照组的体重减少或死亡率，和2)肺中的病毒负荷。小鼠组(每组8只小鼠)用MVA疫苗肌肉内免疫两次：(1)MVA-Pr8M2(表达A型流感病毒Puerto Rico 1934 H1N1(Pr8)的全长M2的MVA构建体);(2)MVA-Pr8M2e-TML(表达M2（TML）的天然跨膜区域的MVA构建体);(3)MVA-METR-C(表达具有半胱氨酸的METR多肽的MVA构建体);(4)MVA-METR-S(表达半胱氨酸被丝氨酸取代的METR多肽的MVA构建体);(5)MVA-ConsNP(表达NP共有序列的MVA构建体);(6)MVAtor(单独MVA载体);和(7)作为阴性对照的PBS。
[0312] 免疫3周后，用50mcL A型流感病毒(A/PR/8/34,H1N1)以每只小鼠629TCID50肺内感染小鼠。每天监控小鼠的体重下降。数据为与攻击前体重相比的均值±SEM（百分比）。若BW下降达到25%则处死小鼠。结果，阴性对照小鼠体重减少并死亡。接受MVA-M2eTML构建体(14%)的小鼠体重减少可测，但METR构建体中仅有7%体重减少，与全长M2(Pr8M2)相似。
[0313] 从感染小鼠肺中定量回收流感病毒，并比较病毒负荷以测定先前疫苗接种的免疫益处。
[0314] 含个体小鼠肺的4组冷冻管从-80°C移出并在冰上解冻。各肺进行称重。将L-15-2x PSK培养基(Leibovitz+4mM L-谷氨酰胺+2X抗生素-抗真菌素)移入各管从而肺重量等于总体积的10%。各肺用Power Gen 125和一次性匀浆器均质化直到完成（30秒-1分钟）。肺匀浆物于4°C 30000rpm离心20分钟。等分肺匀浆物上清；用于TCID50的200mcL和两个400mcL等分样品在干冰中直接冷冻。所述等分样品储存于-80°C。
[0315] 涡旋肺匀浆物，将20mcL加入含MDCK细胞的4孔中，所述细胞18-24小时前以4x10e5细胞接种于180mcL无血清MEM中，所述无血清MEM含胰蛋白酶(TPCK)和4mM谷氨酰胺和2X抗生素-抗真菌素。通过从A列转移20mcL到B列的180mcL培养基中并继续到列H，沿着板向下进行10倍系列稀释。流感病毒A/PR/8/34原液ATCC VR-9用于在每三个试验板上的4孔中感染MDCK细胞作为阳性对照。阳性对照A/PR/8/34的来源是存于温度失效的-80°C冷冻器中的三个药瓶源。感染的MDCK细胞在37°C/5% CO2孵育4天。用PBS清洗板一次，并将MDCK细胞和0.1%火鸡红血细胞于4°C孵育30分钟。未结合的火鸡红血细胞用PBS剧烈清洗四次且感染的MDCK细胞通过贴壁红血细胞可见。Log 10TCID50效价从计数MDCK细胞的感染孔来计算。通过计算Log 10TCID50除以各小鼠肺组织重量克数的反对数，结果表示为TCID50/肺组织重量克数。测定各组的平均值、标准偏差和变异系数，表示为%。
[0316] 实施例7免疫小鼠中针对M2e的抗体响应
[0317] 为了测定免疫动物的抗体效价，用以下MVA疫苗肌肉内免疫小鼠1次、2次或三次：(1)MVA-Pr8M2,(2)MVA-Pr8M2e-TML;(3)MVA-METR-C,(4)MVA-METR-S,(5)MVA-Pr8M2_MVA-ConsNP;(6)MVA-Pr8M2e-TML+MVA-ConsNP;(7)MVA-Pr8M2e-TML+MVA-ConsNP;(8)MVA-ConsNP,(9)对照组,(10)具有插入的MVA病毒(不表达流感病毒抗原);(11)使用PR8传染性流感病毒的亚致死感染(无MVA疫苗);和(12)作为阳性对照的PBS。最终免疫后，所述小鼠用传染性流感病毒攻击(A/Pr/8/34)。为了进行M2ELISA，由M2e区域组成的生物素化肽通过抗生物素蛋白形式固定在ELISA板上。M2胞外域串联重复（METR）内呈现的6种肽中，代表性抗M2e效价通过使用肽4的ELISA板包被来获得，表示A型流感病毒Puerto Rico 1934H1N1。肽#4(SEQ ID NO:4)识别的血清效价概括于表6。
[0318] 表6抗-M2e肽#4抗体响应(μg/mL,几何平均值±几何SD)
[0319]
[0320]
[0321] 如图10所述，表达多重M2e区域的MVA-METR疫苗生成比MVA-M2疫苗效价更高的IgG抗-M2肽血清水平。
[0322] 在另一研究中，BALB/c小鼠用MVA疫苗由鼻内到肺(IN)或粘膜内(IM)免疫两次：(1)A型流感病毒Puerto Rico 1934H1N1的亚致死剂量(阳性对照),(2)MVA-HA(表达全长HA的MVA构建体);(3)MVA-METR-S(表达有丝氨酸取代的METR的MVA构建体);(4)MVA-M2(表达全长M2的MVA构建体);(5)MVA-METR-C(表达具有天然半胱氨酸的METR的MVA构建体);(6)MVA-Pr8M2e-TML(含M2(TML)的天然跨膜区域的MVA构建体);(7)PBS(阴性对照);(8)MVA-ConsNP(表达NP共有序列的MVA构建体);和(9)单独MVAtor(阴性对照)。免疫血清在第二疫苗免疫后21天获得并用ELISA测试，其用四种肽之一包被，各代表A型流感病毒蛋白的不同株系：M2e#1 H5 1999-2008(图从后开始的第二柱);M2e#4 H1和H3人(图后部的柱);M2e#5 H9和H6(图从前开始的第二柱);M2e#6 H7和H3、H8、H10、H2、H6、H9(图前部的柱)。
[0323] 表7：抗-M2e肽#4抗体响应(μg/mL,几何平均值±几何SD)
[0324]
[0325] 鼻内（IN）或肌肉内（IM）免疫小鼠的体重变化示于图11A和图11B。
[0326] 测量鼻内（IN）或肌肉内（IM）免疫小鼠的病毒负荷。A型流感病毒攻击后3天测量用MVA疫苗免疫两次的小鼠肺组织中的病毒负荷。数据示于图12。
[0327] 实施例8NP和M2免疫小鼠中针对低剂量H1N1 PR8攻击的免疫响应
[0328] 在小鼠中测试针对同源低剂量流感病毒感染（H1N1 Pr8）的NP+M2疫苗接种的功效。本研究的小鼠在第0天和第21天用含保守流感病毒抗原的基于MVAtor的疫苗进行肌肉内免疫，如表8所概括。
[0329] 表8：治疗组
[0330]
[0331] 第42天用鼻内给予的H1N1 PR8（<2LD50）攻击小鼠。分析体重、存活和病毒负荷（第2天和第4天）。
[0332] 如图13所示，HA、NP、M2+NP和非致死免疫组受到保护免于体重减少。在M2免疫组中，10只小鼠中有6只在第8天减少<20%的体重。在MVAtor免疫组中，10只小鼠中有10只在第8天减少<20%的体重。所有处理和对照组均有100%存活率。
[0333] 在另一研究中，通过ELISA用重组NP（茵姆基因公司（ImGenex））包被板测试抗NP免疫响应。ELISA结果示于图14：1d21 MVA、2d21 MVA、1d21MVA+NP、2d21 MVA+NP、1d21 MVA-M2eA+MVA-NP、2d21 MVA-M2eA+MVA-NP、1d21非致死性H1N1 PR8和2d21非致死性H1N1 PR8。"1d21″指单一疫苗接种后测量的免疫响应，"2d21″指2剂量疫苗构建体后测量的免疫响应。这些结果显示在两次免疫后观察到抗NP免疫响应。
[0334] 用MVA,MVA-HA,MVA-NP,MVA-M2eA,MVA-M2e+NP或A/PR/8/34肌肉内（IM）免疫小鼠的肺组织中的病毒负荷在H1N1 PR8病毒攻击后第2天和第4天测量。病毒负荷结果示于图15。用MVA-HA免疫的动物在第2天和第4天都有2-3个数量级的肺负荷下降。结果显示用NP+M2免疫的动物在第2天显示出2个数量级的肺病毒负荷下降。然而，接受NP或M2抗原组的任一组在第4天没有显示显著肺病毒复制下降。
[0335] 实施例9NP和M2免疫小鼠中针对致死剂量H1N1 PR8攻击的免疫响应
[0336] 在小鼠中测试针对同源致死剂量流感病毒感染（H1N1 Pr8）的NP+M2疫苗接种的功效。本研究的小鼠在第0天和第21天用含保守流感病毒抗原的基于MVAtor的疫苗进行鼻内（IN）或肌肉内（IM）免疫，如表9所概括。
[0337] 表9：治疗组
[0338]
[0339] 第42天用鼻内给予的H1N1 PR8（3LD50）攻击小鼠。分析血凝素抑制（HAI）（攻击前）、体重、存活和病毒负荷（第3天）。
[0340] A型流感病毒H1N1 Puerto Rico 8/1934简称“PR8”，是小鼠-适应性流感病毒，用于本研究的HAI试验中。HAI前，用火鸡红血细胞就血凝素能力分析PR8，然后稀释为每ml8单位血凝素（稀释因子1024）的合适浓度以进行HAI。对于HAI，25mcL小鼠血清与75mcL受体破坏酶（RDE）一起37°C孵育30分钟，然后在生理盐水中稀释为250mcL（1/10血清稀释）并在使用前4°C保存。
[0341] 用HAI方法在3或4个血清库中测试血清。在25mcL PBS中顺序2倍稀释血清（25mcL），向其中加入25mcL稀释的流感病毒并室温孵育30分钟。加入火鸡红血细胞（50mcL，清洗并稀释）并室温孵育60分钟，然后评估血凝素抑制。HAI结果示于表10。
[0342] 表10：HAI结果
[0343]组 用指示抗原的MVAtor载体免疫的动物 攻击前(GMT)HAI
1 亚致死剂量-H1N1 119±528
2 MVA-HA 1092±740
11 PBS <20
13 单独MVAtor <20
1 亚致死剂量-H1N1 119±528
2 MVA-HA 1092±740
11 PBS <20
13 单独MVAtor <20
[0344] N=8只小鼠/组;<20=低于检测极限
[0345] 如图16A和16B所示，NP+M2免疫组体重免受损失。所有免疫组100%免于死亡，而MVAtor和PBS对照组存活率为0%(0/10)。
[0346] 在另一研究中，通过ELISA用重组NP(茵姆基因公司)和M2肽#4(SEQ IDNO:4)包被板分别测试抗NP和抗M2免疫响应。就ConsNP、Pr8M2+ConsNP、Pr8M2e-TML+ConsNP、METR-C+ConsNP和METR-S+ConsNP的抗-NP ELISA结果示于图17。就M2、M2-TML、METR-C、METR-S、M2+NP、M2-TML+NP、METR-C+NP和METR-S+NP的抗-M2ELISA结果示于图18。这些结果显示在疫苗接种动物中生成抗NP和抗M2免疫响应。
[0347] 用H1N1PR8病毒攻击3天后测量鼻内（IN）或肌肉内（IM）免疫PBS(IN)、MVAtor、NP、M2、M2e-TML、METR-C、METR-S,HA和亚致死PR8(IN)的小鼠肺组织中的病毒负荷。病毒负荷结果示于图19。这些结果显示鼻内免疫NP、M2、M2e-TML、METR-C和METR-S的动物受到部分保护免于病毒在肺中复制。接受肌肉内NP或M2抗原的组的肺中病毒复制没有显著下降。
[0348] 实施例10NP、M2和M1免疫小鼠中针对致死剂量的猪H1N1攻击的免疫响应[0349] 在小鼠中测试针对同源致死剂量流感病毒感染（sH1N1 A/Mx/4108/09）的NP+M2+M1疫苗接种的功效。本研究的小鼠在第0天和第21天用含保守流感病毒抗原的基于MVAtor的疫苗进行肌肉内免疫，如表11所概括。
[0350] 表11：治疗组
[0351]
[0352]
[0353] 第42天用鼻内给予的sH1N1 A/Mx/4108/09（~20LD50）攻击小鼠。分析血凝素抑制（HAI）（攻击前）、体重、存活和病毒负荷（第2和第4天）。
[0354] HAI试验如上述实施例9所述进行。HAI结果示于表12。
[0355] 表12：HAI结果
[0356]
[0357] 给予 小 鼠Flulaval剂 量：150μL,IM(3 种病 毒 各4.5μg HA)；人 剂 量：500μL,IM(3种病毒各15μgHA)。组1(Flulaval)和组8(PBS)的所有放血前样品低于检测极限（<20）。组8(PBS)就两种H1N1大流行病毒的所有39天样品（攻击前）低于检测极限（<20）。
[0358] 如图20A所示，NP+M2疫苗确实保护免于体重减少。然而，M1加入NP+M2时没有观察到显著的额外益处。图20B显示接种疫苗小鼠的存活结果。本研究的存活结果示于下表13。
[0359] 表13：存活结果
[0360]免疫组 %存活
Flulaval 100%(8/8)
M1+NP+METRC 100%(8/8)
M1+NP+M2 100%(8/8)
M2+NP 100%(8/8)
M1 38%(3/8)
M1+NP 88%(7/8)
MVAtor 13%(1/8)
PBS 25%(2/8)
Flulaval 100%(8/8)
M1+NP+METRC 100%(8/8)
M1+NP+M2 100%(8/8)
M2+NP 100%(8/8)
M1 38%(3/8)
M1+NP 88%(7/8)
MVAtor 13%(1/8)
PBS 25%(2/8)
[0361] 这些结果显示接受M1+NP+M2和M1+NP+METR-C的组中致死率显著(p=0.0035)低于PBS组。
[0362] 在另一研究中，通过ELISA用重组NP(EPDU公司)和M2肽#4(SEQ ID NO:4)包被板分别测试抗NP和抗M2免疫响应。就PBS、MVAtor、M1+NP+METRC、M1+NP+M2、M2+NP、M1、M1+NP和Flulaval的抗-NP和抗-M2ELISA结果示于图21。这些结果显示疫苗接种诱导强抗-NP和抗-M2免疫响应。
[0363] 用重组M1和MVA CT84包被板通过ELISA分别测试抗M1和抗MVA免疫响应。就PBS、MVAtor、M1+NP+METRC、M1+M2+NP、M2+NP、M1、M1+NP和Flulaval的抗-M1和抗-MVA ELISA结果示于图22A-B。这些结果显示疫苗接种没有诱导抗-M1的免疫响应。
[0364] 用sH1N1 A/Mx/4108/09病毒攻击后第2天和第4天测试用PBS、MVAtor、M1+NP+METRC、M1+NP+M2、M2+NP、M1、M1+NP、和Flulaval肌肉内（IM）免疫的小鼠肺组织的病毒负荷。肺中病毒复制的结果如图23所示。该结果显示测试的疫苗没有诱导肺中病毒复制。
[0365] 用sH1N1 A/Mx/4108/09病毒攻击后第2天和第4天测试用PBS、MVAtor、M1+NP+METRC、M1+NP+M2、M2+NP、M1、M1+NP、和Flulaval肌肉内（IM）免疫的小鼠鼻甲中的病毒负荷。肺中病毒复制的结果如图24所示。该结果显示所有疫苗接种组中鼻甲的病毒负荷都部分降低。在疫苗中添加M1没有增强鼻甲中病毒负荷的下降。
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