RNA沉默是基于RNA的序列特异性导向和降解的一种重要类型 的基因调控。RNA沉默最早是在转基因植物中发现的，在这里，它 被称为共抑制或转录后基因沉默(PTGS)。直到最近才在纤毛虫，真菌 和从C.elegans到小鼠和人类细胞的多种动物中发现了与PTGS相关 的序列特异性RNA降解过程，RNA干扰(RNAi)。尽管这些过程 在细节上可能不同，RNAi和PTGS是由相同的高度保守的机制产生 的，这表明它们具有古老的起源。基本过程包括将一个双链 RNA(dsRNA)裂解成小的双链干扰RNAs(siRNA)，由它们指导同源 mRNA的识别和定向裂解。所述小的dsRNAs类似于RNA酶III-样 消化的降解产物。具体地讲，siRNAs是靶特异性短的双链RNAs，其 中，所述siRNAs的每一条链具有5’单磷酸，3′羟基末端，和具有2-3 个核苷酸的3′突出部分(Caplen，N.等，2001，PNAS(98)9742-9747)。
RNAi业已引起了人们的极大关注，因为它是一种剔除特定基因 活性的方法，该方法特别适用于以前被认为不适合遗传学分析的物 种。最近的研究证实了合成的siRNAs能够在C.elegans和来自人和 小鼠的细胞系中诱导表达的基因特异性抑制(Caplen N.等，2001，PNAS (98)9742-9747；Elbashir S.等，2001，Nature(411)494-498)。在所述 文献中还证实了，与使用较长的dsRNAs相比，在哺乳动物细胞中， siRNAs提供了一种序列特异性答案，所述较长的dsRNAs能使翻译 因子eIF2α失活，导致蛋白合成的普遍抑制。另外，与使用反义技术 的基因表达的抑制相比，siRNAs似乎非常稳定，并因此可能不需要 大量的化学修饰，这种修饰是单链RNA反义寡核苷酸延长体内半衰 期所需要的。
因此，预计采用siRNAs的RNA沉默，将成为基因表达的工程 控制和功能性基因组，以及从分子农业到可能的动物基因治疗的多种 生物技术应用的重要工具。由于不同的siRNAs能够以不同的效果作 用于它们的靶，对于特定靶测试一种以上siRNAs可能是需要的。另 外，基因组规模的反向遗传学程序需要大量的siRNAs。
不过，与DNA寡聚体合成相比，通过传统化学合成方法生产双 链靶特异性RNA寡聚体，是相对缓慢并且成本高昂的。另外，RNA 寡聚体的化学合成需要专用的合成仪和复杂的纯化方法。本发明提供 了一种生产短的双链靶特异性RNAs的替代方法，该方法基于使用噬 菌体或其他病毒聚合酶和靶序列特异性寡核苷酸模板的体外转录。与 RNA寡聚体的化学合成相比，本发明比较快速，并且易于操作。
不过，体外转录的siRNAs与化学合成的RNA寡聚体存在两方 面的差别。首先，与天然存在的siRNAs相同，化学合成的RNA寡聚 体具有5’单磷酸基团。体外转录的siRNAs保留了5’三磷酸基团。尚 不了解是否是因为该三磷酸基团的存在，才使得体外转录的siRNAs 不能诱导RNA干扰。
其次，化学合成的RNA寡聚体是用包括离子交换和反相HPLC 在内的方法高度纯化的，其中，所述合成化合物的纯度和质量是通过 包括NMR和质谱分析在内的方法评估的。在本发明中，采用了一种 简单的、粗略纯化方法，该方法包括大小排阻层析，苯酚：氯仿提取 和乙醇沉淀。同样尚不了解的是，省略充分的纯化方法，是否会影响 “体外”转录的RNAs在RNA介导的沉默中的用途。
令人吃惊的是，本发明证实了所述5’三磷酸基团和粗略的纯化不 会影响“体外”转录的RNAs的RNA沉默活性，并且提供了siRNA 合成的另一种途径，这使得它有可能成为普通分子生物学实验室的一 种研究工具。
合成具有特定长度和序列的小的单链RNAs的现有体外方法 (Milligan F.等，1987，Nucleic Acid Res.(15)8783-8798)，不能直接 应用于合成小的干扰RNAs。问题在于这样一种事实：RNA聚合酶倾 向于将启动子序列的某些核苷酸转录到转录物中。其结果是，可以通 过使利用上述方法制备的互补的单链RNA分子退火生产的靶特异性 dsRNAs，必须在5’末端包括由启动子序列转录的核苷酸，并且在3’ 末端包括与由所述启动子序列转录的核苷酸互补的核苷酸。很可能在 靶序列的mRNA中不存在确定序列长度的片段，其中，5’末端由启动 子序列转录的核苷酸组成，而3’末端由与所述启动子序列转录的核苷 酸互补的核苷酸组成。本发明通过提供截短的RNA聚合酶启动子序 列解决了这一问题，其中，启动子序列的模板链的5’末端的一个或多 个核苷酸，被作为靶特异性序列一部分的核苷酸所取代。这种取代不 会影响体外转录产率，但是能提高在靶蛋白的mRNA中存在至少一 个具有特定序列长度的靶特异性序列的可能性，其中，5’末端由启动 子序列转录的核苷酸组成，而3’末端由与所述启动子序列转录的核苷 酸互补的核苷酸组成。
下面将说明本发明的这一方面和其他方面。
发明概述
本发明提供了一种用于合成短的双链靶特异性RNAs的体外方 法，包括以下步骤：a)在一种反应混合物中混合有义靶特异性核苷 酸模板和链延伸酶，以便形成模板延伸的有义寡核糖核苷酸产物；b) 在一种反应混合物中混合反义靶特异性寡核苷酸模板和链延伸酶，以 便形成模板延伸的反义寡核糖核苷酸产物；和c)让在步骤a)中获 得的有义寡核糖核苷酸产物与在步骤b)中获得的互补性反义寡核糖 核苷酸产物杂交。
在本发明的另一种实施方案中，所述链延伸酶是RNA聚合酶， 而步骤a)和b)的寡核苷酸模板包括RNA聚合酶启动子序列，它优 选由dsRNAs组成。在一种更优选的实施方案中，所述RNA聚合酶 是T7聚合酶，而步骤a)和b)的寡核苷酸模板包括在模板链的5’末端 用靶特异性模板序列延伸的T7RNA聚合酶启动子序列，任选延伸了 2或3个额外的核苷酸。
本发明特别适用于合成小的干扰RNAs。因此，本发明的另一个 目的是提供一种用于合成靶特异性短的双链RNAs的方法，其中，所 述靶特异性短的双链RNAs的长度少于50个核苷酸，优选少于30个 核苷酸，更优选30-12个核苷酸，其特征还在于，在5’末端包括由启 动子序列转录的核苷酸，而在3’末端包括与由所述启动子序列转录的 核苷酸互补的核苷酸。
因此，本发明提供了一种用于合成小的干扰RNAs的方法，包括 以下步骤：a)在一种反应混合物中混合有义siRNA模板和链延伸酶， 以便形成模板延伸的有义寡核糖核苷酸产物；b)在一种反应混合物 中混合反义siRNA模板和链延伸酶，以便形成模板延伸的反义寡核糖 核苷酸产物；和c)让在步骤a)中获得的有义寡核糖核苷酸产物与 在步骤b)中获得的反义寡核糖核苷酸产物杂交；其中，步骤a)和b) 的siRNA模板包括在所述模板链的5’末端用靶特异性模板序列延伸 的双链RNA聚合酶启动子序列，并且具有2或3个额外的核苷酸。 在一种优选实施方案中，所述链延伸酶是T7RNA聚合酶，而所述 siRNA模板包括双链T7RNA聚合酶启动子序列，优选图1所示出的 截短的T7RNA聚合酶启动子序列。
本发明的另一个目的是提供用于实施本发明方法的试剂盒以及用 于所披露的任何方法中的化合物。
附图简述
图1：寡核苷酸生产方法。提供了一种用于设计JNK2αlmRNA 的编码序列上的具有19个寡核苷酸的靶序列的siRNA寡核苷酸模板 的例子。
图2A：用于荧光素酶报导基因分析中的GL3靶特异性双链 siRNAs。利用本发明的体外方法制备GL3 siRNA1，GL3 siRNA2和 GL3 siRNA3。GL3 siRNA寡聚体是通过化学方法合成的(Vargeese， C.等，1988，Nucleic Acid Res.(26)，1046-1050)。
图2B：GL3靶特异性siRNAs和GL3反义单链siRNAs对HeLa 细胞中荧光素酶表达的影响。将用GL3-对照荧光素酶+报导基因构建 体转染的细胞视为100％。
图2C：GL3-siRNA 1对pGL3-对照转染的HeLa细胞中荧光素 酶表达的剂量反应曲线。
图3A：用于EGFP-转染的HeLa细胞的FACS分析的EGFP靶 特异性双链siRNAs。EGFP ds siRNA 2是用本发明的体外方法制备 的。EGFP ds siRNA寡聚体是通过化学方法合成的(Vargeese，C.等， 1988，Nucleic Acid Res.(26)，1046-1050)。
图3B：通过FACScan分析(Beckton-Dickinson)分析EGFP靶特 异性siRNAs和EGFP-反义单链siRNAs对EGFP-转染的HeLa细胞 中GFP荧光的影响。将仅用EGFP DNA转染的细胞视为100％。
图4A：用于JNK2αl转染的HeLa细胞中的JNK2αl靶特异性 双链siRNAs。
图4B：用于CDS-1转染的HeLa细胞中的CDS-1靶特异性双链 siRNAs。
详细说明
本发明涉及合成短的双链靶特异性RNAs的领域，并且基于采用 链延伸酶的寡核苷酸模板的体外转录。
本文所使用的靶特异性短的双链RNAs，表示与编码一种特定蛋 白，即靶蛋白的部分序列匹配的双链RNA。所述序列的长度优选少 于50个核苷酸，更优选少于30个核苷酸，更优选15-25个核苷酸。 在一种特定实施方案中，所述靶特异性短的双链RNAs可以作为小的 干扰RNAs(siRNAs)用于无脊椎动物和脊椎动物系统的RNA干扰。 本发明所使用的siRNAs是具有12-30个核苷酸的短的dsRNAs分子， 具有2-或3-个核苷酸的突出的3’末端。在一种优选实施方案中，siRNAs 的长度为15-25个核苷酸，具有2个核苷酸的突出的3’末端。更优选 的是siRNAs的长度为17-22个核苷酸，具有2个核苷酸的突出的3’ 末端。
为了获得dsRNA，同时需要有义和反义寡核苷酸模板。本文所 使用的术语“寡核苷酸模板”用于表示这样的结构：它在某些直接物 理过程中，可以导致第二种结构的模式化，第二种结构通常在某种程 度上与其互补。在现代生物学中，几乎仅用于表示指导通过Watson- Crick碱基配对规则合成与它互补的序列的核苷酸序列(The Dictionary of Cell and Molecular Biology，3d.Edition，Academic Press，London，1999(ISBN 0-12-432565-3))。所述模板序列的长度 优选少于50个核苷酸，并且可以是双链的、单链的或部分单链的DNA 寡聚体模板。
所述寡核苷酸模板可以是合成的DNA模板，或以线性化质粒 DNA形式产生的模板，它来自克隆在一种载体的限制位点上的靶特 异性序列，所述载体如原核克隆载体(pUC13，pUC19)或PCR克隆系 统，如Invitrogen的TOPO克隆系统。所述合成DNA模板可以按照 本领域众所周知的技术生产。在本发明的一种优选实施方案中，所述 寡核苷酸模板由部分单链的DNA寡聚体模板组成，它包括由dsDNA 组成的RNA聚合酶启动子序列。在本实施方案中，所述靶特异性短 的双链RNAs的特征还在于，在它的5’末端包括由RNA聚合酶启动 子序列转录的核苷酸，而在它的3’末端包括与由所述启动子序列转录 的核苷酸互补的核苷酸。
本文所定义的“链延伸酶”表示能够由核糖核苷5’三磷酸形成 RNA聚合物的酶；所产生的RNA互补于DNA模板。所述酶在RNA 链的3’-羟基末端添加单核苷酸单位，并因此沿5’→3’方向构建RNA， 与用作模板的DNA链反向平行。例如，所述链延伸酶可以是DNA依 赖性聚合酶，如DNA聚合酶I，II和III；RNA-定向的DNA聚合酶， 如RSV和AMV-聚合酶；DNA-定向的RNA聚合酶，如大肠杆菌RNA 聚合酶；RNA-定向的RNA聚合酶，如噬菌体RNA聚合酶，又被称 为RNA复制酶；或细菌多核苷酸磷酸化酶。
在一种优选实施方案中，所述链延伸酶是RNA聚合酶。所述RNA 聚合酶需要在DNA模板上存在特殊的起始位点。该起始位点在本文 中被称作“RNA聚合酶启动子序列”，它是RNA聚合酶与DNA模板 结合的位点。它还是由RNA聚合酶识别的作为起始信号的位点，以 便指示从哪里开始转录形成RNA。
因此，本发明提供了由dsDNA组成的包括RNA聚合酶启动子 序列的寡核苷酸模板，其中，所述聚合酶启动子序列是由RNA聚合 酶识别的。本文所使用的术语“识别的”包括在启动子序列的一侧或 两侧缩短了一个或多个核苷酸的所有截短的RNA聚合酶启动子序 列，这种截短对RNA聚合酶与起始位点的结合没有或少有影响，并 且对转录反应没有或少有影响。例如，Milligan等(Milligan F.等， 1987，Nature(15)8783-8798)证实了T7 RNA聚合酶的启动子似乎不 需要非模板链上的-17至-14和-3至+6号位置的区域的DNA，因为除 去这些核苷酸对转录反应少有影响。另外，截短超过模板链的+2号位 置，即+3至+6号位置的部分，对该反应的产率少有影响(Milligan F. 等，1987，Nature(15)8783-8798)。由此获得的截短的RNA聚合酶启 动子序列被认为属于“由所述RNA聚合酶识别的RNA聚合酶启动子 序列”。因此，在本发明的一种具体实施方案中，所述RNA聚合酶启 动子序列由截短的RNA聚合酶启动子序列组成，其中，缺失了启动 子序列的模板链的一侧或两侧的一个或多个核苷酸。所述截短的RNA 聚合酶启动子优选由图1所示的在模板链的5’末端的+3至+6号位置 截短的T7RNA聚合酶启动子序列组成。
因此，本发明的第一个目的是提供一种用于合成短的双链靶特异 性RNAs的方法。该方法包括以下步骤：a)在一种反应混合物中混合 靶特异性有义寡核苷酸模板和链延伸酶，以便形成模板延伸的有义寡 核糖核苷酸产物；b)在一种反应混合物中混合靶特异性反义寡核苷 酸模板和链延伸酶，以便形成模板延伸的反义寡核糖核苷酸产物；和 c)让在步骤a)中获得的有义寡核糖核苷酸产物与在步骤b)中获得 的反义寡核糖核苷酸产物杂交。
本发明方法的链延伸酶优选是选自T7RNA聚合酶，T3RNA聚 合酶和SP6RNA聚合酶的RNA聚合酶。在一种更优选的实施方案中， 所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
因此，用于本发明方法的寡核苷酸包括由dsDNA组成的RNA 聚合酶启动子序列，其中，所述RNA聚合酶启动子序列是由选自 T7RNA聚合酶，T3RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶的RNA聚合酶识 别的。在一种优选实施方案中，所述RNA聚合酶启动子序列是由 T7RNA聚合酶识别的。在一种更优选的实施方案中，所述T7RNA聚 合酶启动子序列由图1所示的截短的T7RNA聚合酶启动子序列组成。
在另一种实施方案中，用于本发明方法的寡核苷酸模板的特征在 于，它是部分双链的DNA寡聚体模板，包括双链RNA聚合酶启动子 序列，用靶特异性模板序列延伸所述模板链的5’末端，任选用2或3 个额外的核苷酸延伸。在一种更优选的实施方案中，所述靶特异性模 板序列在5’末端包括由启动子序列转录的核苷酸，而在3’末端包括与 来自所述启动子序列的核苷酸互补的核苷酸。在所述具体实施方案 中，所述寡核苷酸模板包括如图1所示的截短的T7RNA聚合酶启动 子序列，所述靶特异性模板序列的包括位于5’末端的两个鸟苷(g) 核苷酸和位于3’末端的两个胞嘧啶(c)核苷酸。
因此，本发明的第二种实施方案提供了一种用于合成小的干扰 RNAs(siRNAs)的方法，包括以下步骤：a)在一种反应混合物中混 合有义siRNA模板和链延伸酶，以便形成模板延伸的有义寡核糖核苷 酸产物；b)在一种反应混合物中混合反义siRNA模板和链延伸酶， 以便形成模板延伸的反义寡核糖核苷酸产物；和c)让在步骤a)中 获得的有义寡核糖核苷酸产物与在步骤b)中获得的反义寡核糖核苷 酸产物杂交；以便步骤a)和b)的siRNA模板包括在模板链的5’末端 用靶特异性模板序列和2或3个额外核苷酸延伸的双链RNA聚合酶 启动子序列。在一种优选实施方案中，用于siRNAs合成的链延伸酶 由RNA聚合酶组成，优选选自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶。因此，用于本发明方法中的siRNA模板包括一种RNA 聚合酶启动子序列，它是由选自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或 SP6 RNA聚合酶的RNA聚合酶识别的。在一种更优选的实施方案中， 所述链延伸酶是T7RNA聚合酶。因此，在一种优选实施方案中，所 述siRNA模板的RNA聚合酶启动子序列是由T7RNA聚合酶识别的。 在另一种实施方案中，所述siRNA模板包括如图1所示的双链截短的 T7RNA聚合酶启动子序列，其中，所述截短的T7RNA聚合酶启动 子序列是按照本发明方法，在模板链的5’末端延伸的，并且，其中， 所述靶特异性模板序列在它的5’末端包括由所述启动子序列转录的核 苷酸，而在3’末端包括与由所述启动子序列转录的核苷酸互补的核苷 酸。在一种具体实施方案中，用于本发明方法中的siRNA模板包括如 图1所示的双链截短的T7RNA聚合酶启动子序列，其中，所述截短 的T7RNA聚合酶启动子序列是用本发明方法在所述模板的5’末端延 伸的，并且，所述靶特异性模板序列包括位于5’末端的两个鸟苷(g) 核苷酸和位于3’末端的两个胞嘧啶(c)核苷酸。
在上述用于获得模板延伸的寡核苷酸产物的任一种方法中使用的 反应条件为本领域所公知。实际上，用于酶促转录生产RNA的原始 材料是DNA模板，RNA聚合酶，和四种需要的核糖核苷酸碱基腺嘌 呤，胞嘧啶，鸟嘌呤和尿嘧啶的核苷三磷酸(NTPs)，它们存在于最有 利于RNA聚合酶活性的反应缓冲液中。例如，使用T7 RNA聚合酶 进行体外转录的反应混合物，通常包括T7 RNA聚合酶(0.05mg/ml)， 寡核苷酸模板(1μM)，每一种NTP(4mM)，和用于提供Mg2+的 MgCl2(25mM)，用于所述聚合酶的辅因子。在37℃和pH8.1(例如， 在10mM Tris-HCl缓冲液)的条件下，温育该混合物若干小时(Milligan J.& Uhlenbeck O.，1989，Methods Enzymol(180)51-62)。包括上述 成分的试剂盒可以通过商业渠道获得，如MEGA shortscriptTM-T7试 剂盒(Ambion)。
由上述任一种方法获得寡核苷酸产物的纯化方法为本领域所普遍 公知，并且包括凝胶电泳，大小排阻层析，毛细管电泳和HPLC。凝 胶电泳通常被用于纯化来自反应混合物的完整长度的转录产物，但 是，该技术不适用于以较大规模生产。在本发明的一种优选实施方案 中，用于获得寡核苷酸产物的纯化方法包括大小排阻层析，如Sephadex G-25树脂，任选与苯酚：氯仿：异戊醇提取，和乙醇沉淀组合。
本发明的第三个目的是提供用于实施本发明方法的试剂盒。在一 种实施方案中，所述试剂盒包括一种或多种下列成分：a)设计靶特异 性有义和反义寡核苷酸模板的说明书；b)链延伸酶；c)转录缓冲液； d)四种需要的核糖核苷酸碱基的核苷三磷酸(NTPs)；e)用于获得所述 有义和反义寡核糖核苷酸产物的纯化工具。在本发明的一种优选实施 方案中，在所述试剂盒中提供的链延伸酶由RNA聚合酶组成，优选 选自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶的RNA聚 合酶。更优选的是，在本发明的试剂盒中提供的链延伸酶是T7 RNA 聚合酶。
在本发明的试剂盒中所提供的分离工具，一般是指本领域已知的 用于从反应混合物中获得寡核糖核苷酸产物的纯化方法，其中包括凝 胶电泳，大小排阻层析，毛细管电泳和HPLC。在本发明的一种优选 实施方案中，在本发明的试剂盒中所提供的纯化工具由大小排阻层析 柱或树脂组成，如Sephadex G-25树脂。
设计靶特异性有义和反义寡核苷酸模板的说明书应当考虑在本发 明的图1中所示出的方法。所述方法基本上包括以下步骤：
1)寻找位于靶基因的编码序列内的靶特异性序列，该靶特异性序 列具有以下序列5′-xx(n12-30)yy-3′，其中，x表示由启动子转录的核苷 酸，y表示与由启动子序列转录的核苷酸互补的核苷酸，而n12-30表示 具有12-30个核苷酸的任何寡核苷酸；
2)设计一种有义寡核苷酸模板，它包括本发明的双链RNA聚合 酶启动子序列，在所述模板链的5′末端，用在步骤1)中定位的靶特异 性序列的互补寡核苷酸序列延伸，任选用两个额外核苷酸延伸；
3)设计一种反义寡核苷酸模板，它包括本发明的双链RNA聚合 酶启动子序列，在所述模板链的5′末端，用在步骤1)中定位的靶特异 性序列的反向寡核苷酸序列延伸，任选用两个额外核苷酸延伸。
在本发明的一种优选实施方案中，用T7 RNA聚合酶作为链延伸 酶。在所述实施方案中，设计靶特异性有义和反义寡核苷酸模板的方 法包括以下步骤：
1)寻找位于所述靶基因的编码序列中的靶特异性序列，它具有以 下序列5′-gg(n12-30)cc-3′；
2)设计一种具有以下序列的有义寡核苷酸模板
5′TAATACGACTCACTATAGG
3′ATTATGCTGAGTGATATcc(n互补体)12-30gg-任选用两个额 外的核苷酸延伸，其中，(n互补体)12-30表示在步骤1)中定位的靶特 异性序列的互补寡核苷酸序列；和
3)设计一种具有以下序列的反义寡核苷酸模板
5′TAATACGACTCACTATAGG
3′ATTATGCTGAGTGATATcc(n反向)12-30gg-任选用两个额外 的核苷酸延伸，其中，(n反向)12-30表示在步骤1)中定位的靶特异性 序列的反向寡核苷酸序列。
在一种具体实施方案中，本发明的方法被用于合成小的干扰 RNAs(siRNAs)。在所述实施方案中，所述设计靶特异性有义和反义 siRNA模板的方法包括以下步骤：
1)寻找位于所述靶基因的编码序列内，并且具有以下序列5′- xx(n15-30)yy-3′的靶特异性序列。其中，x表示由启动子转录的核苷酸， y表示与由所述启动子序列转录的核苷酸互补的核苷酸，而n15-30表示 具有15-30个核苷酸的任何寡核苷酸；
2)设计一种包括本发明的双链RNA聚合酶启动子序列的有义寡 核苷酸siRNA模板，在所述模板的5′末端，用在步骤1)中定位的靶 特异性序列的互补寡核苷酸序列延伸，用两个额外的核苷酸延伸，优 选用两个腺嘌呤残基延伸；
3)设计一种包括本发明的双链RNA聚合酶启动子序列的反义寡 核苷酸siRNA模板，所述模板的5′末端，用在步骤1)中定位的靶特 异性序列的反向寡核苷酸序列延伸，用两个额外的核苷酸延伸，优选 用两个腺嘌呤残基。
在所述具体实施方案中，所述合成siRNAs的方法用T7RNA聚 合酶作为链延伸酶，所述设计靶特异性有义和反义siRNA模板的方法 包括以下步骤：
1)寻找位于所述靶基因编码序列内，并且具有以下序列5′-gg(n15-30 )cc-3′的靶特异性序列；
2)设计一种具有以下序列的有义寡核苷酸siRNA模板
5′TAATACGACTCACTATAGG
3′ATTATGCTGAGTGATATcc(n互补体)15-30gg aa
其中，(n互补体)15-30表示在步骤1)中定位的靶特异性序列的互 补寡核苷酸序列；和
3)设计一种具有以下序列的反义寡核苷酸siRNA模板
5′TAATACGACTCACTATAGG
3′ATTATGCTGAGTGATATcc(n反向)15-30gg aa
其中，(n互补体)15-30表示在步骤1)中定位的靶特异性序列的反 向寡核苷酸序列。
因此，本发明提供了一种用于合成短的双链靶特异性RNAs的试 剂盒，该试剂盒包括至少一种下列成分：a)设计靶特异性有义和反义 寡核苷酸模板的说明书；b)链延伸酶；c)转录缓冲液；d)四种需要 的核糖核苷酸碱基的核苷三磷酸(NTPs)；e)获得所述有义和反义寡核 糖核苷酸产物的纯化工具。
因此，在另一种实施方案中，本发明提供了用于合成小的干扰 RNAs的试剂盒，该试剂盒包括至少一种下列成分：a)设计靶特异性 有义和反义siRNA模板的说明书；b)链延伸酶；c)转录缓冲液；d)四 种需要的核糖核苷酸碱基的核苷三磷酸(NTPs)；e)获得所述有义和反 义寡核糖核苷酸产物的纯化工具。
本发明的另一个目的是提供用于任何所披露的用来体外合成短的 双链RNAs的方法的工具。因此，本发明提供了：
i)设计靶特异性有义和反义寡核苷酸模板的方法
ii)用于体外合成短的双链RNAs的本发明的链延伸酶
iii)获得所述有义和反义寡核糖核苷酸产物的纯化工具
iv)用于所述反应混合物，以便利用本发明的链延伸酶，由所述靶 特异性有义和反义寡核苷酸模板产生有义和反义寡核糖核苷酸产物的 试剂。
本发明的另一个目的是将通过本发明方法获得的siRNAs用于抑 制靶基因在细胞中表达的方法中。该方法包括将可通过本发明方法获 得的siRNAs导入细胞。
所述靶基因可以是来自所述细胞的基因(即细胞基因)，内源基 因(即存在于基因组中的细胞基因)，转基因(即插入所述细胞基因 组的异位位点的基因构建体)，或来自病原体的基因，该病原体能够 感染获得所述细胞的生物。根据特定的靶基因和所输送的双链RNA 材料的剂量，该方法可以提供所述靶基因功能的部分或全部丧失。
具有所述靶基因的细胞可以来自任何生物或包含在任何生物内。 所述生物可以是植物，动物，原生动物，细菌，病毒或真菌。所述植 物可以是单子叶植物，双子叶植物或裸子植物；所述动物可以是脊椎 动物或无脊椎动物。所述具有靶基因的细胞可以来自生殖细胞系或体 细胞，全能细胞或多能细胞，分裂的或未分裂的细胞，软组织或上皮 细胞，永生化细胞或转化过的细胞等。所述细胞可以是干细胞或分化 过的细胞。分化过的细胞种类包括脂肪细胞，成纤维细胞，肌细胞， 心肌细胞，内皮细胞，神经元，神经胶质细胞，血细胞，巨核细胞， 淋巴细胞，巨嗜细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞， 肥大细胞，白细胞，粒细胞，角质形成细胞，软骨细胞，成骨细胞， 破骨细胞，肝细胞，和内分泌或外分泌腺体的细胞。
可通过本发明的方法获得的分离的RNA由靶特异性短的双链 RNAs组成，其中，所述靶特异性短的双链RNAs的长度少于50个核 苷酸，优选少于30个核苷酸，更优选30-12个核苷酸，其特征在于， 在它的5’末端包括由启动子序列转录的核苷酸，而在3’末端包括与由 所述启动子序列转录的核苷酸互补的核苷酸，由所述启动子序列转录 的核苷酸的数量以及与由所述启动子序列转录的核苷酸互补的核苷酸 的数量优选为2，3或4个核苷酸，更优选2个核苷酸。
可通过本发明的方法获得的短的双链RNAs，任选在3′末端用2 或3个额外的核苷酸延伸，并且，在本发明的其他实施方案中，被表 示为具有以下有义序列5′-xx(n12-30)yy-3′，其中，x表示由启动子序 列转录的核苷酸，y表示与由所述启动子序列转录的核苷酸互补的核 苷酸，而n12-30表示具有12-30个核苷酸的任何寡核苷酸。在一种具体 实施方案中，所述短的双链RNAs具有有义序列5′-gg(n15-30)cc-3′，其 中，g表示由截短的T7RNA聚合酶启动子序列(如图1所示)转录 的核苷酸鸟苷，而n15-30表示具有15-30个核苷酸的任何寡核苷酸。
所述RNA可以直接导入所述细胞(即细胞内的)；或导入细胞 外的腔室，间质腔，进入生物的循环系统，口服导入，或通过将一种 生物浸泡在含有所述RNA的溶液中导入。用于口服导入的方法，包 括直接将所述RNA与所述生物的食物混合，以及工程方法，例如， 通过工程改造使被用作食物的物种能表达所述RNA，然后给要影响 的生物食用。例如，可以将所述RNA喷洒在植物上，或者通过遗传 工程方法，使植物以足以杀伤某些或全部已知能感染该植物的病原体 的量表达所述RNA。
还可以使用导入核酸的物理方法，例如，直接注射到所述生物的 细胞中或注射到所述生物的细胞外。我们在本文中披露了，导入HeLa 细胞外面的双链RNA能够抑制基因表达。
血管内或血管外循环，血液或淋巴系统，韧皮部，根，和脑脊液 是可以导入RNA的部位。能够由重组构建体表达RNA的转基因生物， 可以通过将所述构建体导入来自合适的生物的合子，胚胎干细胞，或 其他多能细胞中生产。
导入核酸的物理方法包括注射含有RNA的溶液，用由所述RNA 覆盖的粒子轰击，在所述RNA的溶液浸泡细胞或生物，或在存在所 述RNA的情况下，对细胞膜进行电穿孔。包装在病毒颗粒中的病毒 构建体能够同时实现将表达构建体有效导入所述细胞，并且通过转录 由所述表达构建体编码的RNA。可以使用本领域已知的用于导入核 酸的其他方法，如脂介导的载体转运，化合物，如磷酸钙介导的转运 等。因此，所述RNA可以与具有一种或多种下列活性的成分一起导 入：增强细胞对RNA的摄取，促进双链的退火，稳定所述退火链， 或加强所述靶基因的抑制。
本发明可用于将RNA导入细胞，以便治疗或预防疾病。例如， 可以将dsRNA导入癌细胞或肿瘤，以便抑制维持癌发生/肿瘤发生表 型所需要的基因的基因表达。为了预防疾病或其他病理学，可以选择 启动或维持所述疾病/病理学所需要的靶基因。因此，在另一种实施方 案中，本发明提供了一种药物组合物，它包括可通过本发明方法获得 的短的双链RNAs，以便抑制靶基因的基因表达，并且包括一种合适 的载体。所述组合物能够以任何合适的方法给药，例如，注射，口服， 眼眶内，局部，鼻腔，直肠使用等。所述载体可以是任何合适的药用 载体，优选使用能够增强所述RNA分子进入靶细胞的效率的载体， 例如脂质体，天然病毒衣壳，或通过化学或酶促方法生产的人工衣壳 或由它衍生的结构。
本发明的其他用途可以是在一种生物中鉴定基因功能的方法，包 括利用双链RNA抑制具有以前未知的功能的靶基因的活性。取代传 统遗传学筛选的耗费时间和劳动力的突变体分离过程的是，通过采用 本发明设想确定功能性基因组的未鉴定过的基因的功能，以便降低靶 基因活性的量和/或改变其活性的作用时间。可以将本发明用于确定药 物的潜在靶，了解与发育相关的正常和病理学事件，确定负责出生后 发育/老化的信号传导途径等。日益加快的从基因组和表达的基因来 源，包括人类、小鼠、酵母、果蝇和C.elegans基因组获得核苷酸序 列信息的速度，可以与本发明结合在一起，以便确定生物(例如线虫) 的基因功能。不过，不同生物使用特定密码子的偏好性，在序列数据 库中查找相关的基因产物，将遗传性状连锁图与获得核苷酸序列的物 理图谱相关联，以及人工智能方法，可用于根据在所述测序项目中获 得的核苷酸序列，确定推测的开放读框。
一种简单的分析方法是按照由已表达序列标志(EST)获得的部 分序列抑制基因表达。生长、发育、代谢、抗病性或其他生物过程的 功能性改变，可能是EST′s基因产物的正常作用的指标。
因此，本发明的一个目的是提供一种抑制靶基因在细胞中表达的 方法，包括将RNA导入细胞，其中，所述RNA包括靶特异性短的双 链RNA，其中，所述靶特异性短的双链RNA的长度少于50个核苷 酸，优选少于30个核苷酸，更优选30-12个核苷酸，其特征在于，在 它的5’末端包括由启动子序列转录的核苷酸，而在它的3’末端包括与 由所述启动子转录的核苷酸互补的核苷酸，其中，所述启动子序列是 由一种RNA聚合酶识别的。在另一种实施方案中，所述启动子序列 是由选自T7RNA聚合酶，T3RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶的RNA 聚合酶识别的。
通过参考以下实验详述，能更好地理解本发明，不过，本领域技 术人员可以理解的是，这些详述只是用于说明本发明的，正如在下面 的权利要求书中更详细地说明的。另外，在本申请中，引用了多份文 献。这些文献的内容被作为参考收入本申请中，以便更全面地说明本 发明所属技术领域的现状。
实施例1：体外转录的EGFP和GL3特异性短的dsRNAs，在人 类细胞中诱导RNA转染
材料和方法
质粒构建体
荧光素酶+是由质粒pGL3-对照(Promega)表达的。EGFP是由 EGFP/pcDNA5-FRT表达的，它包括来自pEGFP(Clontech)的EGFP 基因，该基因定向连接在哺乳动物表达载体pcDNA5/FRT(Invitrogen) 的HindIII和NotI位点上。
SiRNAs的体外转录和杂交
在10mM Tris-HCl pH 9.0，100mM NaCl，1mM EDTA中，让 寡聚体模板链与有义T7启动子序列(5′TAATACGACTCACTATAGG) 杂交，包括煮沸2分钟，并且用2-3小时缓慢冷却到室温。
转录是使用MEGAshortscriptTM T7试剂盒(Ambion)，按照生产 商的说明进行的。在G-25自旋柱上纯化siRNA。苯酚∶氯仿∶异戊 醇(25∶24∶1)提取，使用Heavy Phase-Lock Gels(Eppendorf)，并且在 -80℃下用乙醇沉淀过夜。让互补的siRNA链在1mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA pH8.0中杂交，包括煮沸2分钟，并且用2-3小时 缓慢冷却到室温。通过在非变性20％聚丙烯酰胺TBE凝胶上电泳ds- 和ss-siRNAs，评估杂交。
细胞系和转染
在补充了1.8mM l-谷氨酰胺，9％FBS，和45U/l青霉素/链霉素 的具有高浓度葡萄糖和l-谷氨酰胺(Invitrogen)的DMEM中生长HeLa 细胞。以类似于Elbashir等(2001)披露的方法转染细胞。在转染之 前24小时，对细胞进行胰蛋白酶化，并且用缺乏抗生素的生长培养 基稀释到3×105细胞/ml。将0.5ml细胞接种到24孔平板的每一个孔 中。用1微克GL3-对照或EGFP/pcDNA5-FRT报导基因构建体和 50pmol单链或25pmol双链siRNAs转染所述细胞，除非另有说明， 按照生产商的说明使用LipofectamineTM 2000(LF2000；Invitrogen)。 具体地讲，我们在每个孔中将LF2000用于48微升缺少抗生素的无血 清培养基中。在与用相同的培养基稀释到50微升总体积的报导基因 和/或siRNAs混合之前，在室温下将稀释过的LF2000预培养1分钟。 然后在室温下温育复合物20分钟，然后添加到所述细胞中。EGFP 和GL3报导基因分析是在24小时后进行的。对于JNK2αl siRNA实 验和GL3 siRNA剂量反应实验来说，使用6孔平板。细胞数量增加 了4倍，而试剂用量增加了5倍。对于JNK2αl siRNA实验来说，大 约在转染之后48小时收获细胞，用于RNA分离和蛋白提取。
报导基因分析
使用FACScan(Beckton-Dickinson)对EGFP-转染的细胞进行 FACS分析。将细胞胰蛋白酶化，并且用PBS洗涤，然后重新悬浮在 FACS固定溶液中(PBS+1％甲醛)中。通过比较用水转染的样品和用 EGFP/pcDNA5-FRT转染的样品，估算转染效率，该效率通常为75- 90％。根据在有或没有共转染的siRNAs的样品中平均GFP荧光的改 变，估算由转录的或合成的siRNAs诱导的RNAs的程度。
对于荧光素酶分析来说，将细胞胰蛋白酶化，并且将100微升的 等分样品转移到白色96孔组织培养平板的3个孔中。使用Luc- ScreenTM系统(Applied Biosystems)和TopCount-NXTTM微量平板闪烁 和发光计数器(Packard)，按照生产商的说明进行分析。
Northern和Western印迹分析
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)，按照生产商的说明，用大约 106HeLa细胞的样品制备总RNA。在预制MOPS Latitude RNA琼脂 糖凝胶(BioWhittaker Molecular Applications)上对样品进行电泳，并 且按照生产商的说明转移到Hybond-XL尼龙膜(AP Biotech)上。使用 Rediprime II系统(AP Biotech)，按照生产商的说明制备DNA探针。 杂交是在Rapid-Hyb溶液(AP Biotech)中按照生产商的说明进行的。
细胞核和细胞质蛋白提取物是按照Gordon(1991)披露的方法进 行的，用完整的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)代替亮抑蛋白酶肽、抑 蛋白酶肽、和抑胃酶肽，并且省略了脱氧胆酸钠。
在4-20％SDS聚丙烯酰胺小凝胶(Invitrogen)上对提取物进行 电泳，使用彩虹蛋白标记物(AP Biotech)，并且电印迹到0.2微米的 Tansblot吸印硝酸纤维素膜(BioRad)上.用PBS+0.05％Tween-20漂 洗所述印迹，并且在4℃下，在含有5％奶粉的PBS/Tween-20中，与 以1∶150的比例稀释的JNK2 D2小鼠单克隆抗体(Santa Cruz Biotech) 一起温育过夜。然后用PBS/Tween-20洗涤所述印迹3次，然后与1∶ 3000的HRP-偶联的山羊抗小鼠抗体(BioRad)一起温育45分钟。再洗 涤3次，并且在PBS/Tween-20中温育30分钟，然后通过ECL系统(AP Biotech)检测。
结果
以前业已用siRNAs证实了RNAi，除了两个3’突出核苷酸之外， 它是双链的(Elbashir等2001；Caplen等2001)。为了较快并且较 廉价地生产多种用于多种细胞靶的siRNAs，我们设计了一种用于采 用体外转录技术制备所述分子的方法。
Milligan等(1987)披露了使用部分单链的DNA寡聚体模板，通 过T7 DNA聚合酶进行转录的方法。标准的T7小型启动子包括位于 3’末端的3个鸟苷核苷酸，它是作为转录物的前3个碱基掺入的。不 过，第三个鸟苷通常可以用其他核苷酸取代，而又不会显著降低体外 转录产率(Milligan等1987)。因此，通过这种方法生产的siRNAs应 当包括两个5’鸟苷核苷酸。靠近每一条siRNA链的3’末端的两个互 补的胞嘧啶核苷酸是必要的，以便与另一条链上的5’鸟苷碱基配对。 以这种方式生产的特定长度的siRNAs，应当能够靶定平均以大约250 个核苷酸一次的频率出现在mRNA中的序列。
我们设计的DNA寡聚体模板兼顾到了上述限制因素(图1)。将 每一种模板用于转录siRNA的一条链。通过经过Sephadex G-25大小 排阻柱，苯酚∶氯仿提取，和醇沉淀，对所述链进行粗略纯化。然后 将所述链重新悬浮在退火缓冲液中，并且通过煮沸和缓慢冷却杂交。
我们的体外转录的siRNAs与以前使用的化学合成的产物有两方 面的差别。首先，所有其他报导过的siRNAs都是经过高度纯化的。 其次，体外转录的siRNAs保留了5’三磷酸基团。与作为天然RNAi 机制的一部分在体内生产的siRNA类似，化学合成的RNA寡核苷酸 通常使siRNAs具有携带的5’单磷酸。为了确定上述差别是否使得我 们的siRNAs不能诱导RNAi，我们首先检验了针对两个报导基因- EGFP和GL3设计的双链siRNAs(图2和3)。示出了来自至少三个独 立实验的结果和标准误(图2B，图3B)。
转录的GL3 ds siRNA 1将共转染的pGL3-对照报导质粒的荧光 素酶活性降低了大约5倍，而仅用双倍摩尔浓度的反义链没有作用。 用化学合成的GL3 ds siRNA(ds 1 RNA寡聚体)获得了类似结果。第 二种转录的siRNA具有更适中的作用。而第三种转录的siRNA具有 很强的作用。单用反义链也观察到了显著活性。来自双链类型的作用 的强度是剂量依赖性的(图2C)，并且改变了稳态RNA水平。EGFP ds siRNA 2对荧光素酶活性同样具有适中的作用(图2B)。不过，这种作 用似乎是非特异性的，并且在较大剂量下表现出有限的反应。
在用EGFP/pcDNA5-FRT报导基因共转染的细胞中，相同的转 录的EGFP ds siRNA 2明显减弱GFP荧光(图3B)。用有义或反义链 本身或用化学合成的siRNA(EGFP dsl RNA寡聚体)或它的组成部 分，获得了更适中的作用。EFP荧光不受GL3 ds siRNA 3的影响。
上面所提到的体外转录的(IVT)荧光素酶ds siRNAs以不同的程 度对荧光素酶活性产生了抑制作用。作为RNAi活性的阳性对照，我 们使用了化学合成的荧光素酶ds siRNA。在我们看来，所述合成的ds siRNA将来自共转染的pGL3-对照报导质粒的荧光素酶活性降低了大 约5倍。所有实验的转染效率在91-95％之间波动。一种IVT-荧光素 酶ds siRN A(GL3 ds siRNA 1)将荧光素酶活性降低了78％，而2倍 摩尔浓度的ds siRNA的反义RNA链本身没有作用。我们试验的第二 种IVT-siRNA(GL3 ds siRNA 2)具有更适中的作用(36％抑制作用)。 而第三种IVT-siRNA具有很强的作用(82％的抑制作用)，仅用反义 RNA链同样观察到了显著活性(55％的抑制作用)，使得所述结果令 人费解。各自具有单独使用它们时的1/3摩尔浓度的三种IVT-siRNAs 混合物具有中等作用(70％的抑制作用)，而不是协同作用，这表明 使用多种siRNAs靶定相同的基因可能是没有优势的。我们可以证实 来自ds类型的抑制作用是剂量依赖性的。尽管非特异性GFP siRNA (GFP ds siRNA2)对荧光素酶活性同样具有适中的作用(46％的抑制 作用)，这种作用似乎是非特异性的，并且在较大剂量下表现出有限 的反应(数据未示出)。
相同的IVT-GFP ds siRNA(GFP ds siRNA 2)在用GFP/pcDNA5- FRT报导基因共转染的细胞中能强效减弱GFP荧光(87％的抑制作 用)。单独使用有义(41％)或反义(19％)链或使用化学合成的siRNA (GFP dsl RNA寡聚体)或它的组成部分获得了更为适中的作用。正如 所预料的，GFP荧光不受非特异性荧光素酶ds siRNA 3的影响。
为了证实内源基因表达也受转录的siRNAs的影响，我们靶定了 JNK2αl(图4A)和CDS-1(图4B)基因的产物。与用作为转染对照的水 (模拟物)，EGFP/pcDNA5-FRT质粒(仅有EGFP DNA)，单链 siRNAs，或非特异性siRNA(EGFP ds siRNA 2)转染的细胞相比， Western和Nothern印迹分析，发现了在用转录的siRNA(JNK2αl ds siRNA1-估计降低了87％)或化学合成的siRNA(JNK2αl ds 1 RNA 寡聚体-估计降低了76％)转染的HeLa细胞的细胞核提取物样品中 的JNK2αl蛋白和RNA水平的特异性降低。
与模拟物转染的细胞相比，Western印迹分析在用CDS 1-特异 性IVT-siRNAs转染的HeLa细胞的细胞质提取物中发现了CDS1蛋 白含量的适当的(高达67％)降低，但是在用非特异性siRNA转录 的细胞中没有发现。
实施例2：体外转录的小鼠Insr特异性短的dsRNAs，剔除Balb/C 小鼠肝脏中的Insr
雄性Balb/C小鼠(大约25克)(标准圈养，自由接触食物/水) 接受尾部静脉注射，注射使用盐水2.3毫升，或含有40微克针对鼠胰 岛素受体(NCBI保藏号NM-010568；2536-2556号碱基)的siRNA的 盐水，它是通过体外转录的截短的T7启动子方法制备的，同时使用 800U RNA酶抑制剂。
所述注射是尽可能快地进行的(8-10秒)，在24，48和72小时 处死2只对照和2只siRNA处理的小鼠。迅速取出肝脏，称重，在干 冰/异丙醇中冷冻。用粉碎的冷冻组织和RNEasy Maxi试剂盒(Qiagen) 提取总RNA。
在第一条链cDNA合成之后，通过Q-PCR，使用Smart循环仪(引 物：F 3526-3548，R 3744-3768)分析胰岛素受体的mRNA，同样通过 Q-PCR将结果对亲环蛋白A表达标准化(NCBI保藏号NM017101 的157-182和496-521号碱基)。