一种特异性定量检测口蹄疫O型广西株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用专利检索-蹄叉角动物学专利检索查询-专利查询网

一种特异性定量检测口 蹄疫O型广西株抗原的酶联免疫 试剂盒及其应用

阅读：456发布：2020-05-17

专利汇可以提供一种特异性定量检测口蹄疫O型广西株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种特异性定量测定口蹄疫 O型广西株(O/GX/09-7株) 抗原的酶联免疫试剂盒及其应用。该试剂盒是采用O/GX/09-7株特异性单克隆抗体制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，通过检测酶催化底物产生的信号变化来定量检测标本中O/GX/09-7株抗原的含量。利用本发明试剂盒的检测与目前口蹄疫疫苗其它毒株如O/Mya98/XJ/2010株、O/Mya98/BY/2010、O/JMS/2000、OZK/93毒株、亚洲1型JSL/06、A型A/WH/09不发生交叉干扰，能够简便、快速、灵敏、稳定地检测口蹄疫O型广西株抗原含量以及特异区分口蹄疫O型广西株与其它毒株。，下面是一种特异性定量检测口蹄疫O型广西株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种特异性定量测定口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的酶联免疫试剂盒，包括口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的一株特异性单克隆抗体作为捕获抗体制成的包被酶标板。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)146S抗原另外一株特异性单克隆抗体作为检测抗体经酶标记制成的酶标记抗体；所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶等，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体上。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的阳性质控品，可选择各疫苗厂生产的口蹄疫O型广西株
(O/GX/09-7株)146S抗原纯化灭活液，优选的是金宇保灵生物药品有限公司生产的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)146S抗原纯化灭活液；所述阳性质控品的原料为标准级，纯度不低于80％，使用时稀释至8-64ng/mL。
4.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还可包括检测用的样品稀释液、洗涤液、显色底物液、终止液及说明书；
所述样品稀释液的配方为：Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaH2PO4·2H2O 0.296g，NaCl 8.5g，Proclin 3000.6mL，酪蛋白10g，新生牛血清50mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至
7.2-7.4；
所述洗涤液的配方为：Na2HPO4·12H2O 58g，NaH2PO4·2H2O 5.92g，NaCl 170g，Tween-201.0mL，Proclin 3000.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4；使用洗涤液前用双蒸水稀释20倍；
所述显色底物液的配方为：
1)辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物液包含A液和B液，其中，显色底物A液的配方为：三水合乙酸钠8.2g、冰醋酸1.2mL、浓度为30％的过氧化氢0.27mL，用双蒸水定溶至
1000mL，调整pH值至5.0-5.6；
显色底物B液的配方为：柠檬酸1.92g，乙二胺四乙酸钠0.372g，10mol/L氢氧化钠溶液0.3mL，甘油50mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.23g，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至
2.5-3.5；
使用前将A液与B液按1：1比例混合；
2)碱性磷酸酶(ALP)的显色底物液配方为：pNPP 1g，二乙醇胺100mL，无水氯化镁
47.5mg，双蒸水900mL，pH9.8；
所述终止液的配方为：辣根过氧化物酶的终止液为：1000mL双蒸水中含有浓度为98％的硫酸27.8mL；碱性磷酸酶的终止液为：1000mL双蒸水中含有53g的碳酸钠。
5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)通过2-DE电泳获得口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)特异性抗原片段的特异性蛋白条带，分子量大约在20-30KDa，优选其中5个丰度比较高的蛋白条带干燥、研碎后作为免疫原使用；
2)用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)特异性抗原片段作为免疫原免疫动物；连续免疫4次，每次间隔14天，前3次采用多点皮下免疫方式，第4次采取腹腔注射的免疫方式，每次10μg/只动物；
3)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞上清用间接ELISA方法筛选特异性阳性克隆；
4)培养杂交瘤细胞；从细胞培养液或接种杂交瘤细胞动物的腹水液中分离并纯化出口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述步骤2)中用于制备单克隆抗体的免疫动物可为Balb/C小鼠、Lou/C大鼠、兔等哺乳动物，优选为Balb/C小鼠；
所述步骤3)中当被免疫动物的血清抗体水平超过1:50000时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤；
所述步骤4)中可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体的杂交瘤，从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体。
7.一种用权利要求1-6任一所述试剂盒及ELISA法定量测定口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原浓度的方法，用于疫苗生产过程中的质量控制，包括如下步骤:
1)准备标准品、阳性质控品和待测样品；
2)加阳性质控品、待测样品或已知浓度的标准品，洗板；
3)加酶标抗体，洗板；
4)加底物显色；
5)终止反应；
6)测定OD值；
7)分析结果，得到口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)水平。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1)用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)纯化后146S抗原及试剂盒提供的样品稀释液配制标准品，标准品浓度为：0、2、4、8、16、32、64ng/mL，待检样品同样用样品稀释液稀释成
4-8个梯度；
2)取出所需要的板条，剩余的板条装入自封袋中，置于2-8℃保存备用；
3)分别向孔中加入100μL标准品系列稀释点、阳性质控、待检样品系列稀释点，轻轻振动10-20秒混匀，贴上板贴；
4)置于37℃温箱中温育60分钟，扣除孔中液体，并用洗涤液(用前稀释20倍)洗涤
5-7次，在干净的纸巾或毛巾上拍干，尽量去除残留的水分；
5)每孔中加入100μl的酶标记物，轻轻振动10-20秒混匀，贴上板贴；
6)置于37℃温箱中温育30分钟，扣除孔中液体，并用洗涤液洗涤5-7次，在干净的纸巾或毛巾上拍干，尽量去除残留的水分；
7)每孔加入显色底物液(辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物液(A液、B液各1滴)或碱性磷酸酶(ALP)的显色底物液(2滴))，轻轻振动10-20秒，置于37℃避光反应15分钟，每孔加入1滴终止液(辣根过氧化物酶(HRP)的终止液或碱性磷酸酶(ALP)的终止液(1滴))，轻轻振动几次混匀，使溶液完全变为黄色液体，在30分钟内，测量吸光度(OD)(辣根过氧化物酶(HRP)的以630nm为参考波长，测量450nm处的吸光度，碱性磷酸酶(ALP)测量
405nm的吸光度)
8)分析结果，计算口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原的浓度。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中待测样品为疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液和破乳后的成品疫苗等。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于：所述步骤8)中的结果分析方法可为：分别对标准品浓度和对应OD吸光度值取对数，在双对数坐标图上建立标准曲线，以标准品浓度为横坐标，OD吸光度值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测标本吸光度值在标准曲线上查出样品中口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原的浓度，多个稀释度计算平均值。

说明书全文

一种特异性定量检测口 蹄疫O型广西株抗原的酶联免疫试

剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于酶联免疫检测分析技术领域，具体涉及一种特异性定量测定口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原的酶联免疫试剂盒，适用于口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原的特异、快速、准确检测分析。

背景技术

[0002] 口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，该病毒有7个血清型，各型之间无交叉保护反应。目前国内主要流行的是O型、亚洲1型(如JSL/06株)和A型(A/WH/09株)。其中，O型包括多个毒株，分别是新疆株(O/Mya98/XJ/2010株)、佳木斯株(O/JMS/2000株)、缅甸98株(O/Mya98/BY/2010株)、OZK株(OZK/93株)等。广西株(O/GX/09-7株)也是O型中的一种，在国内广泛流行。快速、准确、特异的检测口蹄疫O型广西株抗原(O/GX/09-7株)有助于疾病的诊断以及疫苗生产质量控制。

[0003] 目前，测定口蹄疫抗原146S的方法主要有密度梯度离心法。但是，密度梯度离心法操作复杂，需要3天的时间，且每台超速离心机每次只能检测5份样品，同时不能进行血清型的区分。目前，国内口蹄疫疫苗大多为多价苗，这意味着该疫苗中含有多种毒株或血清型，比如金宇保灵生物药品有限公司生产的猪口蹄疫O型灭活疫苗含有2种O型抗原，分别是新疆株(O/Mya98/Xj/2010株)和广西株(O/GX/09-7株)。每种抗原的准确定量是保证疫苗安全、有效的一个重要手段。现有密度梯度离心法无法区分不同的口蹄疫血清型，更不能区分同一血清型的不同毒株。从而，需要人们寻找一种更为特异、灵敏和可靠的检测分析方法能够有效区分不同的血清型和毒株。

[0004] 免疫测定(Immunoassay)于上个世纪70年代问世，是通过利用特异性强的抗原抗体反应发展起来的一项具有高灵敏度、高特异性并且快速的分析方法。目前，市场上主流的免疫测定技术主要包括酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)和化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay，CLIA))以及胶体金免疫纸层析等。目前，这些方法已经被广泛应用于临床检测，包括传染病、肿瘤以及激素等项目上。ELISA技术的灵敏度通常可达到ng/mL甚至pg/mL的水平，一般可在30分钟至2小时内完成对近百份样品的检测，且不需要特殊的仪器设备，完全可以满足口蹄疫146S抗原检测的需要。目前，市场上偶见能够检测口蹄疫抗原的酶联免疫检测试剂盒，但是大都采用了多克隆抗体制成，比如中国农业科学院兰州兽医研究所开发、生产的O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒，该试剂盒已经申报专利(专利号CN103076451A)，专利宣称这个试剂盒采用了O型口蹄疫的兔抗血清和豚鼠抗血清两种多克隆抗体制成，能够将O型与A型、亚洲
1型区分开，但是无法区分O型的不同毒株，比如金宇保灵生物药品有限公司生产的猪口蹄疫O型灭活疫苗中的新疆株(O/Mya98/XJ/2010株)和广西株(O/GX/09-7株)，因而就无法对该疫苗中的每种口蹄疫146S抗原进行单独定量，其主要的原因就在于多克隆抗体针对多种抗原表位，而不同的血清型尤其是同一血清型的不同毒株之间可能会存在相同的抗原表位。

[0005] 1975年，分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上创建了单克隆抗体制备技术(杂交瘤技术)，通过这种技术可以获得针对某特定抗原表位的抗体，并大量制备。时至今日，该技术已经非常成熟，并在不同的领域得到广泛的应用。由于不同血清型的口蹄疫146S抗原的基因序列同源性较高，尤其是同一血清型不同毒株间的同源性非常之高，同源性可超过85％，可能只有少数几个或者几十个氨基酸序列的差异。因此，用病毒直接免疫制备单克隆抗体，并从中筛选获得针对特定血清型、尤其是同一血清型不同毒株的特异性抗体就变得非常困难。因此，如何快速、准确地找到口蹄疫病毒不同血清型、不同毒株之间有差别的抗原表位(蛋白或者多肽)，并以此制备特异性单克隆抗体成为开发区分不同血清型、甚至区分同一血清型的不同毒株的口蹄疫146S抗原ELISA试剂盒首要解决的问题。

发明内容

[0006] 首先，本发明提供了一种特异性的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原酶联免疫定量测定试剂盒。

[0007] 本发明所提供的试剂盒，包括用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的一株特异性单克隆抗体作为捕获抗体制成的包被酶标板。

[0008] 所述试剂盒还可包括用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的另外一株特异性单克隆抗体作为检测抗体制成的酶标记抗体。

[0009] 所述检测抗体可用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶等酶标记制成酶标记抗体，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在检测抗体上。

[0010] 为方便结果观察，所述试剂盒还包括口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)阳性质控品，具体可为口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)146S抗原纯化灭活液，用样品稀释液稀释为8-64ng/mL的水平，可选择各疫苗厂生产的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)146S抗原纯化灭活液，优选的是金宇保灵生物药品有限公司生产的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)146S抗原纯化灭活液；所述阳性质控品的原料为标准级，纯度不低于80％。

[0011] 为方便使用，所述试剂盒还可包括检测用的样品稀释液、洗涤液、显色底物液、终止液和说明书。

[0012] 在上述试剂盒中，样品稀释液的配方为：Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaH2PO4·2H2O0.296g，NaCl 8.5g，Proclin 3000.6mL，酪蛋白10g，新生牛血清50mL，用双蒸水定溶至
1000mL，调整pH值至7.2-7.4。

[0013] 洗涤液的配方为：Na2HPO4·12H2O 58g，NaH2PO4·2H2O 5.92g，NaCl 170g，Tween-201.0mL，Proclin 3000.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4；使用洗涤液时用双蒸水稀释20倍。

[0014] 显色底物液的配方：

[0015] 1、辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物液

[0016] 显色底物液包含A液和B液，其中，显色底物A液的配方为：三水合乙酸钠8.2g,冰醋酸1.2mL，浓度为30％的过氧化氢0.27mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至5.0-5.6；

[0017] 显色底物B液的配方为：柠檬酸1.92g，乙二胺四乙酸钠0.372g，10mol/L氢氧化钠溶液0.3mL，甘油50mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.23g，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至2.5-3.5。

[0018] 使用前将A液与B液按1：1等比例混合。该显色底物液反应后需用终止液终止，然后才可以上机检测。

[0019] 终止液：浓度为98％的硫酸27.8mL，用双蒸水定溶至1000mL。

[0020] 2、碱性磷酸酶(ALP)的显色底物液

[0021] 配方为：pNPP 1g，二乙醇胺100mL，无水氯化镁47.5mg，双蒸水900mL，pH9.8。

[0022] 该显色底物液反应后需要终止液终止，终止液：53g 碳酸钠，双蒸水1000mL。

[0023] 按照本领域已知的常规方法制备本发明口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体。具体来讲，本发明口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体的制备方法，可包括以下步骤：

[0024] 1)通过2-DE电泳获得口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)特异性抗原片段的特异性蛋白条带，分子量大约在20-30KDa，优选其中5个丰度比较高的蛋白条带干燥、研碎后作为免疫原使用；

[0025] 2)用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)特异性抗原片段作为免疫原免疫动物；连续免疫4次，每次间隔14天，前3次采用多点皮下免疫方式，第4次采取腹腔注射的免疫方式，每次10μg/只动物；

[0026] 3)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞上清用间接ELISA方法筛选特异性阳性克隆；

[0027] 4)培养杂交瘤细胞；从细胞培养液或接种杂交瘤细胞动物的腹水液中分离并纯化出口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体。

[0028] 在上述单克隆抗体的制备方法中，步骤2)中用于制备单克隆抗体的免疫动物可为Balb/c小鼠、LOU/c大鼠及兔等哺乳动物，优选Balb/c小鼠。

[0029] 步骤3)中当被免疫动物的血清抗体水平超过1:50000时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤，然后，在HAT培养基中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用间接ELISA方法等方法鉴定所需的特异性抗体细胞株。

[0030] 步骤4)中可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体的杂交瘤，从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体。

[0031] 本发明还提供了一种用上述ELISA试剂盒定量测定口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原的方法，包括如下步骤:

[0032] 1)准备标准品、阳性质控品和待测样品；

[0033] 2)加阳性质控品、待测样品或已知浓度的标准品，反应后洗板；

[0034] 3)加酶标抗体，反应后洗板；

[0035] 4)加底物显色；

[0036] 5)终止反应；

[0037] 6)测定OD值；

[0038] 7)分析结果，得到口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)水平。

[0039] 具体来讲，所述检测方法可包括如下步骤:

[0040] 1)用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)纯化后146S抗原及试剂盒提供的样品稀释液配制标准品，标准品浓度为：0、2、4、8、16、32、64ng/mL，待检样品同样用样品稀释液稀释成4-8个梯度；

[0041] 2)取出所需要的板条，剩余的板条装入自封袋中，置于2-8℃保存备用；

[0042] 3)分别向孔中加入100μL标准品系列稀释点、阳性质控、待检样品系列稀释点，轻轻振动10-20秒混匀，贴上板贴；

[0043] 4)置于37℃温箱中温育60分钟，扣除孔中液体，并用洗涤液(用前稀释20倍)洗涤5-7次，在干净的纸巾或毛巾上拍干，尽量去除残留的水分；

[0044] 5)每孔中加入100μL的酶标记物，轻轻振动10-20秒混匀，贴上板贴；

[0045] 6)置于37℃温箱中温育30分钟，扣除孔中液体，并用洗涤液洗涤5-7次，在干净的纸巾或毛巾上拍干，尽量去除残留的水分；

[0046] 7)每孔加入显色底物液(辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物液(A液、B液各1滴)或碱性磷酸酶(ALP)的显色底物液(2滴))，轻轻振动10-20秒，置于37℃避光反应15分钟，每孔加入1滴终止液(辣根过氧化物酶(HRP)的终止液或碱性磷酸酶(ALP)的终止液(1滴))，轻轻振动几次混匀，使溶液完全变为黄色液体，在30分钟内，测量吸光度(OD)(辣根过氧化物酶(HRP)的以630nm为参考波长，测量450nm处的吸光度，碱性磷酸酶(ALP)测量405nm的吸光度)；

[0047] 8)分析结果，计算口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原的浓度。

[0048] 在上述检测方法中，步骤1)中待测样品的选择可以是多样的，如对于口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)感染者，可为来自感染者的活检物、组织切片等，也可为疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液和破乳后的成品疫苗等。

[0049] 步骤8)中的结果分析方法可为：分别对标准品浓度和对应OD吸光度值取对数，在双对数坐标图上建立标准曲线，以标准品浓度为横坐标、OD吸光度值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测标本吸光度值在标准曲线上查出样品中口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原的浓度，多个稀释度计算平均值。

[0050] 本发明提供了一个特异性定量测定口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒是采用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)特异性单克隆抗体制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，通过检测酶催化底物产生的信号变化来定量检测标本中口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原的含量，且与口蹄疫其它毒株，如新疆株(O/Mya98/XJ/2010株)、缅甸98株(O/Mya98/BY/2010)、佳木斯株(O/JMS/2000)、OZK株(OZK/93株)、亚洲1型(JSL/06)和A型(A/WH/09)等毒株无交叉反应，不发生交叉干扰。

[0051] 本发明较现有相关技术具有以下优点：

[0052] 1)本发明应用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)高度特异性的单克隆抗体制成双抗体夹心ELISA检测试剂盒，以四甲基联苯胺或pNPP为底物，检测相应的信号变化，通过双对数数学模型计算待测样品的浓度，其灵敏度达到1.2ng/mL的水平，远远高于密度梯度离心和动物实验方法，并且2个小时内最多可以检测90份样品的检测速度大大缩短了检测周期(蔗糖密度梯度离心法每台超速离心机通常3天检测5份样品)且不需要昂贵的仪器设备，为口蹄疫疾病的控制以及广西株(O/GX/09-7株)疫苗生产的质量控制提供了更有效的方法。

[0053] 2)本试剂盒中包被酶标板是用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)高度特异性的单克隆抗体制成，不仅可用于口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)与亚洲1型、A型的区分，也可以用于广西株(O/GX/09-7株)与O型其它的毒株的区分，如新疆株(O/Mya98/XJ/2010株)、缅甸98株(O/Mya98/BY/2010)、佳木斯株(O/JMS/2000)、OZK株(OZK/93株)，特别适合类似金宇保灵生物药品有限公司生产的猪口蹄疫O型灭活疫苗中广西株(O/GX/09-7株)的单独定量检测，这是采用多克隆抗体研制的试剂盒所不能解决的。

[0054] 3)与采用多克隆抗体研制的试剂盒相比，由于本试剂盒完全采用了单克隆抗体，因此能够大量、稳定地制备，重复性好。不同批次的多克隆抗体由于宿主个体的差异，会导致每批的多克隆抗体在亲和力和特异性上存在差异。

[0055] 综上所述，本发明克服了以往检测方法的缺陷，即大大提高了检测方法的灵敏度、又简化了操作步骤并节省了操作时间，是一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原含量以及特异区分口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)与其它毒株(O/Mya98/XJ/2010株、O/Mya98/BY/2010、O/JMS/2000、OZK/93毒株、亚洲1型JSL/06和A型A/WH/09等)的试剂盒，具有简便、快速、准确度高、灵敏度高、特异性高、稳定性好、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，可应用于疾病或者疫情的监控与检测，也可用于口蹄疫疫苗各生产环节的质量控制等。

[0056] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图说明

[0057] 图1为特异性定量测定口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的酶联免疫检测方法的标准曲线的线性图。

具体实施方式

[0058] 蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组(Genome)或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(protein)。双向凝胶电泳技术(2-DE)是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法。2-DE技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将一个基因组内的各种蛋白质区分开来，并通过软件比对不同血清型或者不同毒株的电泳图谱可以很容易地找到它们有差异的蛋白。发明人基于对大量生物技术的比较研究，确认2-DE技术能为口蹄疫病毒146S抗原各血清型或者各毒株之间寻找到有差异的抗原表位提供可靠的技术手段。

[0059] 因此，本发明首先选采用2-DE技术寻找到口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)146S抗原有差异的蛋白，并采用经典的杂交瘤技术制备口蹄疫O型广西株特异性的抗体，进而开发了一种能够特异性检测口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的ELISA检测试剂盒。该试剂盒由于采用了特异性更高的单克隆抗体，不仅能够将口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)与亚洲1型(JSL/06)、A型(A/WH/09)区分开，更能够将O型广西株(O/GX/09-7株)与O型的其它毒株区分开，比如新疆株(O/Mya98/XJ/2010株)、缅甸98株(O/Mya98/BY/2010)、佳木斯株(O/JMS/2000)、OZK株(OZK/93株)。这就为口蹄疫单价或者多价联合疫苗中O型广西株(O/GX/09-7株)的单独定量提供了可能。

[0060] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

[0061] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

[0062] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

[0063] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0064] 实施例1、制备口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的酶联免疫定量测定试剂盒[0065] 一、制备口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体

[0066] 制备口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体，具体方法包括以下步骤：

[0067] 1、制备口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)特异性抗原

[0068] 取纯化浓缩后的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)纯化抗原(由金宇保灵生物药品有限公司提供的商品)，浓度大于100μg/mL，进行2-DE电泳，方法如下：

[0069] 第一向等电聚焦，具体操作步骤：1)从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(Urea 480mg/mL，CHAPS 20mg/mL，IPG Buffer 5μl/mL，DTT 2.8mg/mL，痕量溴酚蓝),置室温溶解。2)从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。3)沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。4)当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。5)分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。6)在每根胶条上覆盖2-3mL矿物油，防止等电聚焦过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。7)对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序，程序见表1。

[0070] 表1制备型2-DE的等电聚焦参数的选择(18cmIPG胶条)

[0071]

[0072] 平衡：将等电聚焦后的IPG 胶条放入 20mL平衡液 (1.5M Tris-HCl1.34mL,Urea14.14g,Glycerol 12mL,SDS 0.8g,痕量溴酚蓝)中，于摇床上振荡15分钟×2。其中，第一次平衡时，于20mL平衡液中加入100mg DTT；而第二次平衡时，于20mL平衡液中加入0.9g碘乙酰胺。

[0073] 第二向SDS-PAGE，具体操作步骤：1)配制10％的丙烯酰胺凝胶。2)将平衡后的IPG胶条用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)，然后用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液(Tris-Glycine-SDS，Tris6.04g,甘氨酸28.8g,SDS 2g溶于2000mL水)中。3)将IPG胶条移至聚丙烯酰胺凝胶的上方，用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。4)最后，用0.8％的琼脂糖封闭固定，放置
5min，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。5)在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流,待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。6)电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴手套，防止污染胶面)。7)染色。

[0074] 将染色后的凝胶放在GS-710光密度扫描仪上，扫描后的图像用PDQUEST 2D软件(商用软件)分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行比较。最终选择5个高丰度的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)特异性抗原条带，分子量大约在20-30KDa，干燥、研碎后作为免疫原使用。

[0075] 2、制备分泌口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞并获得纯化抗体

[0076] 包括以下步骤：

[0077] 1)用步骤1获得的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)特异性抗原作为免疫原免疫Balb/C小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，共免疫4次，时间间隔14天，前3次免疫方式为多点皮下免疫，最后一次为腹腔注射免疫，每只小鼠注射10μg。

[0078] 2)免疫4次后，取小鼠尾血测定效价，当效价大于5万后，分离免疫动物的脾细胞，将其与生长状态良好的骨髓瘤S/P20细胞融合，用HAT选择性培养基筛选获得杂交瘤细胞。

[0079] 3)用间接ELISA方法筛选特异性杂交瘤细胞克隆，最终获得3个特异性阳性克隆。

[0080] 用间接ELISA方法筛选特异性细胞克隆，具体操作步骤：取广西株(O/GX/09-7株)、新疆株(O/Mya98/XJ/2010株)、缅甸98株(O/Mya98/BY/2010)、佳木斯株(O/JMS/2000)、OZK株(OZK/93)、亚洲1型(JSL/06)和A型(A/WH/09)等毒株146S抗原纯化灭活液，用10mM PBS pH7.2-7.4(Na2HPO4·12H2O，2.9g；NaH2PO4·2H2O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.2-7.4)分别稀释成2.5μg/mL的包被工作液，用多道加样器分别加入到96孔COSTAR酶标板中，每孔加入110μl，每种病毒抗原至少包被2块微孔板，置于2-8℃过夜(16-24小时)，取出微孔板弃去孔中液体，在吸水纸上拍干。用多道加样器向每孔中加入封闭缓冲液300μl(1000mL封闭液包括NaH2PO4·2H2O 0.296g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，酪蛋白10g，Proclin 3000.6mL，双蒸水定溶至1000mL，测定pH值为7.2-7.4)，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后进行封袋，置2-8℃保存备用。

[0081] 取细胞培养上清100μL加至包被有病毒抗原的酶标板中，37℃反应30分钟，用洗涤液(配方：Na2HPO4·12H2O 58g，NaH2PO4·2H2O 5.92g，NaCl 170g，Tween-201.0mL，Proclin3000.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4；使用洗涤液时用双蒸水稀释20倍。)洗板5次，然后每孔中加入浓度为1：2000的兔抗鼠IgG-HRP标记物(购自美国KPL公司)，其稀释液为酶标记抗体稀释液(三羟甲基氨基甲烷12.1g，氯化钠8.8g，BSA 10g，Proclin3001.0mL，食品红0.1g，用双蒸水定溶至1000mL，用6M盐酸调pH值至7.5。)，37℃反应30分钟，用洗涤液洗板5次，拍干后，向每孔中各加入底物A液(显色底物A液的配方为：三水合乙酸钠8.2g、冰醋酸1.2mL、浓度为30％的过氧化氢0.27mL，用双蒸水定溶至
1000mL，调整pH值至5.0-5.6。)和B液(显色底物B液的配方为：柠檬酸1.92g，乙二胺四乙酸钠0.372g，10mol/L氢氧化钠溶液0.3mL，甘油50mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.23g，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至2.5-3.5。)各1滴，室温避光反应15分钟。向每孔中加入终止液(1000mL中含有98％硫酸27.8mL)1滴。振荡10秒。以630nm为参考波长，测量450nm处的吸光度值。以吸光度值大于阴性对照(阴性对照为细胞培养液)的2.1倍为阳性判断标准。

[0082] 先用广西株(O/GX/09-7株)病毒146S抗原包被的微孔板筛选所有的培养上清，从中获得25株阳性克隆，然后用其余病毒包被的微孔板验证这25株阳性克隆的特异性，最后获得3株特异性细胞克隆，它们只与口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)有强烈的信号反应，而不与新疆株(O/Mya98/XJ/2010株)、缅甸98株(O/Mya98/BY/2010)、佳木斯株(O/JMS/2000)、OZK株(OZK/93)、亚洲1型(JSL/06)和A型(A/WH/09)等毒株反应。将这三株阳性克隆分别编号为7G3、2B5、6E1。

[0083] 4)培养杂交瘤细胞，从细胞培养液或接种杂交瘤细胞动物的腹水液中分离并纯化出口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体。

[0084] 腹水制备及特异性单克隆抗体的纯化方法为：取7G3、2B5和6E1这三个口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)特异性阳性克隆，待细胞长到培养瓶50-80％后离心收集细胞，注射经降植烷(购自Sigma)处理的Balb/c小鼠(注射细胞前7-10天，每只小鼠注射降植5 6
烷0.5mL，其目的是为了降低小鼠的免疫功能，提高抗体产量)，每只小鼠约注射10-10 个细胞。7-10天后收集腹水。用蛋白G亲和填料(购自GE公司，货号为17-0618-02)按照GE公司产品说明书亲和纯化方法纯化单克隆抗体。用紫外分光光度计测量280nm的吸光度值，用该吸光度值除以经验系数1.48，得到的结果为单克隆抗体的浓度，单位为mg/mL。7G3分泌的单克隆抗体浓度为2.16mg/mL，2B5分泌的单克隆抗体浓度为5.40mg/mL，6E1分泌的单克隆抗体浓度为1.52mg/mL。为便于下面实验的比较分析，不同的抗体克隆均用10mM PBS pH7.2-7.4(Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaH2PO4·2H2O 0.296g，NaCl 8.5g，Proclin 3000.6mL，双蒸水定溶至1000mL，调整pH至7.2-7.4)稀释为1.5mg/mL。

[0085] 3、纯化抗体的配对模式确认

[0086] 1)用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体制备包被微孔板[0087] 将纯化后的特异性单克隆抗体用10mM PBS pH7.2-7.4(Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaH2PO4·2H2O 0.296g，NaCl 8.5g，Proclin 3000.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH至7.2-7.4)稀释成1-10μg/mL的包被工作液，用多道加样器分别加入到96孔COSTAR酶标板中,每孔加入110μl，每种抗体至少包被2块微孔板。置于2-8℃过夜(16-24小时)。取出微孔板弃去孔中液体，在吸水纸上拍干。用多道加样器向每孔中加入封闭缓冲液300μl(1000mL封闭液包括NaH2PO4·2H2O0.296g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，酪蛋白10g，Proclin
3000.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，测定pH值为7.2-7.4)，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后进行真空封袋，置2-8℃保存备用。

[0088] 2)制备辣根过氧化物酶标记的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体

[0089] 将口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体用戊二醛氧化法与辣根过氧化物酶(HRP)偶联，用PBS充分透析，加等量优质丙三醇，-20℃以下保存。具体操作步骤如下：

[0090] ①将5mg HRP溶于0.2mL含1.25％戊二醛的0.1mol/L pH 6.8的PBS(配方：KH2PO46.805g，Na2HPO4·12H2O 17.9g，NaCl 8.5g，定容于1000mL双蒸水中，调整pH6.8)中，置室温18小时，充分透析除去多余戊二醛；

[0091] ②加生理盐水至1mL，然后加入2.5mg纯化的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体及0.1mL pH9.6的1mol/L碳酸盐缓冲液(配方：取1M碳酸钠3mL与1M碳酸氢钠7mL混合)，混合后于2-8℃冰箱放置24小时；

[0092] ③加入0.1mL 0.2mol/L的赖氨酸溶液(称赖氨酸29.2mg溶于0.01M pH9.5碳酸缓冲液1mL中)，室温放置2小时；

[0093] ④用pH7.20.15mol/L PBS(NaCl 8.5g，Na2HPO4·12H2O 2.89g，KH2PO40.2g，定容于1000mL,调整pH7.2)充分透析，通过离心除去沉淀，上清即为酶结合物。用酶标记物稀释液(三羟甲基氨基甲烷12.1g，氯化钠8.8g，BSA 10g，Proclin3001.0mL，食品红0.1g，用双蒸水定溶至1000mL，用6M盐酸调pH值至7.5)按照一定比例稀释即为酶标记物的工作液。

[0094] 3)三个特异性抗体之间配对验证

[0095] 采用棋盘滴定实验(参见李金明主编《临床酶免测定技术》)确定三株单克隆抗体的配对模式。

[0096] 选择2份样品，其中一份浓度为10ng/mL；另外一份浓度为2ng/mL。组合不同的抗体对实验，采取两步法：第一步加入样品，37℃反应60分钟；洗板5次后，加入酶标记物工作液，37℃反应30分钟。洗板后加入底物37℃显色15分钟，各加入终止液1滴终止反应。于酶标仪上，以630nm为参考波长，测量450nm处的吸光度值。用10ng/mL样品的吸光度除以2ng/mL的吸光度值得到系数b(见下表)。b值越大，表明检测的灵敏度越好。因此优选
7G3作为捕获抗体，2B5作为检测抗体使用；其次是2B5作为捕获抗体，6E1作为检测抗体。
处于经济性的原则，7G3作为捕获抗体可选择2.5μg/mL。

[0097]

[0098]

[0099] 二、用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体制备包被微孔板[0100] 将纯化后的特异性单克隆抗体用10mM PBS pH7.2-7.4(Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaH2PO4·2H2O 0.296g，NaCl 8.5g，Proclin 3000.6mL，双蒸水定溶至1000mL，调整pH至7.2-7.4)稀释成2.5μg/mL的包被工作液，用多道加样器分别加入到96孔COSTAR酶标板中，每孔加入110μl，于2-8℃过夜(16-24小时)。取出微孔板弃去孔中液体，在吸水纸上拍干。用多道加样器向每孔中加入封闭缓冲液300μl(1000mL封闭液包括NaH2PO4·2H2O
0.296g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，酪蛋白10g，Proclin 3000.6mL，双蒸水定溶至1000mL，测定pH值为7.2-7.4)，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后进行真空封袋，贴好标签，置2-8℃保存备用。

[0101] 三、制备酶标抗体及酶标抗体浓度的确定

[0102] 1、制备辣根过氧化物酶标记的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体

[0103] 将口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体用戊二醛氧化法与辣根过氧化物酶(HRP)偶联，用PBS充分透析，加等量优质丙三醇，－20℃以下保存。具体操作步骤如下：

[0104] 1)将5mg HRP溶于0.2mL含1.25％戊二醛的0.1mol/L pH 6.8的PBS(配方：KH2PO46.805g，Na2HPO4·12H2O 17.9g,NaCl 8.5g,定容于1000mL双蒸水中，调整平H6.8)中，置室温18小时，充分透析除去多余戊二醛；

[0105] 2)加生理盐水至1mL，然后加入2.5mg纯化的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体及0.1mL pH9.6的1mol/L碳酸盐缓冲液(取1M碳酸钠3mL与1M碳酸氢钠7mL混合)，混合后于2-8℃冰箱放置24小时；

[0106] 3)加入0.1mL 0.2mol/L的赖氨酸溶液(称赖氨酸29.2mg溶于0.01M pH9.5碳酸缓冲液1mL中)，室温放置2小时；

[0107] 4)用pH7.20.15mol/L PBS(NaCl 8.5g，Na2HPO4·12H2O 2.89g，KH2PO40.2g，定容于1000mL，调整pH7.2)充分透析，通过离心除去沉淀，上清即为酶结合物。

[0108] 2、改良的戊二醛交联法对口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体标记碱性磷酸酶(ALP)

[0109] 1)取ALP 2.0mg和口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的特异性单克隆抗体4.0mg，分别溶于生理盐水中，混合，最终体积控制在0.50mL；

[0110] 2)加入0.50mL 1％的戊二醛，室温磁力搅拌15分钟后，避光反应4小时；

[0111] 3)加入1.0mol/L的乙醇胺0.10mL，室温温育2小时；

[0112] 4)2-8℃条件下用PBS加磁力搅拌过夜(16-24小时)透析，更换透析液3-4次；

[0113] 5)将透析产物移入试剂瓶加入等体积甘油，混匀，加入1％BSA，密闭冷冻保存备用。

[0114] 3、配制酶标抗体稀释液

[0115] 配方：三羟甲基氨基甲烷12.1g，氯化钠8.8g，BSA 10g，Proclin3001.0mL，食品红0.1g，用双蒸水定溶至1000mL，用6M盐酸调pH值至7.5。

[0116] 4、采用棋盘滴定实验(参见李金明主编《临床酶免测定技术》)确定酶标抗体的工作浓度范围。

[0117] 选择2份样品，其中一份浓度为10ng/mL，另外一份浓度为2ng/mL。组合不同的抗体对实验，采取两步法：第一步加入样品，37℃反应60分钟；洗板五次后，加入酶标记物工作液，37℃反应30分钟。洗板后加入底物37℃显色15分钟，各加入终止液一滴终止反应。于酶标仪上，以630nm为参考波长，测量450nm处的吸光度值。用10ng/mL样品的吸光度除以2ng/mL的吸光度值得到系数b。选择系数b较大、本底OD值低于0.050且64ng/mL的广西株样品OD值大于2.0的稀释比例作为酶标记物工作液的稀释比例。

[0118] 按照该稀释比例配制酶标记物工作液，分装，每瓶10.5mL，贴好标签，置于2-8℃备用。

[0119] 三、制备口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)阳性质控品

[0120] 为方便结果观察，所述试剂盒还包括口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的阳性质控品，具体可为口蹄疫疫苗厂生产的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)146S抗原纯化灭活液，优选为金宇保灵生物药品有限公司生产的纯化灭活液。阳性质控品的原料为标准级，纯度不低于80％。用样品稀释液稀释口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)阳性质控品至8-64ng/mL，分装成每瓶1.0mL，贴好标签，置于-20℃保存备用。

[0121] 四、配制样品稀释液

[0122] 样品稀释液的配方为：Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaH2PO4·2H2O 0.296g，NaCl 8.5g，Proclin 3000.6mL，酪蛋白10g，新生牛血清50mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4。分装每瓶25mL，贴好标签，置于2-8℃备用。

[0123] 五、配制洗涤液

[0124] 洗涤液的配方为：Na2HPO4·12H2O 58g，NaH2PO4·2H2O 5.92g，NaCl 170g，Tween-201.0mL，Proclin 3000.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4；分装每瓶25mL，贴好标签，置于室温备用。

[0125] 六、配制显色底物液

[0126] 1、辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物液

[0127] 显色底物液包含A液、B液和终止液，其中，显色底物A液的配方为：三水合乙酸钠8.2g、冰醋酸1.2mL、浓度为30％的过氧化氢0.27mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至
5.0-5.6；

[0128] 显色底物B液的配方为：柠檬酸1.92g，乙二胺四乙酸钠0.372g，10mol/L氢氧化钠溶液0.3mL，甘油50mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.23g，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至2.5-3.5。

[0129] 使用前将A液与B液按1：1比例混合。

[0130] 分装每瓶7mL,贴好标签，置于2-8℃备用。其中A液用白色不透明塑料滴瓶；B液采用黑色或者棕色不透明塑料滴瓶；终止液采用无色透明塑料滴瓶。(购自深圳金灿华实业有限公司)。

[0131] 2、碱性磷酸酶(ALP)的显色底物液

[0132] 配方为：pNPP 1g，二乙醇胺100mL，无水氯化镁47.5mg，双蒸水900mL，pH9.8。

[0133] 分装每瓶12mL，贴好标签，置于2-8℃备用。

[0134] 七、配制终止液

[0135] 辣根过氧化物酶的终止液配方：每1000毫升双蒸水中加入27.8mL 98％的硫酸。

[0136] 碱性磷酸酶的终止液配方：每1000mL双蒸水中加入53g的碳酸钠。

[0137] 八、组装试剂盒

[0138] 将上述组分分装，随机抽取3份，经过各项方法学指标检定合格后，组装成口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的酶联免疫定量测定试剂盒(附使用说明书)。

[0139] 实施例2、口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的酶联免疫定量测定试剂盒的使用方法

[0140] 用本发明的试剂盒对样品进行检测包括以下步骤：

[0141] 1)用口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)146S的纯化灭活液及试剂盒提供的样品稀释液配制标准品，标准品浓度为：0、2、4、8、16、32、64ng/mL。待测样品同样用样品稀释液稀释4-8个梯度。

[0142] 2)取出所需要的板条，剩余的板条装入自封袋中，置于2-8℃保存。

[0143] 3)分别向孔中加入100μl标准品系列稀释点、阳性质控、标本系列稀释点。轻轻振动10-20秒混匀，贴上板贴。

[0144] 4)置于37℃温箱中温育60分钟。扣除孔中液体，并用洗液(用前20倍稀释)洗涤5-7次。在干净的纸巾或毛巾上拍干，尽量去除残留的水分。

[0145] 5)每孔中加入100μl的酶标记物，轻轻振动10-20秒混匀，贴上板贴。

[0146] 6)置于37℃温箱中温育30分钟。扣除孔中液体，并用洗液洗涤5-7次。在干净的纸巾或毛巾上拍干，尽量去除残留的水分。

[0147] 7)每孔加入显色底物液(辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物液(A液、B液各1滴)或碱性磷酸酶(ALP)的显色底物液(2滴))，轻轻振动10-20秒，置于37℃避光反应15分钟，每孔加入1滴终止液(辣根过氧化物酶(HRP)的终止液或碱性磷酸酶(ALP)的终止液(1滴))，轻轻振动几次混匀，使溶液完全变为黄色液体，在30分钟内，测量吸光度(OD)(辣根过氧化物酶(HRP)的以630nm为参考波长，测量450nm处的吸光度，碱性磷酸酶(ALP)测量405nm的吸光度)。

[0148] 8)分析结果：计算口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原的浓度。

[0149] 步骤8)中的结果分析方法可为：分别对标准品浓度和对应OD吸光度值取对数，在双对数坐标图上建立标准曲线，以标准品浓度为横坐标，OD吸光度值为纵坐标绘出标准曲线，如图1所示，以各待测标本吸光度值在标准曲线上查出样品中口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原的浓度。如果有多个稀释度，计算平均值。

[0150] 9)打印检测结果报告。

[0151] 以上检测过程约需耗时2小时，一次实验中最多可以检测近90份样品。

[0152] 试验例1、精密度实验

[0153] 一、分析内精密度

[0154] 用样品稀释液将口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)146S的纯化灭活液(由金宇保灵生物药品有限公司提供)配制低浓度(浓度为15ng/mL)、高浓度(浓度为50ng/mL)阳性质控品，用实施例1的试剂盒和实施例2的检测方法在同一批实验中测定它们的吸光度值，每个质控平行做10孔，计算本发明试剂盒的分析内精密度。

[0155] 结果如表2所示，可以看出本发明试剂盒的内精密度：CV％<15.0％，表明试剂盒检测结果重复性好，检测结果稳定、可靠。

[0156] 表2内精密度分析结果

[0157]

[0158] 二、分析间精密度

[0159] 同上，用样品稀释液配制低、高浓度质控品，分别于不同实验日测定它们的浓度值，连续5天，每次2个重复，共计10个结果，计算它们的分析间精密度，分析本发明试剂盒的分析间精密度。

[0160] 结果如表3所示，可以看出本发明试剂盒的分析间精密度：CV％<20％，表明即使在不同时间检测，结果重复性也很好，检测结果稳定、可靠。

[0161] 表3间精密度分析结果

[0162]

[0163] 试验例2、分析灵敏度实验

[0164] 取阴性对照(即试剂盒中的样品稀释液),设置10复孔，参照实施例2的检测方法进行测量，计算其平均值加上两倍标准差求的OD值所对应的浓度值即为本试剂盒的灵敏度，分别用三个批次试剂盒检测灵敏度，以其中的最大值作为本试剂盒的分析灵敏度。

[0165] 结果经3次实验测定，得出本试剂盒的灵敏度为1.2ng/mL，表明本发明的试剂盒检测灵敏度高，即使待测样品浓度低至1.2ng/mL的水平也可以检出。

[0166] 试验例3、准确性实验：

[0167] 加样回收实验：向1mL样品稀释液中分别加入已知浓度为100ng/mL的样品(金宇保灵生物药品有限公司生产的O/GX/09-7株146S灭活纯化液，其浓度为103.96μg/mL，用试剂盒中的样品稀释液稀释至100ng/mL)50μl、100μl、200μl、400μl，得到待测品，然后用同一批号的试剂盒对待测品中的O/GX/09-7株146S抗原浓度进行检测，其中部分试剂盒一直储存于2-8℃，还有部分试剂盒于37℃已经存放7天。

[0168] 结果如表4所示，表明理论浓度值与实测浓度值的偏倚不超过±10％，在不同剂量水平所做样品的回收率均符合检测要求(100±10％)。

[0169] 表4试剂盒准确性检测结果

[0170]

[0171] 试验例4、稳定性实验

[0172] 将本发明的试剂盒37℃放置3、7、10天，然后检测浓度为15、50ng/mL的阳性质控品，计算灵敏度(n＝10)、精密度(n＝10)、标准曲线的线性相关系数以及标准曲线中64ng/mL的OD值与0ng/mL的OD值的比值。

[0173] 结果如表5所示，可以看出试剂盒在37℃稳定性考核10天后，虽然变异系数(CV％)略有增加，但是仍然低于10％；低值质控和高值质控的测值基本无变化；灵敏度也无明显变化。表明试剂盒的稳定性可以满足需要，在试剂盒的有效期内性能基本不变。

[0174] 表537℃放置3天、7天和10天后的试剂盒的各项指标

[0175]

[0176] 试验例5、特异性及抗干扰能力实验

[0177] 将64ng/mL的口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)抗原(金宇保灵生物药品有限公司生产的浓度为103.96μg/mL的146S纯化灭活液，用试剂盒中的样品稀释液稀释而来)8mL分成8份各1mL，每份各加入1mL 5000ng/mL的BHK宿主蛋白(为O/GX/09-7株的宿主细胞蛋白)、5000ng/mL的口蹄疫新疆毒株抗原1mL(O/Mya98/XJ/2010株)、5000ng/mL的口蹄疫佳木斯毒株1mL(O/JMS/2000)、5000ng/mL的口蹄疫缅甸毒株抗原1mL(O/Mya98/BY/2010)、5000ng/mL的口蹄疫OZK毒株抗原1mL(OZK/93毒株)、5000ng/mL的口蹄疫亚洲1型毒株1mL(JSL/06)、5000ng/mL的口蹄疫A型毒株1mL(A/WH/09)及样品稀释液(做阴性对照)1mL得到待测样品，同时待测样品中的O/GX/09-7株146S抗原浓度进行检测。

[0178] 结果如表6所示，可以看出与理论值相比，不论是O型的其它毒株比如新疆株、缅甸98株、佳木斯株、OZK株，还是亚洲1型和A型，都不影响广西株(O/GX/09-7株)抗原的检测，表明本试剂盒所采用的抗体特异性非常高，完全可以用于分型(区分O型与亚洲1型和A型)，也可以区分同为O型的不同毒株(将O/GX/09-7株从O型的其它毒株中区分开)。

[0179] 表6试剂盒特异性检测结果(O/GX/09-7株146S抗原浓度ng/mL)

[0180]

[0181] 以上试验结果表明本发明口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的酶联免疫定量测定试剂盒的精密度、准确性、灵敏度、稳定性和特异性是完全符合要求的。

[0182] 实施例3、使用本发明口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)的酶联免疫试剂盒定量测定试剂检测样品

[0183] 用实施例1的试剂盒及实施例2的使用方法检测口蹄疫O型广西株(O/GX/09-7株)不同生产阶段的样品和成品疫苗中O/GX/09-7株146S抗原浓度(质控目的)。这些样品均来自金宇保灵生物药品有限公司。其中序号为5、6、7的三个成品疫苗按照如下方法破乳后检测：在100mL疫苗加入20mL的正戊醇，搅拌1分钟后静止30分钟，使其上下分层，取水相检测。

[0184] 结果如表7所示，可以看出：该试剂盒不仅可以检测培养液、灭活液、纯化液和浓缩液，也可以检测各种成品疫苗。也就是说，在口蹄疫灭活疫苗生产的各个环节都可以采用本试剂盒来检测用于质量控制和监测。其中含有O/GX/09-7株的都可以检出，不含有O/GX/09-7株即使含有口蹄疫O型的其它毒株也检不出。表明该试剂盒不仅可以分型(区分O型与亚洲1型、A型)，也可以区分O型的不同毒株。进一步揭示了本试剂盒所采用抗体的特异性和抗干扰能力。

[0185] 表7样品检测结果

[0186]

[0187]

[0188] 实施例4、本发明试剂盒及其检测方法与蔗糖密度梯度离心方法的比较[0189] 为验证本发明试剂盒的应用实际性，现与蔗糖密度梯度离心方法进行对比。

[0190] 用本发明的试剂盒检测5份广西株(O/GX/09-7株)样品，样品均由金宇保灵生物药品有限公司提供，并经蔗糖密度梯度离心法定量，O/GX/09-7株146S抗原浓度范围自2.0-104μg/mL。

[0191] 结果如表8所示，可以看出两种方法符合率高，在EXCEL中拟合趋势线，相关系数R2达到0.9835。

[0192] 表8不同方法对O/GX/09-7株146S抗原浓度检测的比较结果

[0193]样品编号本发明试剂盒(μg/mL) 蔗糖密度梯度离心法(μg/mL)
1 95.6 103.96
2 2.32 2.08
3 25.4 29.2
4 70.7 65.3
5 34.3 37.5

[0194] 结合本发明的其它实施例，可以得出如下结论：

[0195] 1、本发明的试剂盒只需要2个小时最多可以检测90个样品，且不需要昂贵的仪器设备，而蔗糖密度梯度离心法则需要72小时，而每台超速离心机只能检测5份样品，这样的检测速度严重制约了口蹄疫疫苗的生产和质量控制。

[0196] 2、本发明的试剂盒分析灵敏度可以达到1.20ng/mL的水平，蔗糖密度离心法的灵敏度大约为100-200ng/mL(见专利《蔗糖密度梯度紫外定量法检测口蹄疫抗原146S含量的方法》，专利申请号：200910092779.3)。

[0197] 3、本发明的试剂盒，重复性好(CV％＜15％),检测结果可靠。

[0198] 实施例5、定量检测比较实验

[0199] 用金宇保灵生物药品有限公司提供的广西株(O/GX/09-7株)和新疆株(O/Mya98/XJ/2010)纯化灭活液，配制三份样品，其中：

[0200] A：只含有广西株(O/GX/09-7株)抗原，已知抗原浓度为1.2μg/mL；按照常规方法乳化(45mL抗原中加入55mL的乳化剂)后破乳(在100mL乳化后抗原中加入20mL的正戊醇，搅拌1分钟后静止30分钟，使其上下分层)，取水相检测。

[0201] B：只含有新疆株(O/Mya98/XJ/2010)抗原，已知其抗原浓度为1.2μg/mL；按照常规方法乳化(45mL抗原中加入55mL的乳化剂)后破乳(在100mL乳化后抗原中加入20mL的正戊醇，搅拌1分钟后静止30分钟，使其上下分层)，取水相检测。

[0202] C：含有广西株(O/GX/09-7株)和新疆株(O/Mya98/XJ/2010)两种抗原，已知两种抗原浓度分别为1.2μg/mL，146S抗原总浓度为2.4μg/mL。按照常规方法乳化(45mL抗原中加入55mL的乳化剂)后破乳(在100mL乳化后抗原中加入20mL的正戊醇，搅拌1分钟后静止30分钟，使其上下分层)，取水相检测。

[0203] 用本发明的试剂盒以及中国农业科学院兰州兽医研究所生产的口蹄疫O型146S抗原定量ELISA检测试剂盒同时按照各自说明书检测146S抗原浓度，结果如表9所示。

[0204] 表9比较结果(146S抗原浓度，μg/mL)

[0205]

[0206] 从上述结果发现，本发明的试剂盒只检测广西株(O/GX/09-7株)，即使其中混合有新疆株(O/Mya98/XJ/2010)抗原也不影响检测。对照试剂盒无法区分两种O型抗原。如果结合申请人开发的另外一种ELISA检测试剂盒(口蹄疫O型免疫检测试剂盒)，该试剂盒能够检测新疆株(O/Mya98/XJ/2010)，与广西株(O/GX/09-7株)无交叉。完全可以对金宇保灵生物药品有限公司生产的猪口蹄疫O型灭活疫苗中的两种146S抗原做到单独定量、质量控制。对照试剂盒只能检测总的O型抗原，无法单独定量，这不利于疫苗生产过程中的质量控制。

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