[0001] 对相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2013年5月31日提交的美国临时申请号61/829,672和2013年8月27日提交的美国临时申请号61/870,558的优先权，其各自通过提述并入本文。

[0003] 政府支持声明

[0004] 本文所述工作的方面由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的基金1R43RR033149-01 Al和USDA-美国国立粮食和农业研究所(National Institute of Food and Agriculture)的生物技术风险评估项目竞争性基金号2012-33522-19766支持。美国政府可以拥有这些发明的某些权利。

[0005] 本技术领域涉及创建经遗传修饰的动物，例如，具有配子发生基因敲除的家畜动物。

[0006] 背景

[0007] 家畜通常通过有性繁殖创建并使用传统的放牧和饲养方法，或通过集约化的养殖方法在农场养育到性成熟，其中后者对于猪越来越普遍。对于农场主来说有性繁殖是一种有成本效益和有效率的过程。

[0008] 发明概述

[0009] 本发明的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，所述动物包含遗传修饰以破坏选择性地参与配子发生的靶基因，其中所述靶基因的破坏阻止所述动物功能性配子的形成。

[0010] 本发明的一个实施方案是制备家畜动物细胞的方法，包括向选自家畜细胞和家畜胚胎的生物体引入试剂，所述试剂特异性结合细胞的染色体靶位点并导致双链DNA断裂来破坏基因，来选择性破坏配子发生，其中所述试剂选自下组：靶向性核酸内切酶，RNA，重组酶融合蛋白。

[0011] 本发明的一个实施方案是体外细胞，包含特异性结合所述细胞的染色体靶位点并导致双链DNA断裂来破坏基因从而选择性破坏配子发生的试剂，所述试剂选自下组：靶向性核酸内切酶和重组酶融合蛋白。

[0012] 本发明的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，包含对Y染色体的基因组修饰，其中所述修饰包括插入，删除，或取代所述染色体的一个或多个碱基。

[0013] 本发明的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，所述动物包含染色体上的外源基因，所述基因在配子发生中选择性活化的基因表达元件的控制下。

[0014] 本发明的一个实施方案是经遗传修饰的动物，包括遗传不育的雄性家畜动物，其产生功能性的供体精子而不产生功能性的天然精子。

[0015] 本发明的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，所述动物包括染色体上的外源基因，所述基因表达控制所述动物后代性别的因子，其中所述动物产生仅一种性别的后代。

[0016] 本发明的一个实施方案是畜群，包含复数个的所述动物。

[0017] 以下专利申请再次通过提述并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准：US 2010/0146655,US 2010/0105140,US 2011/0059160,和US 2011/0197290。

[0018] 附图简述

[0019] 图1是制造和使用遗传不育动物来传播供体基因的方法的图解。

[0020] 图2是通过在配子发生期间由Y染色体表达因子来控制性别和生育力的方法的图解。

[0021] 图3A描述了用于破坏配子发生的基因，其表达由结合3’UTR的microRNA控制。

[0022] 图3B描述了用于破坏配子发生的基因，其表达由结合3’UTR的microRNA和后期精子发生启动子控制。

[0023] 图4描述了修饰脊椎动物Y染色体的实验结果。

[0024] 图5是实施例6和7的实验结果的图组，示出了CRIPR/Cas9介导的HDR用于将来自疣猪的p65S531P突变基因渗入到常规的猪中。组a)S531P错义突变；组b)对转染的长白猪(Landrace)成纤维细胞的SURVEYOR试验；组c和d)示出了对第3天和第10天取样的细胞的RELP分析。组a中顶部和底部的序列行为向导RNA(gRNA)(具有SEQ ID NO:1的P65_G1S和具有SEQ ID NO:2的P65_G2A)。第二行为野生型(Wt)P65序列，SEQ ID NO:3。第三行为实验中使用的HDR模板，SEQ ID NO:4。示出了左TALEN(SEQ ID NO:5)和右TALEN(SEQ ID NO:6)。

[0025] 图6是实验结果的图组，示出了TALENs和CRISPR/Cas9介导的HDR在猪APC的比较。组a)描述了APC 14.2TALENs和相对于野生型APC序列的gRNA序列APC 14.2Gla。下方，示出了HDR寡聚物，其递送4bp插入(下划线文本)产生新的HindIII位点。组b)示出了展示RFLP和SURVEYOR试验结果的图表。组a的顶行是APC 14.2TALENs序列，SEQ ID NO:7。第二行是野生型APCS序列，SEQ ID NO:8。第三行示出了gRNA序列Gla，SEQ ID NO:9。底部序列是HDR模板，SEQ ID NO:10。

[0026] 图7示出了使用TALENs和质粒同源性模板，基因靶向脊椎动物Y染色体两个位点(AMELY和SRY)。使用同源臂外的基因座特异性引物和同源模板内的转基因特异性引物筛选集落个体集落。所述同源模板的基因座和方向在它们对应的孔上指示而阳性对照指示为(+)。

[0027] 图8表格示出了使用TALENs和质粒同源性基因盒的克隆中Y靶向的分析结果。

[0028] 图9是泛素EGFP对Y染色体中的3个位点的短同源性靶向。有和没有TALENs时，针对SRY的3’接合处(junction)的引物也给出了非特异性条带模式。

[0029] 图10柱状图示出了使用对AMELY和SRY位点特异性的TALENs和短同源模板处理的细胞中EGFP标志物的表达。

[0030] 图11是对表达EGFP标志物的克隆的接合分析。

[0031] 图12是实验结果的图组，示出了具有DAZL和APC的HDR等位基因的克隆猪。组a)是对分别从DAZL-和APC-修饰的长白猪和Ossabaw成纤维细胞衍生的克隆小猪的RFLP分析。组b)是序列分析，确认在八个DAZL建立者(founder)中的三个以及六个APC建立者中的六个中HDR等位基因的存在。供体模板(HDR)中的阻断突变(意图抑制HDR等位基因的再切割)标在方框中，而插入的碱基圈出。顶部WT序列中加粗的字体指示TALEN结合位点。组c)提供了DAZL(左)和APC(右)建立者动物的照片。有14行比对序列，其中每一行分别为编号SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24的独立序列。

[0032] 图13是图像的显微照片图组，示出了缺乏精子发生并没有精子细胞的DAZL敲除(KO)猪。组a是来自睾丸内部的DAZL KO曲细精管的H&E染色，其示出了精原细胞的完全不存在。组b是来自睾丸外部的DAZL KO曲细精管的H&E染色，也示出了精原细胞的完全不存在。组c使用了泛素羧基末端水解酶LI(UCH-LI)，一种存在于野生型猪睾丸中的精原细胞标志物。组d中，UCH-LI不存在于DAZL KO睾丸中，指示精原细胞的不存在。组e中，乙酰化的a-微管蛋白存在于野生型猪睾丸的曲细精管中，指示精原细胞的存在。组f中，DAZL KO猪的曲细精管是乙酰化a-微管蛋白阴性的，证明了这些动物中精子细胞的缺乏。

[0033] 发明详述

[0034] 本文列出了实施方案以制造和使用遗传不育动物，或能够产生仅一种性别的后代的动物。如本文所列出的遗传不育动物以及用于创造它们的简易技术的可用性提供了产生经遗传修饰的动物和常规家畜的新方法和新的机会。一些实施方案涉及将供体组织置于遗传不育的受体雄性中，使得所述受体雄性产生供体精子，并可以用做种畜(stud)来制造所述供体动物的后代。这一技术允许使用有性繁殖来传播所需的遗传性状，包括遗传工程化性状。

[0035] 其它的实施方案用于保护有价值的性状：例如，繁殖和/或遗传修饰以具有一种或多种所需性状的动物也可以经修饰使其不育，或具有仅一种性别的后代，从而确保这些有价值的性状将不会被滥用或脱离遏制。

[0036] 常规的动物生产和遗传修饰的动物生产方法强调生育力(fertility)和存活性(viability)。家畜繁殖效率低下对于家畜生产具有重大的负面影响。尽管越来越多的技术可以用于增加繁殖成功，生殖周期中的损失是常见的。复杂的技术，包括克隆，是已知的，但比有性繁殖的效率低得多，并不适合家畜的大规模生产。在具有很高价值的遗传学的动物中，有时使用人工受精或胚胎转移来最大化它的基因向后代传递。克隆技术，例如体细胞核转移或染色质转移具有低的效率，其不能与有性繁殖相比，并不适合用于经遗传修饰的动物的常规生产。使用胚胎干细胞的克隆(其被称为核移植来源的胚胎干细胞(NTESC))目前不可能用于家畜，因为至今家畜胚胎干细胞的衍生不成功。

[0037] 使用遗传工程化来创造经遗传修饰的家畜将加速创造具有所需性状的家畜。传统的家畜繁殖是一个昂贵并费时的过程，其涉及对遗传性状的谨慎选择和对世代繁殖的漫长等待。即使谨慎选择性状，有性繁殖的变异对培养和传代所需的性状组合提出了相当大的挑战。

[0038] 本文提出了用于动物繁殖的实施方案，其允许所需遗传性状的快速传播，以及用于对所述性状的专用控制和遏制的保护。实施方案包括生产遗传和基因组不育动物，其可以作为提供的遗传材料的宿主。所述宿主的性交将导致供体遗传材料的复制。可以使用一群遗传不育动物来通过有性繁殖广泛传播来自单个供体的相同种质，使得可以快速生成许多供体后代。实施方案包括经修饰产生仅一种性别的动物的供体，使得接收所述动物的使用者将不能滥用具有所述性状的动物，或失去对它们的遏制。

[0039] 基因组不育的动物是一贯不育的，表示其遗传上不能产生后代。术语不育，在本文的语境中，表示不能使用有性繁殖来产生具有其遗传组成的后代。因此产生供体动物后代的动物称作不育，虽然它活跃地产生另一个动物的功能性配子。在一些情况下，所述不育动物产生它自己的配子，可以将其移出并用于人工繁殖过程；例如，可以通过胞浆内精子注射(ICSI)繁殖制造不能游动的精子的宿主动物，或者可以通过克隆繁殖宿主动物。功能性配子是对于成功的有性生殖有用的配子。可以制备基因组不育动物，其进行供体配子发生细胞的配子发生。术语配子发生表示产生单倍体性细胞(卵子和精子)，其各自携带来自每个亲本生殖系的一半遗传补充。精子的产生是精子发生(spermatogenesis)。受精期间精子和卵子的融合产生具有二倍体基因组的合子细胞。术语配子发生细胞指代卵子或精子的祖细胞，通常是生殖细胞，卵原细胞，或精原细胞。

[0040] 本发明的实施方案包括基因组不育动物，其具有对染色体的遗传修饰，所述修饰阻止该动物中的配子发生或精子发生。所述染色体可以是X染色体，Y染色体，或常染色体。所述修饰可以包括对存在的基因的破坏。可以通过改变存在的染色体基因使得其不能表达，或通过遗传地表达将抑制基因的转录或翻译的因子，来创建所述破坏。一些用于制造遗传不育动物的技术也可以应用于制造产生仅雄性或雌性后代的动物，对半传递他们的遗传材料或供体的遗传材料。

[0041] 遗传不育动物的实施方案包括对编码选择性参与配子发生的因子的基因的基因组破坏，其中当对于所述破坏为半合或纯合示于图1中时，所述动物不育。术语破坏和失活在本文中可替换使用。对细胞或胚胎制造遗传修饰来使对于精子活性选择性的基因失活。一种遗传修饰的过程涉及引入TALEN对的mRNA，所述TALEN对特异性结合并打断基因。从所述细胞将动物克隆成胚胎，或经修饰的胚胎直接在代孕母亲中养育。所述动物可以是家畜动物或其它动物。被破坏的精子活性对于生育力是必不可少的，但对于所述动物其他方面不是必要的。因此所述动物是不育的，因为它不能有性生殖，然而，可以使用ARTs来从修饰的精子创建后代。选择具有所需遗传性状的供体动物(作为繁殖和/或遗传工程化的结果)。
该图示出了双肌型的比利时(Belgian Blue)蓝牛供体。从所述供体取出精原细胞和/或精原组织并移植到受体不育动物中。在曲细精管处的移植允许供体细胞和组织复制以制造功能性精子(Brinster和Avarbock,Spemiatogenesis following male germ-cell 
transplantation.PNAS,1994,91:11298-11302)。因此，所述遗传不育动物被制成用于传播供体的遗传材料的工具，且所述动物与复数个雌性交配提供了所需遗传性状的快速传播。

[0042] 经遗传修饰的家畜动物的实施方案示于图2中，其中所述动物包括包含染色体的细胞，所述染色体包含在配子发生中选择性活化的启动子控制下的外源基因。如图1所解释的，通过对细胞或胚胎的遗传修饰创建动物。在该图的实施方案中，所述染色体是Y染色体。由外源基因表达的因子在对于配子发生，或精子发生的阶段选择性的启动子的控制下。所述因子可以破坏靶基因，例如对于雌性动物的发育必要但对于雌性动物的发育不必要(或反之亦然)的基因。或者，可以将所述基因置于启动子的转录控制下，所述启动子在配子发生或精子发生中选择性活化，其中所述因子对于细胞是破坏性或致命的，从而仅阻止雄性配子的发育，或将其破坏，借此仅产生雌性后代，或反之亦然。所述启动子可以在对于配子发生，精子发生，或卵子发生特异的细胞内或组织中活化，例如选自下组的组织：睾丸，曲细精管，或附睾，或在卵子发生的情况下为卵巢，卵泡，卵母细胞，颗粒细胞，或黄体。雌性配子发生的启动子包括，例如，Nobox,Oct4,Bmp15,Gdf9＝FecB,卵生蛋白1和卵生蛋白2。

[0043] 图3A和3B描述了对以上的进一步修饰，其中外源因子也在置于3’UTR中的microRNA结合序列的控制下，使得所述因子在表达所述microRNA的组织中不翻译，但在不表达所述microRNA的组织中，例如选自下组的组织中所述因子将被翻译：睾丸，曲细精管，或附睾。该方法可以使用普遍存在的或组织特异性启动子。在第二个实施方案中，3’UTR将包括靶向对于精子或配子发育必要的基因的microRNA序列。一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，所述动物包括包含染色体的细胞，所述染色体包含外源基因表达元件，其表达为mRNA时可以作为配体结合的靶标，所述配体减弱转录，降解/稳定mRNA，使mRNA局限于某处，或可以抑制或活化翻译。配体可以包括RNA结合蛋白(其也含有或不含有蛋白结合结构域)例如RNA结合蛋白数据库(RBPDB)中的那些，包括但不限于含有以下项的蛋白：核酸识别结构域，RNA识别基序(RRM)，K-同源性结构域(KH结构域)，锌指结构域，TALE样重复，Pumilio和FBF同源性(PUF)重复，或三角状五肽(pentatricopeptide)重复(PPR)蛋白。配体还可以包括调控RNA，例如转运RNA，反义RNA，CRISPR RNA，长非编码RNA，MicroRNA，Piwi-相互作用RNA，小干扰RNA，反式作用siRNA，重复相关的siRNA。所述靶标或调控配体的表达可以在配子发生，卵子发生，或精子发生中选择性地活化或抑制。

[0044] 用于修饰的基因

[0045] 在一个家畜物种中的基因在其它家畜物种以及人和小鼠中一致地具有直系同源物。人和小鼠基因一致地在家畜中具有直系同源物，特别是在牛，猪，绵羊，山羊，鸡和兔中。依赖于所述基因的功能，这些物种和鱼之间的基因直系同源物通常是一致的。生物学家熟悉这些用于寻找基因直系同源物的方法，因此基因在本文中可以根据一个物种描述而不列出直系同源物。因此，描述对基因破坏的实施方案包括对其它物种中具有相同或不同名称的直系同源物的破坏。存在综合的基因数据库以及那些专门为鉴定基因直系同源物的数据库。用于破坏的基因包括对于配子发生，特别是精子发生选择性的基因。用于使精子发生失能而不破坏精子的配子的基序将干扰精子的运动性，顶体融合，或融合生殖(syngamy)。靶基因可以包括选自下组的那些：TENR,ADAM1a,ADAM2,ADAM,alpha4,ATP2B4基因,CatSperl,CatSper2,CatSper3,Catsper4,CatSperbeta,CatSpergamma,CatSperdelta,KCNU1,DNAH8,Clamegin,Complexin-I,塞尔托利氏细胞雄激素受体,Gasz,Ral75,Cib1,Cnot7,Zmyndl5,CKs2,PIWIL4,PIWIL2,和Smcp。

[0046] 可以破坏以干扰精子运动型的基因的实施方案是TENR(Connolly CM；Dearth AT；Braun RE Disruption of murine Tenr results in teratospermia and male 
infertility,Dev.Biol.,2005,278(1):13-21)；ADAM1a(Nishinmra H；Kim E；Nakanishi T；Baba T Possible function of the ADAMla/ADAM2Fertilin complex in the appearance of ADAM3on the sperm surface.,J.Biol.Chem.,2004,279(33):34957-
34962)；和ADAMS(Shamsadin R；Adham IM；Nayernia K；Heinlein UA；Oberwinkler H；
Engel W Male mice deficient for germ-cell cyritestin are infertile,
J.Biol.Reprod.,1999,61(6):1445-1451)。alpha4(Atp1a4，ATPase，Na+/K+转运，alpha4多肽)的敲除使得动物完全不育并导致精子运动性的严重降低(Jimenez T；McDermott JP；
Sanchez G；Blanco G Na,K-ATPase alpha4isoform is essential for sperm 
fertility,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011,108(2):644-649)。具有在精子尾部高度富集的质膜钙/钙调蛋白依赖性钙ATPase的同等型4(PMCA4，由ATP2B4基因编码)的靶基因删除的雄性小鼠由于严重受损的精子运动性而不育。Schuh K；Cartwright EJ；Jankevics E；
Bundschu K；Liebermann J；Williams JC；Armesilla AL；Emerson M；Oceandy D；
Knobeloch KP；Neyses L Plasma membrane Ca2+ATPase 4is required for sperm motility and male fertility,J.Biol.Chem.,2004,279(27):28220-28226)。

[0047] 可以破坏以干扰精子顶体融合和/或精子获能(capacitation)的基因的实施方案为：ADAM2或ADAM3，(Nishimura H；Cho C；Branciforte DR.；Myles DG；Primakoff P Analysis of loss of adhesive function in sperm lacking cyritestin or fertilin beta,Dev.Biol.,2001,233(1):204-213)。alpha4的敲除(上文引用的)也导致来自这些小鼠的精子不能在体外使卵子受精。可以选择性地破坏CatSper家族的基因以创建不能通过有性繁殖创造后代的雄性动物。CATSPER家族基因提供跨膜钙通道蛋白，其包埋于精子细胞的膜中。钙阳离子是超活化(hyperactivation)所需的，其对于受精期间精子穿过卵细胞的膜是必要的。可以破坏由CatSper基因或由Catsper编码的通道亚基来创建不育雄性。破坏CatSper2的雄性完全不育且它们的精子不能穿透卵子(Quill TA；Sugden SA；Rossi KL；Doolittle LK；Hammer RE；Garbers DL Hyperactivated sperm motility driven by CatSper2is required for fertilization,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2003,100(25):
14869-14874)。对Catsper2或Catsper3或Catsper4的破坏具有类似的效果(Qi H；Moran MM；Navarro B；Chong JA；Krapivinsky G；Krapivinsky L；Kirichok Y；Ramsey IS；Quill TA；Clapman DE All four CatSper ion chamlel proteins are required for male fertility and spenll cell hyperactivated motility,Proc.NatI.Acad.Sci.USA,
2007)。小鼠中Clamegin(Clgn)破坏导致精子不能穿透透明带(zona pellucida)(Ikawa M；
Wada I；Kominami K；Watanabe D；Toshimori K；Nishimune Y；Okabe M The putative chaperone calmegin is required for sperm fertility,Nature,1997,387(6633):607-
611)。Complexin-I(Cplx1)缺陷的精子由于缺损的透明带穿透是低生育力的。(Zhao L；
Reim K；Miller DJ Complexin-I-deficient sperm are subfertile due to a defect in zona pellucida penetration,Reproduction,2008,136(3):323-334)。钾通道Kcnul(NCBI Gene ID:157855,也称为Kcnma3,Slo3,KCa5,KCa5.1,KCNMC1)的破坏也制造具有不能经历精子获能的精子的雄性，使得不能受精。DNAH8(Gene ID:1769,也称为hdhc9)的破坏通过干扰鞭毛机器从而干扰运动，导致不能游动的精子。

[0048] Vasa是一种具有RNA依赖的解旋酶的RNA结合蛋白。vasa基因对于精子细胞的发育是必不可少的。已经在果蝇，线虫和小鼠中通过基因敲除，通过RNA干扰(RNAi)降低Vasa mRNA，和通过反义吗啉代处理(敲低)生成了无Vasa的动物，Gustafson和Wessel,Bioessays,32:626-637,2010。人的vasa基因是Ddx4，见Castrillon等，PNAS,97(17):9585-
9590。在动物模型中，去除整个vasa编码区域的空突变导致在卵子生成中具有严重缺陷的雌性不育，包括异常的生殖系分化和卵母细胞决定。部分功能缺失型等位基因纯合的雌性产生可以受精的卵子，但所得的胚胎缺少生殖细胞。因此，不仅在成体中的配子生成期间要求vasa的功能，其对于胚胎发生期间生殖细胞系的分化也是必不可少的(Castrillon等)。
对于小鼠vasa直系同源物Mvh靶向突变为纯合的雄性小鼠不育，并表现出严重的精子发生缺陷，而纯合的雌性是可育的。本发明的实施方案包括家畜动物，其具有被破坏的vasa基因，以及在可诱导控制下的可破坏vasa基因。

[0049] 一些基因，当被破坏时，选择性地干扰精子发生并阻止，或破坏配子的形成，例如DAZ家族的基因，DAZL和DAZ1。DAZ1对于配子发生，特别是精子发生是选择性的，其破坏导致不形成精子。DAZ1在Y染色体上。Alpha1b编码alpha1b肾上腺素能受体，而敲除可以是生殖力减低或缺乏精子形成完全(Mhaouty-Kodja S；Lozach A；Habert R；Tanneux M；Guigon C；Brailly-Tabard S；Maltier JP；Legrand-Maltier C Fertility and spermatogenesis are altered in alphalb-adrenergic receptor knockout male mice,J.Endocrinol,2007,195(2):281-292)。对X染色体的塞尔托利氏细胞(Sertoli cell)雄激素受体(Ar)AR DNA结合结构域(AR-DBD)处的破坏表明AR-DBD对于SC功能和减数分裂后的精子发生是必不可少的，且产生不育雄性，表现出精子发生阻滞，尽管Sertoli细胞数量正常(Lim P；Robson M；Spaliviero J；McTavish KJ；Jimenez M；Zajac JD；Handelsman DJ；Allan CM Sertoli cell androgen receptor DNA binding domain is essential for the completion of spermatogenesis,Endocrinology,2009,150(10):4755-4765；也见Krutskikh A；De Gendt K；Sharp V；Verhoeven G；Poutanen M；Huhtaniemi I Targeted inactivation of the androgen receptor gene in murine proximal epididymis causes epithelial hypotrophy and obstructive azoospermia,Endocrinology,2011,152(2):689-696)。小鼠中Gasz的敲除导致偶线期-粗线期精母细胞阻断并观察到雄性不育缺陷(Ma L；Buchold GM；Greenbaum MP；Roy A；Burns KH；Zhu H；Han DY；Harris RA；Coarfa C；Gunaratne PH；
Yan W；Matzuk MM GASZ is essential for male meiosis and suppression of retrotransposon expression in the male germline,PLoS,Genet,2009,5(9):el 
000635)。缺少两个Ral75等位基因(Ral75-/-)的雄性小鼠是不能生育的，并表现出少-弱-畸形精子症(oligo-astheno-teratozoospermia)；在附睾中几乎没有发现成熟的活动的精子(Fujita E；ouroku Y；Ozeki S；Tanabe Y；Toyama Y；Maekawa M；Kojima N；Senoo H；
Toshimori K；Momoi T Oligo-astheno-teratozoospermia in mice lacking RA175/TSLCl/SynCAM/IGSF4A,a cell adhesion molecule in the immunoglobulin 
superfamily,Mol.Cell Biol.,2006,26(2):718-726)。Cib1的破坏由于破坏了精子发生的单倍体阶段使得雄性不育(Yuan W；Leisner TM；McFadden AW；Clark S；Hiller S；Maeda N；O'brien DA；Parise LV CIB1Is Essential for Mouse Spermatogenesis,Mol.Cell Biol.,2006,26(22):8507-8514)。Cnot7破坏的雄性由于少-弱-畸形精子症不育(Nakamura T；Yao R；Ogawa T；Suzuki T；Ito C；Tsunekawa N；Inoue K；Ajima R；Miyasaka T；Yoshida Y；Ogura A；Toshimori K；Noce T；Yamamoto T；Noda T Oligo-astheno-teratozoospermia in mice lacking Cnot7,a regulator of retinoid X receptor beta,Nat.Genet.,
2004,36(5):528-533)。通过遗传敲除或通过显性阴性体的表达对Cul4A的破坏导致不育与精子发生缺陷(Kopanja D；Roy N；Stoyanova T；Hess RA；Bagchi S；Raychaudhuri P Cul4A is essential for spermatogenesis and male fertility,Dev.Biol.,2011,352(2):278-287)。ZMYND15作为组蛋白脱乙酰酶依赖性转录抑制因子作用，并控制精子发生期间单倍体细胞基因的正常时空表达。Zmynd15的失活导致多种重要的单倍体基因转录的早期活化，包括Prml，Tnpl，Speml，和Catpser3；后期精子细胞耗竭；和雄性不育(Yan W；Si Y；
Slaymaker S；Li J；Zheng H；Young DL；Aslanian A；Saunders L；Verdin E；Charo IF Zmyndl5encodes a histone deacetylase-dependent transcriptional repressor essential for spermiogenesis and male fertility,J.Biol.Chem.,2010,285(41):
31418-31426)。

[0050] 其它基因破坏雄性和雌性的所有配子发生，因此动物品系中这些基因的破坏产生不育后代。一个这种基因是CKs2。缺乏Cks2的小鼠是可存活的，但是两种性别都不育。不育是由于雄性和雌性生殖细胞两者跨越第一减数分裂中期失败。

[0051] 一些基因被组合破坏以产生一种或多种导致不育的效果，例如，以下组合：Acr/H1.1/Smcp，Acr/Tnp2/Smcp，Tnp2/H1.1/Smcp，Acr/H1t/Smcp,Tnp2/H1t/Smcp(Nayernia K；Drabent B；Meinhardt A；Adham IM；Schwandt I；Muller C；Sancken U；Kleene KC；Engel W Triple knockouts reveal gene interactions affecting fertility of male mice,Mol.Reprod.Dev.,2005,70(4):406-416)。实施方案包括第一品系的动物，其具有所示基因组合和/或子组合的敲除。

[0052] 经遗传修饰的动物

[0053] 使用在适当的位置留下标志物，允许其孕育出动物的方法，或通过不在动物中放置标志物的方法，可以制得单等位基因或双等位基因染色体修饰的动物。例如，本发明人已经使用了同源依赖性重组(HDR)方法来对动物的染色体做出改变，或向其插入外源性基因。在本文的其它地方讨论了例如TALENs和重组酶融合蛋白，以及常规方法的工具。一些支持本文公开的遗传修饰的实验数据总结如下。本发明人先前已经证明了当从修饰细胞的多基因群体克隆时超常的克隆效率，并倡导这种方法来避免通过分离的集落的体细胞核转移(SCNT)时克隆效率的变化(Carlson等，2011)。另外，然而，TALEN介导的基因组修饰以及通过重组酶融合分子的修饰，提供双等位基因改变在一代中完成。例如，可以通过SCNT制成对于敲除基因纯合的动物而不需要繁殖来产生纯合子。家畜例如猪和牛的妊娠期以及成熟达到繁殖年龄，是研究和生产的重大障碍。例如，通过克隆和繁殖从杂合突变细胞(两种性别)生成纯合敲除对于猪和牛将分别需要16和30个月。有些人使用遗传修饰的连续周期和SCNT减少了这一负担(Kuroiwa等，2004)，然而，这同时在技术上具有挑战性且成本过高。在SCNT之前常规地生成双等位基因KO细胞的能力在大型动物遗传工程化中是显著的进步。在永生化细胞系中，使用其它方法例如ZFN和稀释克隆已经完成了双等位基因敲除(Liu等，2010)。
最近另一个小组证明了使用商业化ZFN试剂的猪GGTA1的双等位基因敲除(Hauschild等，
2011)，其中可以通过针对GGTA1-依赖的表面表位缺失的FACS富集双等位基因不存在的细胞。虽然这些研究证明了某些有用的概念，它们没有说明动物或家畜可以被修饰，因为简单的克隆稀释对于原代成纤维细胞分离物通常不可用(成纤维细胞以低密度不良生长)，且对于大多数基因，对不存在等位基因的细胞的生物学富集不可用。

[0054] 本发明人先前已经示出了当与密度大于150细胞/cm2的非转基因成纤维细胞一同铺板并使用转座子共选择技术进行药物选择时，转基因原代成纤维细胞可以有效地扩增并作为集落分离(Carlson等，2011，美国公开号2011/0197290)。进一步示出了(见2012年2月24日提交的美国系列号13/404,662)对使用六种TALEN对处理的细胞分离了嘌呤霉素抗性的集落并通过SURVEYOR试验或对跨越靶位点的PCR产物直接测序评价了它们的基因型。一般来说，插入删除阳性克隆的比例与基于第3天修饰水平的预测相似。对于6种TALEN对中的
5种鉴定了双等位基因KO克隆，发生于高达35％的插入删除阳性细胞中。值得注意的是，对于大多数TALEN对，双等位基因KO克隆的频率超出了如果每条染色体的剪切作为独立的事件处理时的预测。

[0055] TALEN诱导的同源重组消除了对于连接的选择标志物的需要。TALENs可用于通过同源依赖修复(HDR)将特定的等位基因精确地转移到家畜基因组中。在一项试验性的研究中，特定的11bp删除(Belgian Blue等位基因)(Grobet等，1997；Kambadur等，1997)引入到了牛GDF8基因座中(见，2012年2月24日提交的美国系列号13/404,662)。当单独转染时，btGDF8.1TALEN对在靶基因座处切割高达16％的染色体。与含有所述11bp删除的超螺旋同源DNA修复模板共转染导致在第3天高达5％的基因转化频率(HDR)而无需选择期望的事件。在1.4％的筛选的分离集落中鉴定了基因转化。这些结果证明TALENs可以用于有效的诱导HDR无需连接的选择标志物的帮助。实施例1提供了实验数据，证明了可以通过使用，例如TALENs遗传改变Y染色体或其它染色体。TALENs在本文的其它地方详细讨论。

[0056] 实施例1，见图4，描述了定向靶向Y染色体的TALENs。三种TALENs对显示了活性。相应地，可以制成在Y染色体上具有插入删除的细胞，以及来自所述细胞的动物。实施例2提供了用于TALEN介导的基因组修饰的方法，以在一代中完成双等位基因敲除。猪和牛的妊娠期以及成熟至繁殖年龄是显著的；例如，对于猪和牛，通过克隆和繁殖从杂合突变细胞(两种性别)产生纯合敲除将分别要求16和30个月。在永生化细胞系中，使用ZFN和稀释克隆已经完成了双等位基因敲除(Liu等，2010)。最近另一个小组证明了使用商业化ZFN试剂的猪GGTA1的双等位基因敲除(Hauschild等，2011)，其中可以通过针对GGTA1-依赖的表面表位缺失的FACS富集双等位基因不存在的细胞。虽然这些其它的研究是有用的，它们使用了简单的克隆稀释。这类过程不可用于大多数原代成纤维细胞分离物，且对于多数基因用于等位基因不存在的细胞的生物学富集不可用。然而，在实施例2中，使用了原代细胞，基于允许单个集落的扩增来筛选双等位基因敲除的方法。实施例3揭示了修饰细胞的替换方法，所述细胞对于制造克隆动物有用。实施例4揭示了其它制造用于克隆的细胞的方法，特别的，涉及单链寡核苷酸作为HDR模板的方法。实施例5使用单链寡核苷酸方法，以不使用标志物的有效方法将基因从一个物种移动到另一个物种。

[0057] 实施例6-8描述了基因的Cas9/CRISPR核酸酶编辑。实施例7和8是Cas9/CRISPR的结果，示出了在预期位点处高效产生的双链断裂。这种断裂提供了通过HDR模板修复过程的基因编辑的机会。CRISPR/Cas9介导的HDR在第3天低于6个百分点且在第10天低于检测范围(图5)。对第二个基因座ssAPC14.2处CRISPR/Cas9诱导的靶向的分析效率高得多，但仍没有达到TALENs在这一位点诱导的HDR的水平，约30％对60％(图6)。Cas9/CRISPR是一种有效的工具，如这些实验所示。

[0058] 实施例9和10描述了使用质粒基因盒(图7和8)或使用线性短同源模板(图9-11)对Y染色体的靶向。两种技术都使用了TALENs来在预期的靶向位点建立双链断裂，而同源模板将感兴趣的基因定向到靶位置。效率为1和24％之间，两种方法都是有效的。

[0059] 实施例11，见图12，描述了用于制造具有被破坏的DAZL基因或被破坏的APC基因的动物的方法。DAZL敲除创造了不育动物。如本文中所解释的，可以用供体细胞或组织处理动物以产生通过有性繁殖传播供体动物的遗传材料的配子。

[0060] 使用这些技术制得了DAZL敲除的猪。这些描述于实施例12中。

[0061] 实施例12，见图13。描述了DAZL KO动物的不育和无生殖细胞表型。经编辑以破坏DAZL基因的动物或细胞是有用的模型，用于研究通过生殖细胞移植恢复人类生育能力，或用于通过遗传修饰的生殖系细胞转移产生遗传修饰的后代。既然对于DAZL已经建立了这一方法，可以使用破坏配子发生的其它基因来重新创建它。

[0062] 实验结果表明，靶向性核酸酶系统在预期同类(cognate)位点有效地剪切dsDNA。靶向性核酸酶系统包括结合同族DNA的基序，通过蛋白-DNA结合，或通过核酸-DNA结合。本文所报道的效率是显著的。本发明人已经在其它地方公开了进一步提高这些效率的进一步技术。

[0063] 本发明的实施方案包括制造经遗传修饰的动物的方法，所述方法包括将胚胎或细胞暴露于编码靶向性核酸酶(例如，大范围核酸酶(meganuclease)，锌指，TALENs，引导RNA，重组酶融合分子)的载体或mRNA，其中所述靶向性核酸酶特异性结合所述胚胎或细胞中的靶染色体位点，创建对细胞染色体的改变，在代孕母亲中克隆所述细胞或将所述胚胎移植到代孕母亲中，由此所述代孕母亲孕育没有报告基因并仅在靶向染色体位点经遗传修饰的动物。所述靶向位点可以是本文所列出的一个，例如，本文所述的多种基因。产生具有经基因编辑的等位基因的生物医药模型动物

[0064] 选择了猪基因组中两种基因编辑的基因座来完成活动物-APC和DAZL。腺瘤性结肠息肉病(APC)基因中的突变不仅是家族性腺瘤性息肉病(FAP)的原因，也在大部分散发性结直肠癌中起到限速作用。DAZL(deleted in azoospermia-like)是一种RNA结合蛋白，其对于脊椎动物中的生殖细胞分化重要。DAZL基因与生育力相关，并对于不育模型以及精子发生阻滞有用。汇集具有HDR编辑的DAZL或APC等位基因的集落用于通过染色质转移克隆。每个汇集从三个转移产生两个妊娠，其中每个妊娠进行到足月。从DAZL修饰的细胞总共出生了八只小猪，其中每一只反应了所选择集落的基因型，其与HDR等位基因(建立者1650，1651和1657)或由于NHEJ的删除一致(图5，组a)。三只DAZL小猪203是死胎。来自APC修饰的细胞的六只小猪中，一只是死胎，三只在一周内死亡，而另一只在3周后死亡，都是因为可能与克隆相关的不明原因。所有六只APC小猪对于预期的HDR编辑的等位基因是杂合的，但除了一只以外所有均在第二个等位基因上具有3bp符合阅读框的插入或删除(图5，组a和b)。剩下的动物被养大，用于精子发生阻滞(DAZL-/-建立者)或结肠癌形成(APC+/-建立者)的表型分析。

[0065] 本文详细描述了模板驱使的基因渐渗(introgression)方法。本发明的实施方案包括模板驱使的基因渐渗，例如，通过HDR模板，将APC或DAZL等位基因放置到非人动物，或任意物种的细胞中。

[0066] 这一方法，以及本文的一般方法，指代细胞和动物。可以从下组选择这些动物和细胞：非人脊椎动物，非人灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，鸡，鸟，兔，山羊，狗，猫，实验室动物，和鱼类。术语家畜表示驯养的动物，其作为食物或生物材料商品。术语偶蹄动物表示偶蹄目的有蹄哺乳动物，其包括牛，鹿，骆驼，河马，绵羊和山羊，其每只脚具有偶数脚趾，通常为两个或有时为四个。

[0067] 配子发生和配子发生启动子

[0068] 配子发生指代这样的生物学过程，通过它生殖细胞系前体细胞经历细胞分裂和分化以形成成熟的单倍体配子。动物通过减数分裂在生殖腺中形成配子。原生殖细胞(PGCs)在发育期间形成配原细胞。雌性配原细胞经历卵子发生，其具有卵母细胞发生，卵细胞发生，和成熟以形成卵子(有时称为卵子发生)的子过程。雄性配原细胞经历精子发生。所述配原细胞是雄性初级精子细胞(二倍体)的前体，其经历减数分裂以产生精原细胞(二倍体)，其产生初级精母细胞(二倍体)。初级精母细胞经历减数分裂以形成次级精母细胞(单倍体)，其形成精细胞(单倍体)，其发育形成成熟的精子(单倍体)，也称为精子细胞。睾丸的曲细精管是所述过程的起始点，其中与内小管管壁相邻的干细胞以向心方向分裂，起始于所述壁并进行到最里面的部分以产生精细胞。精细胞的成熟发生于附睾中。在小鼠或大鼠中的研究已经证明了第一个动物的曲细精管可以接受来自供体动物的组织和/或精原细胞使得捐献的细胞成熟为功能性的精子。受体曲细精管可以有效地接纳供体细胞的精子发生过程。

[0069] 配子发生启动子是对于配子发生过程选择性的启动子。一些配子发生启动子在配子发生的减数分裂阶段之前作用，而其它的在配子发生过程中的多个时间点特异性活化。

[0070] 实施方案包括放置到细胞或胚胎中的外源基因，其在配子发生的选择性启动子的控制下，或在一个或多个选自下组的配子发生子过程期间选择性活化的启动子的控制下：卵母细胞发生，卵细胞发生，卵子成熟，精子发生，成熟成为精原细胞，成熟成为初级精母细胞，成熟成为次级精母细胞，成熟成为精细胞，以及成熟成为精子细胞。一些启动子在配子发生期间普遍地活化，而其它启动子的活化开始于特定的子过程，但可能在配子发生的整个其它阶段继续。实施方案进一步包括放置到细胞或胚胎中的外源基因，其在配子发生过程的选择性组织特异性启动子的控制下：例如，在选自下组的组织中选择性活化的组织特异性启动子：睾丸，曲细精管，以及附睾。

[0071] 细胞周期蛋白A1启动子不仅在粗线期精母细胞中也在更早期的精子发生中活化(Muller-Tidow等，Int J Mol Med.,2003Mar,11(3):311-315；Successive increases in human cyclin Al promoter activity during spermatogenesis in transgenic mice)。

[0072] SP-10启动子(-408/+28或-266/+28；称为SP-10启动子)仅指导精细胞特异性转录。实际上，在转基因小鼠中，尽管转基因整合临近泛-活化CMV增强子，所述-408/+28启动子维持了精细胞特异性并导致了转基因的无异位表达(P Reddi等，Spermatid-specific promoter of the SP-10gene functions as an insulator in somatic cells；Developmental Biology(2003)262(1):173-182)。由视黄酸基因8(Stra8)启动子(称为Stra8启动子)刺激的400-bp调控区域在减数分裂和后减数分裂的生殖细胞中选择性活化，在未分化的生殖细胞中不活化(Antonangeli等，Expression profile of a 400-bp Stra8promoter region during spermatogenesis；Microscopy Research and Technique(2009)72(11):816-822)。

[0073] 发明人开发了可用于农业、研究工具，或生物医学目的的大致各种家畜细胞和/或动物中的多种基因的精确、高频的编辑。这些家畜基因编辑方法包括TALEN和CRISPR/Cas9刺激的同源性指导修复(HDR)，其使用例如质粒、rAAV和寡核苷酸模板进行。发明者开发出这些方法来达到如此高的效率以致遗传改变可以不需要报告物和/或不需要选择标志物而完成。此外，所述方法可以用于建立者世代(founder generation)，来产生仅在预期位点具有预期变化的经遗传修饰的动物。例如，用于靶向性核酸酶的方法和数据提供于2014年1月14日提交的美国系列号14/154,906中，其通过提述并入本文。

[0074] 同源性指导的修复(HDR)

[0075] 同源性指导的修复(HDR)是细胞中修复ssDNA和双链DNA(dsDNA)损伤的一种机制。当存在有与损伤位点具有显著同源性的序列的HDR模板时，细胞可以使用这一修复机制。特异性结合，该术语在生物领域中通常使用时指代分子以与非目标组织相比相对较高的亲和力结合目标，并且通常涉及多个非共价相互作用，如静电相互作用、范德华相互作用、氢键键合等等。特异性杂交是一种具有互补序列的核酸之间的特异性结合的形式。蛋白也可以特异性结合DNA，例如，在TALEN或CRISPR/Cas9系统中或通过Gal4基序。等位基因的渐渗(introgression)指代将外源性等位基因通过模板引导方法复制到内源性等位基因上的过程。在一些情况下，内源性等位基因实际上可以被切出并由外源性核酸等位基因代替，但现在的理论是这一过程是复制机制。由于等位基因是基因对，它们之间具有显著的同源性。所述等位基因可以是编码蛋白的基因，或其可以具有其它功能，如编码生物活性RNA链，或提供位点以接受调节蛋白或RNA。

[0076] HDR模板是包含渐渗的等位基因的核酸。所述模板可以是dsDNA或单链DNA(ssDNA)。ssDNA模板优选的是从约20到约5000个残基，虽然也可以使用其它长度。技术人员将立即理解，明确陈述的范围内的所有范围和数值都是涵盖的；例如，从500到1500个残基，从20到100个残基，等等。所述模板可以进一步包含侧翼序列，其提供与要取代的内源性等位基因或DNA邻近的DNA的同源性。模板还可以包括结合靶向性核酸酶系统的序列，并因此是系统的DNA结合成员的同类结合位点。术语同类指代通常相互作用的两种生物分子，例如受体及其配体。在HDR过程的语境中，生物分子中的一个可以设计为与预期，例如同类，DNA位点或蛋白位点结合的序列。

[0077] 靶向性核酸酶系统

[0078] 基因组编辑工具例如转录激活物样效应器核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)已经影响了生物技术、基因治疗，以及许多物种中的功能基因组研究领域。最近，RNA引导的内切核酸酶(RGEN)通过互补RNA分子引导到其目标位点。Cas9/CRISPR系统是一种REGEN。tracrRNA是另一种此类工具。这些是靶向性核酸酶系统的例子：这些系统具有将所述核酸酶定位到目标位点的DNA结合成员。接着，核酸酶切割位点。TALEN和ZFN具有融合到DNA结合成员的核酸酶。Cas9/CRISPR是在目标DNA上找到彼此的关联物。DNA结合成员具有染色体DNA中的关联序列。DNA结合成员通常根据意图的关联序列设计，以获得在意图位点处或附近的核水解作用。某些实施方案可不受限地应用于所有此类系统；包括最小化核酸酶再切割的实施方案，在意图残基处精确产生SNP的实施方案，以及在DNA结合位点处渐渗的等位基因的放置。

[0079] 位点特异性核酸酶系统

[0080] 基因组编辑工具例如转录激活物样效应器核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)已经影响了生物技术、基因治疗，以及许多物种中的功能基因组研究领域。最近，RNA引导的内切核酸酶(RGEN)通过互补RNA分子引导到其目标位点。Cas9/CRISPR系统是一种REGEN。tracrRNA是另一种此类工具。这些是靶向性核酸酶系统的例子：这些系统具有将所述核酸酶定位到目标位点的DNA结合成员。接着，核酸酶切割位点。TALEN和ZFN具有融合到DNA结合成员的核酸酶。Cas9/CRISPR是在目标DNA上找到彼此的关联物。DNA结合成员具有染色体DNA中的关联序列。DNA结合成员通常根据意图的关联序列设计，以获得在意图位点处或附近的核水解作用。某些实施方案可不受限地应用于所有此类系统；包括最小化核酸酶再切割的实施方案，在意图残基处精确产生SNP的实施方案，以及在DNA结合位点处渐渗的等位基因的放置。

[0081] TALENs

[0082] 术语TALEN用于本文是广泛的，包括不需要另一个TALEN辅助而能切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN还用于指代工程化改造成共同起作用以在相同位点处切割DNA的TALEN对的一个或两个成员。共同起工作的TALEN可以称为左-TALEN和右-TALEN，其参考DNA或TALEN对的手性。

[0083] TAL的密码(cipher)已有报道(PCT公开WO 2011/072246)，其中每个DNA结合重复负责识别目标DNA序列中的一个碱基对。可以装配残基以靶向DNA序列。简言之，确定用于TALEN结合的目标位点，并创建包含核酸酶和一系列识别目标位点的RVD的融合分子。在结合后，核酸酶切割DNA，使得细胞修复机器能够运行以在切割末端处产生遗传修饰。术语TALEN表示包含转录激活物样(TAL)效应器结合域和核酸酶域的蛋白，并包括自身功能性的单体TALEN以及其它要求与另一个单体TALEN二聚化的TALAN。当两个单体TALEN相同时二聚化可以产生同二聚体TALEN，或者当单体TALEN不同时可以产生异二聚体TALEN。已显示了TALEN在永生化的人类细胞中通过两种主要的真核DNA修复途径(非同源末端连接(NHEJ)和同源性指导的修复)来诱导基因修饰。TALEN通常成对使用，但单体TALENs是已知的。用于TALEN处理(以及其它遗传工具)的细胞包括培养细胞、永生化细胞、原代细胞、原代体细胞、合子、生殖细胞、原生殖细胞、胚泡，或干细胞。在一些实施方案中，TAL效应器可以用于将其它蛋白结构域(例如，非核酸酶蛋白结构域)靶向特异性的核苷酸序列。例如，可以将TAL效应器与蛋白结构域相连，所述蛋白结构域来自，没有限制，DAN 20相互作用酶(例如，甲基化酶，拓扑异构酶，整合酶，转座酶，或连接酶)，转录活化子或抑制子，或与其它蛋白相互作用或修饰其它蛋白例如组蛋白的蛋白。这种TAL效应器融合的应用包括，例如，创建或修饰表观遗传调节元件，制造DNA中的位点特异性插入，删除，或修复，控制基因表达，以及修饰染色质结构。

[0084] 术语核酸酶包括外切核酸酶和内切核酸酶。术语内切核酸酶指代能够催化DNA或RNA分子(优选DNA分子)内的核酸之间的键的水解(切割)的任意野生型或变体酶。内切核酸酶的非限制性例子包括II类限制性内切核酸酶，如FokI,HhaI,HindIII,NotI,BbvCl,EcoRI,BglII,和AlwI。当具有通常长度约12-45个碱基对(bp)，更优选14-45bp的多核苷酸识别位点时，内切核酸酶还包含切点罕见内切核酸酶(rare-cutting endonucleases)。切点罕见内切核酸酶在限定基因座处诱导DNA双链断裂(DSB)。切点罕见内切核酸酶可以是例如靶向性内切核酸酶，即由工程化锌指域与限制性酶(如FokI)或化学内切核酸酶的催化域融合得到的嵌合锌指核酸酶(ZFN)。在化学内切核酸酶中，化学或肽切割剂与核酸聚合物或另一个识别特定目标序列的DNA缀合，从而将切割活性靶向到特定的序列。化学内切核酸酶也包括合成的核酸酶，如邻二氮菲、DNA切割分子，以及已知结合特定DNA序列的三链体形成寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides，TFO)的缀合物。根据本发明，这些化学内切核酸酶包含于术语“内切核酸酶”中。这些内切核酸酶的例子包括I-See I,I-Chu L I-Cre I,I-Csm I,Pi-See L PI-Tti L PI-Mtu I,I-Ceu I,I-See IL 1-See III,HO,Pi-Civ I,PI-Ctr L PI-Aae I,PI-Bsu I,PI-Dha I,PI-Dra L PI-Mav L PI-Meh I,PI-Mfu L PI-Mfl I,PI-Mga L PI-Mgo I,PI-Min L PI-Mka L PI-Mle I,PI-Mma I,PI-30Msh L PI-Msm I,PI-Mth I,PI-Mtu I,PI-Mxe I,PI-Npu I,PI-Pfu L PI-Rma I,Pl-Spb I,PI-Ssp L PI-Fae L PI-Mja I,PI-Pho L Pi-Tag L PI-Thy I,PI-Tko I,PI-Tsp I,I-Msol。

[0085] 由TALEN或其它工具制成的遗传修饰可以是，例如，选自下组：插入，删除，外源性核酸片段的插入，以及取代。术语插入广泛地使用，以表示字面上的插入到染色体中或使用外源性序列作为模板用于修复。一般来说，鉴定靶DNA位点并创建将特异性结合所述位点的TALEN对。向细胞或胚胎递送所述TALEN，例如，作为蛋白，mRNA，或通过编码所述TALEN的载体。所述TALEN剪切DNA以制造双链断裂，其接着被修复，通常导致插入删除的创建，或整合伴随的外源性核酸中含有的序列或多态性，其被插入染色体中或作为模板用于具有修饰的序列的断裂修复。这一模板驱使的修复对于改变染色体是一个有用的过程，且提供对细胞染色体的高效改变。

[0086] 术语外源性核酸表示加到细胞或胚胎的核酸，不论所述核酸与细胞中的天然核酸序列相同或不同。术语核酸片段是广泛的，包括染色体、表达盒、基因、DNA、RNA、mRNA，或其片段。所述细胞或胚胎可以是例如选自下组：非人脊椎动物，非人灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，鸡，鸟类，兔，山羊，狗，猫，实验动物，和鱼。

[0087] 一些实施方案涉及产生经遗传修饰的家畜和/或偶蹄动物的组合物或方法，其包含将TALEN对导入家畜和/或偶蹄动物的细胞或胚胎中，从而在位TALEN对特异性结合的位点处对细胞或胚胎DNA做出遗传修饰，以及从所述细胞产生家畜动物和/或偶蹄动物。直接注射可以用于细胞或胚胎，例如注射到合子、胚泡，或胚胎中。或者，可以使用用于蛋白、RNA、mRNA、DNA，或载体导入的多种已知技术之任一种，将TALEN和/或其它因子导入细胞中。可以从胚胎或细胞根据已知方法(例如将胚胎移植到妊娠期的宿主中)，或各种克隆方法产生经遗传修饰的动物。短语“在TALEN特异性结合的位点处对细胞DNA的遗传修饰”等表示当TALEN特异性结合其靶位点时，在TALEN上的核酸酶切割的位点处做出遗传修饰。核酸酶并不在TALEN对结合的地方精确切割，而是在两个结合位点之间的确定位点处切割。

[0088] 一些实施方案涉及对用于克隆动物的组合物或对细胞的处理。细胞可以是家畜和/或偶蹄动物细胞、培养的细胞、原代细胞、原代体细胞、合子、生殖细胞、原生殖细胞、胚泡，或干细胞的。例如，一个实施方案是创建遗传修饰的组合物或方法，其包含将培养物中的复数个原代细胞暴露于TALEN蛋白或编码一种或多种TALEN的核酸。TALEN可以作为蛋白质或核酸片段(例如由mRNA或载体中的DNA序列编码)导入。

[0089] 锌指核酸酶

[0090] 锌指核酸酶(ZFNs)是人工限制酶，其通过将锌指DNA结合域和DNA剪切结构域融合产生。锌指结构域可以经工程化来靶向期望的DNA序列而这使得锌指核酸酶能够靶向复杂的基因组中的独特序列。通过利用内源性DNA修复机制，这些试剂可以用于改变高等生物的基因组。ZFN可以用于使基因失活的方法中。

[0091] 锌指DNA结合域具有约30个氨基酸并折叠为稳定的结构。每个指主要结合DNA底物中的三联体。关键位置的氨基酸残基有助于大多数与DNA位点的序列特异性相互作用。可以改变这些氨基酸而维持剩下的氨基酸保留必要的结构。通过串联几个结构域完成与较长DNA序列的结合。其它的功能性像是非特异性FokI剪切结构域(N)，转录活化结构域(A)，转录抑制结构域(R)以及甲基化酶(M)可以融合到ZFP以分别形成ZFN，锌指转录活化子(ZFA)，锌指转录抑制子(ZFR)，以及锌指甲基化酶(ZFM)。使用锌指和锌指核酸酶用于制造遗传修饰的动物的材料和方法公开于，例如US 8,106,255，US 2012/0192298，US 2011/0023159,和US 2011/0281306。

[0092] 载体和核酸

[0093] 可以将多种核酸导入细胞中，用于敲除的目的，用于基因的失活，获得基因的表达，或用于其它目的。如本文所使用的，术语核酸包括DNA、RNA，以及核酸类似物，以及双链或单链(例如正义或反义单链)的核酸。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分，或磷酸主链处修饰以改进例如核酸的稳定性，杂交，或溶解性。可以修饰脱氧核糖磷酸主链来产生吗啉代核酸，其中每一个碱基部分与六元吗啉环或肽核酸相连，其中脱氧磷酸主链被假肽主链代替，而保留四种碱基。

[0094] 目标核酸序列可以可操作地连接到调控区，如启动子。调控区可以是猪调控区，或者可以来自其它物种。如本文所使用的，可操作地连接指代将调控区相对于核酸序列以允许或促进目标核酸转录的方式定位。

[0095] 一般可以将任意类型的启动子可操作地连接到目标核酸序列。启动子的例子包括但不限于组织特异性启动子，组成性启动子，可诱导启动子，以及对特定刺激物响应或者不响应的启动子。在一些实施方案中，可以使用促进核酸表达而没有显著的组织或时空特异性的启动子(例如，组成型启动子)。例如，可以使用β-肌动蛋白启动子如鸡β-肌动蛋白基因启动子、泛素启动子、miniCAG启动子，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，或3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子及病毒启动子例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子、SV40启动子，或巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施方案中，鸡β肌动蛋白基因启动子和CMV增强子的融合物作为启动子使用。见例如Xu等，(2001)Hum.Gene Ther.12:563；和Kiwaki等，(1996)Hum.Gene Ther.7:821。

[0096] 可以用于核酸构建体的另外的调控区包括但不限于多聚腺苷酸化序列，翻译控制序列(例如内部核糖体进入区段，IRES)，增强子，诱导型元件，或内含子。这些调控区可能不是必要的，尽管它们可以通过影响转录、mRNA的稳定性，翻译效率等等来增加表达。在想要时核酸构建体中可以包含此类调控区以获得核酸在细胞中的最优表达。然而，有时可以在没有此类另外的元件的情况下获得足够的表达。

[0097] 可以使用编码信号肽或选择标志物的核酸构建体。可以使用信号肽，使得编码的多肽定向到特定的细胞位置(例如细胞表面)。可选择标志物的非限制性例子包括嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)，二氢叶酸还原酶(DHFR)，潮霉素-B-磷酸转移酶，胸苷激酶(TK)，以及黄嘌呤(xanthin,xanthine)-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。此类标志物对于在培养物中选择稳定的转化体是有用的。其它的选择标志物包括荧光多肽，如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

[0098] 在一些实施方案中，编码可选择标志物的序列在侧翼可以有重组酶(如例如Cre或Flp)的识别序列。例如，可选择标志物在侧翼可以有loxP识别位点(由Cre重组酶识别的34-bp识别位点)或者FRT识别位点，使得可选择标志物可以从构建体切除。见Orban等,Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89:6861(关于Cre/lox技术的综述)及Brand and Dymecki,Dev.Cell(2004)6:7。含有由可选择标志物基因中断的Cre-或Flp-可激活转基因的转座子也可以用于获得带有转基因的条件性表达的转基因动物。例如，驱动标志物/转基因表达的启动子可以是普遍的或者组织特异性的，其可以导致标志物在F0动物(例如猪)中的普遍或组织特异性表达。转基因的组织特异性激活可以通过例如将普遍表达标志物中断的转基因的猪与以组织特异性的方式表达Cre或Flp的猪杂交，或通过以组织特异性的方式表达标志物中断的转基因的猪与普遍表达Cre或Flp重组酶的猪杂交来完成。转基因的受控表达或标志物的受控切除允许转基因的表达。

[0099] 在一些实施方案中，外源核酸编码多肽。编码多肽的核酸序列可以包括编码“标签”的标签序列，所述标签设计为促进编码多肽的后续操作(例如，促进定位或检测)。可以将标签序列插入编码多肽的核酸序列中，使得编码的标签定位于多肽的羧基或氨基末端。编码的标签的非限制性例子包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)和FLAGTM标签(Kodak,New Haven,CT)。

[0100] 核酸构建体可以使用SssI CpG甲基化酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)甲基化。一般来说，核酸构建体可以与缓冲液中的S-腺苷甲硫氨酸和SssI CpG-甲基化酶在37℃一起孵育。可以通过将构建体与1个单位HinP1I内切核酸酶在37℃孵育1小时和通过琼脂糖凝胶电泳测定确认超甲基化。

[0101] 可以使用多种技术，将核酸构建体导入任意类型的胚胎、胎儿，或成年偶蹄动物细胞，包括例如生殖细胞，如卵母细胞或卵细胞，祖细胞、成体或胚胎干细胞，原生殖细胞，肾细胞，如PK-15细胞、胰岛细胞、β细胞、肝细胞，或成纤维细胞，如皮肤成纤维细胞中。技术的非限制性例子包括使用转座子系统、能感染细胞的重组病毒，或脂质体或能够将核酸递送到细胞的其它非病毒方法，如电穿孔，显微注射，或磷酸钙沉淀。

[0102] 在转座子系统中，核酸构建体的转录单元(即可操作地连接到外源核酸序列的调控区)侧翼有转座子的反向重复。已开发了几种转座子系统(包括，例如Sleeping Beauty(见美国专利号6,613,752和美国公布号2005/0003542)；Frog Prince(Miskey等，(2003)Nucleic Acids Res.31:6873)；Tol2(Kawakami(2007)Genome Biology 8(Suppl.l):S7；Minos(Pavlopoulos等，(2007)Genome Biology 8(Suppl.l):S2)；Hsmar1(Miskey等，(2007))Mol Cell Biol.27:4589)；以及Passport来将核酸导入细胞(包括小鼠、人和猪细胞)中。Sleeping Beauty转座子尤其有用。转座酶可以作为蛋白递送，与外源核酸在相同的核酸构建体上编码，可以在分开的核酸构建体上引入，或作为mRNA(例如，体外转录并加帽的mRNA)提供。

[0103] 核酸可以整合到载体中。载体是广义的术语，其包括设计为从携带者(carrier)移动到目标DNA中的任意特定DNA区段。载体可以称为表达载体，或载体系统，其为引起DNA插入基因组或其它靶定DNA序列(如附加体、质粒，或甚至病毒/噬菌体DNA区段)中需要的一组组分。在动物中用于基因递送的载体系统(如病毒载体(例如逆转录病毒、腺相关病毒以及整合噬菌体病毒)，以及非病毒载体(例如转座子))具有两个基本组分：1)由DNA(或RNA，其逆转录成cDNA)组成的载体，以及2)转座酶、重组酶，或其它整合酶，其识别载体和DNA目标序列两者，并将载体插入目标DNA序列中。载体最常含有一个或多个表达盒，其包含一个或多个表达控制序列，其中表达控制序列是分别控制并调节另一个DNA序列或mRNA转录和/或翻译的DNA序列。

[0104] 许多不同类型的载体是已知的。例如，质粒和病毒载体(如逆转录病毒载体)是已知的。哺乳动物表达质粒通常具有复制起点，适合的启动子和可选的增强子，以及还有任意必要的核糖体结合位点，多聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，以及5’侧翼非转录序列。载体的例子包括：质粒(其也可以是其他种类载体的携带者)，腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒(例如修饰的HIV-1、SIV或FIV)，逆转录病毒(例如ASV、ALV或MoMLV)，以及转座子(例如Sleeping Beauty、P-元件、Tol-2、Frog Prince、piggyBac)。

[0105] 如本文所使用的，术语核酸指代RNA和DNA两者，包括例如cDNA、基因组DNA、合成(例如化学合成)DNA，以及天然存在的和经化学修饰的核酸，例如合成的碱基或替代主链。核酸分子可以是双链或单链的(例如有义或反义单链)。术语转基因在本文中广泛使用，指代其遗传材料已经使用遗传工程技术改变的经遗传修饰的生物体或遗传工程化生物体。因此，敲除偶蹄动物是转基因的，无论外源性基因或核酸是否在动物或其后代中表达与否。

[0106] 经遗传修饰的动物

[0107] 可以使用TALENs和其它遗传工程化技术修饰动物，包括已知的重组酶融合蛋白，或多种载体。通过这些工具制成的遗传修饰可以包括对基因的破坏。术语对基因的破坏指代阻止功能性基因产物的形成。仅当基因产物实现它的正常(野生型)功能时，其为功能性的。对基因的破坏阻止由所述基因编码的功能性因子的表达，并包括对向基因编码的序列和/或对于所述基因在动物中的表达必要的启动子和/或操纵子中一个或多个碱基的插入，删除，或取代。可以通过，例如从动物的基因组中去除至少一部分所述基因，改变所述基因以防止由该基因编码的功能性因子的表达，干扰RNA，或通过外源性基因的显性阴性因子的表达来破坏所述破坏的基因。遗传修饰动物的材料和方法进一步详细描述于2012年2月24日提交的美国系列号13/404,662，2012年5月9日提交的13/467,588和2009年11月10日提交的12/622,886，其各自通过提述并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准。术语反式作用指代不同的分子作用于目标基因的过程(即分子间)。反式作用元件通常是含有基因的DNA序列。这一基因编码用于调节所述目标基因的蛋白(或microRNA或其它可扩散分子)。所述反式作用基因可以与目标基因在同一条染色体上，但活性通过其编码的中间蛋白或RNA。反式作用基因的实施方案为例如编码靶向性核酸内切酶的基因。使用显性阴性突变体对基因的失活通常涉及反式作用元件。术语顺式调节或顺式作用表示不编码蛋白或RNA的作用；在基因失活的语境中，该术语通常表示基因的编码部分的失活，或对于功能性基因的表达必要的启动子和/或操纵子的失活。

[0108] 本领域已知的各种技术可以用于使基因失活以制造敲除动物和/或将核酸构建体导入动物中，来产生建立者动物和制造动物品系，其中所述敲除或核酸构建体整合到基因组中。这些技术包括但不限于原核(pronuclear)显微注射(美国专利号4,873,191)，逆转录病毒介导的对生殖细胞系的基因转移(Van der Putten等，(1985 )Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6148-1652)，对胚胎干细胞的基因靶向(Thompson等，(1989)Cell,56:313-321)，胚胎的电穿孔(Lo(1983)Mol.Cell.Biol.,3:1803-1814)，精子介导的基因转移(Lavitrano等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,14230-14235；Lavitrano等，(2006)Reprod.Fert.Develop.18,19-23)，以及体细胞(例如卵丘细胞或乳腺细胞)，或成体、胎儿或胚胎干细胞的体外转化，接着进行核移植(Wilmut等，(1997)Nature,385:810-
813；和Wakayama等，(1998)Nature,394:369-374)。原核显微注射、精子介导的基因转移，以及体细胞核转移是特别有用的技术。基因组修饰的动物是其中它的所有细胞都具有所述遗传修饰的动物，包括生殖系细胞。当方法用于产生其遗传修饰为嵌合体的动物时，可以使所述动物同系交配并可以选择基因组修饰的后代。例如，如果在胚泡阶段修饰其细胞，可以使用克隆来制造嵌合体动物，或当修饰单细胞时可以发生基因组修饰。根据使用的具体办法，修饰使得其不性成熟的动物对于该修饰可以是纯合或杂合的。如果通过敲除修饰使具体的基因失活，通常需要纯合。如果通过RNA干扰或显性阴性策略使具体的基因失活，那么杂合往往就够了。

[0109] 通常来说，在原核显微注射中，将核酸构建体导入受精卵中；1个或2细胞受精卵用作含有来自精子头部的遗传材料的原核，并且卵在原生质内可见。原核分期的受精卵可以在体外或体内获得(即从供体动物的输卵管中手术回收)。可以如下产生体外受精卵。例如，可以在屠宰场采集猪的卵巢，并在运输期间保持在22-28℃。可以冲洗并分离卵巢用于卵泡穿刺，可以使用18号针在真空下将范围从4-8mm的卵泡穿刺到50ml锥形离心管中。可以使用商业化TL-FIEPES(Minitube,Verona,WI)通过预滤器润洗卵泡液和穿刺的卵母细胞。可以选择被紧密的卵丘质包围的卵母细胞并放置到TCM-199卵母细胞成熟培养基(Minitube,Verona,WI)中，其使用0.1mg/mL半胱氨酸,10ng/mL表皮生长因子,10％猪滤泡液,50μΜ2-巯基乙醇,0.5mg/ml cAMP,10IU/mL孕马血清促性腺激素(PMSG)和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素(hCG)补充，在潮湿的空气中在38.7℃和5％CO2持续约22个小时。接着，可以将所述卵母细胞转移到新鲜的TCM-199成熟培养基中，其不含有cAMP,PMSG或hCG并孵育另外22个小时。可以通过在0.1％的透明质酸酶中涡旋振荡1分钟将成熟的卵母细胞从它们的卵丘细胞剥离。

[0110] 对于猪，成熟的卵母细胞可以在500μl Minitube PORCPRO IVF MEDIUM SYSTEM(Minitube,Verona,WI)中在Minitube 5孔受精皿中受精。在体外受精(IVF)的准备中，可以5
将新鲜收集的或冷冻的公猪精液清洗，并在PORCPRO IVF培养基中重悬至4x 10个精子。精子浓度可以使用计算机辅助精液测试(SPERMVISION,Minitube,Verona,WI)分析。最后，体外授精可以在10μl体积中以终浓度为约40个能动精子/卵母细胞进行，这取决于公猪。将所有受精的卵母细胞在5.0％CO2气氛中在38.7℃孵育6小时。授精后六小时，推定的合子可以在NCSU-23中清洗两次并移到0.5ml的相同培养基中。该系统通常可以在大多数公猪间以
10-30％的多精授精率(polyspermic insemination rate)产生20-30％的胚泡。

[0111] 可以将线性化的核酸构建体注射到一个原核中。接着，可以将注射的卵转移到受体雌性(即到受体雌性的输卵管中)并允许在所述受体雌性中发育以产生转基因动物。具体的，体外受精的胚胎可以在15,000X g离心5分钟来沉淀脂质允许所述原核的可视化。可以使用Eppendorf FEMTOJET注射器注射所述胚胎并可以培养直到胚泡形成。可以记录胚胎分裂和胚泡形成的比率以及质量。

[0112] 可以通过手术将胚胎转移到异步(asynchronous)受体的子宫中。典型地，可以使用5.5寸 导管将100-200(例如，150-200)个胚胎沉积到输卵管的壶腹部-峡部连接。手术后，可以进行妊娠的实时超声检查。

[0113] 在体细胞核转移中，可以将包括如上文所述的核酸构建体的转基因偶蹄动物细胞(例如，转基因猪细胞或牛细胞)例如胚胎卵裂球、胎儿成纤维细胞，成体耳成纤维细胞，或颗粒细胞导入无核的卵母细胞中来建立组合细胞。可以如下将卵母细胞去核，即在极体附近的部分带切开(partial zona dissection)，然后在切开区处压出细胞质。通常，使用具有锋利的有斜面的尖端的注射移液管来将转基因细胞注射到阻滞于减数分裂2的去核卵母细胞中。在一些惯例中，阻滞于减数分裂2的卵母细胞称作“卵”。在生成猪或牛胚胎(例如通过融合并活化卵母细胞进行)后，在活化后约20至24小时，将胚胎转移至接受体雌性的输卵管。参见例如Cibelli等，(1998)Science280,1256-1258及美国专利第6,548,741号。对于猪，可以在转移胚胎后20-21天约对接受体雌性检查妊娠。

[0114] 可以使用标准的育种技术来创建对于来自初始杂合建立者动物的外源核酸方面纯合的动物。然而，可以不需要纯合性。可以将本文中描述的转基因猪与感兴趣的其它猪育种。

[0115] 在一些实施方式中，可以在分开的转座子上提供感兴趣的核酸和可选择标志物并且以不相等的量对胚胎或细胞提供，其中含有可选择标志物的转座子的量远远超过(5-10倍过量)含有感兴趣核酸的转座子。可以基于可选择标志物的存在和表达分离表达感兴趣核酸的转基因细胞或动物。由于转座子会以精确的且不相联的方式(独立转座事件)整合入基因组中，感兴趣的核酸和可选择标志物不是遗传连锁的，并且可以容易地经由标准育种通过遗传分离分开。如此，可以生成转基因动物，其不受在后续世代中保留可选择标志物(即一个从公共安全性观点看有些顾虑的问题)约束。

[0116] 一旦生成了转基因动物，可以使用标准技术评估外源核酸的表达。可以通过Southern印迹分析实现初始筛选以测定构建体整合发生与否。关于Southern分析的描述，参见Sambrook等，1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual second edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview；NY的9.37-9.52部分。也可以在初始筛选中使用聚合酶链式反应(PCR)技术。PCR指扩增靶核酸的规程或技术。一般地，采用来自感兴趣区域末端或超出的序列信息来设计与要扩增的模板的相反链在序列上相同或相似的寡核苷酸引物。可以使用PCR从DNA及RNA扩增特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。引物的长度通常是14至40个核苷酸，但是长度范围可以是10个核苷酸至几百个核苷酸。PCR记载于例如PCR Primer：A Laboratory Manual,ed.Dieffenbach and Dveksler,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995。也可以通过连接酶链式反应、链置换扩增、自身维持的序列复制、或基于核酸序列的扩增来扩增核酸。参见例如Lewis(1992)Genetic Engineering News,12:1；Guatelli等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874；和Weiss(1991)Science,254:1292。在胚泡期，可逐个处理胚胎用于通过PCR、Southern杂交和splinkerette PCR的分析(参见例如Dupuy等，Proc Natl Acad Sci USA(2002)99:4495)。

[0117] 可以使用技术评估转基因猪的组织中编码多肽的核酸序列表达，所述技术包括例如对自动物获得的组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析、Western分析、免疫测定法诸如酶联免疫吸附测定法、和逆转录酶PCR(RT-PCR)。

[0118] 干扰RNAs

[0119] 各种干扰RNA(RNAi)是已知的。双链RNA(dsRNA)诱导同源基因转录体的序列特异性降解。RNA诱导的沉默复合体(RISC)将dsRNA代谢为小的21-23核苷酸的小干扰RNAs(siRNAs)。RISC包含双链RNAse(dsRNase，如Dicer)和ssRNase(如，Argonaut 2或Ag02)。RISC利用反义链作为引导以找到切割靶。siRNAs和microRNA(miRNAs)两者都是已知的。在遗传修饰的动物中使基因失活的方法包括诱导针对靶基因和/或靶核酸的RNA干扰，从而降低靶基因和/或靶核酸的表达。

[0120] 例如，外源核酸序列可诱导针对编码多肽的核酸序列的RNA干扰。例如，与靶DNA同源的双链小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)可以用于降低该DNA的表达。可以生成用于siRNA的构建体，例如Fire等，(1998)Nature,391:806；Romano和Masino(1992)Mol Microbiol,6:3343；Cogoni等，(1996)EMBO J,15:3153；Cogoni和Masino(1999)Nature,399:166；Misquitta和Paterson(1999)Proc.Natl.Acad,Sci.USA,96:1451；以及
Kennerdell和Carthew(1998)Cell,95:1017所描述的。可以通过Mclntyre和Fanning(2006)BMC Biotechnology,6:1所描述的产生shRNA构建体。一般来说，shRNA转录为含有互补区的单链RNA分子，其可以退火并形成短的发夹。

[0121] 找到单个的、个别的有功能的针对特定基因的siRNA或miRNA的概率是高的。例如，siRNA的具体序列的预测率为约50％，但有信心生产出一些干扰RNA且其中至少一个是有功能的。

[0122] 实施方案包括体外细胞，体内细胞，和经遗传修饰的动物例如家畜动物，其表达针对基因例如发育阶段的选择性基因的RNAi。例如，所述RNAi可以选自下组：siRNA、shRNA、dsRNA、RISC和miRNA。

[0123] 可诱导系统

[0124] 可诱导系统可用于控制基因的表达。已知各种允许在时空上控制基因表达的可诱导系统。数个已被证明在转基因动物体内是有功能的。术语可诱导系统包括传统的启动子和可诱导基因表达元件。

[0125] 诱导型系统的例子是四环素(tet)-on启动子系统，其可以用于调节核酸的转录。在此系统中，突变的Tet阻抑物(TetR)与单纯疱疹病毒VP16反式激活物蛋白的激活域融合以创建四环素控制的转录激活物(tTA)，其受到tet或强力霉素(doxycycline，dox)调节。在缺乏抗生素的情况中，转录是最小程度的，而在存在tet或dox的情况中，转录得到诱导。备选的诱导型系统包括蜕皮激素或雷怕霉素(rapamycin)系统。蜕皮激素是一种昆虫蜕皮激素，其生成受到蜕皮激素受体和超气门蛋白(ultraspiracle)基因(USP)产物的异二聚体控制。通过用蜕皮激素或蜕皮激素类似物诸如Muristerone A处理诱导表达。对动物施用以触发诱导型系统的药剂称为诱导剂。

[0126] 四环素诱导型系统和Cre/loxP重组酶系统(组成型的或诱导的)是更为常用的诱导系统。四环素诱导型系统包括四环素控制的反式激活子(tTA)/反向tTA(rtTA)。在体内使用这些系统的方法包括产生两个遗传修饰的动物品系。一个动物品系在选择的启动子的控制下表达激活子(tTA、rtTA或Cre重组酶)。另一组转基因动物表达接纳体(acceptor)，其中接受tTA/rtTA反式激活子(或侧翼为loxP序列)的靶基因控制感兴趣的基因(或要修饰的基因)的表达。将两个品系的小鼠相交配提供了基因表达的控制。

[0127] 四环素依赖的调控系统(tet系统)依赖两个组分，即四环素控制的反式激活子(tTA或rtTA)和以四环素依赖方式控制下游cDNA表达的tTA/rtTA依赖的启动子。在缺乏四环素或其衍生物(如强力霉素)的情况下，tTA结合到tetO序列上，允许tTA依赖的启动子的转录激活。然而，当存在强力霉素时，tTA不能与其靶相互作用且不发生转录。使用tTA的系统被称为tet-OFF，因为四环素或强力霉素允许转录下调。四环素或其衍生物的施用允许暂时控制体内转基因表达。rtTA是tTA的变体，其在缺乏强力霉素时是无功能的，但需要配体存在用于反式激活。因此这种系统被称为tet-ON。已在体内将tet系统用于如编码报告基因、原癌基因或参与信号级联的蛋白的数个转基因的可诱导表达。

[0128] Cre/lox系统使用Cre重组酶，其通过在两远端(distant)的Cre识别序列间，即loxP位点，发生交换而催化位点特异性重组。引入到两loxP序列间的DNA序列(称为floxed DNA)被Cre介导的重组所切除。使用空间控制(带有组织或细胞特异性启动子)或时间控制(带有可诱导系统)在转基因动物中控制Cre的表达导致对两loxP位点间DNA切除的控制。一种应用是条件性基因失活(条件性敲除)。另一种方法用于蛋白过表达，其中将floxed终止子插入到启动子序列和感兴趣的DNA之间。直到Cre表达，遗传修饰的动物才表达转基因，导致切除floxed终止子。这一系统已经应用于组织特异性肿瘤发生和B淋巴细胞中受控的抗原受体的表达。还开发了可诱导的Cre重组酶。只有当施用外源配体时可诱导的Cre重组酶才被激活。可诱导的Cre重组酶是融合蛋白，其含有原来的Cre重组酶和特异的配体结合结构域。Cre重组酶的功能活性依赖于能够结合到融合蛋白中该特异性结构域的外部配体。

[0129] 实施方式包括体外细胞、体内细胞和经遗传修饰的动物例如家畜动物，其包含受控于诱导系统的基因。动物的遗传修饰可以是基因组的或嵌合的。所述可诱导系统例如可以是，例如，选自下组：Tet-On、Tet-Off、Cre-lox和Hif1alpha。实施方案是本文所列出的基因，例如，在DAZL,vasa,CatSper,KCNU1,DNAH8,和睾丸表达基因11(Testis expressed gene 11，Tex11)组成的组中。

[0130] 显性阴性体

[0131] 因此，不仅可以通过去除或RNAi抑制还可以通过创建/表达蛋白的显性阴性变体来破坏基因，所述显性阴性变体对该基因产物的正常功能具有抑制效果。显性阴性体(DN)基因的表达可以导致改变的表型，其通过以下效应发挥功能a)滴定效应(titration effect)；DN被动地与内源基因产物竞争协同因子或所述内源基因的正常靶标而不发挥相同的活性，b)毒丸(poison pill)(或活动扳手(monkey wrench))效应，其中所述显性阴性基因产物主动地干扰正常基因功能所需的过程，c)反馈效应，其中DN主动地刺激对所述基因功能的负调控因子。

[0132] 建立者动物、动物系、性状和繁殖

[0133] 可通过克隆和其它本文中描述的方法生产建立者动物。建立者动物可以是遗传修饰的纯合子，如在合子或原代细胞经历纯合修饰的情况中。同样，也可将建立者制造为杂合子。建立者可以是基因组修饰的，这意味着它们所有细胞在基因组中的都经历修饰。建立者可以是修饰的嵌合体，如可发生在当将载体引入到胚胎的多个细胞之一中时，通常在胚泡期。可检测嵌合动物的后代以鉴定基因组修饰的后代。当建立了能够有性繁殖的或通过辅助生殖技术繁殖，具有持续表达修饰的纯合或杂合后代的动物池时，动物系被建立。

[0134] 在家畜中，已知许多等位基因与多个性状诸如生产性状、类型性状、可加工性(workability)性状、和其它功能性状有联系。技术人员习惯于监测和量化这些性状，例如Visscher等，Livestock Production Science,(1994)40:123-137,US 7,709,206,US 2001/0016315,US 2011/0023140,和US2005/0153317。动物品系可以包括选自下组的性状：
生产性状、类型性状、可加工性性状、生育力性状、育儿(mothering)性状和疾病抗性性状。
进一步的性状包括表达重组基因产物。

[0135] 可以修饰具有所需一种或多种性状的动物来阻止它们的繁殖。从而向接收者提供已经经繁育或修饰以具有一种或多种性状的动物，而降低该接收者自己繁育该动物并滥用所述性状的价值的风险。

[0136] 可以在处理设施有利地完成动物的繁育，其要求化合物的施用以诱导生育能力或性生育能力。所述处理设施可以在良好控制的家畜上实施标准方案，来高效产生一致的动物。可以将动物后代分配到多个位置待养育。农场和农场主(该术语包括牧场和牧场主)从而可以订购期望数量的具有特定年龄范围和/或体重范围和/或性状的后代，并在期望的时间和/或位置运输它们。所述接收者，例如农场主，接着可以养育所述动物并依照他们的需求将这些动物运输到市场。

[0137] 实施方案包括运输(例如，到一个或多个位置，到复数个农场)经遗传修饰的家畜动物，其具有被破坏的基因使得所述动物不能进行有性生殖。所述动物可以具有一个或多个性状(例如表达期望性状，或高价值性状，或新的性状，或重组性状)。实施方案进一步包括提供所述动物和/或繁育所述动物。

[0138] 重组酶

[0139] 本发明的实施方案包括将靶向性核酸酶系统与重组酶(例如RecA蛋白，Rad51)或其它与DNA重组相关的DNA结合蛋白一同施用。重组酶与核酸片段形成细丝，并有效搜索细胞DNA来寻找与序列基本同源的DNA序列。例如重组酶可以与充当HDR模板的核酸序列组合。接着，重组酶与HDR模板组合以形成细丝并置入细胞中。重组酶和/或与重组酶组合的HDR模板可以作为蛋白、mRNA，或与编码重组酶的载体置于细胞或胚胎中。美国公布2011/0059160(美国系列号12/869,232)的公开内容通过提述特此并入本文中用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准。术语重组酶指代遗传重组酶，其在细胞中酶促催化两条相对较长的DNA链之间相对短的DNA部分的连接。重组酶包括Cre重组酶，Hin重组酶、RecA、RAD51、Cre，以及FLP。Cre重组酶是来自PI噬菌体的I类拓扑异构酶，其催化loxP位点之间的DNA的位点特异性重组。Hin重组酶是由198个氨基酸组成的21kD蛋白，其存在于细菌沙门氏菌属(Salmonella)中。Hin属于DNA转化酶的丝氨酸重组酶家族，其中它依赖于活性位点丝氨酸来启动DNA切割和重组。RAD51是人类基因。由该基因编码的蛋白是RAD51蛋白家族的成员，其辅助DNA双链断裂的修复。RAD51家族成员与细菌RecA和酵母Rad51同源。Cre重组酶是实验中用来删除侧翼有loxP位点的特定序列的酶。FLP指代衍生于面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2μ质粒的Flippase重组酶(FLP或Flp)。

[0140] 本文中，“RecA”或“RecA蛋白”指代RecA样重组蛋白家族，其具有基本上全部或大部分相同的功能，特别是：(i)将寡核苷酸或多核苷酸正确定位到其同源目标以用于通过DNA聚合酶的后续延伸的能力；(ii)在拓扑学上制备双链体核酸以合成DNA的能力；和(iii)RecA/寡核苷酸或RecA/多核苷酸复合物高效寻找并结合互补序列的能力。表征得最好的RecA蛋白来自于大肠杆菌；除了蛋白的最初等位形式外，已鉴定了许多突变体RecA样蛋白，例如RecA803。此外，许多生物体具有RecA样链转移蛋白，包括例如酵母、果蝇(Drosophila)、哺乳动物(包括人)，以及植物。这些蛋白包括例如Ree1、Rec2、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad51E、XRCC2以及DMC1。重组蛋白的一个实施方案是大肠杆菌的RecA蛋白。或者，RecA蛋白可以是大肠杆菌的突变体RecA-803蛋白，来自另一种细菌来源的Rec蛋白，或来自另一种生物体的同源重组蛋白。

[0141] 组合物和试剂盒

[0142] 本发明还提供组合物和试剂盒，其含有，例如，编码位点特异性核酸内切酶，CRISPR，Cas9，ZNFs，TALENs，Rec-gal4融合物的核酸分子，它们的多肽，含有这些核酸分子或多肽的组合物，或工程化的细胞系。还可以提供对于指示的等位基因渐渗有效的HDR。这些物品可以用作，例如，研究工具或在治疗上使用。实施例

[0143] 除非另有说明，材料和方法，包括TALENs的制造，一般如2012年2月24日提交的美国系列号13/404,662中所述。

[0144] 实施例1：用于Y染色体修饰的TALENs

[0145] 转染-培养成纤维细胞并如上文所述通过核转染转染。(Carlson等，2011)。在该实验中转座子组分合计1μg。对于同源性依赖修复(HDR)分析，选择了对于双链断裂(DSB)诱导的最佳进行条件，且添加与TALEN质粒相等，3和10倍过剩的修复模板。细胞培养-通过96孔板中在预先确定的密度进行个体集落的分离来产生30-50％的孔中的集落。插入删除检测群体-设计侧接靶位点的引物以产生～500bp的扩增子。使用 核酸酶(Transgenomic,Omaha NE)按照建议处理PCR扩增子，并在8-10％的聚丙烯酰胺凝胶上解析。克隆并测序来自插入删除阳性胚泡的一部分扩增子来表征突变。插入删除检测集落-如上文所使用的侧接靶位点的引物用于使用高分辨率解链分析qPCR预混物(Invitrogen)的扩增并进行解链曲线分析。实时PCR产物的解链概貌的变化将区分携带TALEN诱导的突变的克隆和野生型序列。来自非转染对照细胞的扩增子的解链温度的标准变化将用作参考。克隆具有超出标准变化的解链概貌的扩增子并测序来表征突变。Y靶向检测-使用一个同源臂外部的引物和一个内部的引物开发PCR试验，使得仅如果已经发生同源重组时可能产生产物。通过全基因组扩增Southern印迹验证PCR阳性的集落。WGA Southern印迹来确认Y-靶向-使用REPLI-g Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)的半反应根据“血液或细胞的扩增”方案在个体克隆上进行WGA。Southern印迹的探针杂交来验证靶细胞的5’和3’接合处(junction)。FACS-制备新鲜的精液用于分选具有X-和Y-的精子细胞，通过将1500万精子放置到1ml BTS中，其中Hoechst 33342加到浓度为6.25μM。将该制备物在35℃孵育45分钟。使用改进的流式细胞仪通过DNA含量分选具有X-和Y-的精子，其中所述流式细胞仪具有用于精子分选的标准改进(Johnson等，1987；Jolinson and Pinkel,1986)。通过X和Y靶标的定量PCR确定分选的群体的准确度。血清激素测量-使用来自Endocrine Technologies(Newark,CA)的商业化ELISA试剂盒测量睾酮和FSH的血清水平。

[0146] 制造了四种TALEN对，其针对Y染色体基因添加的两个候选基因座(图4)。第一个候选物定位于SRY的3’端1.7kb处，在两个最高级别的多聚腺甘酸化信号的范围之外。第二个候选基因座是AMELY基因的Y特异性内含子。基于与牛的比较以及猪:牛比较基因图谱数据，预测这些基因座位于SSCY的拟常染色体边界之外(Quilter等，2002；Van Laere等，2008)。因此，它们不能与SSCX或常染色体进行重组，因此预期经过众多代保持在SSCY上。测试的四种TALEN对中有3对表现出了高活性(图4)。

[0147] 实施例2：分离单-和双-等位基因KO克隆

[0148] Carlson等，2012描述了对家畜中的目标基因的修饰，其中当与标准密度(>150个细胞/cm2)的非转基因成纤维细胞(饲养细胞)一同铺板时，转基因原代成纤维细胞有效地扩增并作为集落分离，并使用上文应用的转座子共选择技术进行药物选择(Carlson等，(2011)Transgenic Res.,20:1125和2012年5月9日提交的美国公开2012/0220037)。这些技术对于制造体细胞的遗传变化是有用的，所述体细胞可以用于克隆动物。

[0149] 作为例子，分离使用六种TALEN对处理的细胞的嘌呤霉素抗性集落，并评价了它们的基因型。一般来说，插入删除阳性克隆的比例与基于第3天修饰水平的预测相似。对于7种不同TALEN对中的6种鉴定了双等位基因敲除克隆，发生于高达百分之35的插入删除阳性细胞中。在大多数的例子中，插入删除是纯合的(每个等位基因上相同的插入删除)而不是在每个等位基因上独特的插入删除，表明姐妹染色单体作为模板的修复是普遍的。值得注意的是，在这些修饰的克隆中，对于大多数TALEN对，双等位基因修饰的频率(17-60％)超过了基于第3天修饰水平的预测(10-17％)，如果染色体剪切作为独立的事件处理。

[0150] 实施例3：家畜细胞中TALEN介导的作为HDR靶标的DNA剪切

[0151] 靶向猪低密度脂蛋白受体(LDLR)基因的第四个外显子的TALEN对(LDLR4.2)与超螺旋质粒Ldlr-E4N-stop共转染，所述质粒含有对应猪LDLR基因的同源臂和使得新霉素磷酸转移酶能够依赖HDR表达的基因诱捕(gene trap)。培养3天后PCR分析表明，即使没有抗生素选择，可以在30℃靶向的基因座处检测到对应HDR事件的条带。使用遗传霉素(G418)对培养细胞14天的群体选择导致HDR细胞的显著富集。

[0152] 实施例4：用于模板的单链DNA

[0153] Tan等，2013描述了使用单链DNA的模板驱动的基因修饰。对于TALEN刺激的HDR，单链寡脱氧核苷酸(ssODNs)是有效的模板。靶向基因座来将11碱基对Belgian Blue牛突变基因渐渗到Wagyu细胞中。设计了两种76碱基对的ssODN来模拟包括所述11碱基对删除的BB GDF8基因的正义或反义链。将四微克的编码TALEN的质粒转染到Wagyu细胞中，而0.3nMol的ssODNs与TALENS(N)共转染，或在TALEN核转染24小时后通过MirusLT1(M)试剂或Lipofectamine LTX(L)试剂递送。第三天的半定量PCR表明了在TALEN转染24小时后使用LIPOFECTAMINE LTX试剂递送ssODNs的情况下高达5％的等位基因转化频率。在针对所述靶标设计的正义和反义ssODNs之间观察到PCR信号没有差异。

[0154] 实施例5：使用寡HDR将等位基因导入猪(Ossabaw)细胞中

[0155] Tan等(2013)描述了使用编码TALENs的mRNA和单链寡核苷酸的组合修饰细胞以将一个物种中天然存在的等位基因置入另一个物种中(物种间迁移)。选择了Piedmontese GFD8SNP C313Y作为例子并导入Ossabaw猪细胞中。在任意阶段，这些细胞中没有使用标志物。使用0.4nmol ssODN在猪和牛细胞之间观察到了HDR中相似的峰(未示出)，然而，在Ossabaw成纤维细胞中通过更高浓度的ssODN，HDR没有消除。

[0156] 实施例6：CRISPR/Cas9设计和产生

[0157] 根据他们的方法将基因特异性gRNA序列克隆到Church lab gRNA载体中(Addgene ID:41824)。通过hCas9质粒(Addgene ID:41815)的共转染或从RCIScript-hCas9合成mRNA提供Cas9核酸酶。该RCIScript-hCas9通过将Xbal-Agel片段从hCas9质粒(包含hCas9cDNA)亚克隆到RCIScript质粒中来构建。除了使用KpnI进行线性化外，如上文所述进行mRNA的合成。

[0158] 实施例7：CRISPR/Cas9

[0159] CRISPR/Cas9介导的HDR用于将来自疣猪的p65S531P突变渐渗到常规猪中。参考图5，组a)通过在猪p65(RELA)的核苷酸1591处的T-C转化产生S531P错义突变。该S-P HDR模板包括诱发性的TC转化突变(加粗字体)，其引入新的XmaI位点并使得能够RFLP筛选。与先前实验中使用的p65.8TALENs一起示出了两种gRNA序列(P65_G1S和P65_G2A)。组b)使用S-P-HDR寡聚物(2μΜ)，两种量的编码hCas9的质粒(0.5μg对2.0μg)；以及五种量的G2A转录质粒(0.05至1.0μg)转染长白猪(Landrace)成纤维细胞。将来自每个转染的细胞分为60:40并分别在30和37℃培养3天，接着在37℃延长培养直到第10天。Surveryor试验表明活性范围从
16-30％。组c和d)第3天和第10天取样细胞的RFLP分析。通过黑色箭头指示了191和118bp的预期剪切产物。尽管DSB与目标SNP极为接近，对于S531P的渐渗，CRISPR/Cas9介导的HDR比TALENs效率低。也使用每种gRNA序列分析了个体集落。

[0160] 实施例8：CRISPR/Cas9

[0161] 在猪APC中比较TALENs和CRISPR/Cas9介导的HDR。参考图6，组a)相对于野生型APC序列示出了APC14.2TALENs和gRNA序列APC14.2Gla。下方，示出了LIDR寡聚物，其递送4bp插入(见文字)，其产生新的HindIII位点。使用2μΜ寡HDR模板，以及1μg TALEN mRNA，编码hCas9的DNA和gRNA表达质粒各1μg；或1μg编码hCas9的mRNA和0.5μg gRNA表达质粒转染的猪成纤维细胞接着分离并在30或37℃培养3天，接着在37℃扩增直到第10天。组b)显示RFLP和Surveyor试验结果的图表。如先前确定的，TALEN刺激的HDR在30℃最有效，而CRISPR/Cas9介导的HDR在37℃最有效。对于该基因座，TALEN比CRISPR/Cas9系统更有效刺激HDR，尽管通过SURVEYOR试验测量的DNA切割频率相似。与TALENs相反，当hCas9作为mRNA递送时，相对于作为质粒递送在HDR中仅存在很小的差别。

[0162] 实施例9：靶向Y染色体

[0163] 使用TALEN和质粒同源性基因盒的组合将mCaggs-EGFP基因盒靶向Y染色体。为了该实验的目的，当转基因基因盒和内源基因(SRY或AMELY)两者的定向相同时为正定向，当它们定向相反时，为负定向。在单个100μl电穿孔中，将一微克TALEN mRNA加上500ng同源性基因盒与600,000个细胞混合。使用NEON电穿孔系统(Life Technologies)转染细胞，在30℃培养3天，并以低密度铺板用于得到单细胞衍生的集落。通过接合PCR(junction PCR)使用同源臂外部的一个引物和转基因基因盒范围内的第二引物分析集落中对Y染色体的正确靶向。几个集落对于预期的扩增子是阳性的。图8是图7中示出的结果的总结。Y靶向阳性的克隆范围从百分之6-24。所述转基因基因盒的定向似乎对Y靶向的效率有一些影响。

[0164] 实施例10：对Y染色体的短同源性靶向

[0165] 质粒同源性基因盒的一种替换方案是线性模板，其具有开发用于靶向AMELY和SRY位点的短(50-100bp)同源臂。使用结合EGFP基因盒的5’和3’末端的引物，通过对所述泛素EGFP基因盒的PCR扩增创建所述同源性模板，且所述同源性模板包括对应假定的TALEN诱导的双链断裂的序列5’和3’的尾部，如描述于Orlando等，2010(NAR；2010Aug；38(15))。所述引物包括前两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键，来抑制被内源性核酸酶降解。在典型的100μl电穿孔中包括两微克的TALEN mRNA(或没有作为对照)和lug对每个位点特异性的短同源性模板。电穿孔后，分细胞用于在30或33℃培养三天，接着通过接合PCR测试Y靶向。在30或33℃培养的细胞在5’和3’接合两处对于Y靶向都是阳性的，虽然产物强度说明在30℃时Y靶向更有效。对于每个位点，对应正确Y靶向的扩增子依赖于TALEN，注意SRY 3’接合的顶部条带是非特异性背景信号。转染后培养14天的细胞群体应当不再表达非整合的模板。对第14天的群体进行了EGFP的FACs，来确定TALEN加上短同源性模板的组合，相对于单独模板，是否增加EGFP阳性细胞的比例。确实，当包括TALEN时，EGFP阳性细胞富集了～3倍，且观察到很小的温度影响(图10)。对个体EGFP阳性集落针对Y靶向进行基因型分析。对于AMELY，来自最初分别在30或33℃培养的细胞的0/5(0％)和2/5(20％)的EGFP阳性集落对于Y靶向也是阳性的(图11)。对于SRY，来自最初分别在30或33℃培养的细胞的5/24(21％)和0/9(0％)的EGFP阳性集落对于Y靶向也是阳性的(图11)。

[0166] 实施例11：用于猪基因敲除的TALEN HDR

[0167] 为了生成具有定制设计的敲除等位基因的猪，我们使用了如Tan等，2013中所描述的TALEN和oligo处理细胞。对于这一组实验，TALEN和oligo模板经设计分别靶向猪DAZL或APC，接着分离单个克隆并筛选通过oligo HDR引入的新的限制性位点。图12是实验结果的图组，示出了具有DAZL和APC的HDR等位基因的克隆猪。组a)对衍生于分别为DAZL和APC修饰的长白猪和Ossabaw猪成纤维细胞的克隆小猪的限制性片段长度多态性(RFLP)分析。DAZL建立者的预期RFLP产物为312,242和70bp(空心三角形)，而APC的为310,221和89bp(实心三角形)。WT和DAZL建立者之间的312bp条带大小的差异反映了预期的删除等位基因。组b)序列分析确认了在八只DAZL建立者中的三只，以及六只APC建立者的六只中HDR等位基因的存在。方框中是供体模板(HDR)中的阻断突变，而插入碱基下划线划出。顶部WT序列的加粗文字指示TALEN结合位点。组c)DAZL(左)和APC(右)建立者动物的照片。

[0168] 实施例12：DAZL-KO公猪缺乏精子细胞

[0169] 图13是显微照片图组，示出了DAZL KO猪表现出缺乏精子发生以及生殖细胞的完全不存在。a.来自睾丸内部的DAZL KO曲细精管的H&E染色，其示出了精原细胞的完全不存在，b.来自睾丸外部的DAZL KO曲细精管的H&E染色，也示出了精原细胞的完全不存在，c.泛素羧基末端水解酶LI(UCH-LI)，一种存在于野生型猪睾丸中的精原细胞标志物，d.UCH-LI不存在于DAZL KO睾丸中，指示精原细胞的不存在，e.乙酰化的a-微管蛋白存在于野生型猪睾丸的曲细精管中，指示精原细胞的存在，f.DAZL KO猪的曲细精管是乙酰化a-微管蛋白阴性的，证明了这些动物中精子细胞的缺乏。

[0170] 本文列出的所有公开，专利申请，以及专利在此通过提述并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准。

[0171] 进一步公开

[0172] 实施方案包括，例如，以下所有，将其编号用于参考：1.经遗传修饰的动物，所述动物包括遗传修饰以破坏选择性参与配子发生的靶基因，其中对所述靶基因的破坏阻止所述动物的功能性配子的形成。2.1的动物，其中对所述基因的破坏包括在编码所述靶基因的序列和/或其顺式调控元件中插入，删除，或取代一个或多个碱基。3.1的动物，其中通过以下项破坏所述被破坏的基因：从所述动物的基因组移除至少部分所述基因，改变所述基因以阻止由所述基因编码的功能性因子的表达，或反式作用因子。4.3的动物，其中通过反式作用因子破坏所述靶基因，所述反式作用因子选自下组：干扰RNA和显性阴性因子，其中所述反式作用因子由外源基因或内源基因表达。所述反式作用因子可以是，例如靶向性核酸酶。5.1的动物，其中对所述靶基因的破坏在可诱导系统的控制下。6.5的动物，其中所述诱导系统包括下组的成员：Tet-On，Tet-Off，Cre-lox，Hiflalpha，RHEOSWITCH，蜕化素基因开关，和cumate基因开关。7.1的动物，其中所述靶基因选自下组：DAZL，vasa，CatSper，KCNU1，DNAH8，和睾丸表达基因11(Tex11)。8.1的动物，其中所述靶基因在X染色体或常染色体上。
9.1的动物，其中所述靶基因在Y染色体上。10.1的动物，其中对所述靶基因的破坏选择性抑制雄性配子或雌性配子的形成。11.1的动物，其中所述靶基因选自下组：TENR，ADAM1a，ADAM2，ADAM，alpha4，ATP2B4基因，Catsper基因亚单位，CatSperl，CatSper2，CatSper3，Catsper4，CatSperbeta，CatSpergamma，CatSperdelta，Clamegin，Complexin-I，塞尔托利氏细胞(Sertoli cell)雄激素受体，Gasz，Ral75，Cib1，Cnot7，Zmynd15，CKs2，和Smcp。12.1的动物，其中所述靶基因对于精子发生是必要的，其中对所述基因的破坏选择性抑制精子发生。13.12的动物，其中所述靶基因包括睾丸表达基因11(Tex11)。14.1的动物，其中所述靶基因对精子运动性，精子顶体融合，或精子融合生殖(syngamy)是必要的，其中对所述靶基因的破坏选择性抑制精子运动性，精子顶体融合，或精子融合生殖的一项或多项。15.14的动物，其中其中对所述靶基因的破坏选择性抑制精子运动性，且所述基因选自下组：
TENR，ADAM1a，ADAM3，Atpla4，和ATP2B4。16.14的动物，其中对所述靶基因的破坏选择性抑制精子顶体融合，且所述基因选自下组：ADAM2，ADAM3，Catsper，Clamegin，和Complexin-I。
17.1的动物，其中所述动物选自下组：非人脊椎动物，非人灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，鸡，鸟类，兔，山羊，狗，猫，实验室动物和鱼。18.1的动物，为不育雄性，并不能产生功能性精子。
19.18的动物，其中所述靶基因包括DAZL。20.1的动物，其为供体细胞的受体，所述供体细胞产生具有供体的单倍体供体染色体补充的功能性供体精子。21.20的动物，其中所述供体细胞进一步包括用于表达转基因重组蛋白的基因。22.1的动物，包括选自下组的转基因性状：
生产性状，类型性状，可加工性(workability)性状，生育力性状，育儿性状，和疾病抗性性状。23.制备动物细胞的方法，包括向选自细胞和胚胎的生物体导入试剂，所述试剂特异性结合细胞的染色体靶位点且导致双链DNA断裂以破坏基因，来选择性破坏配子发生，其中所述试剂选自下组：靶向性核酸内切酶，RNA，和重组酶融合蛋白。24.23的方法，其中所述试剂是靶向性核酸内切酶，并包括TALEN或TALEN对，其包含特异性结合染色体靶位点的序列，并在所述基因中创建双链断裂，或与创建第二双链断裂的其它TALEN组合在染色体中创建双链断裂，其中至少部分所述基因置于所述第一断裂和第二断裂之间。25.23的方法，其中所述试剂包含靶向性核酸酶并选自下组：锌指核酸酶，大范围核酸酶，RNA引导核酸酶，或CRISPR/Cas9。26.24的方法，进一步包括将重组酶与所述靶向性核酸内切酶共引入生物体中。27.23的方法，其中向生物体中引入所述试剂包括选自下组的方法：直接注射作为肽的所述试剂，注射编码所述试剂的mRNA，使所述生物体暴露于编码所述试剂的载体，以及将编码所述试剂的质粒引入所述生物体中。28.23的方法，其中所述试剂是重组酶融合蛋白，其中所述方法包括引入靶向性核酸酶序列和融合蛋白，其中所述靶向核酸序列与重组酶形成细丝用于特异性结合所述染色体位点。29.23的方法，其中所述重组酶融合蛋白包括重组酶和Gal4。30.23的方法，进一步包括将核酸引入生物体中，其中所述核酸在双链断裂的位点或第一断裂和第二断裂之间的位点引入所述生物体的基因组。例如，同源性依赖的修复(HDR)可以是用于引入的机制，例如，使用基于oligo的HDR。31.23的方法，其中所述细胞选自下组：体外细胞，体外原代细胞，合子，卵母细胞，配子发生细胞，精子细胞，卵母细胞，干细胞，和合子。32.31的方法，其中所述细胞是合子或胚胎，并包括将所述合子植入代孕母亲中。33.31的方法，包括克隆所述细胞。34.33的方法，其中使用选自下组的方法进行克隆所述细胞：体细胞核转移和染色质转移。35.23的方法，进一步包括向所述细胞中引入核酸模板，其中所述模板具有与通过断裂产生的末端基本同源的末端。此外，所述模板可以引导HDR。36.23的方法，其中所述试剂作为核酸引入并由所述细胞转录来制造所述试剂。37.23的方法，其中所述动物选自下组：非人脊椎动物，非人灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，鸡，鸟类，兔，山羊，狗，猫，实验室动物和鱼。38.23的方法，其中对所述基因的破坏在可诱导系统的控制下。39.23的方法，其中被破坏的基因选自下组：DAZL，vasa，CatSper，KCNU1，DNAH8，PIWIL4(MIWI2)，PIWIL2(MIWI)和睾丸表达基因11(Tex11)。40.体外细胞，其包括特异性结合所述细胞的染色体靶位点并导致双链断裂以破坏基因来选择性破坏配子发生的试剂，其中所述试剂选自下组：靶向性核酸内切酶，RNA引导核酸酶，重组酶融合蛋白。41.40的细胞，其中所述试剂是TALEN或TALEN对，其包含特异性结合染色体靶位点的序列，并在所述基因中创建双链断裂，或与创建第二双链断裂的其它TALEN组合在染色体中创建双链断裂，其中至少部分所述基因置于所述第一断裂和第二断裂之间。另外，40的细胞其中所述试剂包括靶向性核酸酶并选自下组：锌指核酸酶，Tal-效应器核酸酶，RNA引导核酸酶(例如，CRISPR/Cas9)，大范围核酸酶。42.41的细胞，其中所述染色体是Y染色体。43.经遗传修饰的动物，包括对Y染色体的基因组修饰，其中所述修饰包括插入，删除，或取代所述染色体的一个或多个碱基。例如其中所述动物选自下组：非人脊椎动物，非人灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，鸡，鸟类，兔，山羊，猫，实验室动物，和鱼。44.43的动物，其中在Y染色体的基因处建立所述修饰。45.43的动物，其中所述修饰包括插入编码因子的外源核酸，所述因子使得包含Y染色体的配子失能。46.43的动物，其中所述外源核酸表达选自下组的因子：干扰RNA，靶向性核酸酶，和显性阴性体。47.43的动物，其中所述外源核酸表达选自下组的因子：凋亡因子和核酸内切酶。48.43的家畜动物，其中所述外源核酸的表达在可诱导系统的控制下。49.经遗传修饰的动物，所述动物包括染色体上的外源基因，所述基因在配子发生中选择性活化的基因表达元件的控制下。例如其中所述动物选自下组：非人脊椎动物，非人灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，鸡，鸟类，兔，山羊，犬，猫，实验室动物，和鱼。50.49的动物，其中所述染色体是Y染色体。51.49的动物，其中所述外源基因包括编码核酸酶。另外，50的动物其中所述核酸酶是靶向性核酸酶。52.另外，所述动物其中所述靶向性核酸酶选自下组：TALEN，锌指核酸酶，大范围核酸酶，或CRISPR/Cas9。另外，其中所述靶向性核酸酶特异性结合并剪切靶基因。
53.51的动物，其中所述靶基因是下组的成员：DAZL，vasa，CatSper，KCNU1，DNAH8，PIWIL4，PIWIL2和睾丸表达基因11(Tex11)。54.49的动物，其中所述基因表达元件包括启动子，例如，细胞周期蛋白A1启动子，或基因表达元件。可以使用microRNA位点。55.49的动物，其中所述基因表达元件是精子发生选择性的并选自下组：SP-10启动子，Stra8启动子，C-Kit，ACE，和鱼精蛋白。56.49的动物，其中所述基因表达元件是卵子发生选择性的并选自下组：
Nobox,Oct4,Bmpl5,Gdf9,卵生蛋白(Oogenesin)1和卵生蛋白2。57.49的动物，其中所述外源基因使对于雄性后代的产生选择性必需的基因失活，且所述动物的有性生殖仅产生雌性后代。58.49的动物，其中所述外源基因使对于雌性后代的产生选择性必需的基因失活，且所述动物的有性生殖仅产生雄性后代。59.49的动物，其中所述外源基因表达对于细胞致命的因子，从而破坏仅雄性或仅雌性配子。60.59的动物，其中所述因子包括凋亡因子或毒性基因产物。61.59的动物，其中所述因子是凋亡性的且所述外源基因选自下组：FAS，BAX，CASP3和SPATA17。62.59的动物，其中所述因子是毒性的且所述基因选自下组：TOXIN基因，Barnase，白喉毒素A，胸苷激酶，和蓖麻毒素。63.59的动物，其中所述因子包括核酸内切酶。
64.63的动物，其中所述核酸(内切)酶是广谱核酸酶用于一般降解RNA和/或DNA，或否则有用于破坏一般的细胞活性，例如，DICER。65.49的动物，其为遗传不育的雄性或雌性，其中所述外源基因表达干扰第二基因的因子，所述第二基因分别对于精子发生或卵子发生是选择性的，从而阻止所述动物的成功有性生殖。66.65的动物，其中所述因子选自下组：靶向性核酸酶，例如TALEN，干扰RNA，和显性阴性体。67.65的动物，其中干扰所述第二基因选择性抑制精子运动性，精子顶体融合，或精子融合生殖和/或65的动物，其中所述外源基因包括精子动力蛋白干扰蛋白(SDIP)。68.经遗传修饰的动物，包括遗传不育的雄性家畜动物，其产生功能性供体精子而不产生功能性天然(native)精子。例如，其中所述动物选自下组：非人脊椎动物，非人灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，鸡，鸟类，兔，山羊，犬，猫，实验室动物，和鱼。
69.68的动物，其中所述动物有性生殖所述供体的后代。70.68的动物，其中所述供体的基因组进一步包括选自下组的性状：生产性状，类型性状，可加工性(workability)性状，生育力性状，育儿性状，和疾病抗性性状。71.牧群，包括复数个68的动物。72.71的牧群，其中所述动物的供体精细胞携带基因型相同的染色体(或者：携带相同的生殖质)。73.经遗传修饰的动物，所述动物包括染色体上的外源基因，所述基因表达控制所述动物后代性别的因子，其中所述动物产生仅一种性别的后代。例如其中所述动物选自下组：非人脊椎动物，非人灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，鸡，鸟类，兔，山羊，犬，猫，实验室动物，和鱼。74.73的动物，其中所述染色体是Y染色体。75.74的动物，其中所述外源基因表达对于细胞致命的因子，从而破坏仅雄性或仅雌性配子或胚胎。76.75的动物，其中所述外源基因包括编码核酸酶。77.76的动物，其中所述核酸酶是广谱核酸酶用于一般降解RNA和/或DNA，或否则有用于破坏一般的细胞活性，例如，DICER。78.76的动物，其中所述核酸酶是靶向性核酸内切酶。79.75的动物，其中所述因子包括凋亡因子或毒性基因产物。80.77的动物，其中所述因子是凋亡性的且所述外源基因选自下组：FAS，BAX，CASP3和SPATA17。81.79的动物，其中所述因子是毒性的且所述基因选自下组：TOXIN基因，Barnase，白喉毒素A，胸苷激酶，和蓖麻毒素。82.75的动物，其中所述外源基因编码因子和microRNA的融合物。83.73的动物，其中所述因子包含靶向性核酸酶，其特异性结合并剪切染色体的靶序列。84.83的动物，其中所述靶向性核酸酶选自下组：TALEN，锌指核酸酶，引导RNA靶向性核酸酶，RecA融合蛋白，大范围核酸酶。85.73的动物，其中所述因子选自下组：靶向性核酸内切酶，例如，TALEN，干扰RNA，和显性阴性体。
86.83的动物，其中所述外源基因使对于雄性后代的产生选择性必需的基因失活，且所述动物的有性生殖仅产生雌性后代。例如，可以破坏SRY或MIS(Mullerian抑制物质)的基因。